Очистка почв от нефтяных загрязнений с использованием углеводородокисляющих микроорганизмов

Корневые выделения оказывают значительный эффект на рост и активность почвенных микроорганизмов. Благодаря использованию современных методов исследования появилось множество экспериментальных доказательств изменения структуры микробных сообществ ризосферы в зависимости от состава корневых экзометаболитов. Хорошо изученным примером взаимного влияния растений и микроорганизмов служит бобово-ризобиальный симбиоз. На ранней стадии его формирования состав и количество сигнальных молекул (флавоноидов) в корневых выделениях определяет специфичность и интенсивность взаимодействия растения с определенными видами клубеньковых бактерий, активность которых в ризосфере, в свою очередь, изменяет экссудацию сигнальных молекул растением. Похожий механизм выявлен и у арбускулярной микоризы.

Не только симбиотические, но и другие ризосферные микроорганизмы воздействуют на корневую экссудацию. Ее усиление может происходить за счет дополнительного градиента концентрации органических соединений, направленного от поверхности корня и вызванного трофической активностью микроорганизмов, а также влияния микробных экзометаболитов. Обнаружение в корневых выделениях веществ, аналогичных по механизму действия бактериальным сигналам кворум-сенсинга (QS signal mimics), приводит к выводу о способности растения регулировать рост и активность популяций ассоциативных ризобактерий в ризосфере. Основываясь на полученных данных о роли микроорганизмов в физиологических процессах у растений, современная почвенная экология рассматривает ризосферу как систему с обратными связями, в которой трансформация биогенных элементов, сигнальных молекул и энергии определяется степенью интеграции метаболических процессов и физико-химическим состоянием партнеров.

Возможность генетической модификации растений с целью изменения состава и количества корневых экзометаболитов, открывает перспективы для формирования микробно-растительных систем с улучшенной способностью к адаптации в стрессовых условиях и высокой продуктивностью, на что и ориентирована современная селекция [42].

Известна способность ростстимулирующих ризобактерий повышать интенсивность фотосинтеза, что может усиливать приток фотосинтатов в корни и экссудацию. Интерес также представляет повышение содержания в корневых выделениях органических кислот. Они играют важную роль в ассоциативной азотфиксации и конкурентной колонизации корней ризобактериями, повышают антифунгальную активность штаммов -- антагонистов фитопатогенных грибов. Селекция подобных генотипов требует глубокого изучения корневых выделений у сельскохозяйственных культур и их метаболизма в ризосфере, поскольку необходимо четко определить процедуры проверки результатов отбора [43].

Важную роль в образовании растительно-бактериальных ассоциаций могут играть бактериальные гликопротеины -- лектины, которые участвуют в колонизации корней бактериями, а также стимулируют активность растительных ферментов и ростовые процессы. Выявлено сильное ростстимулирующее действие летучих метаболитов ацетоина и 2,3-бутандиола, продуцируемых штаммами Bас. subtilis и Bас. amyloliquefaciens, в отношении Arabidopsis thaliana [44].

Колонизация корней ризобактериями

К необходимым условиям эффективного взаимодействия интродуцируемых популяций ризобактерий с растениями относится способность интродуцента активно колонизировать корни и поддерживать экологически значимую численность популяции. Колонизация корней ризобактериями -- сложный мультистадийный и энергоемкий процесс, за который ответственно большое число бактериальных и растительных генов. Он может быть разделен на несколько стадий: хемотаксис к корневым экзометаболитам, адсорбцию, формирование микроколоний в местах интенсивной экссудации корневых метаболитов, миграцию вдоль корневой поверхности и конкуренцию с другими микроорганизмами. По данным сканирующей электронной микроскопии, микроколонии ризобактерий на поверхности корней покрыты слизеподобным слоем, предохраняющим клетки и колонию в целом от неблагоприятных воздействий.

Для успешной колонизации корней важна способность бактерий утилизировать основные компоненты корневых выделений, в особенности низкомолекулярные органические кислоты. В ризосфере у диплоидных генотипов пшеницы с высоким относительным содержанием органических кислот в корневых выделениях численность ассоциативных азотфиксаторов и других ризобактерий росла интенсивнее.

Активная колонизация ризосферы и поверхности корней служит важным критерием отбора полезных форм ризобактерий, предназначенных для инокуляции растений [45].

1.4.3 Механизмы положительного действия ризосферных бактерий на растения

Азотфиксация

В основном изучены взаимодействия растений с азотфиксирующими ризобактериями (диазотрофами). Наиболее изученные ассоциативные азотфиксаторы -- бактерии родов Azospirillum, Azotobacter и Klebsiella. Показано, что ассоциативная азотфиксация при определенных условиях вносит существенный вклад в обеспечение растений азотом. Среди недавних таких исследований представляет интерес сообщение, что при инокуляции бактерией Azospirillum amazonense растения риса содержали до 27 % N₂ атмосферы.

Продуцирование фитогормонов

К важнейшим механизмам взаимодействия в растительно-бактериальных ассоциациях относится продуцирование бактериями фитогормонов (ауксинов, цитокининов и гиббереллинов), витаминов и других биологически активных веществ. Наибольшее внимание уделялось роли бактериальных ауксинов в стимуляции роста и питания растений, поскольку способность синтезировать индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) широко распространена среди ризобактерий. Изучены биохимические пути и гены, ответственные за синтез ИУК, а также фенотипические эффекты экзогенных ауксинов на растения. Выявлен положительный эффект бактериальных ауксинов на инициацию и удлинение корней, развитие боковых корней и корневых волосков, что может иметь значение для ускоренного роста, потребления питательных элементов и устойчивости растения к стрессам. Синтез ауксинов ризосферными микроорганизмами в значительной степени определяется составом корневых выделений, содержащих их основной метаболитический предшественник L-триптофан. Многие ризобактерии способны синтезировать цитокинины и гиббереллины [46].

Необходимо также учитывать, что некоторые бактерии могут не только продуцировать, но и деградировать фитогормоны. Так, описаны штаммы Ps. putida, расщепляющие ИУК, что может быть использовано для снятия ингибирующего действия суперпродуцентов ИУК, к которым относятся фитопатогены, на растения. Однако как ризобактерии, расщепляющие фитогормоны, так и реакция растений на эту деструкцию требуют более детального изучения [47].

Способность к растворению труднодоступных фосфатов

Способность ризосферных бактерий растворять труднодоступные почвенные фосфаты давно рассматривается как важный механизм положительного действия на фосфорное питание растения. Недавно были обобщены результаты многолетних исследований по экологии, селекции и таксономии фосфатмобилизующих бактерий, а также их ассоциаций с растениями и эффективности инокуляции. Изучены бактериальные гены кислых фосфатаз и фитаз, расщепляющих органофосфаты, а также гены, участвующие в растворении минеральных фосфатов, например ответственные за биосинтез глюконовой кислоты. Многие бактерии могут повышать доступность фосфататов для растения за счет простого подкисления среды в процессе жизнедеятельности, в частности при утилизации сахаров с образованием органических кислот. Благодаря такому неспецифическому эффекту в определенных условиях очень многие ризобактерии могут функционировать как фосфатмобилизующие.

Другие механизмы, облегчающие потребление питательных элементов у растений, обнаружены при изучении их взаимодействия с бактериями рода Azospirillum. Так, инокуляция активизировала транспорт протонов из клеток корней и приводила к подкислению ризосферы, что могло мобилизовать связанные в минералах питательные элементы, в том числе фосфор. Известны азоспириллы, обладающие пектолитической активностью, что вызывает повышенную ионную проницаемость у кортикальных клеток корней. Кроме того, при инокуляции растения потребление питательных элементов может изменяться из-за их трансформации в ризосфере, например с участием бактериальной нитратредуктазы [48].

Продуцирование сидерофоров

Важную роль в повышении доступности питательных элементов способны играть бактериальные сидерофоры -- низкомолекулярные вещества, хелатирующие железо и другие металлы с образованием устойчивых комплексов. В большей степени изучены сидерофоры, синтезируемые бактериями рода Pseudomonas. Продукция сидерофоров ризобактериями связана с удовлетворением их потребностей в железе и ингибированием конкурентной микрофлоры за счет образования недоступных для нее Fe-сидерофорных комплексов. Важно, что такие комплексы могут усваиваться растениями, хотя и в меньшей степени, чем Fe-содержащие соединения некоторых синтетических хелаторов железа и фитосидерофоров [49].

Интерес к механизмам прямого воздействия ризобактерий на системы поглощения и транспорта элементов в растениях в настоящее время возрастает. Наиболее вероятно, что вышеперечисленные специфические эффекты бактерий служат причиной повышения содержания определенного элемента в растительных тканях. Существенное влияние бактерий на рост биомассы растения может не проявиться, если дефицит этого элемента не представляет собой ростлимитирующий фактор. Однако чаще наблюдают только повышение накопления (выноса) определенных элементов, обусловленное увеличением биомассы инокулированных растений. Такое действие бактерий может быть связано со стимуляцией роста корней, приводящей к освоению ими большего почвенного пространства и, следовательно, дополнительных питательных ресурсов [50].

Продуцирование АЦК дезаминазы

Универсальным антистрессовым эффектом обладают бактерии, содержащие фермент 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК) дезаминазу, благодаря которому в растениях снижается содержание этилена -- сигнальной молекулы в каскаде неспецифических стрессовых реакций. Бактерии колонизируют корни растений и используют АЦК в качестве источника питания, что приводит к снижению ее содержания и, соответственно, интенсивности биосинтеза этилена в корнях. В результате ингибирующий эффект стрессового этилена на рост растения подавляется [51].

В настоящее время имеется ряд сообщений о защитном эффекте АЦК-утилизирующих ризобактерий в условиях токсического действия тяжелых металлов, дефицита или избытка почвенной влаги, а также осмотического стресса при засолении почвы.

У растений аминокислота АЦК окисляется АЦК оксидазой до этилена с образованием углекислого газа, циановой кислоты и воды, то есть служит непосредственным предшественником при биосинтезе фитогормона этилена. Этилен вовлечен во многие звенья процессов роста и развития растений, включая прорастание семян, инициацию и удлинение тканей и органов, цветение, созревание плодов, старение тканей и реакции на стрессовые факторы. Активизация биосинтеза АЦК и этилена -- неспецифическая реакция растений на различные стрессы, в которых последний действует как негативный регулятор ростовых процессов [52].

Известно, что аминокислота АЦК входит в состав корневых экссудатов и растение поддерживает ее баланс внутри и вне тканей (в ризосфере ее количество может достигать нескольких микромолей). Симбиотрофные бактерии используют АЦК как источник азотного и углеродного питания. Для поддержания равновесия концентраций растение увеличивает отток АЦК из корней в ризосферу, что приводит к снижению интенсивности биосинтеза этилена в корнях и его ингибирующего действия на растение.

Таким образом, 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК) деаминаза широко распространена у симбиотрофных бактерий. АЦК-утилизирующие бактерии снижают ингибирование роста растений этиленом, синтезируемым при абиотических и биотических стрессах, часто присутствуют на корнях растений и могут быть важным элементом растительно-микробных систем, особенно в условиях стрессов. Поэтому их следует считать перспективным компонентом нового типа бактериальных биопрепаратов со специфическим антистрессовым эффектом [53].

Многие из этих описанных свойств бактерий и механизмов их положительного влияния на растения могут играть важную роль в защите последних от неблагоприятных условий среды и абиотических стрессов. Это обусловлено потенциальной направленностью действия ризобактерий против негативных эффектов и последствий воздействия стрессоров.

1.4.4 Особенности приживаемости ризобактериальных инокулятов

Эффективность инокуляции растений смешанными культурами ризобактерий.

Совместное использование нескольких штаммов ризобактерий с неодинаковыми свойствами и механизмами взаимодействия с растением неоднократно рассматривалось как возможность улучшения эффективности инокуляции. Прием основан на расширении экологической пластичности и диапазона совместимости многокомпонентных бактериальных инокулятов с растением и использовании принципов аддитивности и синергизма при взаимодействии с растением нескольких ассоциантов.

В условиях сосуществования в одной пространственной зоне и конкуренции за корневые экссудаты между активно взаимодействующими друг с другом ризобактериями образуются трофические и регуляторные связи. Например, способность фиксировать атмосферный азот делает диазотрофов чрезвычайно привлекательными партнерами для многих микроорганизмов, усваивающих только минеральные формы азота. Показано, что бактерии рода Azospirillum образуют ассоциации с целлюлозоразлагающими (Cellulomonas), пектинолитическими (Bacillus) и другими ризосферными бактериями. Такие ассоциации основаны на свойстве азоспирилл использовать в качестве источника углерода продукты разложения полимеров бактериями-ассоциантами, снабжая последние фиксированным азотом.

Ризобактерии также играют роль «вспомогательных» агентов для активизации симбиотических отношений при инокуляции растений клубеньковыми бактериями и микоризными грибами. Стимулирующее действие может быть обусловлено как прямым, так и опосредованным влиянием ризобактерий на микросимбионты (в последнем случае -- через положительный эффект на растение) [54].

Ассоциации интродуцируемых ризобактерий с аборигенной микрофлорой

Попадая с семенами в почву, интродуценты вступают в тесный контакт с аборигенной микрофлорой и должны занять экологическую нишу в корневой зоне прорастающих семян, которая привлекает многих полезных и вредных для растений микроорганизмов. Как уже отмечалось, интродуцируемые ризобактерии легко вступают в ассоциации с разнообразными микроорганизмами. С одной стороны, аборигенные микроорганизмы могут повышать доступность дополнительных питательных ресурсов для интродуцента, его выживаемость и активность в зоне корней. С другой стороны, в ризосфере в большой степени развиты взаимодействия микробов по типу антагонизма и конкуренции за корневые выделения.

Интродуцируемые ризобактерии образуют ассоциации не только с полезными, но и с вредными для растений ризосферными аборигенами.

Таким образом, один из важных факторов выживания и активности интродуцируемых бактерий в ризосфере -- взаимодействие с аборигенными микроорганизмами, в частности устойчивость к их влиянию. Слабая конкурентоспособность интродуцентов, а также образование ими ассоциации с вредной для растений микрофлорой или ингибирование активности полезных форм микроорганизмов может влиять на эффективность инокуляции и искажать ожидаемую реакцию растений на внесение ризобактерий в почву [55].

1.5 Ремедиация нефтезагрязненных почв

Нефтяное загрязнение отличается от многих других антропогенных воздействий тем, что оно дает не постепенную, а, как правило, «залповую» нагрузку на среду, вызывая быструю ответную реакцию. При оценке последствий такого загрязнения не всегда можно сказать, вернется ли экосистема к устойчивому состоянию или будет необратимо деградировать. Во всех мероприятиях, связанных с ликвидацией последствий загрязнения, с восстановлением нарушенных земель, необходимо исходить из главного принципа: не нанести экосистеме больший вред, чем тот, который уже нанесен при загрязнении. Суть восстановления загрязненных экосистем - максимальная мобилизация внутренних ресурсов экосистемы на восстановление своих первоначальных функций. Самовосстановление и рекультивация представляют собой неразрывный биогеохимический процесс.

Естественное самоочищение природных объектов от нефтяного загрязнения - длительный процесс. В связи с этим, разработка способов очистки почвы от загрязнения углеводородами нефти - одна из важнейших задач при решении проблемы снижения антропогенного воздействия на окружающую среду [56].

1.5.1 Биоремедиация нефтезагрязненных почв с помощью микроорганизмов

Существующие механические, термические и физико-химические методы очистки почв от нефтяных загрязнений дорогостоящи и эффективны только при определенном уровне загрязнения (как правило, не менее 1% нефти в почве), часто связаны с дополнительным внесением загрязнения и не обеспечивают полноты очистки. В настоящее время одной из наиболее перспективной технологии очистки нефтезагрязненных почв считается интродуцирование в почву различных комплексов микроорганизмов, отличающихся повышенной способностью к биодеструкции тех или иных углеводородных компонентов нефти и нефтепродуктов. Нефть - чрезвычайно сложный и разнообразный по составу субстрат, и это, с одной стороны, определяет трудности очистки почв, но с другой стороны обуславливает широкий спектр микроорганизмов, которые могут использовать различные компоненты и фракции нефти для питания. Способность утилизировать трудноразлагаемые вещества антропогенного происхождения (ксенобиотики) обнаружена у многих организмов.

Это свойство обеспечивается наличием у микроорганизмов специфических ферментных систем, осуществляющих катаболизм таких соединений. Поскольку микроорганизмы имеют сравнительно высокий потенциал разрушения ксенобиотиков, проявляют способность к быстрой метаболической перестройке и обмену генетическим материалом, им придается большое значение при разработке путей биоремедиации загрязненных объектов [57].

Под термином «биоремедиация» принято понимать применение технологий и устройств, предназначенных для биологической очистки почв, т.е. для удаления из почвы уже находящихся в ней загрязнителей. Биоремедиация включает в себя два основных подхода:

1 биостимуляция - активизация деградирующей способности аборигенной микрофлоры внесением биогенных элементов, кислорода, различных субстратов;

2 биодополнение - интродукция природных и генноинженерных штаммов-деструкторов чужеродных соединений.

Биостимуляция in situ (биостимуляция в месте загрязнения).

Механизм самовосстановления экосистемы после нефтяного загрязнения достаточно сложен. С помощью агротехнических приемов можно ускорить процесс самоочищения нефтезагрязненных почв путем создания оптимальных условий для проявления потенциальной активности микроорганизмов, входящих в состав естественного микробиоценоза. Микроорганизмы, потребляющие углеводороды нефти, являются обычными компонентами биоценозов почв. Во всех почвах в большом количестве содержатся микроорганизмы, способные окислять углеводороды различного происхождения (растительного, животного, нефтяного). Поступление в почву свежего энергетического материала вызывает интенсивное развитие углеводородоокисляющей микрофлоры, что обеспечивает утилизацию поллютанта.

Подход in situ основан на стимулировании роста природных микроорганизмов, обитающих в загрязненной почве и потенциально способных утилизировать загрязнитель, но не способных делать это эффективно из-за недостатка основных биогенных элементов (соединений азота, фосфора, калия и др.) или неблагоприятных физико-химических условий. Обеспеченность почв биогенными элементами - азотом, фосфором и калием - важный фактор, определяющий интенсивность разложения нефти и нефтепродуктов. Недостаток биогенных элементов необходимо восполнять путем внесения в почву минеральных удобрений. Практически во всех случаях внесение биогенных элементов в виде минеральных удобрений стимулирует разложение углеводородов в почве. Наиболее интенсивно разложение углеводородов протекает при ежегодном внесении комплекса N, P, K - содержащих удобрений в сочетании с навозом, а также при внесении в почву биогумуса.

В этом случае в ходе лабораторных испытаний с использованием образцов загрязненной почвы устанавливают, какие именно компоненты и в каких количествах следует внести в загрязненный объект, чтобы стимулировать рост микроорганизмов, способных утилизировать загрязнитель.

Биостимуляция in vitro.

Отличие этого подхода в том, что биостимуляция образцов естественной микрофлоры загрязненной почвы проводится сначала в лабораторных или промышленных условиях (в биореакторах или ферментерах). При этом обеспечивается преимущественный и избирательный рост тех микроорганизмов, которые способны наиболее эффективно утилизировать данный загрязнитель. «Активизированную» микрофлору вносят в загрязненный объект одновременно с необходимыми добавками, повышающими эффективность утилизации загрязнителя.

Существующие два пути интенсификации биодеградации ксенобиотиков в окружающей среде - стимуляция естественной микрофлоры и интродукция активных штаммов, не только не противоречат, но и дополняют друг - друга [58].

Биорекультивация нефтезагрязненных почв - это многостадийный биотехнологический процесс, включающий физико-химические методы детоксикации загрязнителя, применение органических и минеральных добавок, использование биопрепаратов.

Основными факторами, влияющими на ход биоразрушения органических загрязнителей, являются их химическая природа (которая обусловливает возможные пути биотрансформации), концентрация и взаимодействие с другими загрязнителями (на уровне их непосредственного взаимодействия или взаимного влияния на трансформацию) [59].

К основным неблагоприятным физико-химическим условиям, лимитирующим деградацию микроорганизмами ксенобиотиков в окружающей среде, можно отнести недостаточное содержание кислорода и неблагоприятную температуру. Нефтяное загрязнение в значительной мере ухудшает газовый обмен почвы, создает условия для усиления восстановительных процессов. Для окисления углеводородов микроорганизмами необходимо наличие молекулярного кислорода, в анаэробных условиях процесс окисления крайне затруднен. Приемы обработки почв, способствующие улучшению аэрации, стимулируют активность микроорганизмов, усиливают окислительные процессы. Интенсификация разложения нефти и нефтепродуктов в почве возможна путем рыхления, частой вспашки или дискования.

Температура также является важным фактором, при прочих равных условиях определяющих интенсивность микробиологического разложения нефти и нефтепродуктов. Оптимальной температурой для разложения нефти и нефтепродуктов в почве считается 20-37°С. В связи с этим особое внимание исследователей в последнее время привлекают природные микроорганизмы, обладающие высокой устойчивостью к низким температурам.

Так же, к неблагоприятным физико-химическим условиям можно отнести низкую или чрезмерную влажность почвы, неблагоприятную кислотность, низкую концентрацию или доступность ксенобиотиков, наличие альтернативных, более предпочтительных субстратов и т.д. Среди биологических факторов отмечены поедание интродуцируемых микроорганизмов простейшими, обмен генетической информацией в популяции, физиологическое состояние и плотность интродуцируемой микробной популяции. Некоторые из перечисленных проблем могут быть решены путем создания генетически сконструированных штаммов-деструкторов и их консорциумов, усовершенствования методов интродукции, оптимизации условий существования природных микробных популяций.

Таким образом, интродукция микроорганизмов приводит к положительным результатам только при создании соответствующих условий для развития внесенной популяции, для чего необходимо знать физиологические особенности интродуцента, а также учитывать складывающиеся микробные взаимодействия [60].

1.5.2 Фиторемедиация нефтезагрязненных почв

Фиторемедиация представляет собой использование растений для очистки окружающей среды. В этой технологии используются природные процессы, с помощью которых растения деградируют и накапливают различные поллютанты. Фиторемедиация является высокоэффективной технологией очистки от ряда органических и неорганических поллютантов.

Органические поллютанты в окружающей среде представлены, главным образом, веществами антропогенного происхождения, и для большинства организмов являются чужеродными (ксенобиотиками); многие из них токсичны, некоторые канцерогенны. В зависимости от их свойств, органические поллютанты могут или разрушаться в корневой зоне растений, или поглощаться с последующим разрушением, изолированием или испарением.

Наряду с преимуществами фиторемедиация имеет ряд ограничений. Растения, производящие очистку, должны находится в зоне загрязнения и быть способными воздействовать на поллютант. Следовательно, свойства почвы, уровень токсичности и климат должны позволять рост и развитие растений. Если почва токсична, её можно сделать более пригодной для роста с помощью внесения определённых почвенных добавок.

Нужно также учитывать, что очистка ограничена уровнем глубины корней, т.к. растения должны иметь контакт с поллютантом. Корни травянистых растений обычно достигают глубины 50 см, деревьев - 3 м, хотя некоторые растения (особенно в аридных районах) способны достигать глубины 15 и более метров.

В зависимости от вовлечённых биологических процессов, фиторемедиация может занять больший период времени, чем другие методы очистки. Деградация поллютантов растениями работает довольно быстро (дни/месяцы), тогда как очистка путём аккумуляции растениями занимает годы.

Также фиторемедиация может ограничиваться доступностью поллютантов растению. Биодоступность поллютантов зависит от химических свойств поллютанта, свойств почвы, условий среды, различных биологических процессов. Биодоступность поллютантов может быть увеличена путём внесения в почву определённых добавок (например, органические кислоты, понижая рН и хелатируя катионы, делают более доступными для растения загрязняющие металлы, а сурфактанты - гидрофобные органические поллютанты) [61].

Для достижения максимальной эффективности очистки фиторемедиация может использоваться в сочетании с другими методами биоремедиации и небиологическими технологиями очистки. Например, наиболее загрязнённые части субстрата могут удаляться путём экскавации, после чего дальнейшая очистка может проводиться с помощью растений.

За последние десять лет фиторемедиация приобрела большую популярность, что отчасти связано с её низкой стоимостью. Так как в процессе фиторемедиации используется только энергия солнца, данная технология на порядок дешевле методов основанных на применении техники (таких как экскавация, промывка и сжигание почвы). То, что данная технология применяется прямо в районе загрязнения (in situ) способствует снижению затрат и уменьшению контакта загрязнённого субстрата с людьми и окружающей средой [62].

Ризофильтрация

Растения могут применяться как фильтры в созданных искусственно заболоченных участках или в промышленных установках. К данной технологии в частности относится ризофильтрация - использование растений в гидропонных установках для фильтрации загрязнённой воды. Для фиторемедиации в искусственно созданных заболоченных территориях применяются различные водные виды: ряска Lemna sp. и Azolla sp. - для неорганических поллютантов (хорошие накопители металлов и лёгкий сбор биомассы), виды родов Myriophyllum и Elodea - для органических поллютантов (высокий уровень деградирующих ферментов). В процессе ризофильтрации осуществляется интенсивное аэрирование, что позволяет использовать также наземные растения, часто используются горчица Brassica juncea и подсолнечник Helianthus annuus.

Фитоэкстракция

Данная технология заключается в использовании растений для экстрагирования поллютантов и аккумулирования их в тканях, после чего надземная растительная биомасса собирается. Растительный материал может далее либо использоваться для непищевых целей (производство дерева, картона) либо сжигаться с последующим вывозом золы на свалку или, в случае ценных металлов, рециркуляцией накопленных элементов. Для фитоэкстракции часто применяют горчицу Brassica juncea и подсолнечник Helianthus annuus из-за их быстрого роста, большой биомассы и высокой устойчивости к поллютантам [63].

Фитодеградация

Некоторые растения могут напрямую деградировать органические поллютанты с помощью своих ферментов, обычно внутри тканей, до неорганических соединений или до стабильных интермедиатов, накапливающихся в растении. Технология использования растений для деградации поллютантов получила название фитодеградация. Она эффективна против органических поллютантов обладающих хорошей подвижностью в растении (гербициды, ТНТ, трихлорэтилен). Применяемые для фитодеградации виды характеризуются наличием обширной плотной корневой системой и высоким уровнем синтеза ферментов деградации (наиболее часто применяют растения тополя).

Фитоиспарение

Технология, получившая название фитоиспарение, основывается на том, что после поглощения некоторые поллютанты могут покидать растение в летучей малотоксичной форме. Если летучее соединение всё же токсично, то после испарения растением оно разбавляется в атмосфере до уровня не представляющего угрозы. Фитоиспарение может быть использовано для летучих органических соединений (трихлорэтилен) и некоторых неорганических веществ, способных переводиться растением в летучее состояние (селен, ртуть). Обычно в данной технологии применяют всё тот же тополь благодаря высокому уровню транспирации [64].

Фитостимуляция

Технология фитостимуляции состоит в применении растений для стимуляции биодеградации поллютантов микрооргаизмами в ризосфере. Такая стимуляция биодеградации осуществляется за счёт секреции растениями органических веществ, используемых ризосферными микроорганизмами в качестве источника энергии и углерода, а также различных вторичных метаболитов, активирующих гены, ответственные за синтез деградирующих ферментов. Для фитостимуляции микроорганизмов-деструкторов корневой зоны применяются растения обладающие обширной плотной корневой системой и секретирующие специфические вещества, способствующие росту этих микроорганизмов. Фитостимуляция применяется для очистки от гидрофобных органических поллютантов, в основном от углеводородов нефти, которые не могут быть поглощены растениями, но могут быть деградированы микроорганизмами [65].

Среди перечисленного наибольшую актуальность приобретают методы, основанные на использовании объединенного метаболического потенциала микроорганизмов и растений. Микроорганизмы-деструкторы проявляют большой углеводородокисляющий потенциал, но в процессе биоремедиации нефтезагрязненных почв возникает проблема их приживаемости. В связи с этим используется симбиотическое взаимодействие растений и микроорганизмов-деструкторов, так как ризосфера является природной экосистемой, обеспечивающей высокую численность микробных популяций и ее естественное поддержание.

Основными механизмами для фиторемедиации нефтезагрязненных почв являются стимуляция растениями почвенных микроорганизмов через ризосферный эффект и активизация деятельности микробного сообщества, и, как следствие, интенсификация биохимических и химических процессов трансформации чужеродных соединений в почве.

Таким образом, важной и основной ролью растений в детоксикации поллютантов играет ризосфера растений, которая является областью активного развития микроорганизмов-деструкторов углеводородного загрязнения почв [66].

2. Цели и задачи работы

Подход проекта основан на селекции штаммов или консорциумов бактерий, обладающих комплексом антистрессовых свойств и способности к биодеструкции нефти. Основная цель данной работы сводится к отбору и детальной характеристике штаммов микроорганизмов, повышающих адаптационный потенциал растений к стрессовым факторам среды и осуществляющих деструкцию нефтезагрязнений почвы.

Это позволит интенсифицировать процесс фиторемедиации одновременно в двух направлениях: 1 - стимуляция роста растений за счет оптимизации гормонального статуса и улучшения минерального и водного питания; 2 - активизация процессов очистки почвы за счет биодеструкции нефтезагрязнений. Важно подчеркнуть, что биодеструкция нефтезагрязнений на этапе фиторемедиации в основном осуществляется ассоциированными с растениями микроорганизмами, которые используют ресурсы растительного происхождения для углеводородокисляющих деструктивных процессов. Повышение численности их популяций обеспечит в дальнейшем интенсивную колонизацию корней растений, образование эффективных растительно-микробных систем и нитенсификацию фиторемедиации.

В ходе исследовательской работы поставлены следующие задачи:

1. Отобрать штаммы микроорганизмов отличающихся нефтедеструктивной способностью и охарактеризовать их углеводородокисляющий потенциал для разработки перспективных биотехнологических методов эффективной фиторемедиации нефтезагрязненных почв.

2. Выявить способность исследуемых штаммов микроорганизмов продуцировать фитогормоны типа ауксинов и определить количественное содержание продуцируемых фитогормонов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

3. Выявить АЦК-утилизирующие микроорганизмы и определить у них способность к продукции фермента АЦК дезаминазы.

4. Определить способность исследуемых штаммов микроорганизмов к разложению труднодоступных фосфатов и выявить активных мобилизаторов фосфатов.

Так же должна быть проверена возможность создания консорциума штаммов бактерий, обладающих по возможности несколькими или одним из свойств (наличие антистрессового фермента АЦК дезаминазы, способности продуцировать фитогормоны ауксины, способности растворять труднодоступные фосфаты и утилизировать углеводороды нефти), которые важны для разработки новых технологий фиторемедиации нефтезагрязненных почв.

нефть углеводород бактерия деструкция

3. Экспериментальная часть

3.1 Объекты исследования

Микроорганизмы, использованные в работе, включают в себя 30 штаммов бактерий, взятых из коллекции ассоциативных микроорганизмов. В рамках экспериментальных исследований данного проекта не планируется выделение штаммов бактерий из природных источников или генетическая модификация микроорганизмов. Поэтому работа будет основана на результатах изучения свойств коллекционных штаммов для получения антистрессовых и углеводородокисляющих бактерий. Все исследуемые штаммы микроорганизмов депонированы в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного значения (ВКСМ) Россельхозакадемии.

Основными объектами данной исследовательской работы являются микроорганизмы родов: Rhodococcus, Variovorax, Arthrobacter, Bacillus, Micrococcus и Pseudomonas. Важно подчеркнуть, что большинство ассоциативных бактерий, в том числе содержащих АЦК дезаминазу, и продуцентов ауксинов относятся к выше перечисленным родам [47].

К тем же таксономическим группам относятся и многие углеводородокисляющие бактерии - биодеструкторы нефти [25]. Это обуславливает высокую вероятность селекции штаммов, которые сочетают в себе полезные для роста растений свойства и способные утилизировать органические загрязнения в виде нефти и нефтепродуктов.

Эти бактерии являются уникальным по биоразнообразию и функциональности биоресурсом и будут служить основным объектом исследований, что позволит успешно выполнить поставленные задачи.

Таблица 2 - Штаммы микроорганизмов исследуемых в экспериментальной части работы

№	Вид	Штамм	Источник выделения	Краткая характеристика
1	Rhodococcus erythropolis	192	почва Лен. области	стимулятор роста, продуцент каротиноидов
2	Rhodococcus erythropolis	196	почва Лен. области	стимулятор роста, продуцент каротиноидов
3	Rhodococcus fascians	394	семена ячменя, Дагестан	стимулятор роста, продуцент каротиноидов
4	Rhodococcus erythropolis	395	корни яблони	стимулятор роста, продуцент каротиноидов
5	Rhodococcus pyyridinivorans	398	колос пшеницы	эпифит
6	Rhodococcus fascians	399	проростки овса	стимулятор роста, продуцент каротиноидов
7	Rhodococcus erythropolis	401	листья проростков овса	эпифит
8	Rhodococcus erythropolis	402	листья проростков пшеницы	эпифит
9	Rhodococcus erythropolis	403	листья проростков овса	эпифит
10	Rhodococcus sp.	393	корни яблони	стимулятор роста, продуцент каротиноидов
11	Rhodococcus maris	346	листья черной смородины	эпифит
12	Rhodococcus fascians	392	корни проростков пшеницы	стимулятор роста, продуцент каротиноидов
13	Rhodococcus sp.	191	почва Лен. области	стимулятор роста, продуцент каротиноидов
14	Bacillus subtilis	440	почва из-под плодовых деревьев, Украина	антагонист фитопатогенов
15	Pseudomonas aeruginosa	478	почва Лен. области	продуцент пигментов
16	Micrococcus luteus	220	корни пшеницы	стимулятор роста, продуцент каротиноидов
17	Arthrobacter histidinolovorans	352	корни табака	стимулятор роста, продуцент каротиноидов
18	Micrococcus luteus	396	почва Лен. области	продуцент ?-каротина
19	Arthrobacter citreum	426	почва Лен. области	продуцент аминокислот
20	Bacillus endophyticus	107	почва Лен. области	антагонист фитопатогенов
21	Bacillus megaterium	64	почва Моск. области	фосфатредуктор
22	Bacillus koreensis	154	почва Лен. области	фосфатредуктор
23	Bacillus pumilus	128	почва Горьк. области	антагонист фитопатогенных грибов
24	Variovorax paradoxus	5c2	ризосфера горчицы сарептской	стимулятор роста
25	Rhodococcus sp.	4n44	ризосфера горчицы сарептской	стимулятор роста
26	Variovorax paradoxus	5p3	ризосфера горчицы сарептской	стимулятор роста
27	Arthrobacter sp.	D12str	ризосфера ячменя	стимулятор роста
28	Arthrobacter histidinolovorans	409	корни овса	колонизатор ризосферы
29	Bacillus subtilis niger	120	почва, Башкортостан	антагонист фитопатогенов
30	Pseudomonas aeruginosa	188	почва Лен. области	продуцент пигментов

В ходе работы будут изучены следующие функциональные характеристики вышеперечисленных микроорганизмов: устойчивость бактерий к углеводородам нефти и их биодеструктивный потенциал, их ростстимулирующая активность, а именно, способность к продукции фитогормонов-ауксинов, АЦК-утилизирующая способность и продукция АЦК дезаминазы, а так же способность к растворению труднодоступных фосфатов.

3.2 Материалы и методы исследования

3.2.1 Определение углеводородокисляющей активности

Изучение деструктивной активности штаммов по отношению к углеводородам нефти проводили, культивируя микроорганизмы в жидких средах, содержащих углеводородный субстрат (сырую нефть) в качестве единственного источника углерода и энергии.

Минеральный состав питательной среды:

K₂HPO₄ - 1 г/л;

MgSO₄·7H₂O - 0,2 г/л;

NaCl - 5 г/л;

NH₄H₂PO₄ - 1 г/л.

Так же в минеральную среду был добавлен дрожжевой экстракт из расчета 20мг/л (200мкл/л из stock solution - 100 мг/мл) для затравки микроорганизмов.

После автоклавирования питательная среда разливалась в стерильные пробирки по 5мл в каждую.

Для посева использовалась 3-х суточная культура выбранных 30ти штаммов микроорганизмов. Концентрация вносимых в питательную среду ресуспензированных в физиологическом растворе микроорганизмов - 10⁵ клеток на 5 мл среды.

При определении углеводородокисляющей активности использовался гравиметрический метод. Для выявления активности в пробирки с питательной средой была внесена стерильная сырая нефть по 25 мкл в каждую из расчета 5 г/л. Контролем служили пробирки с питательной средой и нефтью без внесения микроорганизмов.

При определении прироста биомассы углеводородокисляющих бактерий проводился сравнительный анализ на фотоэлектрическом колориметре. Контролем для определения прироста служили пробирки с питательной средой и микроорганизмами без внесения нефти.

Культивирование проходило при температуре 28⁰С, на круговой качалке при 110 об/мин, в течение 7 суток. Эксперимент поставлен в двукратной повторности.

Для определения деструктивной активности гравиметрическим методом по окончании культивирования была проведена экстракция нефти. При экстрагировании был использован органический растворитель хлороформ (СHСl₃) в объеме 1 мл на каждую из пробирок. Хлороформ, будучи тяжелее культуральной жидкости, и экстрагированная в нем нефть переходили в нижний слой раствора. Экстракция проводилась в трехкратной повторности, каждая в течение 5 минут. Экстракты удалялись со дна пробирки пипеткой, объединялись и затем помещались в предварительно взвешенные алюминиевые кюветы. После полного удаления растворителя кюветы повторно взвешивались для определения количества частично разложившейся нефти. Наибольшая разница между массой нефти из контрольной пробирки и массой нефти из пробирок с исследуемыми культурами соответствует наибольшему количеству разложившихся углеводородов нефти до СО₂ и Н₂О, что говорит о наибольшей углеводородокисляющей активности штамма.

Для определения прироста биомассы был проведен сравнительный анализ на фотоэлектрическом колориметре Smart-Spec-Plus (Biorad, США). Наибольшая разница между оптическими плотностями культуральной жидкости исследуемых образцов и контроля соответствовала наибольшему приросту биомассы углеводородокисляющих бактерий. Измерения проводились при длине волны ?=540 нм. Опыт проводился в двукратной повторности.

По окончании опыта по экспериментальным данным было отобрано 11 наиболее активных штаммов микроорганизмов, которые подвергались дальнейшим исследованиям для изучения их ростстимулирующих свойств.

3.2.2 Определение способности к продуцированию ауксинов по выявлению фитогормонов с использованием ВЭЖХ

Способность бактерий продуцировать ауксины изучена с помощью периодических культур.

Состав питательной среды для культивирования отобранных штаммов микроорганизмов:

KH₂PO₄ - 0,4 г/л;

K₂HPO₄ - 0,1 г/л;

MgSO₄·7H₂O - 0,2 г/л;

NaCl - 0,1 г/л;

Дрожжевой экстракт - 50 мг/л;

Глюкоза - 5 г/л.

В качества предшественника в биосинтезе ауксинов в питательную среду было внесено 250 мг/л L-триптофана.

Для посева использовалась 3-х суточная культура, посевная доза которой составляла 10⁶ клеток на 5 мл среды. Бактерии культивировались в пробирках до стационарной фазы роста при 28⁰С, в течение 5 суток в темноте.

По окончании культивирования суспензии были центрифугированы и фильтрованы через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм.

Для выявления штаммов с наиболее интенсивной способностью к продуцированию основного фитогормона типа ауксинов, определяющего фитостимуляцию - индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) - был проведен сравнительный анализ на фотоэлектрическом колориметре.

Для анализа использовался реактив Сальковского, дающий характерное розово-красное окрашивание с ИУК. Наиболее интенсивное окрашивание соответствует наиболее интенсивному продуцированию ИУК.

Состав для приготовления реактива Сальковского:

FeCl₃ - 1 г;

H₂O - 250 мл;

H₂SO₄ (конц.) - 150 мл.

Реакция проводилась в соотношении супернатант : реактив Сальковского - 1 : 2, объем реакционной смеси - 1,5 мл.

Контролем для сравнительного анализа служила питательная среда без внесения микроорганизмов с добавлением того же количества реактива Сальковского. Показания снимались при длине волны ?=540 нм. Эксперимент проводился в двукратной повторности.

По окончании эксперимента было отобрано 5 штаммов микроорганизмов отличающихся наиболее активным продуцированием ИУК.

Отобранные в ходе эксперимента 5 штаммов микроорганизмов подвергались дальнейшему исследованию на предмет определения точного количества продуцируемого фитогормона ИУК и некоторых его производных.

Анализ проводился с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием системы Ультра Производительной жидкостной хроматографии (UPLC) на колонке с обращенной фазой Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18 (Waters, США) с флуоресцентным детектором. Данная система предназначена для выполнения исследований как с применением новейших методик и материалов UPLC, так и традиционными методами высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).

Суспензии отобранных культур были также центрифугированы и фильтрованы через мембранные фильтры. Для выделения ауксинов культуральные жидкости и исходные стерильные среды были экстрагированы этилацетатом, подкисленным 0,4 N HCl до рН=3,0. Полученный экстракт был выпарен при 35°C на вакуумном роторном испарителе и растворен в 150 мкл 18% ацетонитрила с последующей фильтрацией через нейлоновый мембранный фильтр Spin-X с диаметром пор 0,22 мкм (Corning, США). Идентификацию ауксинов проводили с использованием флуоресцентного детектора. Длина возбуждающей волны детектора - 280 нм, эмиссионной волны - 350 нм. Объем пробы - 150 мкл.

Ауксины разделялись на колонке 150 мм 5 мм с обращенной фазой С18 в течение 5 минут в буфере ацетонитрил - вода - уксусная кислота. Скорость подачи буфера - 0,3 мл/мин.

Количество фитогормонов в исследуемых образцах рассчитывали с помощью стандартного раствора, в котором концентрация ауксинов была заранее известна. В 5 мкл стандарта содержится: 0,0025 мкг индолил-3-молочной кислоты (ИМК); 0,05 мкг индолил-3-карбоновой кислоты (ИКК); 0,02 мкг индолил-3-уксусной кислоты (ИУК).

По окончании эксперимента у исследуемых образцов было определено количество продуцируемых фитогормонов.

3.2.3 Выявление АЦК-утилизирующих микроорганизмов и определение активности продуцируемого ими фермента АЦК дезаминазы

Выявление АЦК (1-аминоциклопропан-1-карбоксилат) - утилизирующих бактерий проводили, культивируя микроорганизмы на специальной питательной среде для селекции бактерий, утилизирующих АЦК в качестве источника азота, с добавлением смеси органических кислот и АЦК.

Состав питательной среды:

KH₂PO₄ - 0,4 г/л;

K₂HPO₄ - 0,1 г/л;

MgSO₄·7H₂O - 0,2 г/л;

NaCl - 0,1 г/л;

Агар - 15 г/л;

Глюкоза - 5 г/л;

Маннит - 2,5 г/л;

Смесь органических кислот - 0,2 г/л.

Состав смеси органических кислот:

Na-citrate (Na₃C₆H₅O₇ - натриевая соль лимонной кислоты);

Na-pyruvate (CH₃COCOONa - натриевая соль пировиноградной кислоты);

Na-D-gluconic acid (NaC₆H₁₁O₇ - натриевая соль альдоновой (глюконовой) кислоты);

Na-acetate (CH₃COONa - натриевая соль этановой (уксусной) кислоты);

Na-succinate (Na₂C₄H₄O₄ - натриевая соль бутандиовой (янтарной) кислоты);

Na-malic acid (Na₂C₃H₂O₄ - натриевая соль пропандиовой (малоновой) кислоты).

На данной выше основе было приготовлено 3 варианта питательных сред:

1. В качестве источника азота был добавлен NH₄NO₃ из расчета 0,4 г/л. Данная среда служила положительным контролем, с помощью которого определялась оптимальность состава среды и оценивалась эффективность выбранных источников углеродного и азотного питания для исследуемых микроорганизмов.

2. В качестве источника азота был добавлен АЦК в той же концентрации, что и NH₄NO₃. По росту биомассы на данной среде были выявлены АЦК-утилизирующие микроорганизмы.

3. Среда без добавления источника азота и АЦК. Данная среда служила отрицательным контролем. При сравнении роста микроорганизмов на данной среде с ростом микроорганизмов на среде с добавлением АЦК были выявлены АЦК-утилизирующие штаммы.

Засев культур на твердую питательную среду осуществлялся репликаторным методом. В 11 ячеек репликатора было добавлено по 150 мкл физиологического раствора с ресуспензированными в нем клетками исследуемых образцов. Для приготовления посевного материала использовалась 3-х суточная культура.

Культивирование микроорганизмов на всех средах проводилось в термостатах при температуре 28⁰С.

Для выявления наиболее активных АЦК-утилизирующих бактерий на 5-е сутки культивирования была проведена сравнительная визуальная оценка интенсивности и особенности роста исследуемых штаммов микроорганизмов на разных питательных средах.

Наиболее активные АЦК-утилизирующие бактерии подвергались дальнейшему исследованию на предмет изучения активности продуцируемого этими бактериями фермента АЦК дезаминазы.

Активность фермента определяли биохимическим методом Салеха и Глика.

Культуры отобранных активных АЦК-утилизирующих штаммов микроорганизмов были выращены в течение 24 часов при температуре 30⁰С.

Состав питательной среды для культивирования отобранных штаммов микроорганизмов:

KH₂PO₄ - 0,4 г/л;

K₂HPO₄ - 0,1 г/л;

MgSO₄·7H₂O - 0,2 г/л;

NaCl - 0,1 г/л;

Дрожжевой экстракт - 50 мг/л;

Глюкоза - 5 г/л.

После культивирования микроорганизмов культуральные жидкости были центрифугированы в течение 10 минут при 9000g, ресуспензированы в 0,1 М трис-HCl буфере (рН = 7,5) и вновь центрифугированы. Затем клетки были ресуспензированы в 600 мкл 0,1 М трис-HCl буфере (рН = 8,5).

К приготовленной суспензии было добавлено 30 мкл толуола, и клетки были разрушены путем интенсивного встряхивания смеси в течение 1 минуты.

Затем к 100 мкл клеточных экстрактов было добавлено 10 мкл 0,5 М АЦК, 100 мкл 0,1 М трис-HCl буфера (рН = 8.5), и реакционная смесь инкубировалась в течение 30 минут при температуре 30^оС.

Реакция была остановлена добавлением 1 мл 0,56 М HCl, после чего смесь центрифугировалась в течение 5 минут при 14000g.

По окончании центрифугирования к 500 мкл супернатанта было добавлено 400 мкл 0,56 М HCl и 150 мкл 0,2% раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М NaOH, и реакционная смесь вновь инкубировалась в течение 30 минут при температуре 30^оС.

После инкубации был добавлен 1 мл 2 М NaOH.

Активность фермента АЦК дезаминазы определяли по количеству ?-кетобутирата, который образовывается при расщеплении бактериями АЦК, спектрофотометрически при длине волны ? = 540 нм.

Для определения активности АЦК дезаминазы использовался калибровочный график зависимости концентрации ?-кетобутирата от оптической плотности реакционной смеси.

3.2.4 Определение способности к разложению труднодоступных фосфатов

Изучение способности бактерий к разложению труднодоступных фосфатов проводили, культивируя микроорганизмы на агаризованной питательной среде, содержащей в качестве труднодоступных растениям соединений трехзамещенный фосфат кальция (Ca₃(PO₄)₂) и фитат Ca, которые в существенной мере снижают биодоступность фосфора. Проявление способности характеризуется зонами просветления на питательных средах вокруг колоний выросших микроорганизмов.