Очистка почв от нефтяных загрязнений с использованием углеводородокисляющих микроорганизмов

Состав питательной среды для культивирования отобранных штаммов микроорганизмов:

Пептон - 5 г/л;

Гидролизат козеина - 5 г/л;

MgSO₄·7H₂O - 1,5 г/л;

Агар - 15 г/л.

На данной выше основе было приготовлено 3 варианта питательной среды:

1. С добавлением 3 г/л Ca₃(PO₄)₂ в качестве труднодоступного фосфата.

2. С добавлением 3 г/л фитата Са в качестве труднодоступного фосфата.

3. С добавлением 1,5 г/л K₂HPO₄ в качестве легкодоступного фосфата.

Для засева культур на твердую питательную среду использовался репликаторный метод. В 11 ячеек репликатора было добавлено по 150 мкл физиологического раствора с ресуспензированными в нем клетками. Для приготовления посевного материала использовалась 3-х суточная культура.

Культивирование микроорганизмов на всех средах проводилось в термостате при температуре 28⁰С.

По результатам эксперимента можно было визуально сравнить рост биомассы бактерий, выросших на среде с добавлением легкодоступного источника фосфора, и бактерий, выросших на среде с труднодоступными фосфатами.

Так как среды с добавлением фосфата и фитата Са, в отличие от прозрачной среды с добавлением K₂HPO₄, были белесовато-мутными, то способность к растворению труднодоступных фосфатов можно было оценить по площади зон просветления на питательных средах вокруг колоний выросших микроорганизмов. Наибольшая площадь зоны просветления соответствовала наилучшей способности к разложению труднодоступных фосфатов.

Результаты эксперимента фиксировались на 7-е сутки культивирования.

3.3 Результаты исследования, их анализ и обсуждение

3.3.1 Результаты опыта по определению углеводородокисляющей активности

Прирост биомассы углеводородокисляющих бактерий.

Для определения прироста биомассы был проведен сравнительный анализ оптических плотностей культуральной жидкости исследуемых образцов на фотоэлектрическом колориметре Smart-Spec-Plus (Biorad, США). Контролем служила культуральная жидкость бактерий выросших при тех же условиях, но употреблявших в качестве единственного источника углерода и энергии стартовое количество дрожжевого экстракта, присутствующего в среде вместо углеводородов нефти.

Показания снимались при длине волны ?=540нм.

Так как опыт проводился в двукратной повторности, численные значения для каждого исследуемого образца были усреднены.

Таблица 3 - Оптическая плотность культуральной жидкости исследуемых образцов

№ штамма	D540 (оптическая плотность)	D540ср.	№ штамма	D540 (оптическая плотность)	D540ср.
1	0,015	0,007	16	0,081	0,082
	-0,001			0,083
2	0,042	0,036	17	0,002	0,011
	0,030			0,020
3	0,071	0,070	18	0,031	0,024
	0,069			0,017
4	-0,024	- 0,014	19	-0,009	-0,003
	-0,004			0,003
5	0,017	0,023	20	-0,002	-0,020
	0,029			-0,038
6	0,058	0,054	21	0,038	0,031
	0,049			0,024
7	0,078	0,081	22	-0,001	0,008
	0,083			0,017
8	0,030	0,012	23	0,073	0,071
	-0,006			0,068
9	-0,013	0,001	24	0,047	0,055
	0,015			0,063
10	0,023	0,010	25	0,085	0,086
	-0,003			0,087
11	0,037	0,025	26	0,061	0,064
	0,013			0,066
12	0,028	0,013	27	0,067	0,070
	-0,002			0,073
13	0,006	-0,008	28	0,023	0,015
	-0,022			0,007
14	0,059	0,065	29	0,055	0,060
	0,070			0,064
15	0,036	0,019	30	0,072	0,079
	0,002			0,085

Наибольшая оптическая плотность культуральной жидкости соответствует наибольшему приросту биомассы и характеризует то, что углеводороды нефти в качестве единственного источника углерода и энергии, являются приемлимыми для роста и развития микроорганизмов.

По результатам эксперимента из 30 исследуемых образцов можно выделить 11 штаммов микроорганизмов, которые наилучшим образом используют углеводороды нефти в качестве источника питания и энергии, а именно: №25, №16, №7, №30, №23, №3, №27, №14, №26, №29, №24. Номера штаммов микроорганизмов указаны в порядке убывания оптической плотности их культуральной жидкости.

Убыль углеводородного субстрата из среды.

Выявленный прирост биомассы у 11 из 30 штаммов исследуемых микроорганизмов по результатам проведенного опыта дает основания полагать, что выбранные штаммы активно использовали углеводороды нефти для собственного роста и развития и, как следствие, обладают деструктивным потенциалом.

Для подтверждения углеводородокисляющей активности выбранных штаммов была зафиксирована убыль углеводородного субстрата из среды гравиметрическим методом.

Для определения массы нефти, оставшейся по окончании культивирования, вычислялась разница между массой предварительно взвешенной пустой кюветы и массой этой же кюветы, содержащей экстрагированную нефть.

M₁ = m₂ - m₁, (1)

где m₁ - масса пустой кюветы, [мг];

m₂ - масса кюветы, содержащей экстрагированную нефть, [мг];

M₁ - масса нефти, оставшейся по окончании культивирования, [мг].

Так как опыт проводился в двукратной повторности, численные значения были усреднены для каждого исследуемого штамма.

Для определения количества разложившейся нефти вычислялась разница между массой нефти из контрольной пробирки и массой нефти, оставшейся по окончании культивирования.

M₂ = М_к - M₁, (2)

где М_к - масса нефти из контрольной пробирки, [мг];

М_к = m₂ - m₁ = 103,9 - 81,5 = 22,4 мг.

M₂ - масса разложившейся нефти, [мг].

Деструктивная способность исследуемых штаммов микроорганизмов выражалась в процентах убыли углеводородного субстрата из среды - M₂, %.

Таблица 4 - Промежуточные и итоговые данные по нахождению массы разложившейся нефти исследуемых образцов

№ штамма	m1, мг	m2, мг	M1, мг	M1ср., мг	M2, мг	M2, %
3	100,9	117,8	16,9	16,4	6,0	26,7
	99,3	115,2	15,9
7	100,6	116,0	15,4	14,3	8,1	36,2
	102,3	115,5	13,2
14	101,7	115,6	13,9	14,9	7,5	33,5
	103,5	119,3	15,8
16	99,3	116,4	17,1	17,0	5,4	24,1
	100,1	117,0	16,9
23	105,0	120,0	15,0	15,2	7,2	32,1
	100,4	115,7	15,3
24	101,9	117,4	15,5	14,3	8,1	36,2
	99,0	112,1	13,1
25	104,4	120,8	16,4	16,1	6,3	28,1
	100,8	116,5	15,7
26	102,4	116,2	13,8	14,9	7,5	33,5
	103,8	119,7	15,9
27	100,6	116,7	16,1	15,8	6,6	29,5
	101,3	116,7	15,4
29	103,7	115,4	11,7	13,8	8,6	38,4
	100,4	116,3	15,9
30	100,9	118,1	17,2	15,4	7,0	31,3
	102,8	116,5	13,7

Наибольшее значение М₂ соответствует наибольшему количеству углеводородов нефти, разложившихся до СО₂ и Н₂О, и деструктивной способности в целом. Деструктивная способность охарактеризована у следующих штаммов микроорганизмов: №29, № 7, №24, №14, №26, №23, №30, №27, №25, №3, №16. Номера штаммов указаны в порядке убывания их углеводородокисляющей активности.

По результатам данного опыта у 11 отобранных штаммов микроорганизмов, проявляющих наибольшую интенсивность роста, была подтверждена их углеводородокисляющая активность, выраженная в процентах убыли углеводородного субстрата из среды.

3.3.2 Результаты опыта по определению способности к продуцированию ауксинов по выявлению фитогормонов с использованием ВЭЖХ

11 отобранных в предыдущем опыте штаммов микроорганизмов подвергались предварительному анализу на определение их способности к продукции фитогормонов ауксинов.

Для выявления штаммов, отличающихся наиболее интенсивной способностью к продуцированию индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) был проведен сравнительный анализ с использованием реактива Сальковского на фотоэлектрическом колориметре. Контролем для сравнительного анализа служила питательная среда без внесения микроорганизмов с добавлением того же количества реактива Сальковского. Показания снимались при длине волны ?=540нм.

Таблица 5 - Оптическая плотность реакционной смеси исследуемых образцов

№ штамма	D540 (оптическая плотность)
3	0,134
7	0,380
14	0,052
16	0,002
23	0,005
24	0,039
25	0,001
26	0,005
27	0,008
29	0,006
30	0,061

Так как наибольшее значение оптической плотности соответствует наиболее яркому окрашиванию реакционной смеси, а значит и наиболее активному продуцированию ИУК, то по результатам эксперимента было отобрано 5 штаммов микроорганизмов отличающихся наиболее активным продуцированием ИУК: №7, №3, №30, №14, №24. Номера штаммов исследуемых микроорганизмов указаны в порядке убывания их активности продуцирования ИУК.

Рисунок 8 - Хроматограмма разделения ауксинов продуцируемых штаммом № 3

Отобранные штаммы подвергались дальнейшему исследованию на предмет определения точного количества продуцируемого фитогормона ИУК и некоторых его производных с использованием ВЭЖХ.

Рисунок 9 - Хроматограмма разделения ауксинов продуцируемых штаммом № 7

Рисунок 10 - Хроматограмма разделения ауксинов продуцируемых штаммом № 14



Рисунок 11 - Хроматограмма разделения ауксинов продуцируемых штаммом № 30

По окончании разделения и идентификации ауксинов, системой UPLC была произведена обработка данных, в результате которой нами были получены диаграммы хроматографии каждого исследуемого штамма микроорганизмов, позволяющие рассчитать точное количество продуцируемого ими основного фитогормона ИУК и его производных.

Обозначения принятые в рис.8-11:

EU - интенсивность флуоресценции (Emission Units - единицы эмиссии);

ILA - индолил-3-молочная кислота (ИМК);

ICA - индолил-3-карбоновая кислота (ИКК);

IAA - индолил-3-уксусная кислота (ИУК).

Для определения точного количества продуцируемых штаммами фитогормонов был использован стандартный раствор с заранее известной концентрацией ауксинов. В 5 мкл стандарта содержится: ИМК - 2,5·10^-6 нг; ИКК - 5·10^-5 нг; ИУК - 2·10^-5 нг.

Чтобы определить количество любого из трех ауксинов, содержащихся в одной единице эмиссии, нужно соотнести концентрацию ауксина стандартного раствора и площадь пика на диаграмме хроматографии этого же стандартного раствора. Как правило, эти данные так же заранее известны, таким образом:

k ИМК = 1,21·10^-7; k ИКК = 2,04·10^-6; k ИУК = 4,97·10^-8,

где k ИМК - количество индолил-3-молочной кислоты в 5мкл стандартного раствора отнесенное к одной единице эмиссии;

k ИКК- количество индолил-3-карбоновой кислоты в 5мкл стандартного раствора отнесенное к одной единице эмиссии;

k ИУК - количество индолил-3-уксусной кислоты в 5мкл стандартного раствора отнесенное к одной единице эмиссии.

Зная площадь пиков на диаграммах хроматографии исследуемых штаммов микроорганизмов, можно определить точное количество продуцируемых ими ауксинов:

ИМК=kИМКsИМК200; ИКК=kИККsИКК200; ИУК=kИУКsИУК200, (3)

где s ИМК, s ИКК, s ИУК - площадь пиков соответствующих ауксинов на диаграмме [EU²];

ИМК, ИКК, ИУК - количество соответствующих ауксинов исследуемого образца [нг/мл];

200 - кратность 1 мл к 5 мкл.

Таблица 6 - Количество ауксинов в 1 мл культуральной жидкости исследуемых образцов

№ штамма	s ИМК	s ИКК	s ИУК	ИМК, нг/мл	ИКК, нг/мл	ИУК, нг/мл	ИМК+ ИКК+ ИУК, нг/мл
3	5507205	3621342	87965148	133,3	1477,5	874,4	2485,2
7	142194628	5499558	300159765	3441,1	2243,8	2983,6	8668,5
14	44866130	3464215	30090478	1085,8	1413,4	299,1	2798,3
24	6429752	-	7595573	155,6	-	75,5	231,1
30	25577146	2626492	26488684	619,0	1071,6	263,3	1953,9

По результатам проведенного эксперимента видно, что штаммы №3, №14 и №30 наиболее активно продуцируют ИКК, в отличие от штамма №24, который ИКК не продуцирует, штамм №7 наиболее активно продуцируют ИМК, а штамм №24 - ИМК, нежели основной фитогормон ИУК. Штамм №7 наиболее активно продуцирует каждый из трех идентифицированных ауксинов. По количеству всех продуцируемых фитогормонов штаммы исследуемых микроорганизмов располагаются в следующей последовательности, начиная с наиболее активного продуцента: №7, №14, №3, №30, №24.

3.3.3 Результаты опыта по выявлению АЦК-утилизирующих микроорганизмов и активности продуцируемого ими фермента АЦК дезаминазы

Для выявления наиболее активных АЦК-утилизирующих бактерий по окончании культивирования была проведена сравнительная визуальная оценка интенсивности и особенности роста исследуемых штаммов микроорганизмов на разных питательных средах.

Оценка производилась на 5е сутки культивирования микроорганизмов.

Так как на среде без внесения источников азота наблюдался незначительный рост биомассы большинства из 11 исследуемых микроорганизмов, то предполагается, что минимальное количество азота попало в питательную среду из посторонних источников, например с внесением некоторых компонентов питания, в меньшей вероятности рост микроорганизмов на голодной среде объясняется их азотфиксирующими способностями.

Из 11 исследуемых штаммов микроорганизмов штаммы №24 и №25 проявили более интенсивный рост на среде с добавлением АЦК в качестве источника азота, по сравнению с ростом на положительном и отрицательном контроле. Отсутствие роста наблюдалось у штаммов №16, №23, №26 и №29.

По результатам данного эксперимента было отобрано 2 штамма микроорганизмов обладающих наиболее активной АЦК-утилизирующей способностью: №24 и №25. Они подвергались дальнейшему исследованию на предмет изучения активности продуцируемого этими бактериями фермента АЦК дезаминазы, разлагающего АЦК до ?-кетобутирата и аммония.

Активность фермента АЦК дезаминазы определяли биохимическим методом Салеха и Глика. Количество ?-кетобутирата, который образовывается при расщеплении бактериями АЦК, определяли спектрофотометрически при длине волны ? = 540 нм.

Оптическая плотность реакционной смеси штамма №24 D₅₄₀ = 0,71

Оптическая плотность реакционной смеси штамма №25 D₅₄₀ = 0,85

По численным значениям оптической плотности с помощью калибровочного графика была найдена концентрация ?-кетобутирата (С_{?-кетобутират}) в каждом из исследуемых образцов.

Штамм №24: С_{?-кетобутират} = 0,69±0,02 мкмоль/мл;

Штамм №25: С_{?-кетобутират} = 0,79±0,05 мкмоль/мл.

По результатам проведенного опыта штамм №25 является наиболее активным продуцентом АЦК дезаминазы из всех 11 исследуемых штаммов микроорганизмов.

3.3.4 Результаты опыта по определению способности микроорганизмов разлагать труднодоступные фосфаты

Для определения способности разлагать труднодоступные фосфаты и их ингибирующего действия на рост и развитие микроорганизмов была проведена визуальная сравнительная оценка прироста биомассы бактерий, выросших на среде с добавлением легкодоступного источника фосфора, и прироста биомассы бактерий, выросших на среде с труднодоступными фосфатами.

Если прирост биомассы бактерий, выросших на среде с добавлением труднодоступных фосфатов (фосфат и фитат Са), более интенсивен, чем прирост биомассы на среде с легкодоступным фосфатом (K₂HPO₄), то для этих бактерий фосфат и фитат Са не оказывают ингибирующего действия на их рост и развитие.

Разница между интенсивностью роста биомассы бактерий, культивированных на среде с добавлением K₂HPO₄, и интенсивностью роста бактерий, культивированных на среде с добавлением фосфата и фитата Са, в среднем была незначительной.

Штаммы микроорганизмов с более интенсивным ростом на среде с труднодоступными фосфатами, по сравнению с ростом на среде с добавлением K₂HPO₄: №7, №24, №27, №30. Остальные штаммы проявляли меньшую интенсивность роста, по сравнению с ростом на среде с добавлением K₂HPO₄, отсутствие роста наблюдалось у штаммов №3,№16,№23, №29.

По результатам визуального сравнения интенсивности роста микроорганизмов на разных средах можно сделать вывод, что у штаммов №7, №24, №27 и №30 трудноразлагаемые фосфаты не оказывают ингибирующего действия на их рост и развитие.

Для выявления штаммов микроорганизмов, отличающихся наиболее активной способностью растворять труднодоступные фосфаты, сравнивалась площадь зон просветления на питательных средах вокруг колоний бактерий выросших на 7е сутки культивирования.

На чашках Петри фиксировались диаметры зон просветления на питательной среде с добавлением Ca₃(PO₄)₂ (d₁) и на питательной среде с добавлением фитата Са (d₂).

Сравнивая численные значения d₁ и d₂ можно сделать вывод, что фитат Са - более труднодоступное соединение для микроорганизмов, чем Ca₃(PO₄)₂.

Таблица 7 - Диаметр зон просветления на питательных средах

№ штамма	d1, мм	d2, мм
3	-	-
7	7,6	5,8
14	4,3	-
16	-	-
23	-	-
24	10,2	9,4
25	6,4	-
26	-	-
27	5,1	-
29	-	-
30	7,4	5,9

Так как наибольшая площадь зоны просветления соответствует наилучшей способности к разложению труднодоступных фосфатов, то из 11 исследуемых штаммов микроорганизмов можно выделить 3 штамма, обладающих способностью к разложению труднодоступных фосфатов: №24, №7 и №30.

Выводы по работе

1. По результатам опыта по выявлению углеводородокисляющей способности из 30 исследуемых штаммов микроорганизмов было отобрано 11 штаммов отличающихся наиболее активной углеводородокисляющей способностью, а именно: №25 (Rhodococcus sp. 4n44), №16 (Micrococcus luteus 220), №7 (Rhodococcus erythropolis 401), №30 (Pseudomonas Aeruginosa 188), №23 (Bacillus pumilus 128), №3 (Rhodococcus fascians 394), №27 (Arthrobacter sp. D12str), №14 (Bacillus subtilis 440), №26 (Variovorax paradoxus 5p3), №29 (Вacillus subtilis niger 120), №24 (Variovorax paradoxus 5с2). Способность к биодеструкции углеводородов нефти была подтверждена экспериментальными данными выражающими убыль углеводородного субстрата из среды.

2. По результатам опыта по выявлению способности к продукции фитогормонов ауксинов наилучшие результаты показали штаммы №3 (Rhodococcus fascians 394), №7 (Rhodococcus erythropolis 401), №14 (Bacillus subtilis 440), №24 (Variovorax paradoxus 5с2), №30 (Pseudomonas Aeruginosa 188). Наилучшую продукцию ауксинов выявил штамм №7 (Rhodococcus erythropolis 401).

3. По результатам численных значений опыта на выявление АЦК дезаминазной активности наилучшим образом проявили себя штаммы №24 (Variovorax paradoxus 5с2) и №25 (Rhodococcus sp. 4n44).

4. При выявлении штаммов микроорганизмов обладающих способностью к разложению труднодоступных фосфатов были отобраны 3 из 11 исследуемых образцов: №7 (Rhodococcus erythropolis 401), №24 (Variovorax paradoxus 5с2), №30 (Pseudomonas Aeruginosa 188).

По результатам экспериментальной части всей исследовательской работы предоставляется возможность создания консорциума штаммов бактерий, обладающих несколькими или одним из ростстимулирующих свойств и углеводородокисляющей активностью, которые важны для разработки новых технологий фиторемедиации нефтезагрязненных почв, а именно: штаммы №7 (Rhodococcus erythropolis 401), №24 (Variovorax paradoxus 5с2) и №30 (Pseudomonas aeruginosa 188).

Считаю целесообразным проведение вегетационного опыта для определения эффективности выбранного консорциума штаммов при фиторемедиации нефтезагрязненных почв.

Список литературы

1. Шаркова С.Ю. Агрохимические свойства серых лесных почв при загрязнении их нефтью / С.Ю. Шаркова Е.В. Надежкина / Плодородие, 2008.- №4.- 45с.

2. Вальков В.Ф. Экология почв: Учебное пособие для студентов вузов Часть 3. Загрязнение почв / В.Ф. Вальков, К.Ш. Казеев, С.И. Колесников / Ростов-на-Дону: УПЛ РГУ, 2004. - 54 с.

3. Воеводина Л.А. О биологических методах мелиорации земель. / Л.А. Воеводина, О.В. Воеводин // Вестник государственного аграрного университета, Кубанский государственный аграрный университет, 2005. - № 13. - с. 71-77.

4. Емельянова, Е.К. Биорекультивация загрязненных нефтью объектов в Тюменской области / Е.К. Емельянова // Вестник Новосибирского государственного университета. Серия: Биология, клиническая медицина, 2010. - Т. 8, № 4, с. 155-161

5. Гриценко А.И. Экология. Нефть и газ / А.И. Гриценко, Г.С. Акопов, В.М. Максимов. - М.: Наука, 1997.-598 с.

6. Восстановление нефтезагрязнённых почвенных экосистем / Под ред. М.А. Глазковской.- М. Наука, 1988.- 264 с.

7. Шамаева А.А. Исследование процессов биоремедиации почв и объектов, загрязненных нефтяными углеводородами: Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биол. Наук: 14.11.2007 / Башкирский гос. унив-т.- Уфа.- 2007.

8. Панов Г.Е. Охрана окружающей среды на предприятиях нефтяной и газовой промышленности / Г.Е. Панов, Л.Ф. Петряшин, Г.Н. Лысяный. - М.: Недра, 1986.- 244 с.

9. Проскуряков В.А. Химия нефти и газа / В.А. Проскуряков.- СПб.: Химия, 1995. - с.448.

10. Андреева И.И. Ботаника: учеб для с/х вузов / И.И. Андреева, Л.С. Родман.- М.: Колос, 2005. - 528с.

11. Саксонов М.А. Экологический мониторинг нефтегазовой отрасли / М.А. Саксонов, А.Д. Абалаков, Л.В. Данько, О.А. Бархатова, А.Э. Балаян, Д.И. Стом // Физико-химические и биологические методы. - Иркутск: Иркут. Ун-т, 2005.-114 с.

12. Пиковский Ю.И. Проблема диагностики и нормирования загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами / Ю.И. Пиковский, А.Н. Геннадиев, С.С. Чернянский, Г.Н. Сахаров // Почвоведение.-№ 9.-2003.-с.1132-1140.

13. Колесниченко А.В. Процессы биодеградации в нефтезагрязненных почвах / А.В. Колесниченко, А.И. Марченко, Т.П. Побежимова, В.В. Зыкова.- Москва: «Промэкобезопасность», 2004. - 194 с.

14. Джамбетова П.М. Влияние нефтезагрязнений на морфологические и цитогенетические характеристики растений / П.М. Джамбетова, Н.В. Реутова, М.Н. Ситников // Экологическая генетика [электронный ресурс]: Рецензируемый научно-практический журнал.- СПб.- 2005.

15. Мазунина Л.Е. Особенности анатомии и морфологии растений в условиях нефтяного загрязнения / Л.Е. Мазунина М. : Изд-во ЛКИ, 2008. - 336 с.

16. Бочарникова Е.Д. Влияние нефтяного загрязнения на свойства серо-бурых почв Апшерона и серых лесных почв Башкирии / Е.Д Бочарникова // Автореф. Дис. … канд. биол. наук.- М.: 1990.-16 с.

17. Киреева Н.А. Рост и развитие растений яровой пшеницы на нефтезагрязненных почвах и при биоремедиации / Н.А. Киреева, А.М. Мифтахова, Г.М. Салахова // Агрохимия.- 2006.- №1.- с.85-90.

18. Левин С.В. Эколого-микробиологическое нормирование содержания нефти в почве / С.В. Левин, Э.М. Халимов, В.С. Гузев // Токсикологический вестник.-1995.- №1.- с. 11-15.

19. Мазунина Л.Е. Особенности анатомии и морфологии растений в условиях нефтяного загрязнения

20. Чупахина Г.Н. Адаптация растений к нефтяному загрязнению / Г.Н. Чупахина, П.В. Масленников // Экология.- 2004.- №5.-с.330-335.

21. Иерусалимский Н.Д. Исследование микрофлоры сточных вод нефтеперераба-тывающих предприятий / Н.Д. Иерусалимский, Е.А. Андреева, Е.Л. Гришанкова, Е.Л. Головлев, В.В. Дорохов, Л.Н. Жукова // Прикладная биохимия и микробиология. - 1965.- № 2.-с.163-166.

22. Киреева Н.А. Микробиологическая оценка почвы, загрязненной нефтяными углеводородами / Н.А. Киреева // Баш. Хим. ж.-1995.-2, № 3-4.-с. 65-68.

23. Киреева Н.А. Влияние загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами на численность и видовой состав микромицетов / Н.А. Киреева, Н.Ф Галимзянова // Почвоведение, 1995.- №2,- с.211-216.

24. Бабаев Э.Р., Преобразование нефти в процессе её микробиологической деградации в почве // Э.Р. Бабаев, Мовсумзаде М.Э. / Башкирский химический журнал, 2009. - Т.16. - №3. - С. 80-87.

25. Скрябин Г.К., Головлёва Л.А. Использование микроорганизмов в органическом синтезе / Г.К. Скрябин, Л.А. Головлёва М.:Наука, 1976. - 332 с.

26. Crawford R.L., Frick T.D. Purification and properties of gentisate-l,2-dioxygenase from Moraxella osloensis // Journal of Bacteriology. - 1975. - Vol. 121. - P. 794-799.

27. Gasellas, M., Grifoll M., Sebate J., Solanas A.M. Isolation and characterization of a fluorenone-

degrading bacterial strain and its role in synergistic degradation of fluorene by a consortium // Canadian journal of Microbiology. - 1998. - Vol. 44. - P. - 734-742.

28. Grifoll М., Gasellas М., Bayona J., Solanas A.M. Isolation and characterization of a fluorenedegrading bacterium: identification of ring oxidation and ring fission products // Applied and Environmental Microbiology. - 1992. - Vol. 58. - P. 2910-2917.

29. Kastner M., Breuer-Jammali M., Mahro H. Enumeration and characterization of the soil microflora from hydrocarbon-contaminated soil sites able to mineralize polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) //Applied Microbiology and Biotechnology. - 1994. - Vol. 41. - P. 267-273.

30. Kiyohara H., Nagao K., Nomi R. Degradation of phenanthrene through o-phthalic acid bv an

Aeromonas sp. // Agricultural and biological chemistry. - 1976. - Vol.40. - P. 1075-1082.

31. Kiyohara H., Nagao K. The catabolism of phenantrene and naphthalene by bacteria// Journal of

General Microbiology. - 1978. - Vol. 105. - P. 69-75.

32. Kiyohara H., Nagdd K., Yana K. Rapid screen for bacteria degrading water-insoluble, solid

hydrocarbons on agar plates // Applied and Environmental Microbiology. - 1982. - Vol. 43. - P. 454 457.

33. Samanta S.K., Singh О.V. Polycyclic aromatic hydrocarbons: environmental pollution and

bioremediation // Trends in Biotechnology. - 2002. - Vol. 20. - P. 243-248.

34. Sukplanga P., Thongmeea A., Velaa G. Roland. Degradation of Linseed Oil Vapors by Soil Bacteria in Trickling Biofilters // Bioremediation Journal. - 1999. -Vol. 3. - P. 189-200.\

35. Vetrova A.A., Ovchinnikova A.A., Puntus I.F, Filonov A.E., Boronin A.M. An enhanced biodegradation of crude oil by Psedomonas plasmid-bearing strains in model soil systems // Applied Biochemistry andтMicrobiology. - 2010. -Vol. 46. - P. 719-725.

36. Yamada К., Horiguchi S., Takahashi J. Studies on the utilization of hydrocarbons by microorganisms// Agricultural and biological chemistry. - 1965. - Vol. 29. - P. 943-948.

37. Crawford R.L., Frick T.D. Purification and properties of gentisate-l,2-dioxygenase from Moraxella osloensis // Journal of Bacteriology. - 1975. - Vol. 121. - P. 794-799.

38. Cerniglia СЕ. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons //Biodegradation. - 1992. -Vol. 3.- P. 351-368.

39. Bar-Ness E., Chen Y., Hadar Y. Siderophores of Pseudomonas putida as an iron source for dicot and monocot plants. Plant and Soil, 1991, 130: 231-241.

40. Becker D., Stanke R., Fendrik I. Expression of the NH4+-transporter gene LEAMT1:2 is induced in tomato roots upon association with N2-fixing bacteria. Planta, 2002, 215: 424-429.

41. Mantelin S., Touraine B. Plant growth-promoting bacteria and nitrate availability: impacts on root development and nitrate uptake. J. Exp. Bot., 2004, 55: 27-34.

42. Czarny J.C., Grichko V.P., Glick B.R. Genetic modulation of ethylene biosynthesis and signaling in plants. Biotech. Adv., 2006, 24: 410-419.

43. Glick B.R., Jacobson C.B., Schwarze M.M.K. 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acideaminase mutants of the plant growth promoting rhizobacterium Pseudomonas putida GR12-2 do not stimulate canola root elongation. Can. J. Microbiol., 1994, 40: 911-915.

44. Belimov A.A., Dodd I.C., Hontzeas N. Rhizosphere bacteria containing ACC deaminase increase yield of plants grown in drying soil via both local and systemic hormone signaling. New Phytol., 2009, 181: 413-423.

45. Glick B.R. Phytoremediation: synergistic use of plants and bacteria to clean up the environment. Biotech. Adv., 2003, 21: 383-393.

46. Safronova V.I., Stepanok V.V., Engqvist G.L. Root-associated bacteria containing 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase improve growth and nutrient uptake by pea genotypes cultivated in cadmium supplemented soil. Biol. Fertil. Soils, 2006, 42: 267-272.

47. Belimov A.A., Wenzel W.W. The role of rhizosphere microorganisms in heavy metal tolerance of higher plants. Aspe. Appl. Biol., 2009, 98: 81-90.

48. Belimov A.A., Dodd I.C., Safronova V.I. e.a. ACC deaminase-containing rhizobacteria improve vegetative development and yield of potato plants grown under water-limited conditions. Aspe. Appl. Biol., 2009, 98: 163-169.

49. Mayak S., Tirosh T., Glick B.R. Plant growth-promoting bacteria that confer resistance in tomato to salt stress. Plant Physiol. Biochem., 2004, 42: 565-572.

50. Bloemberg G.V., Lugtenberg B.J.J. Molecular basis of plant growth promotion and biocontrol by rhizobacteria. Curr. Opin. Plant Biol., 2001, 4: 343-350.

51. Duffy B., Keel C., Defago G. Potential role of pathogen signaling in multitrophic plant-microbe interactions involved in disease protection. Appl. Environ. Microbiol., 2004, 70: 1836-1842.

52. Van Loon L.C., Bakker P.A.H.M., Pieterse C.M.J. Systemic resistance induced by

rhizosphere bacteria. Annu. Rev. Phytopathol., 1998, 36: 453-483.

53. Lugtenberg B.J.J., Dekkers L., Bloemberg G.V. Molecular determinants of the rhizosphere olonization by pseudomonas. Annu. Rev. Phytopathol., 2001, 39: 461-490.

54. Кравченко Л.В., Азарова Т.С., Леонова-Ерко Е.И. и др. Корневые выделения томатов и их влияние на рост и антифунгальную активность штаммов Pseudomonas. Микробиология, 2003, 72(1): 48-53.

55. Simons M., Permentier H.J., De Weger L.A. e.a Amino acid synthesis is necessary for tomato root colonization by Pseudomonas fluorescens strain WCS365. MPMI, 1997, 10: 102-106.

56. Kuiper I., Bloemberg G.V., Lugtenberg J.J. Selection of a plant-bacterium pair as a novel tool for rhizostimulation of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria. MPMI, 2001, 14:

57. Кочергин И.Е., Ознобихин В.И., Савельев А.В. Опыт биоремедиации нефтезагрязненной почвы в рамках полевого эксперимента в условиях северного Сахалина / И.Е Кочергин, В.И. Ознобихин, А.В. Савельев / Сборник статей РЭА, №1, 2009, 84-96с.

58. Назаров А.В. Ризосферное микробно-растительное взаимодействие - основа новых биотехнологических методов восстановления нефтезагрязненных почв. / А.В. Назаров. Вестник Пермского научного центра. Пермь, 2011, № 4, 19-24.

59. Швец А.А. Фиторемедиация загрязненных нефтью почв в условиях северо-западного Кавказа: Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата с/х наук: 25.12.2009 / Кубанский гос. техн. унив-т.- Краснодар.- 2009.

60. Алиев С.А. Рекомендации по рекультивации нефтезагрязненных земель / С.А. Алиев, Гвозденко Д.В., Бабаев М.П., Гаджиев Д.А.- Баку: Элм, 1981.-26 с.

61. Колесниченко А.В. Процессы биодеградации в нефтезагрязненных почвах / А.В. Колесниченко, А.И. Марченко, Т.П. Побежимова, В.В. Зыкова.- Москва: «Промэкобезопасность», 2004. - 194 с.

62. Коронелли, Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде (обзор) / Т.В. Коронелли // Прикладная биохимия и микробиология.-1996.- 32, № 6.- с.579-585.

63. Логинов О.Н. Биотехнологические методы очистки окружающей среды от техногенных загрязнений / О.Н. Логинов, Н.Н, Силищев, Т.Ф. Бойко, Н.Ф. Галимзянова.-Уфа: Гос. изд. научно-тех. литературы «Реактив», 2000. - 100 с.

64. Сидоров Д.Г. Полевой эксперимент по очистке почв от нефтяного загрязнения с использованием углеводородокисляющих микроорганизмов / Д.Г. Сидоров, И.А. Борзенков, Р.Р. Ибатулин, Е.И. Милехина, И.Т. Храмов, С.С. Беляев, М.В. Иванов // Прикладная биохимия и микробиология.- 1997.- Т.33, №5.- с.497-502.

65. Шаркова С.Ю. Агрохимические свойства серых лесных почв при загрязнении их нефтью / С.Ю. Шаркова Е.В. Надежкина // Плодородие.- 2008.- №4.-с.45.

66. Оборин А.А. Нефтезагрязненные биогеоценозы (процессы образования, научные основы восстановления, медико-экологические проблемы): монография / А.А. Оборин. - Пермь, 2008. - 511 с.

Размещено на Allbest.ru