Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Академия экологии, морской биологии и биотехнологии

Отделение экологии

Кафедра общей экологии

Курсовая работа, 3 курс

Научный руководитель:

к. б. н., доцент кафедры общей

экологии ДВГУ, И. П. Безвербная

ЛЕТЯГИНА АЛЕНА ВАСИЛЬЕВНА

Владивосток

2008

Содержание

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Литературный обзор

1.1 Микробиологические исследования переноса чужеродных микроорганизмов с судовым балластом

1.2 Формы существования микроорганизмов в водных микробных сообществах, методы их анализа и количественного учета

1.3 Сохранение и изменение патогенных свойств микроорганизмов в водной среде

ГЛАВА 2. Материалы и методы

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Одной из серьезных экологических проблем является проблема биологической инвазии. То есть вселение, несвойственных данной акватории, организмов в новые местообитания. Одним из способов попадания микроорганизмов в новые акватории осуществляется путем их сбрасывания с балластными водами. Чужеродные организмы могут перемещаться через океаны в водяном балласте судов, адаптироваться к новым условиям и в результате создавать значительные проблемы для морской среды, государственного имущества и здоровья человека. В забортной воде могут содержаться различные живые существа - от бактерий и мелких водорослей до моллюсков, медуз и даже небольших рыб. Эти живые существа попадают на борт судна в порту выгрузки, путешествуют вместе с судном на многие тысячи морских миль и сбрасываются за борт в порту погрузки.

Одним из путей попадания чужеродных морских организмов в акватории портов является транспортировка их с балластными водами. В частности это характерно и для портов города Владивосток. Природные воды могут загрязняться микроорганизмами кишечной группы (холерный вибрион, бациллы брюшного тифа, паратифов, дизентерии), лептоспирами (возбудителями инфекционной желтухи, водяной лихорадки), возбудителями туляремии, бруцеллеза, некоторыми вирусами (Коксаки, ЕСНО, полиомиелита, трахомы и др.). Следует отметить, что вредными могут являться в данных обстоятельствах не только возбудители инфекций, но и вполне мирные в своей нормальной среде обитания существа (Сагайдак, 2003).

Микроорганизмы обладают уникальной способностью к адаптации. Для них характерна высокая экологическая пластичность и способность сохранять свою жизнеспособность в широком диапазоне различных абиотических факторов -- влажность, температура, органический состав, рН и др. (Бухарин, Литвин, 1997). Благодаря чему риск загрязнения акваторий портов возрастает. Микроорганизмы вступают в сложные отношения с другими обитателями экосистем. Отсюда их способность вырабатывать субстанции, которые называются «факторами патогенности». Борьба с переносом водных организмов с водяным балластом является большой и трудной задачей.

В настоящее время еще не приняты международные правила по контролю над переносом и внесением вредных водных и патогенных организмов посредством водяного балласта судов. Микроорганизмы, транспортируемые с балластными водами могут находиться в трех формах: в планктонной, в осадках и биопленках. Остается проблемой оценка количества и особенностей этих микроорганизмов. Методы отбора и микробиологического анализа балластных вод до сих пор недостаточно разработаны. Кроме того, в Приморье, где функционируют несколько крупных портов, деятельность которых связана с экспортом грузов, до сих пор не проводилось изучение переноса микроорганизмов с судовым балластом. В связи с этим актуальным является проведение поисковых микробиологических исследований для анализа ситуации с переносом микроорганизмов в балластных танках судов и подбор методик для выполнения последующих масштабных мониторинговых исследований.

Поэтому целью курсовой работы было: подобрать методы и провести микробиологический анализ балластных вод, отобранных на судах, работающих на наиболее интенсивных судоходных линиях. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) изучить существующие методы оценки численности и состава планктонных микробных сообществ, сообществ осадков и биопленок, в которых могут существовать микроорганизмы в балластных танках судов;

2) проанализировать литературные данные о микробиологических исследованиях проб из балластных танков судов;

3) изучить известные факты и условия проявления микроорганизмами, изолированными из водной среды, патогенных свойств;

4) выполнить микробиологический анализ проб балластной воды и составить коллекцию штаммов для последующих исследований.

ГЛАВА 1. Литературный обзор

1.1 Микробиологические исследования переноса чужеродных микроорганизмов с судовым балластом

Вселение опасных морских видов с балластными водами судов в новую окружающую среду, было идентифицировано как одна из четырех самых больших угроз океанам в мире. Другие три - наземные источники морского загрязнения, чрезмерное использование морских ресурсов и физическое изменение/разрушение морской среды обитания (Сообщение №4 AGPS, 1993).

У привнесенных водных видов есть потенциал вызывать крупные экологические и экономические изменения (Carlton et. al., 1990; Mills et. al., 1993) и микробные компоненты могут представлять опасность для здоровья человека (McCarthy, Khambaty, 1994; Hallegraeff, 1998). Главное направление в мировом транспорте чужеродных водных видов - это перенос их с балластными водами, сбрасываемыми с судов (Carlton, 1985; Ruiz et. al., 1997). Например, известно, что Соединенные Штаты Америки ежегодно получают более 79 млн. тонн балластных вод из-за границы (Carlton et. al., 1995). Когда суда берут воду в одном порту и сбрасывают в другом, балластные воды могут включать в себя различный состав планктона, нектона и бентоса (Carlton, Geller, 1993; Lavoie et. al., 1999).

Исследование балластных вод сосредоточилось в значительной степени на многоклеточных, однако в изобилии среди водных организмов находятся микроорганизмы. Было подсчитано, что бактерии и вирусы естественного происхождения в прибрежных водах имеют высокие концентрации (Ducklow, Shiah, 1993; Wommack, Colwell, 2000). Учитывая такой удельный вес, высокую репродуктивную способность и широкий диапазон устойчивости к физическим факторам - микроорганизмы являются частыми захватчиками прибрежных экосистем (Ruiz et. al., 2000).

Исследования микроорганизмов в балластных водах были ограниченны до настоящего времени и сосредоточились главным образом на Vibrio cholerae (McCarthy, Khambaty, 1994), динофлагелятах (Hallegraeff, 1993, 1998) и протистах (Galil, Hulsmann, 1997). Примером наиболее вероятного транспорта с балластными водами, среди микроорганизмов, является Vibrio cholerae O1. Этот вид вызывает у человека заболевание холеры. В 1991 Vibrio cholerae был найден в устрицах и кишечнике рыб в заливе Mobile Bay, Алабама (DePaola et. al., 1992). Этот вид Vibrio cholerae не отличался от вида, отвечающего за эпидемию холеры в Латинской Америке, которая была в это же время. Когда же балластные воды судов, покинувших Латинскую Америку и прибывших в Mobile Bay, были проверены на бактерию холеры, то было обнаружено, что они содержали вызывающий эпидемию вид Vibrio cholerae (McCarthy et. al., 1992). Это предполагает, что балластная вода способствовала вселению в прибрежные воды залива Соединенных Штатов вызывающего эпидемию вида. Впоследствии, Береговая охрана Соединенных Штатов организовала Международную Морскую организацию по контролю за Балластными водами. Моряки предпринимают меры по снижению распространения патогенных микроорганизмов в балластных водах (Federal Register 1991).

Сейчас единственный широко распространенный метод для управления распространением чужеродных водных микроорганизмов - это обмен балластными водами открытого океана. Эта процедура заключается в том, что судно, которое взяло балластную воду в прибрежном порту, сбрасывает эту воду в открытом океане и заменяет ее океанической водой. В свою очередь эта океаническая вода выпускается в следующем порту захода. Уменьшая плотность прибрежных организмов, и заменяя их океаническими видами, процент успеха вторжения микроорганизмов теоретически ниже. Различия между океанической водой и водой в порту получения, где происходит ее сбрасывание, обеспечивают большую вероятность гибели океанических видов (Smith et. al., 1999).

Однако есть несколько проблем с этой обменной процедурой; в первую очередь опасность для судна и команды из-за волнений в море или вследствие выполнения процедуры ненадлежащим образом. Кроме того, много судов предпринимают только частичный обмен (Carlton, 1995); даже когда обмен предпринят, это не всегда полностью эффективно (Zhang, Dickman, 1999), так как осадок в основании резервуаров судов не может быть полностью удален во время обмена (Williams et. al., 1988). Наконец, изменения в солености воды могут немного затронуть микроорганизмы и особенно их покоящиеся стадии, или вообще никак на них не повлиять.

Объемы переноса бактерий и степень их выживаемости в новой среде могут быть значительными. Так, например, анализ результатов микробиологических исследований БВ и осадков 69 судов, прибывающих в Чесапикский залив (США), и экстраполяция экспериментальных данных показали, что в заливе ежегодно выживает до 1018-1019 клеток бактерий, перенесенных с балластом (Drake et. al., 2007).

Неоднократно также сообщалось о выявлении и высокой выживаемости патогенных и условно-патогенных бактерий в пробах из балластных танков судов, в частности, энтерококков, Listeria monocytogenes, Aeromonas spp., Providencia rettgeri, Salmonella spp., Escherichia coli и других представителей сем. Enterobacteriaceae, Mycobacterium spp., Clostridium perfingens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putrefaciens, Vibrio algynolyticus, Vibrio cholerae, Vibrio spp. (Burholder et. al., 2007; Dobbs et. al. 2003; Drake et. al., 2003; Ivanov, 2006; Knight et. al., 1999; Whitby et. al., 1998).

Томсон с соавторами показали высокий уровень антибиотикорезистентности среди патогенных бактерий, обнаруженных в БВ и опасность этих особенностей превносимых бактерий для сообществ Чесапикского залива (США) (Thomson et. al., 2003).

В настоящее время сведений о микроорганизмах балластных вод не так уж и много, универсальных методов анализа и количественного учета не разработано. Известно, что микроорганизмы могут сохраняться в балластных танках в воде, в осадках и в виде биопленок. Каждое из этих типов сообществ - специфично, для каждого существуют свои методы и особенности исследования.

1.2 Формы существования микроорганизмов в водных микробных сообществах, методы их анализа и количественного учета

микроорганизм водный патогенный перенос

Микробные сообщества в воде могут находиться в различных видах. Они могут быть в планктонной форме, в виде биопленок или в осадках.

Биопленки. Микроорганизмы предпочитают жить, будучи прикрепленными к твердой поверхности, нежели свободно плавающими - как в водной среде, так и в воздухе. Они организованы в так называемые биопленки (Biofilm), сбалансированные по видовому составу и функциональному распределению членов сообщества. Микроорганизмы в биопленке существуют и ведут себя не так, как свободно плавающие бактерии.

Это взаимодействующая общность разных типов микроорганизмов, которые сгруппированы в микроколонии, окруженные защитным матриксом. Матрикс пронизан каналами, по которым циркулируют питательные вещества, продукты жизнедеятельности, ферменты, метаболиты и кислород. Все микроколонии имеют свои микросреды, отличающиеся уровнями рН, усваиванием питательных веществ, концентрациями кислорода. Бактерии в биопленке общаются между собой посредством химических раздражений (сигналов). Микроорганизмы в биопленке более устойчивы к антибиотикам, антимикробным средствам и другим активным агентам.

В биопленке по-иному, в сравнении с чистыми культурами бактерий, происходят их многочисленные физиологические процессы, в том числе продукция метаболитов и биологически активных веществ. Сообщество организует единую генетическую систему в виде плазмид - кольцевых ДНК, несущих поведенческий код для членов биопленки, определяющих их пищевые (трофические), энергетические и другие связи между собой и внешним миром. Реакция микроорганизмов на изменение условий окружающей среды в биопленке существенно отличается от реакции каждого отдельного вида в монокультуре. Такая организация обеспечивает ее физиологическую и функциональную стабильность и, следовательно, является залогом конкурентного выживания в экологической нише.

Микроорганизмы в донных осадках. Важнейшая из экологических зон - это водное пространство или пленка на поверхности донных осадков, где происходит массовое развитие фототрофных сообществ и осуществляется первичная продукция органического вещества. Продукция органического вещества в результате фотосинтеза является необходимым условием обеспечения жизни в водоеме. Конечные продукты фотосинтеза обычно имеют большую молекулярную массу. К этой группе веществ относят углеводы, пептиды, целлюлоза, растворимые и летучие вещества - прямые субстраты для роста микроорганизмов, а также ряд веществ ингибиторов или стимуляторов роста. Осадки характеризуются присутствием форм, способных к скользящим движениям, либо прикрепленным к субстрату. К их числу относят многие цианобактерии, диатомеи, зеленые фототрофные нитчатые бактерии, флексибактерии, нитчатые серные бактерии (Нетрусов А.И., Бонч-Осмоловская Е.А. и др., 2004). В балластных водах микроорганизмы могут содержаться в донных осадках.

Микроорганизмы в планктонной пленке. Поверхностная пленка воды характеризуется обилием питательных веществ, преимущественно липидов, которые вследствие высокого поверхностного натяжения накапливаются здесь из водной массы и из воздуха. Поверхностная пленка представляет собой аналог твердого субстрата, к которому прикрепляются в массовом количестве микроорганизмы.

В создании первичной продукции Мирового океана значительную роль играет фотосинтез пикопланктона. Для него характерны некоторые виды цианобактерий, фотосинтезирующие зеленые серобактерии.

Методы количественного учета микроорганизмов.

О росте микроорганизмов в естественных субстратах или в питательных средах судят по изменению количества их клеток или биомассы в единице объема. Методы определения этих показателей могут быть прямыми (подсчет клеток под микроскопом, взвешивание) или косвенными. Косвенные методы основаны на измерении параметров, величина которых зависит от количества или биомассы микроорганизмов (число колоний, выросших после посева суспензии клеток на питательную среду, рассеяние или поглощение суспензией света, содержание в ней белка и т.д.). Выбор метода зависит от целей исследования, свойств питательной среды или субстрата, а также особенностей роста и морфологии микроорганизмов.

Большинство микроорганизмов, растущих в природных образцах, еще ждут своей очереди быть выделенными в чистые культуры. По некоторым оценкам, можно культивировать меньше 0,1% всего микробного разнообразия.

Десятки тысяч видов микроорганизмов нуждаются в выделении и идентификации. Хотя многие из таких микроорганизмов относятся к так называемым «некультивируемым» и, таким образом остающимся недоступным классическим микробиологическим методам идентификации, существует несколько способов, позволяющих оценить их разнообразие и распространение.

Культивируемые микроорганизмы обладают способностью к росту на плотных и жидких питательных средах (Нетрусов А.И., Егорова М.А. и др., 2005); а некультивируемые - организмы, которые не прорастают на обычно пригодных для них средах. Эта категория относится к физиологическому состоянию известных организмов, а не организмам, для которых не подобраны методы культивирования (Заварзин Г.А., Колотилова Н.Н., 2001).

Поэтому выделяют следующие методы количественного учета для некультивируемых форм:

Определение количества клеток микроорганизмов под микроскопом. Метод позволяет определить общее количество клеток в единице объема (как живых, так и мертвых). Основное ограничение метода -- необходимость довольно высоких концентраций клеток в единице исследуемого субстрата.

1. Подсчет клеток в счетных камерах. Это метод рекомендуется использовать для подсчета некоторых относительно крупных бактерий.

2. Капиллярный метод прямого счета микроорганизмов. Позволяет подсчитывать мелкие микроорганизмы. Применяется для подсчета микробных клеток и контроля роста бактерий.

3. Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках (метод Виноградского--Брида). Этот метод применяется в различных модификациях для определения численности микроорганизмов в разнообразных естественных субстратах. Преимущество метода заключается также в том, что фиксированные окрашенные препараты могут долго храниться.

4. Подсчет клеток на мембранных фильтрах. Данный метод рекомендуется использовать для определения численности микроорганизмов в субстратах с низкой плотностью клеток.

При выявлении и количественном учете микроорганизмов широко применяют люминесцентную микроскопию. Люминесцентная микроскопия дает также возможность выявить и оценить в исследуемой пробе численность отдельных групп микроорганизмов (Нетрусов А.И., Егорова М.А. и др., 2005).

Методы количественного учета для культивируемых форм:

Определение числа клеток микроорганизмов высевом на питательные среды. В отличие от подсчета микроорганизмов под микроскопом этот метод дает возможность определить только число жизнеспособных клеток в популяции. Поскольку сред, пригодных для роста всех микроорганизмов, не существует, метод высева дает возможность определить лишь число микроорганизмов, способных расти на среде данного состава, причем не позволяет учесть те микроорганизмы, которые не растут (например, так называемые жизнеспособные, но не культивируемые формы) или растут очень медленно.

1. Определение количества клеток высевом на плотные питательные среды (метод Коха). Метод широко применяют для определения численности жизнеспособных клеток в различных естественных субстратах и в лабораторных культурах. В его основе лежит принцип Коха, согласно которому каждая колония является потомством одной клетки.

2. Определение количества клеток высевом в жидкие среды (метод предельных разведений). Метод используют для подсчета микроорганизмов, которые плохо или совсем не растут на плотных питательных средах.

Определение биомассы взвешиванием. Этот метод широко применяют для оценки роста микроорганизмов в жидких питательных средах. Можно использовать его и для определения массы клеток, выращенных на плотной питательной среде.

Определение количества клеток и биомассы нефелометрическим методом. Позволяет быстро и довольно точно определить концентрацию клеток в суспензии или культуральной жидкости. Нефелометрический метод пригоден лишь для тех микроорганизмов, рост которых вызывает равномерное помутнение среды и не сопровождается заметным изменением формы и размеров клеток, образованием мицелия, пленок или других скоплений (Нетрусов А.И., Егорова М.А. и др., 2005 ).

Кроме количественного учета микроорганизмов, чрезвычайно важно анализировать качественный состав микробного сообщества, который может указать на роль и потенциал микробоценоза в экосистемах. Существует несколько различных методов анализа структуры микробного сообщества:

1. Структура сообществ на основе липидного анализа. Информация, полученная с помощью липидного анализа, позволяет частично проникнуть внутрь микробного сообщества. ЖК образцы из природных микробных сообществ представляют в основном широкий спектр сложных молекул в которых эти образцы ЖК обеспечивают количественный анализ, но интерпретация отдельных специфических компонентов сообщества может быть трудной. Количественные сравнения суммарных образцов ЖК могут дать информацию о структуре сообщества в целом, но не могут обеспечить более детальный анализ на уровне (внутри) отдельных специфических микробных групп.

Анализ содержания специфических липидных биомаркеров не может определить каждый вид микроорганизмов в природных образцах, т.к. много видов имеют сходный ЖК состав. Некоторые специфические группы микроорганизмов, однако, имеют характерный специфический ЖК профиль.

Липидный анализ может быть чрезвычайно полезен, когда основные физические параметры или экология системы известны. В особенности, ЖК анализ обеспечивает оценку гетерогенности образцов или гетерогенность внутри образца и оценку структуры сообществ. Липидный анализ дает такую информацию о сообществах, которую невозможно получить другими методами.

2. Структура сообществ на основе анализа нуклеиновых кислот. Анализ ДНК в образцах был использован успешно для усиления ЖК анализа.

Такой подход позволяет определить физиологический потенциал микробного сообщества. По сравнению с ЖК анализом это более детальный подход для изучения структуры микробных сообществ, он представляет собой комбинацию следующих методов: амплификацию с помощью ПЦР, следующие затем денатурирующий градиентный гель электрофорез (DGGE) или температурный градиентный гель электрофорез (TGGE) - анализ генов рРНК.

Сочетание ЖК анализа и анализа НК может быть очень полезным для характеристики биомассы и структуры микробного сообщества. Липидный анализ является показателем фенотипических свойствам сообщества, которые показывают существующую в настоящий момент микробиологическую активность, скорость роста, действие токсикантов, несбалансированный рост, дефицит некоторых питательных веществ, метаболический баланс между аэробами и анаэробами, в то время как анализ НК позволяет более детально оценить структуру и физиологический потенциал микробного сообщества.

3. BIOLOG. Автоматизированная система идентификации микроорганизмов, основанная на аэробной метаболической активности, используется для определения сравнительной структуры микробных сообществ. Система основана на оценке дифференциальной бактериальной метаболической активности в отношении 92 углеродсодержащих субстратов и может показать различия в метаболизме микробных сообществ.

Структура сообществ на основе анализа изолированных штаммов. Для идентификации культивируемых микроорганизмов в настоящее время широко используется анализ содержания distinctive ester-linked FA (преимущественно для фосфолипидов и липополисахаридов клинических изолятов). Образцы уникальных (выдающихся ЖК из микроорганизмов, выращенных на стандартной среде используются для дифференцировки более чем 2000 организмов с использованием стандартной системы MIDI идентификации (MIDI, Newark, Del.). Использование этой системы требует предварительной изоляции и культивирования штаммов. Как результат этого, некультивируемые организмы, составляющие значительную часть микробного сообщества не могут быть идентифицированы(Hurst, 2002).