Исследование токсикологических характеристик новых высокомолекулярных флокулянтов

В эксперименте использовали вытяжки с pH = 6,5 - 7,5, имитирующие кислые атмосферные осадки. Водные вытяжки для образцов с добавкой шлама в количестве 0 - 4,5 мас. % острой токсичностью не обладают, так как гибель рачков менее 50 % [48].

Глава II. Экспериментальная часть

2.1 Подготовка исходных реагентов и растворителей

Ацетон - сушили над CaCl2, а затем кипятили над оксидом фосфора (Р2 О5) в течение двух часов и дважды перегоняли над Р2 О5, Ткип = 560С,

n = 1.3550.

Этанол абсолютный. Этанол (ректификат) восемь часов кипятили над свежепрокаленным оксидом кальция (на 1 литр этанола 200г СаО), затем смесь 5г магниевых стружек, 0.5г сублимированного йода и 75 мл спирта, высушенного над СаО, кипятили с обратным холодильником до полного превращения Мg в этилат магния. В реакционную колбу добавляли остальное количество спирта, раннее обработанного СаО, кипятили смесь в течение 2х часов, и отгоняли спирт.

Диэтиловый эфир сушили над щелочью и дважды перегоняли над металлическим натрием. Отогнанный эфир хранили над натрием, Ткип = 34-350С.

Акриламид- CH2=CH-CONH2 использовали фирмы "Mitsubishi Chem. Ind. Ltd" (Япония) с Тпл = 84,5°С.

Пропанол - сушили над CaО и перегоняли.

Метанол марки «х.ч.», Ткип. = 64.5-65.00С.

Гидроксид натрия, хлорид натрия, серная кислота марки «х.ч.»

Гидрохлорид гуанидина (ГГХ) «х.ч».

Инертный газ-аргон (о.с.ч).

Во всех опытах использована бидистиллированная вода, рН 7.

Очистка инициатора Персульфат аммония (ПСА) (NH4)2S2O8, µ-пероксо-бис (тетраоксосульфат) аммония, “ч.д.а.”, перекристаллизовывали из бидистиллированной воды несколько раз, затем высушивали в вакууме до постоянного веса.

2.2 Синтез мономерной соли на основе метакриловой и акриловой кислоты и гуанидина

а) Получение этилата натрия.

В трехгорлую колбу (объемом 2л) снабженную мешалкой и обратным холодильником, помещали необходимое количество абсолютированного этилового спирта (500 мл) и при непрерывном перемешивании понемногу добавляли металлический натрий (1 моль) в течение двух часов. После добавления всего натрия, реакционную массу перемешивали еще 1 час до полного растворения натрия.

б) Получение гуанидина.

В полученный раствор этилата натрия при перемешивании порциями добавляли эквимольное количество (1 моль) ГГХ. Реакционный раствор перемешивали в течение 4 часов и оставляли в холодильнике на ночь. На следующий день раствор гуанидина отфильтровывали от выпавшего осадка хлорида натрия.

в) Получение метакрилата и акрилата гуанидина (МАГ, АГ).

Полученный накануне реакционный раствор гуанидина помещали в колбу снабженную мешалкой, термометром, капельной воронкой. После охлаждения раствора гуанидина до - 10 - 6 0С при перемешивании прикапывали метакриловую или акриловую кислоту в течение двух часов. Скорость подачи регулировали так, чтобы температура в реакционной массе не превышала -5 - 0 0С. Для отвода избыточного тепла применяли охлаждающую баню из смеси ацетона и сухого льда. После прикапывания всего количества метакриловой или акриловой кислоты, рН реакционного раствора был близок к 7.

Раствор перемешивали еще 4 часа при комнатной температуре, после чего колбу с продуктом реакции помещали в холодильник на несколько суток.

Полученный прозрачный раствор мономерной соли в этаноле высаживали в 10 кратный избыток абсолютированного эфира. Выпавшие белые игольчатые кристаллы МАГ или АГ отфильтровывали через плотный стеклянный фильтр, многократно промывали абсолютным эфиром и сушили в вакууме при комнатной температуре. Выход МАГ 70-75%, выход АГ 80-85 %.

Затем синтезированные соли подвергали двукратной перекристаллизации из смеси абсолютного спирта и ацетона 10:90.

Структура и состав всех синтезированных мономерных солей были подтверждены совокупностью различных физико-химических методов анализа: ЯМР и ИК-спектроскопия, элементный анализ, Т.пл..

2.3 Синтез сополимеров

Синтез полимеров и сополимеров производили по типичной методике радикальной полимеризации в ампулах. Предварительно приготовленные растворы мономеров и инициатора переносили в ампулу, которую вакуумировали трижды замораживая и дегазируя, после чего ампулы отпаивались и помещались в термостат для проведения гомо(со)полимеризации.

2.4 Биологические тест-объекты и показатели, используемые при установлении эколого-токсикологических нормативов

Объекты и показатели, используемые при установлении эколого-токсикологических нормативов

Тест-объект	Тест-параметр
	Основной	Вспомогательный
Организмы-редуценты	Бактериальная микрофлора	Численность клеток. Дыхание (по БПК). Концентрации кислорода, аммиака, нитритов, нитратов
Организмы-продуценты	Водоросли	Общая численность клеток, рН среды, концентрация кислорода, соотношение живых и мертвых клеток	Биомасса. Содержание пигментов. Интенсивность фотосинтеза
	Макрофиты	Выживаемость, рост стебля, отростков, корней	Интенсивность фотосинтеза
Зоопланктон	Инфузории	Выживаемость, размножение	Поведение
	Ракообразные	Выживаемость, плодовитость, численность и возрастной состав модельных популяций	Морфологические изменения
Зообентос	Моллюски	Выживаемость, плодовитость, питание, масса	Поведение. Морфологические изменения. Потребление кислорода
	Хирономиды	Выживаемость на различных стадиях и сроки их прохождения. Морфологические аномалии. Плодовитость	Поведение, вес и общее состояние личинок и имаго
Рыбы	Эмбриогенез	Выживаемость эмбрионов. Выклев и состояние предличинок	Аномалии развития. Биохимические отклонения
	Взрослые	Выживаемость, масса тела, анатомические и клинические изменения, питание, частота дыхания, органолептика мяса, кумуляция	Поведение. Биохимические изменения

2. 5 Методики биотестирования

Методика Н.С. Строганова [51]

Основные положения:

Острый опыт. Предлагаемый метод позволяет определить острую токсичность:

а) сточных вод отдельных цехов предприятий, включая условно-чистые воды;

б) сточных вод на разных этапах очистки;

в) очищенных сточных вод при сбросе в водоем;

г) химических веществ.

Дафнии позволяют определить как качество природных вод, так и токсичность стоков. Показателем острой токсичности является гибель 50% и более дафний в анализируемой воде по сравнению с контролем в течение 24, 48 и 96 часов. Для определения качества природных вод ставятся хронические опыты по методике Л.А.Лесникова длительностью 10-15 суток.

Методика Л.А. Лесникова [49]

Отобранные пробы воды фильтруются через мельничный газ. Опыты можно ставить только после выравнивания температур в пробах и маточной культуре дафний. В каждую пробу с 0,3 л воды помещается по 10 дафний возрастом 6 суток. В течение опыта регулярно, (один раз в двое суток) под бинокуляром отмечается их состояние. Длительность опытов не менее 10суток. В пробы воды корм не добавляется. В ходе опыта воду не заменяют, молодь не удаляют. При просмотрах у дафний регистрируются: размеры (в делениях окулярмикрометра), состояние гонад и эмбрионов в выводковых камерах, их число, окраска тела, наличие и цвет капель жира, наполненность кишечника и его содержимого. У погибших и иммобилизованных дафний регистрируются симптомы гибели (тетаническое сокращение мышц туловища, судорожное опорожнение кишечника, побеление участков тела, яиц или эмбрионов и т.п.).

Результаты опытов позволяют в основном качественно судить о характере изменения условий в водоеме. В качестве руководства в первом приближении можно использовать прикладываемую к методике определительную таблицу, составленную на основании анализа результатов опытов с разными веществами.

Определительная таблица токсического действия веществ и физиологического состояния дафний.

1(2,3) Дафнии гибнут все в течение первых 4 суток. Острое летальное действие 4

2(1,3) Дафнии постепенно гибнут все или частично в сроки от 4 до 15 суток. Хроническое летальное действие 14

3(1,2) Дафнии не гибнут за срок до 15 дней или гибнут отдельные особи. Явной закономерности в сроках их гибели не обнаруживается 19

4(5,6,7) У иммобилизованных дафний исчезают капли жира, окраска тела снижается до 1 балла, наблюдаются (сохраняются) следы перистальтики кишечника, подергивание мышц плавательных антенн, иногда редкие сокращения сердца 8

5(4,6,7), Дафнии скапливаются у поверхности воды в сосуде, окраска тела становится 3м-5м (наблюдается помутнение), погибшие особи либо остаются у поверхностной пленки, либо падают на дно; отдельные мышцы погибших дафний вздрагивают у почти разложившихся особей, туловище у погибших дафний часто и выдвинуто далеко вниз через щель раковины. Гибель наступала от резкого дефицита кислорода (меньше 0,5 мг/л)

6(4,5,7) Наблюдается помутнение плазмы клеток сначала в жаберных отростках ног, затем всего туловища. 12

7(4,5,6) У дафний наблюдается судорожное сокращение мышц туловища, сопровождающееся выдавливанием части яиц или эмбрионов из выводковой камеры. Иногда при этом наблюдается судорожное опорожнение кишечника. Действие органических токсичных веществ с раздражающим типом действия: ряд циклических соединений, например фенолы, и другие, как формалин, нефтепродукты и т. п.

8(9) Дафнии сначала роятся в одном углу сосуда, кувыркаются, затем становятся вялыми и все чаще ложатся на дно. Фильтровальный аппарат их ничем не забит, кишечник либо пуст, либо имеет следы содержимого (баллы 1 и 2). Число яиц в выводковой камере сокращается вплоть до нуля. Развитие отложенных яиц протекает нормально. Дафнии голодают. Действие воды, взятой с олигосапробного участка водоема.

9(8) Фильтровальный аппарат дафний забит сгустками или слизью, животные ложатся на дно. При искусственном осторожном освобождении от такого засорения (препарировальной иглой) и перенесении в хорошие условия дафния может восстановить жизнедеятельность полностью и нормально размножаться. Часто сгустки или нити наблюдаются и на плавательных антеннах и на каудальной игле 10

10(11) Забит только фильтровальный аппарат. В среде содержаться взвеси в количествах делающих невозможным функционирование фильтровального аппарата дафний.

11(10) Забит только фильтровальный аппарат, слизистые комки или нити на плавательных антеннах и на каудальной игле. Вода для опыта взята с полисапробно - мезосапробного участка водоема. Внесено слишком много корма, особенно когда кормят дрожжами.

12(13) Помутнение плазмы наблюдаетя у иммобилизованных дафний. Действие хлоридов и сульфатов натрия и кальция и смесей этих солей.13(12) Помутнение плазмы жабр наблюдаетя у еще плавающих дафний,которые часто ложатся на дно, а затем судорожно всплывают и снова падают на дно. Часто у таких дафний уже прекращено дрожание глаза и сокращение сердца. Действие солей калия, магния аммония и тяжелых металлов.14(15,16,17,18) Дафнии постепенно бледнеют, у них исчезают капли жира, число яиц в выводковых камерах сокращается до 1-2, многие самки становятся бесплодными. Гибель наступает через 5-10 дней но отдельные особи живут и дольше. Дафнии скучиваются в одном углу сосуда и кувыркаются. Вода ля опыта взята с олигосапробного участка водоема. Внесено в опыт очень мало корма.

15(14,16,17,18) У дафний резко повышается балл окраски тела (4-5), которое часто становится несколько мутным, животные поднимаются к поверхности сосуда. Дефицит кислорода в среде порядка 1,5 мг/л.

16(14,15,17,18) У дафний в плавательных антеннах и каудальной игле бактериальные обрастания, балл окраски тела часто повышается; все яйца и эмбрионы в выводковых камерах погибают, часто разлагаются до превращения в сплошную пенистую массу. Вода для опыта взята из - мезосапробного участка водоема. Резкий перекорм дафний.

17(14,15,16,18) У части дафний через разные сроки от начала опыта наблюдается судорожное сокращение мышц туловища и выдавливание частияиц из выводковой камеры. Одни яйца развиваются неправильно, другие яйца гибнут и сбрасываются при линьке со шкуркой (эквузием).Действие хронических доз ряда циклических соединений типа фенолов,нефтепродуктов, инсектицидов и т. п.

18 (14,15,16,17) У дафний отмирает часть яиц в выводковой камере. Значительная часть выметанной молоди тут же погибает. Перед гибелью несколько снижается интенсивность окраски тела. Действие солей тяжелых металлов.19(20,21) Интенсивность размножения дафний понижается, среднее число яиц на самку 3-7. Дафнии бледнеют (1-2 балла), исчезают капли жира. Понижено наполнение кишечника 22

20(19,21) Окраска тела дафний умеренная (2-3 балла) Капли жира имеются. Наполнение кишечника 4-5 баллов. Средняя интенсивность размножения 18-40 яиц на самку 24

21(19,20) Окраска тела дафний яркая (4-5 баллов) 27

22(23) Случаев гибели яиц в выводковых камерах нет. Вода для опытов взята с олигосапробно-мезосапробного участка водоема. В опыты вносится не достаточно корма.

23(22) В выводковых камерах часть яиц гибнет(яйца иногда заметно увеличиваются в размерах) и часто в выводковых камерах одновременно присутствуют яйца и зародыши. Действие небольших концентраций солей тяжелых металлов. Иногда - это действие ухудшения условий среды и причины неясны.

24(25,26) В выводковых камерах все яйца развиваются нормально. Иногда на дафниях появляются эпибионты из водорослей (особенно в опытах с водой из природных водоемов, взятой в летнее время. Вода для опыта взята с - мезосапробного участка водоема. В опыт внесено оптимальное количество корма.25(24,26) У дафний в выводковых камерах часть яиц гибнет и прекращает развиваться, или часть их развивается без линек эмбрионов. После вымета нормально развитой молоди такие яйца сбрасываются на дно сосуда, часть их остается в выводковых камерах сброшенных шкурок. Действие небольших концентраций циклических соединений. В лабораторных опытах может быть следствием того, что дафниям в корм дается пожелтевшая культура водорослей.

26(24,25) У дафний отмирает часть яиц в выводковых камерах. На дафниях обрастания из бактерий, грибков и сувоек. Иногда резорбция яиц в гонадах. Вода для опыта взята с - мезосапробного участка водоема. Небольшой перекорм.

27(28) Обрастаний на дафниях нет, может даже быть довольно много капель жира. Функции размножения не нарушены. В среде пониженное содержание растворенного кислорода (2-3 мг/л).

2.6 Общая методика определения токсичности воды на дафниях

Для определения токсичности вод необходимо иметь культуру дафний.

При культивировании дафний берут водопроводную воду, отстоянную не менее 7 суток и насыщенную кислородом (не менее 6,.0 мг/л), с pH =7,0 - 8,2; жесткость общая - 3-4 мг/л.

Лучше всего использовать биологизированную воду из аквариума. Кормом служат зеленые водоросли (хлорелла) и хлебопекарные дрожжи. Дрожжи приготовляют так: берут 1 г. свежих или 0,3 г. воздушно-сухих дрожжей, заливают их 100мл дистиллированной воды. После набухания дрожжи тщательно перемешивают, дают отстояться в течение 30 минут. Используют только жидкость, которую добавляют в сосуды с дафниями в количестве 3 мл на 1 л воды. Кормят дафний 1 - 2 раза в неделю. Зеленые водоросли Chlorella vulgaris можно приобрести в лаборториях и хранить в холодильнике (срок хранения 14 суток). Дозировка кормления для дафний: из расчета 2 мл/л суспензии водорослей хлореллы с плотностью 25-35млн кл/мл.

Оптимальный режим для выращивания водорослей создается при соблюдении следующих условий: питательная среда Тамийя (таблица 4), круглосуточное освещение лампами дневного света и постоянное продувание атмосферным воздухом.

Таблица №4

Состав питательной среды для культивирования зеленых водорослей.

Соли	Среда Тамийя, г/л дист. воды	Среда Успенского №1
KNO3	5.000	0.025
KH2PO4	1.250	0.025
MgSO4*7H2O	2.500	0.025
FeSO4*7H2O	0.003	-----
ЭДТА (Трилон Б)	0,037	-----
CaCl2	-----	0.100
K2CO3	-----	0.037
Микроэлементы* А3, В2 (мл)	1,0	1,0

Для культивирования дафний используют стеклянные сосуды емкостью 3 - 5 литров. Начальная плотность дафний от 6 до 10 особей на 1 л. Через 5 - 7 суток в сосуды добавляют воду для дальнейшего культивирования. В помещении, где находится культура дафний, не должно быть вредных газов и паров, оптимальная температура 20 градусов Цельсия, освещение рассеянное 12 - 14 часов в сутки. Обмен воды в культуре дафний проводят через 7суток.

Отбор проб для анализа. Для анализа на токсичность берут воду объемом до 1 л. Время от начала забора до опыта не должно превышать 6 часов, а температура хранения 4 градуса Цельсия.

Пробы промышленных сточных вод (2 - 3 л) отбирают из соответствующих коллекторов или открытых участков водотока, которые хранят в стеклянной таре в холодильнике.

Проведение опытов. Опыты ставят в трех повторностях; в каждый стакан заливают по 200 мл раствора и сажают по 10 дафний. Их переносят стеклянной трубкой диаметром 5 - 7 мм. Каждая серия опытов сопровождается контрольными испытаниями с биологизированой водой. Длительность наблюдений 96-120 часов.

Регистрируемые показатели. В кратковременных опытах основным показателем токсичности среды является выживаемость рачков, наблюдения за которой проводят непрерывно в течение первого часа воздействия раствора, через каждые 15 мин в продолжение второго часа, затем ежечасно до конца первого дня наблюдений, а в последующие сутки 2-3 раза в день.

Время гибели рачков отмечают по наступлении неподвижности (иммобилизации): дафнии лежат на дне стакана, плавательные движения отсутствуют и не возобновляются при легком прикосновении струей воды или покачивании стакана.

Наблюдают за ходом эксперимента через 24, 48 или 96 часов. Дафний во время эксперимента не кормят.

После окончания эксперимента производят подсчет дафний. Рассчитывают процент выживших особей.

Проба воды оценивается как токсичная, если за 24 часа опыта в ней гибнет больше 50% дафний по сравнению с контролем. Для количественной оценки токсичности проб воды применялась четырехбальная система Н.С. Строганова.

Таблица 5. Шкала токсичности по Н.С. Строганова [ ].

Количественная оценка (балл)	Продолжительность жизни 50%дафний (дни)	Оценка токсичности
1	1 до 20	Слабая токсичность или ее отсутствие
2	2 до 10	Средняя токсичность
3	3 до 5	Сильная токсичность
4	4 до 2	Весьма сильная токсичность

Для более детальной токсикологической оценки сточной и природной воды биотестирование должно вестись минимум на двух объектах параллельно. Один объект должен относиться к фитопланктону (хлорелла или сцередесмус), другой -- к зоопланктону (дафния магна или цериодафния). Предпочтительнее тестировать на хлорелле и цериодафнии, как на более чувствительных объектах.

Пробы сточной воды для биотестирования отбирают, руководствуясь инструкцией по отбору проб для анализа сточных вод НВН 33-5.3.01-85[53]; отраслевыми стандартами или другими нормативными документами. Пробы природной воды отбирают, руководствуясь, ГОСТ 17.1.5.05-85[54].

Биотестирование проб воды проводят не позднее 6 ч после их отбора. Если указанный срок не может быть соблюден, пробы хранят до двух недель с открытой крышкой внизу холодильника (при +4°С). Не допускается консервирование проб с помощью химических консервантов. Перед биотестированием пробы фильтруют через фильтровальную бумагу с размером пор 3,5--10 мкм.

При определении наличия острого и хронического токсического действия воду тестируют без разбавления. Для учета результатов биотестирования при установлении величин ПДС и определения степени токсичности сточной и природной воды готовят серию разбавлении.

Для контроля (вода без токсических веществ) и разбавлении используют водопроводную воду, которую дехлорируют путем отстаивания и аэрирования с помощью микрокомпрессоров в течение семи суток. В тех случаях, когда результаты биотестирования учитывают при установлении величин ПДС, в качестве контрольной и разбавляющей служит природная вода, отобранная вне зоны влияния источника загрязнения и отфильтрованная через фильтровальную бумагу.

Если отсутствует возможность отбора проб из контрольного створа, тестируют сточную воду на сбросе в водный объект в разбавлении, соответствующем таковому в контрольном створе.

Кратковременное биотестирование -- до 96 ч -- позволяет определить острое токсическое действие воды на дафний по их выживаемости. Показателем выживаемости служит среднее количество тест-объектов, выживших в тестируемой воде или в контроле за определенное время. Критерием токсичности является гибель 50 и более процентов дафний за период времени до 96 ч в тестируемой воде по сравнению с контролем.

Длительное биотестирование--20 и более суток -- позволяет определить хроническое токсическое действие воды на дафний по снижению их выживаемости и плодовитости. Показателем выживаемости служит среднее количество исходных самок дафний, выживших в течение биотестирования, показателем плодовитости -- среднее количество молоди, выметанной в течение биотестирования, в пересчете на одну выжившую исходную самку. Критерием токсичности является достоверное отличие от контроля показателя выживаемости или плодовитости дафний.

Культуру дафний выращивают в климатостате, люминостате, боксе или помещении, не содержащем токсических паров или газов. Оптимальная температура для культивирования дафний и биотестирования составляет 20±2°С, освещенность 400--600 лк при продолжительности светового дня 12--14 ч. Не допускают освещения дафний прямыми солнечными лучами. Стеклянную посуду для содержания дафний моют питьевой водой, хромовой смесью или соляной кислотой. Нельзя использовать для мытья синтетические моющие средства и органические растворители. В помещении, где находятся дафнии, не проводят обработку инсектицидами, не хранят летучие вещества и не работают с ними. Для культивирования дафний используют водопроводную воду, которую отстаивают и насыщают кислородом с помощью микрокомпрессоров не менее 7 сут. Используют также природную или аквариумную воду, отфильтрованную через бумажный фильтр. Вода для культивирования должна удовлетворять следующим требованиям: рН 7,0--8,2; жесткость общая 3--4 мг-экв/л, концентрация растворенного кислорода не менее 6,0 мг/л, солевой состав до 6 ‰.

Оптимальная плотность культуры -- 25 половозрелых самок в 1 л воды. Раз в 7--10 сут. половину объема воды в сосуде с культурой дафний заменяют на свежую, удаляют сифоном скопившийся на дне осадок и при большой плотности культуры ее прореживают. Не рекомендуется аэрировать воду в сосудах с дафниями.

Посев водорослей производят альгологически чистой культурой, которую выращивают в стерильных условиях. Культуру водорослей вносят в питательную среду в количестве, дающем светло-зеленое окрашивание. Исходная концентрация около 2 тыс. кл/мл.

Культивируют водоросли в стеклянных кюветах, батарейных стаканах или плоскодонных колбах при круглосуточном освещении лампами дневного света 3000 лк и постоянном продувании культуры воздухом с помощью микрокомпрессоров. Через 7--10 суток, когда окраска культуры водорослей становится интенсивно зеленой, их отделяют от питательной среды путем центрифугирования или отстаивания в холодильнике в течение 2--3 сут. Осадок разбавляют в два раза дистиллированной водой. Суспензию хранят в холодильнике не более 14 сут. Водоросли вносят в культуру дафний из расчета 1 мл суспензии (600--1000 млн. кл/мл) на л воды.

1 -- 2 раза в неделю дафний кормят хлебопекарными дрожжами. Для приготовления дрожжевого корма 1 г свежих или 0,3 г воздушно-сухих дрожжей заливают 100 мл дистиллированной воды. После набухания дрожжи тщательно перемешивают. Образовавшуюся суспензию отстаивают в течение 30 мин. Недостающую жидкость добавляют в сосуды с дафниями в количестве 3 мл на 1 л воды.

Раствор дрожжей хранится в холодильнике до двух суток. Можно кормить дафний сырым рисом. Рис предварительно размачивают в теплой воде (3--4 ч.) и вносят в культуру из расчета 1 -- 2 зерна на 1 л воды. Рис держат в культуре до 10 дней при постоянной продувке мелкодисперсными пузырьками воздуха. При хроническом опыте дафний кормят только хлореллой -- по 5 капель на 100 мл.

При необходимости биотестирования воды с общим содержанием солей свыше 3 г/л выращивают культуру, адаптированную к повышенной минерализации среды. Для этого в воду, в которой культивируют дафний и минерализация которой известна, постепенно порциями добавляют хлористый натрий. Вначале его вносят из расчета 500 мг/л. Через неделю минерализацию воды повышают еще на 250 мг/л. Эту операцию повторяют каждую неделю до тех пор, пока содержание солей в среде не достигнет нужного уровня (но не выше 6 г/л с учетом начальной минерализации). В дальнейшем достигнутый уровень минерализации среды поддерживают постоянно. Эта же среда служит контролем при биотестировании и в качестве разбавляющей. Адаптированных к повышенному содержанию солей дафний нельзя использовать для тестирования вод с более низким содержанием солей.

При кратковременном биотестировании используют только односуточных дафний, а двухсуточных самок -- при длительном биотестировании.

Перед началом биотестирования в пробе воды определяют концентрацию растворенного кислорода, которая должна быть не менее 6,0 мг/л (оптимально 6,0 --7,0). Если она ниже 6,0 мг/л, то перед биотестированием воду аэрируют с помощью микрокомпрессора. В процессе биотестирования аэрировать воду не рекомендуется. Биотестирование проводят при тех же условиях, что и культивировании. Результаты биотестирования считают правильными, если гибель дафний в контроле не превышает 10% в остром опыте и 25% в хроническом и концентрация растворенного в тестируемой воде кислорода в конце биотестирования составляет не менее 2 мг/л.

Для определения наличия острого токсического действия сточной воды на сбросе в водный объект воду тестируют без разбавления. Если требуется сравнить степень токсичности сточной воды, отобранной из разных мест или в разное время, готовят серию разбавлении (не менее трех).

Объем пробы воды для биотестирования без разбавления -- 500 мл, с учетом разбавлении -- 1 л.

Посадку дафний в сосуды для биотестирования проводят следующим способом: стеклянной трубкой диаметром 0,5 -- 0,7 см отлавливают дафний из культуры, помещают в сачок из планктонного газа, погрузив его в тестируемую воду, переводят в нее дафний, посадку ведут от разбавлении тестируемой воды с большей кратностью к меньшей.

В сосуды наливают по 300 мл контрольной и тестируемой воды или ее разбавлении. Повторность трехкратная. В каждый сосуд помещают по 10 односуточных дафний и экспонируют при оптимальных условиях в течение времени до 96 ч. При кратковременном биотестировании дафний не кормят.

Учет выживших дафний проводят через 1, 6, 24, 48, 72, 96 ч. Особей считают выжившими, если они свободно передвигаются в толще воды или всплывают со дна сосуда не позднее 15 с после его легкого покачивания. Если в любой считываемый период времени в сточной воде гибнет 50 и более процентов дафний, биотестирование прекращают.

Для определения наличия хронического токсического действия воды в контрольном и других створах водного объекта воду тестируют без разбавления. Если требуется сравнить степень токсичности разных проб воды или использовать результаты биотестирования при установлении величин ПДС, готовят серию разбавлении. Определяют минимальную кратность разбавления, при которой хроническое токсическое действие не проявляется.

Объем пробы воды для биотестирования без разбавления -- 1 л, с учетом разбавлении -- 3 -- 5 л.

В сосуды наливают по 300 мл контрольной и тестируемой воды или ее разбавлении. Повторность трехкратная. В каждый сосуд вносят одинаковое количество корма, помещают по 10 двухсуточных самок дафний и экспонируют при оптимальных условиях. Дафний кормят ежесуточно. Три раза в неделю в сосудах с дафниями производят смену контрольной и тестируемой воды на свежеотобранную. При смене воды дафний кормят за 3 ч до смены. Допускается использовать воду, хранящуюся в холодильнике.

С момента появления молоди, в те сутки, когда меняют воду, производят учет выживших исходных самок и выметанной молоди. Для этого самок с помощью стеклянной трубки пересаживают в заранее подготовленные сосуды с контрольной и тестируемой водой (соответственно) и подсчитывают их количество в каждом сосуде. Оставшуюся воду процеживают через сито из планктонного газа. При этом на сите остается выметанная молодь, которую подсчитывают и удаляют.

После того, как в контроле все исходные самки дадут по четыре помета, биотестирование заканчивают. Время биотестирования сокращается, если при промежуточном подсчете устанавливают достоверное отличие от контроля показателя выживаемости или плодовитости дафний.

При биотестировании сточной воды на сбросе в водный объект рассчитывают процент погибших дафний в тестируемой воде по сравнению с контролем

А = (N₂/N₁) * 100% (1)

N₁ - среднее арифметическое количество дафний, выживших в контроле;

N₂ - среднее арифметическое количество дафний, выживших в тестируемой воде.

Если А>50%, тестируемая вода оказывает острое токсическое действие, если А<50%, тестируемая вода не оказывает острого токсического действия на дафний.

Для определения степени острого токсического действия тестируемой воды рассчитывают графическим методом:

ЛКр₅₀-96 ч -- кратность разбавления тестируемой воды, при которой гибнет 50% дафний за 96 ч;

ЛКр₀-96 ч -- минимальную кратность разбавления, при которой дафнии не гибнут за 96 ч.

На оси абсцисс откладывают логарифмы величин кратности разбавлении тестируемой воды, а на оси ординат -- средние арифметические величины выживаемости дафний в процентах к контролю. Полученные точки соединяют прямой. От точек на оси ординат, соответствующих 50 и 100% выживаемости, проводят линии, параллельные оси абсцисс. Из точек пересечения этих линий с экспериментальной прямой опускают перпендикуляры на ось абсцисс и находят логарифмы величин кратности разбавлении, которые будут соответствовать исковым величинам ЛК_р50 и ЛК_ро. Чем больше величины ЛК_р50 и ЛК_ро, тем токсичнее тестируемая вода.

Степень токсичности можно также установить, рассчитав ЛК_р50 -- среднее время гибели 50% дафний в тестируемой воде. Для этого строят график (на оси абсцисс откладывают время наблюдения, на оси ординат -- выживаемость в процентах к контролю). Чем меньше ЛК_р50, тем токсичнее тестируемая вода.

При биотестировании воды из контрольного или других створов водного объекта вывод о наличии хронического токсического действия делают на основании установления достоверности различия между показателем выживаемости или плодовитости дафний в контроле и в тестируемой воде. Для этого рассчитывают среднее арифметическое показателей выживаемости и плодовитости в контрольной и тестируемой воде

Результаты биотестирования при разбавлении тестируемой воды с целью их использования при установлении величин ПДС или определения степени хронического токсического действия тестируемой воды обрабатывают с помощью вышеописанных приемов. Определяют минимальную кратность разбавления тестируемой воды, при которой различия между величинами показателей выживаемости и плодовитости дафний в контроле и соответствующем разбавлении будут недостоверными.

Если получают две разные величины минимальной кратности разбавления тестируемой воды (одну, при которой недостоверным будет отличие от контроля показателя выживаемости, и другую, при которой недостоверным окажется отличие от контроля показателя плодовитости), вывод об отсутствии хронического токсического действия на дафний делают на основании большей величины.

Периодически, не реже одного раза в месяц, необходимо проводить контроль чувствительности дафний и цериодафний к «эталонному» токсиканту бихромату калия (K₂Cr₂O₇). Концентрация бихромата калия, которая в течение 24 часов иммобилизует 50% дафний, взятых для эксперимента, должна находиться в диапазоне 0,9--2,0 мг/л. Указанный диапазон концентраций вызывает 50%-ную иммобилизацию дафний и цериодафний. Испытания проводятся в соответствии с общими требованиями для биотестирования. Используется для испытания, бихромат признанного аналитического качества. Если результаты опытов не укладываются в указанный интервал, т» следует проверить правильность приготовления исследуемых растворов, соблюдение условий проведения опытов, правильность выбора возраста рачков. Если ошибки исключены, следует заменить культуру, получив ее в базовых лабораториях по биотестированию [55].

2.7 Методика биотестирования синтезированных сополимеров на дафниях Daphnia magna Straus

Дафний в количестве 20 штук высаживали в чашки Петри, причем это были половозрелые особи, 4 - дневного возраста, способные к размножению без адаптации. Дафний не кормили, появившуюся молодь не отсаживали, а наблюдали за развитием ювенильных особей в модельных растворах.

В ходе опыта с помощью бинокуляра регистрировались следующие признаки: двигательная активность, способность к размножению, фототаксис.

2.8 Методика биотестирования на хирономидах Chironomus dorsalis

Хирономид в количестве 10 штук высаживали в чашки Петри, это преимущественно личинки 2 и 3 стадии. В ходе хронического опыта гидробионтов кормили дрожжами, вводя в каждую чашку Петри по 1 мл суспензии. Регистрировались такие признаки как: двигательная активность, способность к превращению из личинки в куколку, а затем в имаго.

Кроме того, в модельный раствор помещали кладку яиц взрослых особей и наблюдали за развитием личинок.

2.9 Методика биотестирования на комарах обыкновенных Culex sp

Личинок обыкновенных комаров, возраст которых составлял 2 дня, в количестве 10 штук высаживали в чашки Петри, затем приливали растворы сополимеров определенной концентрации. Визуально регистрировалась двигательная активность, поведение личинок у поверхности, способ питания, превращение личинок в имаго. После проведения биотестирования комаров высаживают из тестируемых растворов, помещают в контрольную пробу и продолжают наблюдение.

2.10 Методика биотестирования на водных жесткокрылых: Platambus maculatus, Haliplus flavicollis и Gyrinus sp

Для биотестирования брали Platambus maculatus, Haliplus flavicollis и Gyrinus sp. в количестве 5 штук и высаживали в модельные растворы.

В ходе хронического опыта учитывали двигательную активность, фототаксис и способность к размножению, контроль проводили визуально, так как жесткокрылые имеют относительно большие размеры (55-80мм.) Далее см. методику 2.8.

Глава III. Обсуждение результатов

Исключительная роль воды в жизни человека и всего живого на Земле обусловливает большое и постоянно возрастающее внимание к экологическому состоянию водных объектов. Особое внимание уделяется проблеме загрязнения воды, которая тесно связана с проблемой обеспеченности пресной водой. Следует отметить, что в настоящее время технология обработки воды как научно-техническое направление все еще значительно отстает от запросов практики. Поэтому при прогрессирующем загрязнении водоемов промышленными стоками и при увеличении числа примесей с различными свойствами проблема создания новых полифункциональных материалов для очистки воды становится особенно актуальной.

Особое место среди флокулянтов занимают производные полиакриламида. Перспективными химическими структурами для получения новых производных полиакриламида являются гуанидинсодержащие соединения. В случае сополимеров акриламида с гуанидинсодержащими солями возможно совмещение полезных свойств, присущих индивидуальным мономерам. Как известно, гуанидинсодержащие соединения обладают биоцидными свойствами [56-58]. Известно также, что сочетание в полиакриламидных флокулянтах карбамидных групп с карбоксильными и аминогруппами препятствует свертыванию макромолекул в клубок и позволяет иметь развернутую оптимальную для флокуляции конформацию [59].

В связи с этим, представлялось важным изучение токсичности новых сополимеров акриламида с метакрилатом и акрилатом гуанидина, синтезированных по схемам 3, 4:



Схема 3. Получение сополимера акриламида с метакрилатом гуанидина

Схема 4. Получение сополимера акриламида с акрилатом гуанидина

Методы биотестирования на ветвистоусых ракообразных занимают ведущее положение в системе экологического мониторинга природных вод, а биотест на дафниях Daphnia magna Strauss является наиболее стандартизованным из всех известных [20, 21, 60]. Как видно, из обзора литературы, при биотестировании природных вод на зоопланктоне регистрируют поведенческие реакции, патологические нарушения, метаболические (биохимические) показатели, физиологические функции, окраску тела, скорость выедания корма и др., но наиболее чувствительной и надежной считается тест-реакция, в которой регистрируется процессы размножения - выживаемость и плодовитость.

Для определения токсичности ряда гомо - и сополимеров использовали методику определения токсичности воды с помощью дафний Daphnia magna Strauss, а также новых биоиндикаторов, раннее для этих целей неиспользованных - личинки комаров обыкновенных Culex sp.

Дафний в количестве 20 штук высаживали в чашки Петри с исследуемыми образцами. Контроль проводили визуально и с применением бинокуляра, контролируя количество выживших дафний, причем учитывались изменения в движении и размножении рачков. Параллельно ставили контрольный опыт с природной водой. Наблюдения проводили 96 часов, дафний во время эксперимента не кормили. По окончании эксперимента проводили учет выживших дафний, выжившими считаются дафнии, если они свободно передвигаются или всплывают со дна.

Коэффициент токсичности в %, рассчитывали по формуле:

Кt =100(Х1-Х2)/Х1

где, Х1 и Х2 среднее арифметическое количество выживших дафний в контроле и опыте.

Проба воды оценивалась как обладающая острой токсичностью, если за 96 часов биотестирования в ней гибло 50% и более дафний по сравнению с контролем.

Токсикологические характеристики сополимеров исследовали в зависимости от состава и концентрации при постоянной температуре.

В качестве модельных соединений были взяты полиакрилатгуанидин (ПАГ), полиметакрилатгуанидин (ПМАГ), полиакриламид (ПАА).

Экспериментальные результаты показали, что растворы гомополимеров и сополимеров без разбавления оказывают (рис.7) угнетающее действие на весь процесс размножения дафний, задерживает рост, наступление половой зрелости и появления первого помета, уменьшает количество пометов и плодовитость, повышает выброс молоди и яиц. При разведении в отношении 1:2 токсичность сополимеров снижается. Наименее токсичными являются растворы сополимеров с концентрацией от 0,1 до 0,01 %. Токсичность образцов зависит также от состава сополимеров, с увеличением содержания метакрилата гуанидина токсичность понижается.



32

Рис. 7. Зависимость коэффициента токсичности гомо - и сополимеров от состава и концентрации

Анализ экспериментальных данных по исследованию токсичности сополимеров показывает, что растворы сополимеров МАГ:АА (20:80) и МАГ:АА (30:70) с концентрацией 0,1% и 0,01% практически не влияют на плодовитость дафний, но на 15% сокращают длительность жизни. Отметим, что гомополимер ПМАГ снижает плодовитость и длительность жизни у исследуемых дафний всего на 7%, а полиакриламид на 30 %. Выявлено, что токсичность полиакриламида выше, чем у сополимеров, т.е. даже небольшое содержание метакрилата гуанидина в сополимерах уже снижает токсичность полиакриламидного флокулянта.

По сравнению с сополимерами акриламида с метакрилатом гуанидина, сополимеры с акрилатом гуанидина показали более низкую токсичность, причем токсичность тем выше, чем больше содержание в звеньях сополимеров АА (табл.6), диаграмма 1.

Это ожидаемый результат для полиамфолитных сополимеров, учитывая то, что производные акриловых кислот имеют низкую токсичность, тогда как акриламид обладает высокой токсичностью. Отсюда можно сделать вывод о том, что при выборе сополимера в качестве флокулянта нужно учитывать состав сополимера.

Учитывая полученные данные можно варьировать состав композиций для очистки воды для достижения максимального эффекта очистки при минимальных проявлениях токсичности.

Таблица 6

Образец 1% раствор	Выживаемость дафний, в %
	Острый опыт	Хронический опыт
АГ: АА (10:90)	87	66
АГ: АА (20:80)	90	89
АГ: АА (30:70)	98	98
АГ: АА (40:60)	91	82
АГ: АА (50:50)	89	62
АГ: АА (60:40)	89	55
АГ: АА (70:30)	45	59
АГ: АА (80:20)	48	68
АГ: АА (90:10)	100	100

Существование любого организма или сообщества организмов зависит от комплекса определенных условий или факторов среды обитания. Для использования в качестве биоиндикаторов подходят виды организмов, с низкой экологической валентностью, то есть способные выносить лишь ограниченные изменения условий существования и реагировать на любые изменения амплитуды колебаний экологических факторов.

В этой связи совершенствование методов биологического тестирования путем выявления биоиндикаторов, активно реагирующих на изменение химического состава своей экологической ниши, безусловно, является важной задачей.

Поэтому помимо D. magna, для токсикологической оценки водных растворов полимерных флокулянтов использовали также личинок комаров - звонцов Chironomus dorsalis, Platambus maculatus, Haliplus flavicollis и Gyrinus sp., Culex sp.

Выбор в качестве объекта исследования именно этих видов обусловлено следующими причинами:

- высокая численность популяции;

- легко культивируются в лабораторных условиях;

- продолжительность жизни выше по сравнению с дафниями.

Результаты исследований на указанных биоиндикаторах показали, что наименее токсичными в исследованных условиях являются сополимеры АА с АГ по сравнению с ПАА, причем наименее токсичным образцом для данных тест-культур оказался сополимер АА: АГ (10:90), в растворе которого наблюдался переход личинок в куколки, а затем превращение в имаго.

Использование новых биоиндикаторов также подтвердило меньшую токсичность сополимеров акриламида с акрилатом гуанидина (табл.8, 9, 10), диаграммы 2, 3

Таблица 8

Гибель тест-объектов (хирономиды) в тестируемой воде за 48 часов (хронический опыт)

Полимеры	Выживаемость хирономид, %
МАГ: АА (70:30-0, 01% раствор)	99
ПАА(0, 01% раствор)	33
МАГ: АА (1:99)	23
ПМАГ(0, 01% раствор)	69
ПАГ (0, 01% раствор)	47
МАГ (0, 1 % раствор)	100

Таблица 9

Гибель тест-объектов (жесткокрылые) в тестируемой воде за 48 часов (хронический опыт)

Полимеры	Выживаемость жесткокрылых, %
МАГ: АА (70:30-0, 01% раствор)	100
ПАА(0, 01% раствор)	78
МАГ: АА (1:99)	47
ПМАГ(0, 01% раствор)	65
ПАГ (0, 01% раствор)	88
МАГ (0, 1 % раствор)	100

Таблица 10

Образец 1% раствор	Выживаемость комаров, в %
	Острый опыт	Хронический опыт
АГ: АА (10:90)	69	65
АГ: АА (20:80)	78	71
АГ: АА (30:70)	82	77
АГ: АА (40:60)	87	80
АГ: АА (50:50)	77	66
АГ: АА (60:40)	71	69
АГ: АА (70:30)	43	41
АГ: АА (80:20)	39	41
АГ: АА (90:10)	100	100

Для выявления чувствительности дафний к тяжелым металлам, а также изучения способности полученных сополимеров и гомополимеров к комплексообразованию были приготовлены модельные растворы свинца разной концентрации и определена их токсичность для используемых биотестов.

Выявлено, что исходная концентрация свинца 1г/л приводит к 99% летальному исходу для дафний. Минимальная концентрация свинца, при которой степень выживаемости дафний равна 82%, составляет 0,03 г/л. Концентрация свинца, равная 0,03 г/л совпадает с санитарно-токсикологической ПДК содержания свинца в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования.

Полученные результаты открывают возможность определять повышение ПДК свинца в воде методом биотестирования. В связи с этим, представляло интерес исследование комплексообразующих способностей гомополимеров и сополимеров по отношению к ионам свинца методом равновесного диализа.

Экспериментальные исследования показали, что сополимеры не обладают комплексообразующей способностью по отношению к ионам свинца, так степень выживаемости дафний, в воде обработанной сополимерами составила всего 3%. Гомополимеры МАГ и АГ в отличие от сополимеров обладают комплексообразующей способностью к ионам тяжелых металлов. Степень выживаемости дафний составила 96 %, что свидетельствует о практически полном связывании ионов свинца данными гомополимерами. Результаты комплексообразующих способностей указанных полимеров подтверждены исследованиями модельных растворов методом атомно-адсорбционной спектроскопии.

Таким образом, полученные результаты показали возможность регулирования токсичности сополимеров путем варьирования их состава и концентрации.

Выводы

1) Впервые исследованы эколого-токсикологические характеристики новых флокулянтов - гуанидинсодержащих сополимеров акриламида методом биотестирования.

2) Показано, что токсичность сополимеров зависит от состава и концентрации, определены оптимальные условия их применения. Обнаружено, что токсичность сополимеров акриламида уменьшается с увеличением содержания гуанидинсодержащего мономера.

3) Выявлены новые биоиндикаторы для оценки токсичности сополимеров - личинки комаров обыкновенных, личинки поденок, жуки-вертячки, некоторые из которых оказались более чувствительными по сравнению с дафниями.

4) Разработаны методики оценки токсикологических свойств водных растворов полимеров с использованием выявленных биоиндикаторов.

5) Оценена чувствительность новых биоиндикаторов по отношению к ряду сополимеров и обнаружено, что наиболее чувствительным биоиндикатором являются личинки комара обыкновенного (Culex sp.).

Литература

1. Шуберт Р. Основные принципы методов биоиндикации // Изучение загрязнения окружающей природной среды и его влияния на биосферу: Матер. 3 заседания Международной рабочей группы по проекту № 14 МАБ ЮНЕСКО. Л., 1986. С. 112-122.

2. Израэль Ю.А. Экология и контроль состояния природной среды. Л.: Гидрометеоиздат, 1984.

3. Филиппова Л.М., Инсаров Г.Э., Семевский Ф.Н. и др. О структуре и задачах экологического мониторинга // Проблемы экологического мониторинга и моделирование экосистем. Л., Гидрометеоиздат. 1978. Т. 1. С. 19-32.

4. Методы биоиндикации и биотестирования природных вод. Л., Гидрометеоиздат. 1989. Вып. 2. - 277с.

5. Макрушин А.В. Биологический анализ качества вод. Л., ЗИН. 1974. - 60 с.

6. Винберг Г.Г., Алимов А.Ф., Балушкина Е.В., и др. Опыт применения разных систем биологической индикации загрязнения вод // Научные основы контроля качества поверхностных вод по гидробиологическим показателям. Л., Гидрометеоиздат. 1977. С. 124-131.

7. Брагинский Л.П. Некоторые принципы классификации пресноводных экосистем по уровням токсической загрязненности // Гидробиол. журн. 1985. Т. 21. № 6. С. 65-74.

8. Зенин А.А., Белоусова Н.В. Гидрохимический словарь. Л., 1988. - 235С.

9. Строганов Н.С., Исакова Е.Ф., Колосова Л.В. Метод биотестирования качества вод с использованием дафний // Методы биоиндикации и биотестирования природных вод. 1989. Вып. 1. - 78 с.

10. Лесников Л.А., Исакова Е. Ф., Колосова Л. В. Опыты на дафниях // Метод. Рекомендации по установлению ПДК загрязняющих веществ для воды рыбохозяйственных водоемов. М., 1986. 102 с.

11. Методическое руководство по биотестированию воды. РФ-118-02-90 / Под ред. А.Н. Крайнюковой. М., 1991. 87 с.

12. Лакин Г.Ф. Биометрия. М., 1990. - 348 с.

13. Исакова Е.Ф. Сезонные изменения фактической плодовитости Daphnia magna в лабораторной культуре // Гидробиол. Журнал. 1980. Т. 16. №4

14. Кокова В.Е. Непрерывное культивирование беспозвоночных. Новосибирск, 1982. - 231 с.

15. Гиляров А.М. Популяционная экология. М., 1990. - 467 с.

16. Пятаков М.Л. По поводу сезонного изменения плодовитости у ветвистоусых // Зоологический журнал. Т. 35. Вып. 12.

17. Брагинский Л.П. Методологические аспекты токсикологического биотестирования на Daphnia magna Str. и других ветвистоусых ракообразных (критический обзор) // Гидробиол. журн. - 2000. - Т. 36, № 5. - С.50-70.