Исследование гуминовых и фульвокислот различных почв Краснодарского края по данным ЭПР и ЯМР спектроскопии

1.1 Общие сведения о Гуминовых веществах. Биосферные функции

Гуминовые вещества (ГВ)- это сложные смеси устойчивых к биодеструкции высокомолекулярных темноокрашенных органических соединений природного происхождения, образующихся при разложении растительных и животных остатков под действием микроорганизмов и абиотических факторов среды[1]. ГВ представляют собой макрокомпоненту органического вещества почвенных и водных экосистем, а также твердых горючих ископаемых. Их содержание в почвах и водах составляет 60-80% от общего органического вещества, в торфах и углях оно колеблется от 20 до 90% [2]. Общепринятая классификация ГВ основана на различии в растворимости в кислотах и щелочах. Согласно этой классификации ГВ подразделяют на три составляющие: гумин - не извлекаемый остаток, нерастворимый ни в щелочах, ни в кислотах; гуминовые кислоты (ГК) -- фракция ГВ, растворимая в щелочах и нерастворимая в кислотах (при pH<2); фульвокислоты - (ФК) -- фракция ГВ растворимая и в щелочах и в кислотах.

Гуминовые кислоты (ГК) - высокомолекулярные азотсодержащие органические кислоты, растворимые в щелочах и нерастворимые в кислотах. Гуминовые кислоты образуются при бактериальном разложении отмерших растительных остатков, а так же при длительном воздействии кислорода атмосферы или пластовых вод на органические вещества. Строение гуминовых кислот определяется наличием слабо конденсированных и замещенных ароматических ядер, связанных между собой участками неароматического характера.

Фульвокислоты (ФК) - (креновая и апокреновая) представляют собой светлоокрашенные (от соломенно-желтой до оранжевой окраски) высокомолекулярные азотсодержащие органические вещества. Они по сравнению с гуминовыми кислотами содержат больше кислорода и водорода и меньше углерода. Элементный состав фульвокислот колеблется в следующих пределах: углерод -- 40-52%, кислород -- 40-48%, водород -- 4-6%, азот -- 2-6%. Фульвокислоты хорошо растворяются в воде, в растворах кислот и щелочей, водном растворе аммиака и других веществах. Их водные растворы имеют кислую реакцию (рН 2,6--2,8), поэтому, просачиваясь вглубь, они оказывают сильное разрушающее действие на минеральную часть почвы и способствуют выносу оснований из верхних горизонтов почв.

В качестве обобщающего названия, обозначающего как гуминовые, так и фульвокислоты, применяют термин «гумусовые кислоты» (ГФК). Гумусовые кислоты являются наиболее подвижной реакционноспособной компонентой ГВ, активно участвующей в химических процессах, протекающих в экосистемах [3,1].

Все ГВ образуются в результате посмертного превращения органических остатков. Превращение органических остатков и ГВ получило название процесса гумификации. Он идет вне живых организмов, как с их участием, так и путем чисто химических реакций окисления, восстановления, гидролиза, конденсации и др. В отличие от живой клетки, в которой синтез биополимеров осуществляется в соответствии с генетическим кодам, в процессе гумификации нет какой-либо установленной программы, поэтому могут возникать любые соединения, как более простые, так и более сложные чем исходные биомолекулы. Образующиеся продукты вновь подвергаются реакциям синтеза или разложения, и такой процесс идет практически беспрерывно [4,47].

ГВ считают первой устойчивой формой органических соединений углерода вне живых организмов. Гуминовые вещества выполняют в биосфере множество функций, из которых важнейшие следующие:

1) Аккумулятивная функция. Она заключается в накоплении химических элементов и энергии, необходимых живым организмам. Практически это означает, что ГВ ответственны за жизнеобеспечение почвенной биоты и гидробиоты, и поскольку они благодаря своей устойчивости сохраняются длительное время, то тем самым гарантируют непрерывное снабжение растений и микроорганизмов энергией и строительным материалом. В составе гуминовых веществ найдено от 40 до 60% углерода, 3-5% азота, 30-40% кислорода, а так же водород, сера, фосфор. Многие металлические катионы, в том числе так называемые микроэлементы. Не случайно темно-серые и черные по цвету почвы в народе всегда считали плодородными и называли, хотя и не всегда правильно, черноземами. Окраску таким почвам придают ГВ.

2) Транспортная функция. Она заключается в формировании геохимических потоков минеральных и органических веществ, преимущественно в водных средах, за счет образования устойчивых, но сравнительно легкорастворимых комплексных соединений гумусовых кислот с катионами металлов и гидроксидами. Транспортная функция до некоторой степени противоречит аккумулятивной функции, поскольку их результаты прямо противоположны, но противоречивость действия обеспечивает многообразия влияния гуминовых веществ на минеральные компоненты почв и горных погод.

3) Регуляторная функция. Эта функция объединяет множество различных явления и процессов и относится к почвам, водам и другим природным телам. В регуляторной функции гуминовых веществ можно выделить несколько главных составляющих: 1) формирование почвенной структуры и водно-физических свойств почв; 2) регулирование реакций ионного обмена между твердыми и жидкими фазами; 3) влияние на кислотно-основные и окислительно-восстановительные режимы; 4) регулирование условий питания живых организмов путем изменения растворимости минеральных компонентов; 5) регулирование теплового режима почв и атмосферы, включая проявления парникового эффекта.

4) Протекторная функция, которая заключается в способности гуминовых веществ связывать в малоподвижные или трудно диссоциирующие соединения токсичные и радиоактивные элементы, а также соединения, негативно влияющие на экологическую ситуацию в природе , в том числе они могут инкорпорировать некоторые пестициды, углеводы, фенолы. Защитная функция гуминовых веществ настолько велика, что богатые ими почвы могут полностью предотвратить поступление в грунтовые воды ионов свинца и других токсичных веществ.

5) Физиологическая функция. Многими исследователями было установлено, что различные гуминовые вещества, особенно гуминовые кислоты и их соли, могут стимулировать прорастание семян, активизировать дыхание растений, повышать продуктивность крупного рогатого скота, птицы. Более того, было показано, что некоторые препараты гуминовых веществ сдерживают развитие злокачественных опухолей, повышают устойчивость организмов к различного рода воспалительным процессам.

Гуминовые и фульвоислоты существенно отличаются по своим свойствам. Гуминовые кислоты способны накапливаться в почве и формировать ее плодородие. Фульвокислоты активно разрушают минеральную часть почвы и снижают тем самым ее плодородие. Поэтому важно знать не только общее количество гумуса в почве, но и его качественный состав - соотношение в нем гуминовых и фульвокислот является важным показателем их агрохимической оценки [45].

1.2 Элементный состав гумусовых кислот

Обычно под элементным составом гумусовых кислот понимают состав их органической части, образованной сравнимыми количествами атомов углерода, водорода и кислорода. Обязательным минорным элементом является азот, почти во всех препаратах определяется и сера. Однако помимо органической части, в состав всех выделенных препаратов гумусовых кислот входит и неорганическая часть. Она состоит из зольных элементов (преимущественно ионов металлов, оксидов кремния и алюминия) и гигроскопической влаги, содержание которой достигает 10%. Поэтому в общем виде брутто - формулу гумусовых кислот можно записать следующим образом:

CxHyNzOpSqMr(Al2O3)l(SiO2)m (H2O)n,

где М- ионы металлов

x,y,z,p,q,r,l,m,n- стехиометрические коэффициенты.

Средний элементный состав органической части гумусовых кислот различного происхождения приведен в таблице 1, взятой из работы [5]. Авторы этой публикации подвергли статистической обработке данные по элементному составу 650 препаратов гумусовых кислот, опубликованные в более чем 400 литературных источниках. Приводимая ими сводка является наиболее представительной. Как видно из таблицы 1, содержание углерода в ГК различного происхождения варьирует от 50 до 60%, кислорода - от 30 до 40%. В целом, для ГК характерны более низкие значения атомного соотношения Н/С, чем для ФК, что указывает на их большую ненасыщенность. Данный показатель убывает в ряду: морские донные отложения> пресные воды> торфа ? почвы. ФК характеризуются более низким содержанием углерода и более высоким - кислорода. Это предполагает большую степень замещения ароматического каркаса ФК кислородосодержащими функциональными группами. Максимальное содержание кислорода характерно для ФК пресных вод [46].

Следует отметить, что наиболее узкими диапазонами стандартных отклонений (5-10% (отн) от среднего) характеризуются содержания С и О. Разброс значений для Н гораздо больше (10-20% от среднего), но максимальные значения стандартных отклонений достигаются для содержаний N и S.

По-видимому, это связано с большими ошибками в определении N и S как следствие их низкого содержания по сравнению с С, Н и О. Нельзя исключать и того, что содержание N и S в гумусовых кислотах не подчиняется устойчивым закономерностям, а является довольно случайным.

Таблица 1 - Средний элементный состав гумусовых кислот различного происхождения (в расчете на беззольную навеску, n- число препаратов, ± стандартное отклонение)

* Подавляющее большинство данных по содержанию кислорода получено по разности; ** д.о.- донные отложения

Авторы процитированного выше обзора склонны относить наблюдающиеся вариации элементного состава гумусовых кислот различного происхождения по специфике их генезиса, отводя возможным погрешностям методического характера второстепенную роль. С точки зрения И.В. Перминовой [6] это может быть справедливо в отношении содержания углерода (особенно для низкозольных проб), тогда как содержание кислорода, водорода и азота весьма существенно зависит как от метода определения, так и способа корректировки первичных данных анализатора на содержание зольных элементов в пробе и гигроскопическую влажность. Наличие воды наиболее существенно влияет на результаты определения водорода. Поэтому именно этим фактором объясняется то, что даже в пределах выборок препаратов сходного происхождения и фракционного состава величина относительного стандартного отклонения по водороду достигает 20%, тогда как для двух других макроэлементов- кислорода и углерода- она не превышает 10 %. Присутствие в составе зольных элементов ионов щелочных и щелочноземельных металлов может приводить к образованию термостойких карбонатов и, как следствие, вызывать занижение результатов определения углерода.

1.3 Функциональный состав гумусовых кислот

В настоящее время в гумусовых кислотах обнаружено более десяти различных типов кислород, азот и серосодержащих функциональных групп: карбоксильные, фенольные и спиртовые гидроксильные, карбонильные, хинонные, метоксильные, сложноэфирные, енольные, амино-, амидо- и имидогруппы, сульфо-, тиольные и дисульфидные группы [7].

Кислородсодержащие группы. Кислород входит как в состав каркасной, так и периферической части гумусовых кислот. В последнем случае он находится преимущественно в углеводных фрагментах. Обобщенные сведения о распределении кислорода по различным функциональным группам в гумусовых кислотах почв приведены в таблице 2.

Таблица 2 - Распределение кислорода между функциональными группами в гумусовых кислотах почв, по данным [6,7]

Как видно из данной таблицы около 75% кислорода в молекулах ГК и около 95% - в ФК распределено между четырьмя типами функциональных групп: карбоксильными, фенольными и спиртовыми гидроксильными, и карбонильными, причем вклад этих групп в общее содержание кислорода различен для ГК и ФК. Вышеперечисленные функциональные группы, определяют комплексообразующую способность гумусовых кислот по отношению к тяжелым металлам.

Хинонные и семихинонные. Методом ЭПР показано, что в гумусовых кислотах содержание неспаренных электронов составляет (0,1⁴⁰)спин/г [8]. Присутствие данных групп обуславливает возможность протекания реакций с участием гумусовых кислот по свободнорадикальному механизму, в частности, восстановления ионов металлов в их присутствии и декарбоксилирование отдельных фрагментов гумусовых кислот.

Азотсодержащие группы. Содержание азота в гуминовых кислотах составляет 1-5% (таблица 1). Часть азота входит в состав каркасной (негидролизуемой) части. Остальной азот находится в составе периферической (гидролизуемой) части. По данным, опубликованным в монографии Д.С. Орлова, [1] азот периферической части распределяется следующим образом: 20-45% входит в состав аминокислотных остатков, 2-8% - в состав аминосахаров, 8-15% присутствует в гумусовых кислотах в виде солей аммония, до 20% - в неустановленных фрагментах. При этом азот каркасной части находится в составе следующих групп: - группы, связанные с ароматическими кольцами, -NH- и =N- группы в открытых цепях; индольные, пиррольные и пиридиновые кольца; мостиковые NR- группы, связывающие хинонные кольца; аминокислоты, связанные с ароматическими ядрами через N.

Из приведенных фрагментов алифатические амины, аминокислоты и гетероциклы способны образовывать комплексные соединения с тяжелыми металлами. Таким образом, указанные группы, наряду с кислородсодержащими, могут влиять на комплексообразующие свойства гумусовых кислот по отношению к тяжелым металлам.

Серусодержащие группы. Согласно [9], распределение серы в торфяных гумусовых кислотах можно представить следующим образом ( в % от общей серы): 8-12% - лабильные сульфонатные группы, 3-6% - аминокислоты, 4-19% - эфиры серной кислоты, 54-70% - тиолы, S- гетероциклы, стабильные сульфонаты, 3-23%- алифатические сульфиды.

1.4 Модели строения гуминовых и фульвокислот

Гумусовые кислоты относятся к соединениям переменного состава, вследствие чего полную и однозначную их структурную формулу вывести невозможно. Следует отметить, что замена в молекуле гуминовой или фульвокислоте отдельных структурных фрагментов, боковых цепей и функциональных групп существенно не изменяет их свойства в целом. Таким образом, существуют статистические формулы, отражающие средний состав, строение и средние свойства гумусовых кислот.

К настоящему времени предложены некоторые варианты формул химического строения ГК, но все они имеют гипотетический характер, отражая в той или иной мере подробно накопленные экспериментальные данные. Схемы молекулярного строения ГК можно разделить на две группы: 1) блок-схемы и 2) структурные (условно) формулы [10].

Интересную блок-схему предложили В. Мистерски и В. Логинов в 1959 г [11]. Эта схема показывает, что в состав гуминовой кислоты входит так называемое «ядро», представленное ароматическими кольцами, включая хиноны, кислород- и азотсодержащие гетероциклы.

Рисунок 1 - Блок-схема строения гуминовой кислоты по Мистерски и Логинову

Кольца несут хинонные и карбоксильные группы. «Ядро» окружено периферическими алифатическими цепями, в том числе углеводного и полипептидного характера. За счет комплексообразования и сорбции ГК содержат также минеральные компоненты, в первую очередь, железо, алюминий, кальций, фосфаты. Эта схема удобна для общей характеристики ГК, но она не раскрывает характера сочленения слагающих молекулу остатков и, следовательно, не позволяет объяснить способность ГК участвовать в химических реакциях или, тем более, прогнозировать роль и функции ГК в почвообразовании. Сходную, но более формализованную блок-схему ГК предложили М. Чешир с соавторами в 1967 году.

Первая «структурная» формула ГК, выделенной из каменного угля, была составлена В. Фуксом [12]. Формула Фукса выведена из существовавших представлений о строении угля в виде циклически полимеризованного углерода. Она имеет сейчас только историческое значение, поскольку очень далека от реального строения гумусовых кислот почвы хотя бы потому, что в ней не отражено участие сильно развитых периферических цепочек, сложенных углеводами и полипептидами. Этот недостаток был преодолен в формуле В.И. Касаточкина, который сохранил идею циклически полимеризованного углерода для «ядра» ГК, но ввел боковые радикалы в виде молекулярных цепей линейно полимеризованного углерода, несущих различные функциональные группы (рисунок 2).

Рисунок 2 - Схема строения гуминовых кислот: а- по Фуксу; б- по Касаточкину.

Формула Касаточкина, как и предыдущие формулы, схематична, но она сыграла большую роль в развитии химии почвенного гумуса. Используя идею о различном соотношении «ядра» и боковых цепей (по Касаточкину, плоской атомной сетки циклически полимеризованного углерода и молекулярных цепей линейно полимеризованного углерода), удалось объяснить изменения содержания углерода и оптической плотности в ГК зонального ряда почв. По В. И. Касаточкину, в ГК черноземов преобладает «ядро». И поэтому они содержат больше углерода и отличаются более интенсивной окраской.

Формула Касаточкина имеет ряд существенных недостатков. Так, наличие плоской атомной сетки циклически полимеризованного углерода в таком количестве противоречит гибкости молекул ГК, их способности изменять конфигурацию при образовании гуматов или при деридратации. В плоскую непрерывную сетку не вписываются гетероциклические атомы азота и кислорода; такому строению не отвечает и состав продуктов окисления ГК.

Структурная формула мономерного звена молекулы ГК, содержащая «оптимальное» конденсированное «ядро», предложена Комиссаровым и Логиновым в 1970 году [13]. Наличие конденсированного ядра ароматического углерода подтверждено исследованием продуктов окисления. Однако, наличие плоского конденсированного «ядра» противоречит экспериментальным данным о строении ГК других природных сред, хотя следует отметить, что для ГК угля доля конденсированных структур может быть велика.

Рисунок 3 - Предполагаемая структурная схема отдельного фрагмента гуминовой кислоты окисленного угля по Комиссарову.

В формуле Фелбека (рисунок 4) представлены единичные кольчатые структуры, несущие функциональные группы и связанные с открытыми цепями [14].

Рисунок 4 - Структурная схема негидролизуемой части почвенной гуминовой кислоты по Фелбеку.

Сходное с этим изображение строения гуминовой кислоты дает Фляйг [15] (рисунок 5), но он отмечает при этом возможность существования двухъядерных ароматических структур.

Рисунок 5 - Структурная формула почвенной гуминовой кислоты по Фляйгу

Схема строения структурной ячейки, предложенная Орловым, может рассматриваться как возможный вариант блок-схемы (рисунок 6). Структурная ячейка представляет собой минимальную по размеру часть макромолекулы, которая содержит набор структурных фрагментов. Подробно приводятся характерные фрагменты негидролизуемой части молекулы и типичные способы их соединения, а гидролизуемая периферия дана в виде набора структурных компонентов, количество и характер сочленения которых варьируется. Состав и строение структурных ячеек, из которых сложена вся макромолекула, могут также варьировать.

Рисунок 6 - Строение структурной ячейки ГК почв по Орлову

Эта схема строения ГК позволяет объяснить почти все известные экспериментальные данные и, по мнению В. Перминовой [16], удовлетворительно объясняет конформационные особенности молекул, интенсивную окраску и другие свойства ГК.

Возможны и необходимые замены в составе компонентов гидролизуемой части молекул в типах замещений шестичленных колец «ядра», а также в наборе и характере сочленения этих колец [48]. Однако такие замещения, изменяя индивидуальный облик каждой отдельной молекулы, не должны практически влиять на их общие типовые признаки.

В 2004 году С. Н. Чуков предложил другой доработанный вариант [17] блок-схемы Д.С. Орлова. По его мнению, «ядро» ГК все же включает высокополимеризованные формы ароматического углерода, как это было показано на основе экспериментальных данных и в структурной формуле И.Д. Комиссаровым.

Рисунок 7- Строение структурной ячейки ГК почв по Орлову, Чукову

Имеются попытки компьютерного моделирования структуры ГК на основе готовых пакетов программ по данным ЯМР, ММР, элементного анализа. При этом стоит отметить схожесть полученных структурных формул ГК с предложенными Фелбеком и Фляйгом.

Шнитцер [18], как один из зарубежных лидеров изучения ГК, представил структурную формулу этих соединений, которая также схожа с формулой Орлова, но включает несколькочленные ароматические фрагменты. Однако, характер сочленения этих фрагментов в макромолекулу по Шнитцеру не предусматривает единую систему сопряженных связей, как это предусмотрено формулой Комиссарова.

1.5 Реакционная способность гуминовых кислот

Наличие различных функциональных групп при ароматических ядрах и алифатических цепях и особенности строения самого остова макромолекул - причины многообразия химического взаимодействия ГК. Рассматривают три типа химических превращений ГК: 1) процессы, протекающие в периферической, наиболее лабильной части макромолекул; 2) превращение стабильной, «ядерной» части ГК; 3) преобразования глобального характера, охватывающие макромолекулу в целом.

По механизму взаимодействия химические реакции, протекающие при участии ГК, могут относиться к двум типам: 1) гетеролитические реакции, где макромолекула ГК при формировании новой связи благодаря своему полифункциональному характеру выступает как нуклеофильный или электрофильный реагент; 2) радикальные или гомолитические реакции, в которых образование ковалентной связи обусловлено взаимными одноэлектронными вкладами соединяющихся реагентов.

В процессе гетеролитических реакций объектом «атаки» ГК являются карбоксилы, фенольные и спиртовые гидроксилы, карбонильные и другие функциональные группы, а также двойные связи в углеродном скелете. Особенности строения ГК оказывают существенное влияние на характер химических взаимодействий, протекающих при участии этих активных центров макромолекул.

Свертывание макромолекул ГК по длине приводит к образованию сферических частиц. В этих условиях реакционная способность макромолекул может заметно снижаться в силу экранирования от внешних воздействий части ионогенных групп и вследствие других пространственных затруднений. Одновременно изменяется и сам характер диссоциации функциональных групп, что обусловлено свободной электрический энергией ионизации.

Важным типом реакции по ароматическому ядру ГК являются реакции электрофильного замещения: нитрование, галогенирование, алкилирование, диазотирование, нитрозирование и др. Среди гомолитических процессов, протекающих при химических взаимодействиях ГК, важное место занимают свободнорадикальные реакции. Парамагнитные свойства ГК дают основание рассматривать их как стабильные свободны макрорадикалы.

1.6 Взаимодействие гумусовых кислот с тяжелыми металлами

Весь спектр взаимодействий ГФК с металлами по характеру связи ГФК-металл в образующихся соединениях можно разделить на три основных типа [19,20,21]:

1) Образование соединений солевого типа с ионной связью между анионом ГФК и катионом металла (гуматы и фульваты щелочных щелочноземельных металлов).

2) Образование соединений с преимущественно ковалентным характером связи ГФК-металл. По данному типу ГФК связываются с поливалентными катионами (Al, Fe, Si), входящими в структуру глинистых частиц.

3) Образование комплексных соединений с координационной связью ГФК-металл. Данный тип связывания с ГФК характерен для переходных металлов.

В большинстве соединений связь носит смешанный характер с преобладанием того или иного типа в зависимости от природы катиона [22]. Тяжелые металлы (ТМ) относятся к числу переходных и для них характерен третий тип связывания с ГФК. Единого взгляда на природу комплексообразующих центров ГФК до сих пор не существует [21]. Это связано со сложностью качественной и количественной интерпретации данных тех методов, которые применимы для исследований ГФК и дают информацию о типе образующихся комплексов [49,50]. Однако, основываясь на исследованиях функционального состава ГФК, а также ИК и ЭПР спектров комплексов ТМ с ГФК, полагают, что за взаимодействие гумусовых кислот с тяжелыми металлами ответственны следующие структурные фрагменты [21]:

Рисунок 8 - структурные фрагменты взаимодействия ГК с тяжелыми металлами.

Считается также возможным участие в данном процессе групп, содержащих гетероциклический или аминный азот [23,24,21]. Однако, ввиду низкого процентного содержания азота, этот тип связывания не может играть существенной роли. Согласно данным работ [21,25,26], в металло-гуматном взаимодействии определяющую роль играют карбоксильные группы, входящие в состав двух основных типов связывающих центров: салицилатных и фталатных. В то же время в работах [27,28] указывается на существенный вклад группировок типа пирокатехина. Рассмотренные связывающие центры характерны для ГФК терригенного происхождения с высоким содержанием ароматических структур. Для ГФК аквагенного происхождения, отличающихся преобладанием в углеродном скелете алифатических фрагментов, взаимодействие ГФК с тяжелыми металлами определяется, в основном, карбоксилат-ионами, эфирными группами, и комбинациями различных групп [29,30]. Следовательно, доля хелатных взаимодействий для аквагенных ГФК существенно меньше, что, возможно, и является причиной более низкой устойчивости их комплексов [30].

1.7 Исследование структурно-группового состава гумусовых кислот методами спектроскопии ядерного магнитного резонанса

Трудно переоценить роль С ЯМР в получении информации о структуре гумусовых кислот. В 50-х - 70-х годах нынешнего столетия принципы строения углеродного скелета гумусовых кислот оставались предметом оживленной дискуссии, в которой часть исследователей придерживались концепции об алифатическом характере структуры гумусовых кислот, а другая часть рассматривала структуру гумусовых кислот как исключительно ароматическую. Получение в 1976 г. первого спектра ¹³С ЯМР ФК почв [31] позволило дать однозначный ответ на вопрос о строении углеродного скелета этих соединений, показав, что в нем в сопоставимых количествах содержатся как ароматические, так и алифатические фрагменты. Впоследствии эти данные были подтверждены для гумусовых кислот различного происхождения многочисленными исследованиями. В ЯМР ¹³С спектрах гумусовых кислот были обнаружены сигналы, отнесенные к разным фрагментам структуры этих веществ, что позволило существенно углубить качественные знания о фрагментном составе гумусовых кислот [32].

С ЯМР спектр гумусовых кислот приведен на рисунке 9. Как видно из рисунка, полидисперсность и химическая гетерогенность гумусовых кислот приводит к тому, С ЯМР спектры этих соединений не содержат разрешенных пиков, относимых к С определенного типа, а представляют собой суперпозицию большого числа слабовыраженных сигналов.

Рисунок 9 - Типичный 13С ЯМР спектр ГК почв

В связи с этим традиционная в спектроскопии ЯМР задача отнесения индивидуальных сигналов не является актуальной в случае спектров гумусовых кислот [33]. Общий подход к анализу такого рода спектров предусматривает выделение в них групп сигналов или спектральных областей, соответствующих атомам углерода со сходным химическим окружением, и определение сравнительной интенсивности этих областей. Как видно из рисунка 9., в С ЯМР спектре гумусовых кислот наблюдается лишь один отчетливый минимум с нулевой интенсивностью сигнала при 90 м.д., в остальных случаях невозможно провести точное разделение различных групп сигналов из-за их частичного перекрывания. Выбор разбиения спектров гумусовых кислот на группы сигналов представляет собой неоднозначную задачу. Для выбора границ разбиения анализируют положение локальных минимумов в спектрах гумусовых кислот и привлекают табличные данные по химическим сдвигам С в органических соединениях в сочетании с имеющейся информацией об основных структурных элементах гумусовых кислот [34].

Наиболее распространенным является выделение С ЯМР спектре гумусовых кислот пяти наиболее удовлетворительно разделенных диапазонов химических сдвигов, соответствующих незамещенным и О- замещенным алифатическим, ароматическим, карбоксильным и карбонильным атомам углерода (таблица 3)

Таблица 3- Основные диапазоны сигналов в спектре гумусовых кислот.

В зависимости от цели исследования и желаемой детализации получаемой информации перечисленные в таблице 3 основные спектральные диапазоны часто подразделяют на более узкие (таблица 4). При этом детализация спектральной информации сопровождается снижением достоверности количественных характеристик определяемого состава [32]. Это обуславливает проблему оптимизации выбора соотношения информативности и достоверности при С ЯМР спектров гумусовых кислот, которая в настоящее время решается каждым исследователем сугубо индивидуально.

Таблица 4 - Выделение узких диапазонов сигналов в С ЯМР гумусовых кислот.

Важно отметить принципиальную нестрогость количественного анализа спектра гумусовых кислот при разбиении на диапазоны в связи с невозможностью количественного учета перекрывания групп сигналов. В случае низкомолекулярных соединений для разделения набора перекрывающихся сигналов используют аппроксимацию пиков лоренцевыми кривыми [35]. Для спектров полимеров описаны подходы к такому разделению, основанные на аппроксимации гауссовыми кривыми [36]. Однако в связи с тем, что в спектрах гумусовых кислот форма пиков в общем случае не является ни лоренцевой, ни гауссовой, а в ряде случаев невозможно определить и положение пиков при детальном разбиении, применение такого подхода не позволяет получить существенного повышения точности и надежности количественного анализа спектров.

Следует отметить, что отнесение некоторых групп сигналов до сих пор является предметом дискуссии. Так, группу сигналов в области 90-110 м.д. длительное время относили к незамещенным ароматическим атомам С в орто- положении к гидроксильной группе. Однако в последние годы преобладает мнение, что большая часть этих сигналов обусловлена атомами углерода ацетального типа в полисахаридных циклах периферии гумусовых кислот. В области 44-60 м.д. некоторые исследователи выделяют группу сигналов N- замещенного углерода метиленовых групп, однако отделить эти сигналы от находящихся в этой же области находится сигналов метоксильных и незамещенных СН-групп представляется невозможным.

Химические сдвиги большинства сигналов С не зависят от выбора условий регистрации спектра и растворителя. Однако сигналы карбоксильных групп и атомов ароматического углерода, замещенного ОН- группой, при переходе от органических апротонных растворителей к воде и растворам щелочей смещаются в слабое поле в связи с ионизацией соответствующих групп.

1.8 Использование электронного парамагнитного резонанса при изучении почв

В последние годы в биохимии почв остро встала проблема совершенствования методологических подходов к изучению органического вещества и в особенности почвенного гумуса. Многие традиционные методы, такие, например, как фракционно-групповой анализ гумуса и др. во многом исчерпали свои возможности, а целый ряд предлагаемых методов оказались либо сложными для массового применения, либо косвенными и трудно интерпретируемыми. Причина этого отчасти заключается в сложном строении и гетерополидисперсном характере почвенного гумуса. В результате, при изучении процессов трансформации органического вещества исследователи сталкиваются с трудно сопоставимыми и зачастую с противоречивыми данными. Таким образом, необходим выход на новый уровень методологического обеспечения, связанный с использованием современных методов изучения молекулярной структуры и функциональных свойств гумусовых веществ.

Одним из таких методов, позволяющих получать прямую информацию о важнейших физико-химических параметрах гумусовых соединений, является метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). ЭПР обладает высокой чувствительностью и дает многообразную информацию о строении веществ, содержащих свободные радикалы, которые благодаря большому запасу энергии и высокой активности играют большую роль в большинстве химических реакций между органическими, органе минеральными и минеральными соединениями в почвах. Изучение свободнорадикальной структуры почв и гумусовых веществ позволяет судить об их реакционной способности и является актуальной задачей в решении комплексной проблемы формирования и превращения органического вещества почв.

Важную роль неспаренных (свободных) электронов в любой химической или биологической системе обусловливает большой запас энергии и соответственно высокая активность, которой обладают эти электроны. Известно, что большинство химических реакций идет через стадию образования свободных радикалов, обладающих неспаренным электроном. Свободный радикал может быть короткоживущим (например, в ходе реакции неорганических молекул) и стабильным (обычно в сложных органических системах). В литературе, посвященной использованию метода ЭПР в изучении природных высокомолекулярных органических соединений, для обозначения группировок атомов или участков молекул, обладающих неспаренным свободным электроном, принят термин "парамагнитные центры". Все вещества, содержащие неспаренные электроны, можно подразделить на две большие группы. В первой - неспаренные электроны связаны либо со всей молекулой, либо с большей ее частью. Эти неспаренные электроны перемещаются по сильно делокализованным молекулярным орбиталям и обуславливают активность атомных группировок, входящих в состав молекулы. Изучение этих неспаренных делокализованных электронов важно для понимания специфики реакций, идущих через стадию свободных радикалов, и механизма процессов полимеризации или образования промежуточных продуктов каких-либо биохимических реакций. Ко второй - относят те, в которых неспаренный электрон связан только с каким-либо атомом, а не перемещается по делокализованной молекулярной орбитали, охватывающей многие атомы.

Таким образом, цель настоящей работы заключалась в определении радикальной активности почв методом ЭПР спектроскопии и установлению корреляции между их происхождением, функциональными характеристиками и качественным и количественным составом гуминовых (ГК) и фульвокислот (ФК).

1.9 Строение почвенного профиля. Почвенные горизонты

Почвенным профилем называется совокупность почвенных горизонтов, объединенных единым процессом почвообразования. Строение почвенного профиля определяется морфологическими признаками отдельных почвенных горизонтов, закономерно переходящих один в другой [37].

Строение профиля большинства почв, если их рассматривать в разрезе сверху вниз, сравнительно однотипно: сверху лежит небольшой слой растительных остатков, образующих лесную подстилку, травяной войлок, или дернину; глубже расположен горизонт, в разной степени окрашенный гумусом, или перегноем, а под ним образуется горизонт, переходный к материнской породе (Рисунок 10).

Мощность, или глубина, почвенного профиля зависит от типа и времени протекающего почвообразовательного процесса и может изменяться в очень широких пределах.

Рисунок 10 - Строение почвенного профиля.

Строение и мощность почвенного профиля позволяют судить о характере и направлении почвообразовательных процессов, применении систем обработки почв, необходимости внесения удобрений, видах выращиваемых культур, об устойчивости и продуктивности лесов. Для характеристики почвенного профиля в целом производят описание отдельных его горизонтов.

Генетические почвенные горизонты - это формирующиеся в процессе почвообразования однородные, обычно параллельные земной поверхности слои почвы, составляющие почвенный профиль и различающиеся между собой по морфологическим признакам, составу и свойствам [51].

Каждому из горизонтов дается буквенное обозначение. Буквами обозначают генетические горизонты, а сочетаниями букв и буквенно-цифровыми индексами - переходные горизонты и подгоризонты. Приняты следующие обозначения:

Т-торф, органогенный горизонт.

А- горизонт биогенного накопления органического вещества в почвах. Обычно называется гумусовым, перегнойно- аккумулятивным или дерновым горизонтом.

Ао- лесная подстилка, травяной войлок, дернина.

Апах- пахотный горизонт почвы.

А1- гумусовый, дерновый, перегнойно-аккумулятивный, перегнойно-элювиальный горизонт дерново-подзолистых, серых лесных и осолоделых почв; имеет серый или черный цвет.

А2- элювиальный ( или горизонт вымывания). Подзолистый или осолоденелый. Обычно окрашен в белесоватые, белесые и белые тона;

В - иллювиальный, или горизонт вымывания, в подзолистых, серых лесных, каштановых и некоторых других породах.

G- глеевый горизонт, характерен для почв с постоянным избыточным увлажнением болотных почв.

С- материнская рыхлая горная порода.

Д- подстилающая горная порода.

Кроме того, применяют буквенные индексы:

g- для оглеенных горизонтов;

с- скопления водорастворимых солей.

г- скопления гипса; цифровые индексы-1,2,3 и тд.

2. Экспериментальная часть

2.1 Реактивы и оборудование

Были использованы следующие реактивы: MnCl₂, CuCl₂, 0,05 н. и 1н. , 0,1 н. NaOH; насыщенный раствор , сухой Ca , 0,1 н. HCl, ацетон, уголь марки АГ-3.

Регистрацию ЭПР спектров исследуемых почв и препаратов гумусовых веществ проводили на ЭПР спектрометре JES-FA300 при СВЧ мощности в резонаторе 20-40 мВт и частоте СВЧ 9.372 ГГц.

2.2 Отбор проб