Ферментеры. Производство альфа-амилазы мощностью 110 кг в год

Размещено на http://www.allbest.ru/

Реферат

Отчёт: 48 страниц, 3 таблицы, 8 рисунков, 22 источника, 2 приложения.

ФЕРМЕНТЕРЫ. ПРОИЗВОДСТВО б - АМИЛАЗЫ МОЩНОСТЬЮ 110 КГ. В ГОД

Объектом исследования являлись промышленные ферментеры и б - амилаза

Цель работы - изучить промышленные ферментеры, их характеристики и принцип действия, рассчитать продуктовый баланс получения б - амилазы и подобрать аппаратурное оформление процесса

Результаты работы применяются в ежедневной практике инженера - биотехнолога

Содержание

Введение

1.Теоретическая часть

1.1 Процесс ферментации

1.2 Технологические особенности процесса ферментации

1.2.1 Аэробное культивирование

1.2.2 Анаэробное культивирование

1.3 Конструкции ферментеров

1.3.1 Ферментеры с подводом энергии к газовой фазе

1.3.2 Ферментеры с подводом энергии к жидкой фазе

1.3.3 Ферментеры с комбинированным подводом энергии

1.4 Системы теплообмена, пеногащения, стерилизации

1.5 Прблемы масштабирования ферментационных процессов

2.Технологическая часть

2.1 Расчет продуктового баланса б - амилазы

2.2 Расчет и выбор основного технологического оборудования

Заключение

Список использованных источников

Приложения

Введение

Промышленное производство биопрепаратов представляет собой сложный комплекс взаимосвязанных физических, химических, биофизических, биохимических, физико-химических процессов и предполагает использование большого количества разнотипного оборудования, которое связано между собой материальными, энергетическими потоками, образующими технологические линии.

Тема курсовой работы является весьма актуальной, так как ферментеры составляют основу биотехнологического производства, задача которых заключается в обеспечении оптимальных условий для роста культивируемых биообъектов и биосинтеза целевого продукта при соблюдении условий стерильности и экономичности процесса.

Масса аппаратов, используемых, например, в микробной биотехнологии, различна, и требования здесь определяются большей частью экономическими соображениями. При масштабировании добиваются соответствия важнейших характеристик процесса, а не сохранения принципа конструкции.

Применяемое в биотехнологии оборудование должно вносить определенную долю эстетичности в интерьер цеха или отделения. В ходе его эксплуатации и вне ее оборудование должно быть легко доступным, содержащимся и функционирующим в определенных рамках требований гигиены и санитарии. В случае замены каких-либо частей или деталей в аппарате, смазки и чистки узлов при текущем ремонте, и т. д., загрязнения не должны попадать внутрь биореакторов, в материальные поточные коммуникационные линии, в конечные продукты. Поэтому цель курсовой работы заключается в рассмотрении таких важных вопросов, как ферментация, условия и оборудование для ее проведения, продуктовый баланс готового продукта и его характеристики.

ферментация амилаза культивирование

1. Теоретическая часть

1.1 Процесс ферментации

Под ферментацией понимают всю совокупность последовательных операций от внесения в заранее приготовленную и нагретую до требуемой температуры среду посевного материала и до завершения процесса роста клеток или биосинтеза целевого продукта. По окончании ферментации образуется сложная смесь, состоящая из клеток продуцента, раствора непотребленных питательных компонентов и накопившихся в среде продуктов биосинтеза. Такую смесь называют культуральной жидкостью [5].

Ферментация - главная стадия биотехнологического процесса. Начинается с того момента, когда заранее подготовленный посевной материал вводится в реактор. Размножение культуры микроорганизма характеризуется четырьмя временными фазами на рисунке 1: лаг-фаза; экспоненциальная; стационарная; вымирание.

Рисунок 1 - Фазы роста и размножения микроорганизмов

Во время лаг-фазы метаболизм клеток направлен на то, чтобы синтезировать ферменты для размножения в конкретной среде. Длительность лаг-фазы может быть разной для одной и той же культуры и среды, так как на неё влияет множество факторов. Например, сколько в посевном материале было нерастущих клеток.

Экспоненциальная фаза - это период роста, когда происходит деление клеток с экспоненциальным ростом численности популяции. Этот период ограничен во времени количеством питательной среды. Питательные вещества кончаются или рост клеток замедляется из-за выделения токсичного метаболита.

Рост прекращается и наступает так называемая стационарная фаза. Метаболизм продолжается и может начаться выделение вторичных метаболитов. Во многих случаях целью является получение не биомассы, а именно вторичных метаболитов, так как они могут использоваться для получения ценных продуктов и препаратов. В этих случаях ферментация целенаправленно удерживается в стационарной фазе. Если продолжать ферментацию дальше, клетки постепенно будут терять активность, т.е. вымирать [3].

Ферментацию принято характеризовать с использованием разных критериев.

Наиболее часто она дифференцируется по принципу организации материальных потоков на периодическую, полупериодическую (регулируемую), непрерывную, отъемно-доливную, многоциклическую.

По характеру культивирования продуцента разделяется на поверхностную и глубинную. По типу целевого продукта в ферментации выделяют биомассу, высокомолекулярное индивидуальное вещество (ферменты и т.д.), низкомолекулярные первичные и вторичные метаболиты.

Периодический процесс достаточно прост и довольно часто употребляется. Однако нельзя считать его оптимальным. При периодическом процессе единовременно загружают в ферментер все компоненты питательной среды и посевной материал. схема процесса на рисунке 2.



Рисунок - 2 Ферментация по принципу организации процесса: а - периодическая; б - полупериодическая; в - непрерывная

После этого включаются все элементы обвязки ферментера и совершается полный цикл ферментации. По его завершении культуральная жидкость (вместе с мицелием) сливается и направляется в цех химической очистки для выделения целевого продукта. Таким образом, какой-либо коррекции условий биосинтеза во время ферментационного цикла не выполняется: нет ни постепенного поддержания оптимального соотношения источников углерода, азота, фосфора, ни добавления в нужный момент предшественников целевого продукта, ни сохранения оптимального значения рН и т.п. Все это сказывается на продуктивности ферментации. Выход целевого продукта снижается.

Полупериодический (регулируемый) процесс по сравнению с периодическим более прогрессивен. Улучшается рост продуцента и биосинтез целевого продукта, появляется возможность коррекции процесса при его отклонениях от оптимальных условий.

Непрерывный процесс ферментации заключается в том, что из ферментера непрерывно отбирают небольшие порции культуральной жидкости и одновременно в него же вносят такой же объем питательной среды. Система оказывается проточной. Использование непрерывного процесса целесообразно, например, в том случае, если целевым продуктом является непосредственно сама биомасса выращиваемого микроорганизма.

Отъемно-доливной ферментационный процесс является промежуточным между периодическим и непрерывным. Культуральная жидкость отбирается более крупными порциями, чем в непрерывном процессе.

Многоциклический процесс является еще одним вариантом периодической ферментации. По завершении ферментационного цикла при сливе культуральной жидкости в аппарате остается ее примерно 10%, а затем в ферментер вносят 90% (объемн.) свежей питательной среды, и начинается новый ферментационный цикл. Таким образом, для этого процесса не надо ни выращивать нового посевного материала, ни подготовки и стерилизации ферментера и трубопроводов, одновременно экономятся время и средства.

По характеру культивирования продуцента в питательной среде выделяют поверхностную и глубинную ферментацию. Необходимо подчеркнуть, что большинство биообъектов, используемых в качестве продуцентов биотехнологических продуктов, являются аэробами.

При поверхностной ферментации биообъект растет на поверхности жидкой питательной среды. Хотя целевой продукт (если он водорастворим) распределяется по всему объему среды, биомасса его продуцента располагается лишь в виде поверхностной пленки в любого рода емкостях: колбах, включая так называемые микробиологические матрицы, бутылях и, наконец, даже в ферментерах при условии, что не работает мешалка и барботажное устройство, т.е. нет ни массообмена, ни аэрации. Биомассы оказывается очень мало и, соответственно, мало целевого продукта.

При глубинной ферментации, несмотря на различия конструкций ферментеров, клетки продуцента вследствие работы мешалки или турбинного перемешивания и пропускания под давлением воздуха через всю толщу среды «работают» во всем объеме питательной среды. Это делает процесс высокоэкономичным. В ферментере создаются условия для накопления большого количества активно функционирующей биомассы продуцента и, соответственно, целевого продукта.

В качестве примера, относящегося к истории биотехнологии , можно указать, что замена поверхностной ферментации на глубинную (в ферментационных аппаратах) позволила в короткий срок повысить производство пенициллина, особенно остро необходимого в годы Второй мировой войны.

Ферментационные процессы могут, наконец, быть дифференцированы в технологическом отношении и по типу целевого продукта. Целевым продуктом может быть биомасса; высокомолекулярное вещество (как правило фермент); низкомолекулярные метаболиты. Метаболит может быть первичным или вторичным. Таким образом, необходимость в индукторах и предшественниках, а также время их внесения в среду зависит от целевого продукта. Поскольку биосинтез вторичных метаболитов характерен для определенных стадий развития культуры продуцента и стимулируется в так называемых стрессовых ситуациях, например, при обеднении среды источниками углерода, азота, фосфора, внесение индуктора и предшественников обязательно в том случае, когда целью процесса является именно вторичный метаболит [13].

1.2 Технологические особенности процесса ферментации

В зависимости от доступа кислорода в процессе ферментации различают аэробное и анаэробное культивирование.

1.2.1 Аэробное культивирование

Аэробное культивирование -- аэрация среды -- непременное условие в тех микробиологических процессах, в которых используются аэробные микроорганизмы-продуценты.

Потребность аэробных микроорганизмов в молекулярном кислороде зависит от окисляемого источника углерода и от физиологических свойств и активности роста микроорганизмов. Для биосинтеза 1 кг дрожжевой биомассы необходимо, например, 0,74-2,6 кг молекулярного кислорода. При интенсивном потреблении субстрата независимо от источника углерода продуцент ассимилирует 0,83-4,0 мг кислорода/1 л среды/мин.

Растворимость кислорода в среде сравнительно низка и зависит от температуры, давления и от концентрации растворенных, эмульгированных и диспергированных компонентов, данные представлены в таблице 1. При давлении 0,1 МПа и температуре 30°С в 1 л дистиллированной воды максимальное количество растворенного кислорода составляет 7,5 мг. В реальной питательной среде максимальная растворимость кислорода колеблется в интервале 2-5 мг/л. Запасы кислорода в среде обеспечивают жизнедеятельность аэробного продуцента в течение 0,5-2 мин.

При глубинном культивировании запасы кислорода в питательной среде возобновляются при подаче аэрирующего воздуха. Скорость абсорбции кислорода увеличивается с ростом интенсивности перемешивания среды в таблице 2.

Во время роста биомассы микроорганизмы обычно потребляют больше кислорода, чем во время сверхсинтеза целевого метаболита. Принято говорить о критической концентрации кислорода, при которой наблюдается лимитация дыхания клеток. Для большинства аэробных микроорганизмов, растущих в сахаросодержащих субстратах, критическая концентрация кислорода 0,05-0,10 мг/л, что соответствует 3-8 % от полного насыщения среды кислородом. Лимитация роста и физиологической деятельности клеток наблюдается при более высоких концентрациях кислорода: на средах с глюкозой рост дрожжей лимитируется при рО2 на уровне 20-25 % от полного насыщения.

Оптимальной для роста биомассы считается концентрация кислорода 50-60 % от полного насыщения, для биосинтеза целевых метаболитов -- 10-20 %. Для аэрации культур используют, как правило, обычный воздух. В ферментерах принудительную аэрацию обычно совмещают с механическим перемешиванием мешалками, скорость которых может достигать сотен и тысяч оборотов в минуту. Количество пропускаемого воздуха на заданном уровне поддерживают автоматически. Воздух стерилизуют путем прохождения через активированный древесный уголь, стеклянную вату, пропитанную антисептиком, или специальные ткани из полимеров.

Таблица 1 - Зависимость абсорбции кислорода в воде (мг/л) от концентрации диспергированных компонентов (20 °С)

Сахароза	Подсолнечное масло	Биомасса
концентрация,%	абсорбция О2	концентрация,%	абсорбцияО2	концентрация,%	абсорбцияО2
0	8,2	0	8,9	0	8,0
2,5	7,8	0,05	11,6	3,0	4,1
5,0	7,2	0,10	18,9	6,0	2,4
7,5	6,6	0,15	19,0	9,6	1,5
10,0	5,9	0,20	22,3	16,0	1,2
15,0	4,8	0,25	24,0	32,0	0,8

Таблица 2 - Зависимость скорости абсорбции кислорода в воде от аэрации и перемешивания среды (мг/(л*мин)) [1]

Количество подаваемого воздуха, м3/(м3*мин)	Частота вращения мешалки, мин-1
	0	500	800	1000	2000
0,35	1,3	4,0	7,5	14,5	15,1
0,65	3,5	7,3	12,1	19,1	22,1
1,00	6,0	10,0	15,0	23,0	24,0
1,30	7,5	13,9	18,0	26,0	28,0
1,60	11,0	15,5	20,0	27,0	29,0

1.2.2 Анаэробное культивирование

Анаэробные процессы биологического окисления у гетеротрофных микроорганизмов в зависимости от того, что является конечным акцептором водородных атомов или электронов, делят на три группы: дыхание (акцептор -- кислород); брожение (акцептор -- органическое вещество) и анаэробное дыхание (акцептор -- неорганическое вещество: нитраты, сульфаты и др.).

У облигатных анаэробов брожение является единственно возможным способом получения энергии; у факультативных анаэробов оно составляет обязательную первую стадию катаболизма глюкозы, за которой может следовать аэробное окисление образовавшихся продуктов, если в среде присутствует кислород.

Обособленной промежуточной группой являются аэротолерантные микроорганизмы, получающие необходимую для жизнедеятельности энергию в анаэробном процессе, т. е. на уровне субстратного фосфорилирования, и одновременно имеющие дыхательную цепь для поглощения кислорода среды и создания благоприятных анаэробных условий. Данный эффект носит название «эффекта дыхательной защиты».

Примерами облигатно анаэробных процессов являются маслянокислое и метановое брожения. Универсальным для всех микроорганизмов, за небольшими исключениями, является катаболизм глюкозы -- гликолиз до образования пирувата. Механизм гликолиза отражен в уравнении (1).

Глюкоза + 2АТР + 2 NAD = 2 Пируват + 4АТР + 2NADH + 2Н+ (1)

Возбудители спиртового брожения (дрожжи) после декарбоксилирования пирувата и образования ацетальдегида восстанавливают ацетальдегид до этанола. Молочнокислые бактерии гомогенного молочнокислого брожения восстанавливают пируват до молочной кислоты. Гетероферментативные молочнокислые бактерии сбраживают глюкозу по несколько отличающемуся пентозофосфатному пути с образованием молочной кислоты, а также уксусной кислоты, этанола и диоксида углерода.

Выращивание анаэробов гораздо сложнее, чем аэробных микроорганизмов, так как соприкосновение клеток анаэробов с кислородом воздуха должно быть сведено к минимуму или даже полностью исключено. Для этого используют различные приемы, нередко, комбинируя их, друг с другом.

Выращивание в высоком слое среды. Это наиболее простой способ ограничения доступа воздуха к клеткам. Жидкую среду заливают в ферментеры высоким слоем, а посевной материал вносят на дно аппарата.

Культивирование в вязких средах. Диффузия кислорода в жидкость уменьшается с увеличением ее вязкости. Поэтому в средах с картофельным или кукурузным крахмалом хорошо развиваются некоторые облигатные анаэробы, например, возбудители маслянокислого и ацетобутилового брожения.

Помимо этого анаэробные условия на производстве создают герметизацией аппаратуры, продуванием среды инертными газами, в том числе газообразными продуктами, образовавшимися во время ферментации. Отсутствие необходимости аэрации среды несколько упрощает при анаэробной ферментации конструкцию ферментера (биореактора) и облегчает управление процессом [19].

1.3 Конструкции ферментеров

При ферментационной технологии можно использовать цельные живые клетки (микробов, клетки животных и растений) или какие-нибудь клеточные компоненты (например, ферменты) с целью физических или химических преобразований органических веществ. Однако недостаточно получать требуемые изменения веществ, метод должен иметь преимущества перед другими, применяемыми в настоящее время, технологиями производства этих же самых продуктов. Преимущества производства органических продуктов биотехнологическими способами перед чисто химическими методами достаточно многогранны:

1)многие сложные органические молекулы, такие, как белки и антибиотики, не могут практически быть синтезированы химическими способами;

2)биоконверсия обеспечивает значительно больший выход целевого продукта;

3)биологические системы функционируют при более низких температурах, менее высоких значениях рН (близких к нейтральному) и т. п.;

4)каталитические биологические реакции намного специфичнее, чем реакции химического катализа;

5)биологические процессы обеспечивают почти исключительно продукцию чистых изомеров одного типа, а не их смесей, как это часто бывает в реакциях химического синтеза.

Но вместе с тем биологические способы в сравнении с химическими методами обладают рядом явных недостатков:

1)биологические системы могут легко быть загрязнены посторонней нежелательной микрофлорой.

2)целевой продукт, синтезируемый биологическим способом, присутствует в довольно сложной смеси, что обусловливает необходимость разделения его от примеси ненужных веществ.

3)биотехнологические производства требуют больших количеств воды, которую в итоге необходимо удалять, сбрасывая в окружающую среду.

4)биопроцессы обычно идут медленнее в сравнении со стандартными

химическими процессами.

Ферментеры обычно представляют собой герметические цилиндрические емкости, высота которых в 2-2,5 раза превышает диаметр. Чаще всего их изготовляют из нержавеющей стали. Для поддержания температуры в аппарате имеется двойной кожух или теплообменник типа змеевика.

Главное требование к аппаратам -- сохранение стерильности, поэтому они должны быть герметичными, все линии трубопроводов должны быть доступны для обработки горячим паром. Рабочий объем ферментера обычно не превышает 7/10 общего объема.

Тип ферментера для каждого биотехнологического процесса выбирают с учетом специфики продуцента, свойств среды и экономических соображений. Важное значение для аэробного процесса имеет система аэрации. При этом оценивают, с одной стороны, скорости поступления кислорода с жидкостью и его массопередачи от газовой фазы, с другой -- скорости потребления кислорода микроорганизмами и его удаления с отработавшей жидкостью. Скорость перехода кислорода из газовой фазы в жидкую выражают через объемную скорость абсорбции. Изменение концентрации кислорода в жидкой фазе характеризуется уравнением (2).

dC/dt = KLa (Cp - С), (2)

где KLa - объемный коэффициент массопередачи на границе газ--жидкость; Сp - равновесная концентрация кислорода в среде; С - фактическая мгновенная концентрация кислорода в среде.

Для каждого биотехнологического процесса должна быть разработана

подходящая схема, а сам процесс должен постоянно наблюдаться и тщательно контролироваться. Для большинства практических биотехнологических процессов такими системами являются ферментеры или биореакторы, которые обеспечивают необходимые физические условия, способствующие наилучшему взаимодействию катализатора со средой и поставляемым материалом. Биореакторы варьируют от простых сосудов до весьма сложных систем с различным уровнем компьютерного оснащения.

Биореакторы изготавливаются в двух вариантах или типах. Первый тип для нестерильных систем, когда нет абсолютной необходимости оперировать с чистыми культурами микроорганизмов (например, ферментация при пивоварении, производство пекарских дрожжей и т. п.).

Биореакторы второго типа предназначены для асептических процессов, обычно используемых в производстве таких соединений как, антибиотики, аминокислоты, полисахариды и одноклеточный бактериальный белок. В реакторах такого типа все посторонние микроорганизмы должны быть исключены, что, естественно, связано со значительными сложностями при их конструировании и разработке самого биотехнологического процесса. Основное требование к биореакторам любого типа сводится к обеспечению оптимальных условий роста продуцента или накоплению синтезируемого им продукта. Для достижения указанных целей необходимо разрабатывать технологию, призванную оптимизировать процесс, а именно: использовать подходящий источник энергии, набор питательных веществ должен соответствовать питательным потребностям организма-продуцента, из ростовой среды должны быть удалены соединения, ингибирующие его жизнедеятельность, должна быть подобрана соответствующая посевная доза и, наконец, обеспечены все остальные требуемые физико-химические условия. Экономически рентабельные процессы в своей основе весьма сходны, независимо от избранного продуцента, используемой среды и образуемого продукта. Главная задача - получение максимального количества клеток с одинаковыми свойствами при их выращивании в определенных тщательно контролируемых условиях. Фактически один и тот же биореактор (лишь с небольшими изменениями) может быть использован для производства ферментов, антибиотиков, органического белка. Специфика биотехнологических процессов состоит в том, что в них участвуют живые клетки, субклеточные структуры или выделенные из клеток ферменты и их комплексы. Это оказывает довольно существенное влияние на процессы массопередачи (обмена веществ между различными фазами - перенос кислорода из газообразной фазы в жидкую) и теплообмена (перераспределение тепловой энергии между взаимодействующими фазами). Поэтому одним из важнейших компонентов биореакторов является система перемешивания, обеспечивающая однородность условий в аппарате, оптимальность между фазами реактора, между культуральной жидкостью и клетками и т. д.

Системы аэрации зачастую бывают очень сложной конструкции, поскольку они должны обеспечить баланс между расходом О2 и его поступлением в нужных количествах, учитывая тот факт, что потребность в кислороде не одинакова на различных стадиях культивирования. Крайне важным является обеспечение должного уровня теплообмена в биореакторах, поскольку жизнедеятельность и метаболическая активность объектов зависит в значительной степени от колебаний температуры. Поддержание температуры в определенном узком диапазоне диктуется: резким снижением активности ферментов по мере падения температуры и необратимой инактивацией (денатурацией) макромолекул (в первую очередь белков) при ее повышении до критических значений. Температурный оптимум у каждого организма лежит в определенных пределах. Большинство биотехнологических процессов осуществляется в мезофильных условиях (30-50 0С). С одной, это имеет преимущество, потому что лишь в редких случаях обеспечивать повышенный подогрев реакторов. Однако, с другой стороны, возникает проблема удаления избыточного тепла, выделяющегося при интенсивном росте культивируемых клеток, поэтому биореактор должен быть оснащен эффективной системой охлаждения. Еще одной серьезной проблемой при культивировании в биореакторах является пенообразование, связанное с необходимостью аэрирования содержимого, в котором постоянно присутствуют поверхностно-активные вещества (ПАВ) продукты распада жиров (мыла) и белки (составные компоненты субстрата например, белки соевой и кукурузной муки и т. п.). Образующийся слой пены опять же, с одной стороны, способствует росту аэробных микроорганизмов, а с другой - сокращает полезный объем реактора и способствует заражению культуры посторонней микрофлорой. Это заставляет интенсивно разрабатывать эффективные системы пеногашения.

Специфическим элементом биореактора является система, обеспечивающая стерильность процесса. Стерилизация осуществляется на разных этапах процесса, как до его начала, так и при осуществлении и после окончания. Иными словами, в биотехнологическом производстве важное место отводится принципу асептики, выдвинутому еще в 60-е годы XIX в. Луи Пастером.

В последнее время в биотехнологию внедряется принцип дифференцирования режимов культивирования: разные этапы одного и того же процесса осуществляются при различных условиях - температура, рН, аэрация и т. п. Естественно, это создает новые (дополнительные) требования при конструировании реакторов. Таким образом, в соответствии с основными принципами реализации биотехнологических процессов современные биореакторы должны обладать следующими системами:

- эффективного перемешивания и гомогенизации среды выращивания;

- обеспечения свободной и быстрой диффузии газообразных компонентов системы (аэрирование в первую очередь);

- теплообмена, обеспечивающего поддержание оптимальной температуры внутри реактора и ее контролируемые изменения;

- пеногашения;

- стерилизации сред, воздуха и самой аппаратуры;

- контроля и регулировки процесса и его отдельных этапов [4] .

Для создания оптимальной биореакторной системы необходимо точно придерживаться следующей генеральной линии:

1)ферментер должен быть сконструирован так, чтобы исключить попадание загрязняющих микроорганизмов, а также обеспечить сохранения требуемой микрофлоры;

2) объем культивирумой смеси должен оставаться постоянным, т. е. чтобы не было утечки или испарения содержимого;

3) уровень растворенного кислорода должен поддерживаться выше критических уровней аэрирования культуры аэробных организмов;

4) параметры внешней среды, такие, как температура, рН и т. п., должны постоянно контролироваться;

5) культура при выращивании должна быть хорошо перемешиваемая.

К материалам, используемым при конструировании сложных, прецизионно работающих ферменторов, предъявляются определенные требования (порой весьма строгие):

а) все материалы, вступающие в контакт с растворами, подающимися в биореактор, соприкасающиеся с культурой микроорганизма, должны быть устойчивыми к коррозии, чтобы предотвратить загрязнения металлами даже в следовых количествах;

б) материалы должны быть нетоксичным и, чтобы даже при самой малой растворимости они не могли бы ингибировать рост культуры;

в) компоненты и материалы биореактора должны выдерживать повторную стерилизацию паром под давлением;

г) перемешивающая система биореактора и места поступления и выхода материалов и продуктов должны быть легко доступными и достаточно прочными, чтобы не деформироваться или ломаться при механических воздействиях;

д) необходимо обеспечить визуальное наблюдение за средой и культурой, так что материалы, используемые в процессе, по возможности должны быть прозрачными.

Для оптимизации биотехнологических процессов требуется постоянный и тщательный контроль за изменяющейся картиной ферментации, что обеспечивается наличием в биореакторах соответствующих датчиков, позволяющих осуществлять избирательный анализ определенных параметров ферментационного процесса.

Неотъемлемой частью большинства ферментаций является та или иная степень компьютеризации. За последние десятилетия форма биореакторов существенно изменилась. Первые (исходные) ферментационные системы представляли собой неглубокие емкости, перемешивание в которых осуществлялось либо путем их встряхивания, либо посредством перемешиваниясодержимого вручную. На основе первичных систем в последующем были созданы аэрируемые башенные конструкции, которые в настоящее время доминируют в промышленном производстве. Системы перемешивания являются важным классификационным принципом биореакторов различного типа. Правда, поскольку биореакторы являются многопараметровыми аппаратами, они могут классифицироваться и по другим критериям: размерам, целевым назначениям (лабораторные, опытно-промышленные или пилотные, промышленные), режиму работы (периодического и непрерывного действия), условиям культивирования (аэробные и анаэробные, мезофильные и термофильные, для поверхностного и глубинного выращивания, для жидких и твердых питательных сред, газофазные).

И все же система перемешивания имеет не последнее значение в классификации. По способу перемешивания и аэрации биореакторы подразделяются на аппараты с механическим, пневматическим и циркуляционным перемешиванием.

По структуре потоков ферментеры (биореакторы) могут быть аппаратами полного перемешивания или полного вытеснения.

Конструктивные различия ферментеров (биореакторов) определяются в основном способами подвода энергии и аэрации среды:

1)ферментеры с подводом энергии к газовой фазе;

2)ферментеры с подводом энергии к жидкой фазе;

3)ферментеры с комбинированным подводом энергии [10].

1.3.1Ферментеры с подводом энергии к газовой фазе

В аппаратах этого типа аэрация и перемешивание культуральной жидкости осуществляются сжатым воздухом, который подается в ферментер (биореактор) под определенным давлением. К таким ферментерам (биореакторам) относят:

- барботажные ферментеры представлены на рисунке 3, подача воздуха в которых осуществляется через барботажные устройства, расположенные в нижней части аппарата;



Рисунок 3 - Барботажный ферментер: 1 - корпус; 2 - воздухораспределитель; 3 - карман; 4 - коллектор

- аппараты с диффузором (эрлифтные аэраторы), имеющие внутренний цилиндр-диффузор, который обеспечивает перемешивание поступающих по распределительным трубам в нижнюю часть аппарата субстрата и воздуха;

- трубчатые ферментеры (газлифтные), состоящие из реактора кожухотрубчатого типа, через который жидкость потоком воздуха перемещается в верхнюю часть аппарата и, попадая в сепаратор, возвращается в реактор, где снова увлекается воздухом, подвергаясь таким образом циркуляции на рисунке 4;

Рисунок 4 - Газлифтный ферментер: 1 - корпус; 2 - диффузор; 3 - диспергатор; 4 - воздухораспределитель; 5 - теплообменник

- ферментеры (биореакторы) с форсуночным воздухораспределением, оборудованные форсунками для подачи воздуха, расположенными в нижней части аппарата, и находящимся над ними диффузором, который обеспечивает внутреннюю циркуляцию жидкости;

- ферментеры (биореакторы) колонного типа, представляющие собой цилиндрическую колонну, разделенную горизонтальными перегородками (тарелками) на секции; воздух барботирует через слой жидкости каждой тарелки, а перемещение жидкости через кольцевую щель обеспечивает противоточное движение жидкой и газовой фаз [6]

1.3.2 Ферментеры с подводом энергии к жидкой фазе

К таким аппаратам относят:

- аппарат с самовсасывающей турбиной представлен на рисунке 5, имеющий цилиндрический диффузор и мешалку с полыми лопастями и валом, при вращении которой за счет создаваемого разрежения происходит самовсасывание воздуха, благодаря чему происходит подъем жидкости в кольцевом зазоре между диффузором и стенками аппарата с последующим ее возвращением в диффузор;

Рисунок 5 - Ферментер с самовсасывающей турбиной: 1 - корпус; 2 - диффузор; 3 -самсовсасывающая мешалка; 4 - теплообменник; 5 - фильтр

- ферментер (биореактор) с турбоэжекторными перемешивающими устройствами -- аппарат, разделенный вертикальными перегородками на секции, в каждой из которой имеется самовсасывающая мешалка турбинного типа (эжектор) и диффузор; для перемещения жидкости из секции в секцию в перегородках сделаны окна [9]

1.3.3 Ферментеры с комбинированным подводом энергии

В этих аппаратах осуществлен подвод энергии к газовой фазе для аэрации и к жидкой фазе для перемешивания. Ферментер представляет собой цилиндрический сосуд, снабженный механической мешалкой и барботером, который устанавливается, как правило, под нижним ярусом мешалки.

По способу перемешивания, в соответствии с которым используются аппараты, их разделяют на ферментеры с механическим, пневматическим и циркуляционным перемешиванием [12].

Эти реакторы имеют механическую мешалку с центральным валом и лопастями (лопатками), число которых обычно равно 6, реже 8 на рисунке 6.Лопасти могут быть прямыми или изогнутыми, часто их располагают в несколько ярусов, что обеспечивает более эффективное перемешивание больших объемов жидкости. В систему входят также отражательные перегородки - узкие металлические пластинки, прикрепленные к внутренним стенкам биореактора. Они предотвращают возникновение водоворотов и обеспечивают вихревое движение жидкости, равномерно распределяемое по всему объему реактора. Однако в ряде случаев они не могут быть применены (культивирование мицелиальных грибов), так как обрастают микроорганизмами (мицелием). Нежное и медленное перемешивание создается в биореакторах, предназначаемых для выращивания клеток животных и (в меньшей степени) растений. Аэрация (без явного, интенсивного перемешивания) может осуществляться путем барботажа - подачи воздуха снизу через горизонтальную трубку с отверстиями, иногда аэрирование достигается применением специальных вибраторов, которые обеспечивают высокую степень асептики, малый расход энергии и относительно слабо травмируют клетки [15].

В аппаратах с пневматическим перемешиванием мешалка отсутствует и перемешивание жидкости осуществляется пузырьками газа на рисунке 7. Естественно, что скорость массообмена в них намного ниже, чем в ферменторах с механическим перемешиванием (с мешалками). Классическим аппаратом такого типа является эрлифтный реактор (air lift - подъем воздуха). Биореакторы с пневматическим перемешиванием характеризуются более мягким (плавным) перемешиванием содержимого и получили распространение при выращивании клеток животных и растений. Пневматические аппараты привлекают также простотой конструкции и малыми энергозатратами. Основной их недостаток - "тихоходность" Однако и это не всегда является недостатком, поскольку, например, в условиях "тихоходных" установок культуры клеток растений характеризуются биосинтетическими способностями, присущими целому растению. Так, клетки Digitalis lanata в эрлифтном ферменторе продуцируют ценный кардиологический препарат - р - метилдигоксин.

Рисунок 6 - Ферментер с механическим перемешиванием

Перемешивание и аэрация усиливаются с помощью вращающихся дисков с отверстиями, установленных вблизи барботера, или с помощью придонных пропеллеров. Классический эрлифтный аппарат дополнен диффузором, нижний обрез которого находится над барботером. Возможны варианты подачи воздуха как во внутренний, так и во внешний по отношению к диффузору объем среды [18].



Рисунок 7 - Ферментеры с пневматическим перемешиванием: А-эрлифтный; В - пузырькового типа

Биореакторы циркуляционного или гидродинамичесиого типа оснащены насосами и эжекторами, создающими направленный токжидкости по замкнутому контуру (кругу). Жидкость увлекает за собой пузырьки газа и тем самым культуральная среда одновременно с перемешиванием может насыщаться либо атмосферным кислородом, либо (с использованием специальных устройств и эжекторов) газом иного типа. Эти аппараты отличаются простотой конструкции и надежностью в эксплуатации. Ферменторы циркуляционного типа часто заполняются твердыми частицами (насадкой), которые способствуют лучшему перемешиванию содержимого реактора, препятствуют обрастанию стенок при длительном культивировании, а также обеспечивают диспергирование воздуха в жидкости. Некоторые микроорганизмы, прикрепляясь к таким насадкам (в частности, грибы и актиномицеты), развиваются намного лучше. От биореакторов с насадками - один шаг к ферменторам для иммобилизованных клеток или к аппаратам для иммобилизованных ферментов. В последнее время разрабатываются новые способы аэрации.

Например, воздух может подаваться через специальные полипропиленовые мембраны. Это позволяет избегать пенообразования и очень хорошо зарекомендовало себя при выращивании клеток эукариотических организмов, в частности при промышленном получении интерферона.

Существуют разные варианты такого типа аппаратов: аппараты типа «падающей струи», типа «погруженной струи [17]

1.4 Системы теплообмена, пеногащения, стерилизации

Теплообмен осуществляется с помощью труб с охлаждающим или нагревающим агентом, которые оплетают аппарат и образуют так называемую рубашку реактора. Иногда эта система труб располагается непосредственно в полости ферментора. Нагревающими агентами в промышленных биореакторах служат горячая вода или пар. Естественно, в лабораторных ферментерах чаще используется электрический подогрев. В качестве охлаждающих агентов применяют воду с низкой температурой (артезианскую или пропущенную через холодильную установку); более глубокое охлаждение достигается использованием этиленгликоля или фреонов. Проблема охлаждения ферменторов становится очень значительной в промышленных масштабах.

Пеногашение - средство борьбы с избыточным ценообразованием. Существуют химические, механические, акустические и другие виды пеногашения. Наиболее часто применяют химические и механические способы пеногашения. К химическим средствам относятся поверхностно- активные вещества, которые, внедряясь в стенки пузырей, становятся центрами их неустойчивости. Эффективными пеногасителями служат растительные (соевое, рапсовое, кокосовое, подсолнечное, горчичное) масла, животные (сало, рыбий жир) и минеральные жиры. Недостатком этих пеногасителей является то, что при их утилизации микробными клетками сами по себе способствуют пенообразованию. Механические пеногасители представляют собой различные устройства, сбивающие пену: диски, лопасти, барабаны, располагающиеся в верхней части реактора. Более сложными приспособлениями являются сепараторы пены, которые одновременно служат для сбора биомассы, содержащейся в пенном слое. Все эти устройства, конечно же, приводят к дополнительным затратам и удорожают производство [2].

Устройства и режим стерилизации определяется конструкцией биореактора, вспомогательного оборудования, используемых питательных сред и т. п. Наибольшее значение имеют термический метод стерилизации оборудования и сред и фильтрационный способ, применяемый для удаления микроорганизмов из подаваемого в ферменторы воздуха или другого газа.

Режимы термальных способов стерилизации определяются химическим составом питательных сред. При этом определяющим является состояние компонентов среды после стерилизации; главное сохранность ее питательных качеств [11].

1.5 Проблемы масштабирования ферментационных процессов

Технология производственного процесса отрабатывается поэтапно: в лабораторных, пилотных (опытно-промышленных) и промышленных установках. Чаще встречаются аппараты с объемами ферменторной камеры: 0,5-100 л (лабораторные), 100-5000 л (пилотные) и 5000-1000000 л и более (промышленные). На каждом этапе увеличения масштаба ферментации (процесса) - масштабном переходе (масштабировании биотехнологического процесса) - решаются конкретные задачи отработки (налаживания) производства и его оптимизации.

Лабораторные ферменторы по устройству и форме напоминают промышленные и подразделяются на те же типы. Правда, в лабораторных масштабах наиболее часто применяются аппараты с механическим перемешиванием. По принципу теплообмена и стерилизации они делятся на две категории. К первой относятся лишенные собственных системтеплообмена и стерилизации. Такие аппараты, по сути дела, представляют собой камеры для культивирования, помещаемые в водяные бани и стерилизуемые в автоклавах. Аппараты второй категории снабжены системами теплообмена и стерилизации, принципиально не отличающимися от таковых промышленных установок.

С помощью лабораторных биореакторов решаются следующие задачи:

1) кинетические - определение скорости роста клеток, эффективность утилизации субстратов и образования целевого продукта;

2) некоторые массообменные - расчет коэффициентов массопередачи, скорость поступления в среду О₂ и других газов, скорость освобождения от газообразных продуктов, образующихся при культивировании продуцентов (в первую очередь СО₂);

3) определение коэффициентов реакций, связывающих утилизируемые субстраты и О₂ с получаемыми целевым и побочными продуктами.

Пилотные установки используют для поиска (отсюда и название) наиболее целесообразных технологий и в общих чертах моделирование промышленного процесса. Поэтому на данном этапе стараются применять тот тип аппарата, который предполагается использовать в промышленном

масштабе. Иными словами, отрабатываются все аспекты производства, вплоть до штатных вопросов. При масштабных переходах следует постоянно иметь в виду, что при соблюдении одинаковых условий (среда, тип аппарата, температура и рН, скорость перемешивания) уровень и скорость синтеза целевого продукта могут существенно различаться ситуация, очень четко прослеженная еще в 1940-1950 гг. при организации крупномасштабных производств антибиотиков.

Вследствие сказанного при переходе от лабораторных к пилотным, а затем от пилотных к промышленным установкам, приходится наряду с объемом изменять и конструкцию, и режимы работы аппаратов. Центральной проблемой при этом является подбор надежных критериев масштабирования, обеспечивающих разработку высокоэффективных и экономичных технологий промышленного производства целевого продукта [14].

2. Технологическая часть

2.1 Расчет продуктового баланса получения б - амилазы

1.Количество ферментоционной среды с учетом потерь (10%) засчет уноса среды с отходящими от ферментера газами

Количество готовой культуральной жидкости (к.ж.) - (G) составит -1 м³.Потери с уносом - 10%.

Количество засеянной питательной среды составит:

G₁= GЧ1,1м³

G₁= 1Ч1,1 = 1,1м³

2.Расход компонентов питательной среды для приготовления 1,1 м³ (G₁) ферментационной среды, и содержание абсолютно сухих веществ в ней.

Общий расход компонентов для ферментационной среды:

G₂=g₁+g₂ и т.д., где g₁, g₂ и т.д. - расход отдельного компонента среды.

G₂= 1,1Ч( 0,93+0,03+0,03+0,008+0,002)= 1,1м³

Содержание абсолютно сухих веществ в ферментационной среде:

G₃=c₁+c₂+c₃ и т.д., где с₁,с₂ и т.д. - содержание абсолютно сухих веществ каждого компонента среды, которая определяется путем умножения расхода компонента на содержание a, c, b в компоненте в соответствии с ГОСТом.

G₃=27,9+2,94+1,8+0,04+0,01=32,69 кг

Количество посевного материала для засева ферментационной среды (посевная доза - 2% по отношению к G₁):

G₄=G₁Ч0,02 м³

G₄=1,1Ч0,02=0,022 м³

Потери при выращивании посевного материала - 5%.

Количество готового посевного материала составит:

G₅= G₄Ч0,95м³

G₅= 0,022Ч0,95=0,0209м³

Расход компонентов питательной среды для получения посевного материала:

Общий расход компонентов для посевной среды:

G₆=g₁+g₂+ и т.д.,где g₁, g₂ и т.д. - расход отдельного компонента посевной среды.

G₆=0,0209 м³

Содержание абсолютно сухих веществ в посевной среде:

G₇= c₁+с₂+с₃ и т.д.

G₇= 0,058+0,061+0004+0,00008+0,00002 = 0,1231 кг

Количество среды, поступившей в ферментер (среда для ферментации + посевной материал):

G₈= G₁+G₅ м³

G₈= 1,1+0,0209 = 1,1209 м³

Содержание абсолютно сухих веществ при этом составит:

G₉=G₃+G₇ кг

G₉=32,69+0,1231 = 32,8131 кг

Количество культуральной жидкости (к.ж.), полученной после ферментации и поступившей на стадии обработки (выход с учетом уноса с отходящими газами - 90%):

G₁₀=G₈Ч0,9 м³

G₁₀=1,1209Ч0,9= 1,00881 м³

Потери к.ж. с отходящими газами составят 10%:

G₁₁=G₈Ч0,1 м³

G₁₁=1,1209Ч0,1= 0,11209 м³

При этом потери абсолютно сухих веществ с отходящими газами составит 10%:

G₁₂=G₉Ч0,1 кг

G₁₂=32,8131Ч0,1=3,28131 кг

Активность культуральной жидкости: А₁.

Общая активность в культуральной жидкости:

А₂=А₁ЧG₁₀ ед

А₂=8000Ч1,00881= 8070,48 ед

Затраты абсолютно сухих веществ на энергию биосинтеза 15%:

G₁₃=G₉Ч0,15 кг

G₁₃=32,8131Ч0,15= 4,9220 кг

Количество абсолютно сухих веществ в культуральной жидкости, поступившей на обработку:

G₁₄=G₉-(G₁₂+G₁₃) кг

G₁₄=32,8131-(3,28131+4,9220)=24,6098 кг

3.Фильтрация культуральной жидкости

Расход воды на промывку осадка при гидромодуле 1:0,5:

G₁₅=G₁₀Ч0,5 дм³

G₁₅=1,00881Ч0,5= 504,405 дм³

Количество полученного фильтрата с учетом 10% потерь на фильтрации:

G₁₆= (G₁₀+G₁₅)Ч(1-0,1) см³

G₁₆= (1,00881+504,405)Ч(1-0,1) = 1361893,5см³

Активность фильтрата с учетом потерь от инактивации 5%:

A₃= ед/см³

A₃= = 0,005 ед/см³

Общая активность фильтрата:

A₄=G₁₆ЧA₃ ед

A₄=1361893,5Ч0,005= 6809,46 ед

Потери активности на стадии составят: a₁=A₂-A₄= 8090,48- 6809,46= 1261,02 ед из них:

- потери активности с биомассой (а₂) составляют 7%:

а₂=аЧ0,07= 1261,02Ч0,07= 88,2714 ед,

- потери от инактивации а₃=а₁-а₂= 1261,02- 88,2714= 1172,7486 ед

Количество абсолютно сухого остатка, отделенного при фильтрации:

При фильтрации в к.ж. в осадке остается 40% от содержания абсолютно сухих веществ, содержащихся в к.ж.:

G₁₇=G₁₄Ч0.4 кг

G₁₇=24,6098Ч0.4= 9,8439 кг

При влажности осадка 85%, его количество составляет:

G₁₈= = = 65,626кг, или

G₁₉= = = 54,6883дм³, где 1,2 - плотность осадка.

Содержание абсолютно схих веществ в фильтрате:

G₂₀=G₁₄-G₁₇ кг

G₂₀=24,6098- 9,8439= 14,7659 кг

4.Концентрирование ферментного раствора методом ультрафильтрации:

Количество ультраконцентрата при степени концентрирования - 10:

G₂₁=G₁₆:10 дм³

G₂₁=1361893,5:10= 136,189 дм³

Активность амилазы в ультраконцентрате с учетом 10% потерь:

А₅= ед/см³

А₅= = 0,045 ед/см³

Общая активность концентрата:

А₆=А₅ЧG₂₁ ед

А₆=0,045Ч136189,35= 6128,52 ед

Количество абсолютно сухих веществ в концентрате 7,5%:

G₂₂=G₂₁Ч0.075 кг

G₂₂=136,189Ч0.075= 10,2142 кг

Количество ультрафильтрата:

G₂₃=G₁₆-G₂₁ дм³

G₂₃=1361,8935-136,189= 1225,7045дм³

Количество абсолютно сухих веществ в ультрафильтрате:

G₂₄=G₂₀-G₂₂ кг

G₂₄=14,7659-10,2142= 4,5517 кг

Общая активность амилазыв ультрафильтрате (потери с ультрафильтратом - 6,5% от общей активности фильтрата):

А₇=А₄Ч0,065 ед

А₇= 6809,46Ч0,065 = 6366,84ед

Потери от инактивации - 3,5%:

а₄=А₇:С₂₃ ед/мл

а₄=6366,84:12257045 = 0,0005 ед/мл

5.Осаждение раствором Na₂SiO₃

Количество Na₂SiO₃ для осаждения амилазы составляет 70% от объема ультрафильтрата:

G₂₅= G₂₃Ч0,7м³

G₂₅= 1,2257095Ч0,7= 0,858 м³

Содержание амилазы в ультраконцентрате составляет 45%:

G₂₆= G₂₃Ч0,45м³

G₂₆= 1,2257045Ч0,45= 0,5516 м³

Количество осажденной амилазы составляет 98%:

G₂₇= G₂₆Ч0,98м³

G₂₇= 0,5516Ч0,98= 0,5405 м³

Активность осажденной амилазы с учетом 10% потерь:

А₈= ед/см³

А₈= = 0,004 ед/см³

Общая активность осадка:

А₉=А₈ЧG₂₇ ед

А₉=0,004Ч0,5405= 2162 ед

Количество абсолютно сухих веществ в осадке:

G₂₈= G₂₄Ч0,1кг

G₂₈= 4,5517Ч0,1= 0,45517 кг

6.Фильтрация осажденной амилазы

Количество осадка с учетом влажности увеличивается в 2 раза:

G₂₉= G₂₈Ч2= 0,5405Ч2= 1,088 м³

Содержание абсолютно сухих веществ в осадке с учетом потерь:

G₃₀= G₂₈Ч0,1= 0,45517Ч0,1= 0,045517 кг

Активность амилазы при этом составляет:

А₁₀=А₈Ч0,9= 0,004Ч0,9= 0,0036 ед/см³

Общая активность осадка:

А₁₁=А₁₀ЧG₂₉= 1,081Ч0,0036= 1985,8 ед

7.Сушка осадка амилазы

Количество высушенного препарата с учетом 10% потерь вещества с отходящим воздухом, содержание влаги в препарате 8%:

G₃₁= м³

G₃₁== 1,0575 м³

Активность амилазы:

А₁₂= ед/см³

А₁₂== 0,0003 ед/см³

Общая активность препарата:

А₁₃=А₁₂ЧG₃₁=0,0003Ч1,0575= 324 ед

Содержание абсолютно сухих веществ с учетом потерь:

G₃₂= G₃₀Ч0,1= 0,045517Ч0,1= 0,0045517 кг

8.Стандартизация сухого препарата

Количество препарата после стандартизации с учетом потерь:

G₃₃= G₃₂Ч0,98=1,0575Ч0,98= 1,03635 м³

Общая активность с учетом потерь:

А₁₄=А₁₃Ч0,99= 324Ч0,99= 320,76 ед

9.Фасовка, упаковка, маркировка

Потери на стадии упаковки составляют 1,0%. Количество упакованного препарата: G₃₄= G₃₃Ч0,99=1,03635Ч0,99=1,02599 м³

Активность препарата после упаковки составляет: