Открытие принципов введения специфических генных модификаций мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток

Размещено на http://allbest.ru

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ НАУКИ РФ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования

“БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ.М.АКМУЛЛЫ”

Естественно-географический факультет

Кафедра генетики

КУРСОВАЯ РАБОТА

Открытие принципов введения специфических генных модификаций мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток

по дисциплине “Генетика и селекция”

Хасбатуллина Гульназ Венеровна

Научный руководитель:

д.б.н., профессор В.Ю.Горбунова

Уфа-2020



Оглавление

Введение

Глава 1. Биографии лауреатов Нобелевской премии по физиологии и медицине 2007 года

1.1 Биография Марио Ренато Капекки

1.2 Биография Мартина Джона Эванса

1.3 Биография Оливера Смитиса

Глава 2. Открытие принципов введения специфических генных модификаций мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток (обзор научной литературы)

2.1 Эксперименты по открытию принципов введения специфических генных модификаций мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток

Выводы по 2 главе

Глава 3. Методы исследований

3.1 Векторные конструкции

3.2 Внесение вектора в эмбриональные стволовые клетки

3.3 Метилирование ДНК в контроле генома

3.4 "Программируемый нокаут генов"

Глава 4. Метод генного таргетирования и его внедрение в современную медицину

4.1 Генное таргетирование и трансгенез у млекопитающих

4.2 Примеры использования нокаутированных мышей для изучения функций генов и наследственных заболеваний человека

Выводы по 4 главе

Заключение

Список использованной литературы



Введение

В данной курсовой работе рассмотрены значительные достижения в области исследований в физиологии и медицине. В 2007 году докторам Марио Р. Капекки, Мартину Дж. Эвансу и Оливеру Смитису присуждается Нобелевская премия в области физиологии и медицины за открытие ими принципов введения специфических модификаций генов у мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток.

Актуальность исследования Нобелевских лауреатов обуславливается тем, что работа позволила модифицировать специфические гены в зародыше млекопитающих и вырастить потомство, которое несет и выражает модифицированный ген. Инструментарий экспериментальных генетических методов, разработанных Капекки, Эвансом и Смитисом, обычно называемый технологией нокаута, позволил ученым определить роль конкретных генов в развитии, физиологии и патологии. Он революционизировал науку о жизни и играет ключевую роль в развитии медицинской терапии.

Цель работы: сформировать представление о механизмах введения специфических модификаций генов у мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток и подробнее раскрыть их на примере открытий Нобелевских лауреатов.

Для достижения поставленных целей были поставлены следующие задачи:

- освоить методику поиска и обработки научной литературы;

- ознакомиться с экспериментами, на основе которых открыты и изучены механизмы введения специфических модификаций генов у мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток;

- исследовать пути открытия принципов введения специфических модификаций генов у мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток;

- освоить методы, на которых были основаны открытияпринципов введения специфических модификаций генов у мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток;

- раскрыть важнейшую роль исследования ученых.

Генное таргетирование часто используется для инактивации отдельных генов. Такая элиминация прояснила работу большого количества генов, развитие, физиологию, старение и болезни. Продолжающиеся международные усилия сделают нокаут для всех генов доступным для научных исследований и разработки фармацевтических продуктов в ближайшем будущем.

С помощью генного таргетинга теперь можно производить практически любой тип модификации ДНК в геноме мыши [7]. Таким образом, ученые могут определить важность отдельных генов в здоровье и болезни. Эта технология уже имеет более пятисот моделей заболеваний человека, таких как сердечно-сосудистые заболевания, нейродегенеративные заболевания, диабет и рак.



Глава 1. Биографии лауреатов Нобелевской премии по физиологии и медицине 2007 года

1.1 Биография Марио Ренато Капекки

Марио Рамберг Капекки (родился 6 октября 1937 года) - американский ученый итальянского происхождения, генетик, лауреат Нобелевской премии.

Рис. 1. Марио Ренато Капекки [9].

Родился Капекки в Вероне, в семье итальянского летчика Лучано Капекки. Во время Второй мировой мать Марио попала в концентрационный лагерь Дахау - за распространение антифашистских памфлетов и членство в антифашистской группе. Люси Рамберг, мать Марио Капекки, до ареста успевает продать большую часть своего имущества и передать их крестьянской семье, чтобы они позаботились о ребенке. Денег Люси хватает лишь на год,после этого юному Марио приходится покинуть приемную семью.

В 1967-м Марио Капекки получает степень доктора по биофизике в Гарварде, диссертацию свою Капекки писал под началом Уотсона.В 1969-м году Марио Капекки становится помощником профессора на факультете биохимии в Медицинской школе Гарварда. В 1971-м году Капекки повышают до адъюнкт-профессора: в 1973-м он устраивается в Университет Юты.С 1988-го Марио активно сотрудничает с Медицинским институтом Говарда Хьюза, кроме того, он числится членом Национальной Академии Наук и работает над рядом генетических проектов [9].

Из всех исследований, в которых Капекки принимает участие, более всего его прославило изучение генетического кода и легендарный эксперимент с мышью - которой Капекки сумел «отключить» с помощью стволовых клеток ряд генов.

Мышь в качестве подопытного животного Марио выбрал не случайно - он давно занимался изучением определенной генетической цепочки ДНК мышей. По-мнению ученого, эта цепочка играет ключевую роль в развитии эмбрионов не только у мышей, но и у всех многоклеточных живых существ. Тщательное изучение этой цепочки генов гарантированно приведет к целой серии прорывов в генетике, эмбриологии и многих смежных областях.

1.2 Биография Мартина Джона Эванса

Рис.2. Мартин Джон Эванс [8].

Сэр Мартин Джон Эванс(родился 1 января 1941) --британский биолог, который, с Мэтью Кауфман, был первым, кто вырастил эмбриональных стволовых клетокв культуре мышей. Он также известен, наряду с Марио Капекки и Смитис, за его работу в развитии нокаута мыши и связанной с ним технологии генного таргетирования, способ использования эмбриональных стволовых клеток для создания специфических генных модификаций у мышей.

Эванс родился в городе Страуд графства Глостершир. Как мальчик Эванс был тихим, застенчивым и любознательным. Он любил науку, и родители поощряли его образование.

Он пошел в среднюю школу в колледже Сент - Дунстана, независимой школы для мальчиков в Юго - Восточной Лондоне , где он начал изучать химию и физику и биологию. Эванс окончил Колледж Христа в 1963 году, хотя, он не сводил выпускные экзамены, потому что был болен мононуклеозом.

Он переехал в Университетский колледж Лондона, где он имел удачную позицию в качестве научного сотрудника, обучение лабораторных навыков под доктором Элизабет Деучер. Его цель в то время была «изолировать онтогенетический контролируемые м-РНК ». Он был награжден докторской степенью в 1969 году[8].

Он стал преподавателем в анатомии и эмбриологии отдела в Университетском колледже Лондона, где он занимался исследованиями и преподавал аспирантам и студентам старших курсов.

В 1978 году он переехал в отдел генетики в Кембриджском университете, где его работа совместно с Мэтью Кауфман началась в 1980 году и они разработали идею использования бластоцисты для выделения эмбриональных стволовых клеток.

В 1999 году он стал профессором генетики и директором школы Biosciences в Университете Кардиффа, где он работал до выхода на пенсию. В 2007 г. был удостоен Нобелевской премии по физиологии и медицине вместе с Капекки и Смитис за их работу в обнаружении способа введения гомологичной рекомбинации у мышей, использующих эмбриональные стволовые клетки.

Эванс был назначен президентом Университета Кардиффа 23 ноября 2009 года. Впоследствии Эванс стал канцлером университета Кардиффа,с 2012 года является почетным членом Колледжа Святого Эдмунда.

1.3 Биография Оливера Смитиса

Оливер Смитисродился в 1925 году в Великобритании, гражданин США, кандидат биологических наук в Оксфордском университете. Профессор патологии и лабораторной медицины в Университете Северной Каролины.

Рис.3. Оливер Смитис [11].

По его собственным словам, его интерес к науке зародился от раннего знакомства с радио и телескопами.

В 1951 году в Оксфорде ему была присвоена степень магистра, а позднее там же -- степень доктора философии по физиологии.

С 1953 по 1960 годы работал в медицинской исследовательской лаборатории в Торонтском университете, а с 1960 по 1988 годы -- в лаборатории университета Висконсин-Мэдисон. С 1988 года профессор лаборатории патологии и лабораторной медицины университета Северной Каролины.

С помощью разработанных им методик он проводил генетические исследования мышей. Он и Марио Капекки, независимо друг от друга, совершили важные открытия в области специфических генных модификаций у мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток.

В 2016 году Оливер Смитис подписал письмо с призывом к Greenpeace, Организации Объединенных Наций и правительствам всего мира прекратить борьбу с генетически модифицированными организмами (ГМО). Оливер Смитиз является почётным фелло оксфордского Баллиол-колледжа и президентом Общества генетиков Америкив 1975 году.



Глава 2. Открытие принципов введения специфических генных модификаций мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток (обзор научной литературы)

2.1 Эксперименты по открытию принципов введения специфических генных модификаций мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток

Мартин Эванс идентифицировал и выделил эмбриональную стволовую клетку раннего эмбриона, из которой происходят все клетки взрослого организма. Он установил его в культуре клеток, модифицировал генетически и повторно ввел в приемных матерей, чтобы произвести генетически модифицированное потомство. Марио Капекки и Оливер Смитис, независимо друг от друга, обнаружили, как гомологичная рекомбинация между сегментами молекул ДНК может быть использована для таргетирования генов в геноме млекопитающих и разработали методы для получения генетически модифицированных мышей.

Открытию генного таргетирования поспособствовал ряд исследований.

Концепция о том, что дифференцированные клетки и ткани получаются из недифференцированных стволовых клеток была предложена еще сто лет назад [1]. Однако их точные свойства оставались неуловимыми на протяжении многих десятилетий. Исследования тестикулярных тератом показали, что эти опухоли содержат тотипотентные клетки.

В 1950-х годах Лерой Стивенс в Лаборатории Джексона было обнаружено, что мыши штамма 129Sv имеют высокую частоту таких опухолей. Она показал, что их клетки могут развиваться в эмбриоидные тела, т. е. агрегаты эмбриональных клеток. При пересадке такие агрегаты могут индуцировать солидные опухоли с множеством различных типов клеток [2, 3]. Несколько лет спустя Клейнсмит и Пирс продемонстрировали, что такие опухоли были получены из недифференцированных эмбриональных клеток карциномы [4] .

На рис.1 показана общая стратегия генного таргетинга у мышей.

Рис.1

Где пункт А--это генное таргетирование эмбриональных стволовых (Эс) клеток в культуре сопровождается клонированием линии Эс-клеток, содержащей желаемые мутации. Положительный-отрицательный отбор используется для обогащения эмбриональных стволовых клеток, содержащих модифицированные гены.

В пункте Б эти эмбриональные стволовые клетки вводят в бластоцисты, которые вводят приемным матерям для получения химерных мышей, способных передавать мутантный ген своему потомству. Для облегчения выделения желаемого потомства эмбриональных стволовых клеток и реципиентные бластоцисты получают от мышей с различными аллелями окраски шерсти. На рисунке клетки ЭС(ES), нацеленные на ген, и их потомство показаны красным цветом, а бластоцисты-желтым.

Развитие методов культивирования клеток позволило исследователям установить культуры эмбриональных клеток карциномы (ЭК-клеток)из мышиных тестикулярных тератокарцином. Несколько ученых, включая Мартина Эванса из Кембриджского университета, сообщили о таких культурах в начале 70-х годов [5-7] .

Эванс получил 129sv мышей от Стивенса, установил колонию мышей и охарактеризовал полученные клетки тератомы в культуре [8, 9] . Эти клетки эмбриональной карциномы (ЭК) могут быть выращены на питательных слоях облученных фибробластов. Когда последние были изъяты, экстенсивно in vitro произошла дифференциация. Они проходили через примитивную эмбриональную эндодерму, которая сгущалась в эмбриоидные тела. Прикрепление на твердой поверхности породило все виды клеточных типов, включая кожу, нерв, бьющуюся сердечную мышцу и т. д. Это показало, что клетки ЭК дифференцируются таким же образом, как и внутренняя клеточная масса эмбриона мыши [8, 9] .

Эванс видел потенциал в использовании этих клеток EC не только для изучения культуры клеток, но и для создания химерных мышей. Чтобы реализовать это видение, он установил сотрудничество с Ричардом Гарднером в Оксфорде, который сделал инъекции клеток EC в бластоцисты и реимплантировал их в приемных мышей. Потомство было химерным, с вкладом клеток ЭК почти в каждой ткани [10] . Аналогичные выводы были сделаны несколькими другими группами примерно в то же время, [11] [12]. Однако у химерных мышей, несущих ЭК-производные клетки, развились множественные опухоли, и они не могли внести свой вклад в зародышевую линию из-за кариотипических аномалий.

Полученные результаты позволили предположить, что нормальные клетки со сходным фенотипом, как и клетки ЭК, могут быть найдены и использованы для экспериментов. В 1980 году Эванс объединился с эмбриологом Мэттом Кауфманом, чтобы объединить культуру клеток и манипуляции с эмбрионами. Как было описано Эвансом [14], он намеревался использовать гаплоидные эмбрионы для культивирования клеток, но подготовил некоторые диплоидные в качестве контроля.

Команда Эванса установила методы инъекции бластоцисты, чтобы проверить, действительно ли клетки ES могут способствовать функциональным зародышевым клеткам и, таким образом, использоваться для создания химерной мыши. Они сообщили об успешной передаче зародышей в 1984 году[17] .Следующим шагом было определить, можно ли использовать ES-клетки для введения генетического материала в зародышевую линию. Эванс и его коллеги заразили клетки Эс рекомбинантным ретровирусом перед введением их в бластоцисты [18]. Ретровирусная ДНК была идентифицирована у основателей и передана потомству F1, продемонстрировав введение чужеродной ДНК в мышиный зародыш [19] . В октябре 1986 года Эванс пришел к выводу, что "культивированные эмбриональные клетки обеспечивают эффективное средство для производства трансгенных животных" [19].

Эванс сделал важный шаг, введя мутантную форму специфического эндогенного гена в геном мыши. Он и его коллеги перевели мутантный ген гипоксантин фосфорибозилтрансферазы (HPRT), который является дефектным при синдроме Леша-Нихана, х-связанном моногенном дефекте метаболизма Пурина [21]. Несколько копий мутировавшего гена HPRT были введены в геном клеток ES при ретровирусной инфекции в культуре. Мутировавшие клетки Эс вводили в бластоцисты и вносили свой вклад в химеры. Мутации были переданы зародышевой линии и идентифицированы в мужском потомстве как потеря активности HPRT. В статье, опубликованной в Nature back-to-back с одним из Лаборатории Эванса, Хупер и др. В Эдинбурге сообщили о передаче зародышем другого мутированного гена HPRT, спонтанной мутации делеции в клетках ES [22]. Впервые модели заболеваний человека были созданы путем генетической манипуляции клетками ES.

Принцип рекомбинации между гомологичными генами был известен в течение полувека и был признан Нобелевской премией Джошуа Ледербергу в 1958 году за его исследования в области бактерий. В 70-е годы стало очевидно, что эукариоты используют аналогичный механизм для опосредования обмена генетической информацией между гомологичными хромосомами во время мейоза. Ранние исследования дрожжей сопровождались экспериментами, демонстрирующими рекомбинацию между последовательностями ретровирусной ДНК в геноме млекопитающих и введенной олигомерной ретровирусной ДНК. Новаторская работа Ричарда Акселя показал, что культивированные клетки млекопитающих, дефектные в тимидинкиназе, могут быть спасены путем введения гена тимидинкиназы ( tk вируса герпеса [28] .

Марио Капекки решил усовершенствовать метод и использовал тонкую стеклянную пипетку для введения ДНК непосредственно в ядро [29] . Это значительно повысило эффективность передачи генов, и метод Капекки был быстро принят другими исследователями для введения новых генов в оплодотворенные эмбрионы мышей и получения трансгенных мышей [30]. Однако перенесенный ген все равно был случайным образом введен в геном хозяина. Капекки сделал важное наблюдение: когда ген tk был введен, копии были интегрированы только в один или два локуса генома хозяина, с несколькими копиями, образующими конкатемеры голова-хвост. Он рассудил, что такие конкатемеры могут быть порождены только двумя механизмами: либо репликацией, либо гомологичной рекомбинацией. Была проведена серия тщательных экспериментов, которые однозначно показали, что конкатемеры голова-хвост генерируются гомологичной рекомбинацией [30]. Это, в свою очередь, предоставило доказательства того, что соматические клетки млекопитающих обладают эффективным ферментативным механизмом для опосредования гомологичной рекомбинации. Если бы этот механизм можно было использовать для осуществления гомологичной рекомбинации между вновь введенной молекулой ДНК и той же последовательностью ДНК в геноме клетки-реципиента, любой клеточный ген мог бы мутировать.

В настоящее время Капекки представил предложение о предоставлении гранта Национальным институтам здравоохранения США для проверки возможности целенаправленного использования генов в клетках млекопитающих. Он был отклонен, поскольку рецензенты посчитали крайне маловероятным, что введенная ДНК найдет свою соответствующую последовательность в геноме хозяина[10]. Примерно в то же время Мартин Эванс и др. в Англии предложили аналогичную стратегию в заявке на грант в Совет медицинских исследований Великобритании, которая также была отклонена.

Капекки решил продолжить работу над гомологичной рекомбинацией, несмотря на то, что был отвергнут NIH. Он генерировал линии клеток-реципиентов, которые несли дефектный ген резистентности к неомицину (neo ^r ) и были способны восстановить его, введя функциональный ген neo r [23] . Коррекция происходила с относительно высокой частотой (в одной клетке на 1000 введенных клеток), что делает вероятным использование гомологичной рекомбинации для манипулирования генами генома млекопитающих.

Параллельно с работой Капекки Оливер Смитис разработал концепцию, согласно которой гомологичная рекомбинация может использоваться для восстановления мутировавших генов. Еще в 1960-х годах он уже установил, что аллельный вариант гаптоглобина возник в результате рекомбинантных событий [21] .

Позднее он клонировал гены глобина плода человека и пришел к выводу, что ^G г и ^A г возникли в результате процесса, включающего гомологичную рекомбинацию [24]. Он разработал пошаговую процедуру отбора для восстановления целевых клеток, несущих модифицированные гены. Стратегия была успешной, и он сообщил в знаковой статье в номере Nature от 19 сентября 1985 года об успешной интеграции гомологичной рекомбинации плазмиды в хромосомный ген в-глобина клеток эритролеукемии человека [27] .

К 1985 году Капекки показал, что гомологичная рекомбинация встречается с высокой частотой в клетках млекопитающих и Смиты использовали гомологичную рекомбинацию для вставки последовательности плазмидной ДНК в хромосомный ген человеческой клетки. Однако вся эта работа проводилась в культуре клеток. «Может ли гомологичная рекомбинация использоваться для таргетирования генов в зародыше и получения штаммов генетически модифицированных животных?» И Капекки, и Смити слышали о ячейках ES Мартина Эванса и решили дать им попробовать. С помощью Эванса они оба создали культуру клеток ES для использования в гомологических экспериментах по рекомбинации.

Смитис впервые использовал гомологичную рекомбинацию для коррекции мутантного гена HPRT в культивируемых клетках ES [35]. Для этой цели была использована клеточная линия ES, которая несла делеционную мутацию; эта клеточная линия ранее использовалась для производства мутантных мышей. Ген HPRT был восстановлен плазмидой, несущей отсутствующий промотор, и первые 2 экзона и Смиты показали, что обработанные клетки выжили и выросли в селекционной среде HAT, что требует активности фермента HPRT. Смитис и его соавторы пришли к выводу,что "Эта модификация выбранного гена в плюрипотентных клетках ES демонстрирует целесообразность этого пути для манипулирования геномами млекопитающих заранее определенными способами" [18] .

Команда Капекки также выбрала ген HPRT для своих ранних исследований. Стандартные методы были доступны для селективно растущих клеток с функциональными ферментами HPRT и уже несколько лет использовались для отбора мутантов, гибридомных клеток в производстве моноклональных антител и др. Томас и Капекки [20] ввели ген резистентности неомицина в Экзон гена HPRT в клетках ES и показали, что клоны трансфецированных клеток потеряли HPRT, но приобрели активность neo R. Они заключили в своей клеточной бумаге, что "Есть надежда, что эта комбинация использования клеток ES в качестве линии клеток-реципиентов и сайт-специфического мутагенеза, достигаемого посредством генного таргетирования, обеспечит средства для генерации мышей любого желаемого генотипа." [12] они продолжили изложение экспериментальной стратегии:

"Преимущество этого сценария заключается в том, что первое поколение химер обычно будет гетерозиготным для целевой мутации и что последующее размножение может быть использовано для получения гомозиготного животного. Таким образом, только один из двух локусов должен быть инактивирован, и рецессивные леталы могут сохраняться в виде гетерозигот. В случае успеха эта технология будет использоваться в будущем для анализа траектории развития мыши, а также для создания моделей мышей для заболеваний человека.” [12]

Это видение стало реальностью и теперь является краеугольным камнем экспериментальной медицины.

Важно было перейти от” модельного гена " HPRT к общей стратегии, которая позволила бы таргетировать гены, функция которых не может быть выбрана в культуре клеток. Капекки указал, что частота гомологичной рекомбинации против случайной интеграции составляет 1/1 000, что должно быть достаточно высоким, чтобы также разрешить таргетирование не выбираемых генов[19].

Это наблюдение побудило их работать над разработкой методов, необходимых для таких подходов. Элемент сопротивления неомицина (neo ^R) вводится в Экзон замещающего вектора, который также имеет на своем конце элемент тимидинкиназы (HSV-tk).

Гомологичная рекомбинация целевого гена приведет к экспрессии neo R, но элемент tk будет потерян, поскольку он находился вне рекомбинирующих последовательностей ДНК. Напротив, случайное интегрирование вектора замещения введет в ген tk, а также neo ^R. Эта стратегия была успешно использована для разрушения гена int-2, который является членом семейства факторов роста фибробластов (FGF) [18] .

В настоящее время все компоненты были созданы для производства генно-целевых штаммов мышей: разработка культуры клеток ES, демонстрация того, что модификация генов в таких клетках может быть передана зародышу и зарегистрирована в потомстве, наблюдение того, что гомологичная рекомбинация происходит с высокой частотой в геноме млекопитающих, применение методов переноса генов в клетки ES и изобретение стратегий обогащения трансфецированных клеток. Несколько лабораторий присоединились к гонке, и в 1989 году родилось несколько различных нокаутирующих мышей [17-19].

Выводы по 2 главе

Нобелевская премия 2007 года в области физиологии и медицины присуждается докторам Марио Р. Капекки, Мартину Дж. Эвансу и Оливеру Смитису за открытие ими принципов введения специфических модификаций генов у мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток. Их работа позволила модифицировать специфические гены в зародыше млекопитающих и вырастить потомство, которое несет и выражает модифицированный ген.

Такие животные стали незаменимыми в медицинских исследованиях. Кроме того, знания о биологии стволовых клеток и генной технологии, полученные в ходе исследований, которые привели к созданию “нокаутирующей мыши”, изменили понимание нормального развития и процессов заболевания и определили новые направления для медицинской терапии. Инструментарий экспериментальных генетических методов, разработанных Капекки, Эвансом и Смитисом, обычно называемый технологией нокаута, позволил ученым определить роль конкретных генов в развитии, физиологии и патологии. Он революционизировал науку о жизни и играет ключевую роль в развитии медицинской терапии.



Глава 3. Методы исследований

Нокаут гена - это молекулярно-генетический метод, в ходе которого задуманные исследователем изменения вносятся в нуклеотидную последовательность изучаемого гена или его регуляторных элементов.

Рис. 5. Стратегия получения линии нокаутированных мышей [5].

Мышь является наиболее адекватным модельным животным для использования технологии инактивации генов.

Это обусловлено следующими причинами:

а) мышь - хорошо изученный и доступный объект;

б) геном мыши и человека содержит приблизительно одинаковое число генов;

в) сходство аминокислотных последовательностей всех белков человека и мыши составляет около 90%.

Однако основной причиной использования мыши в качестве модели для инактивации гена является возможность изолирования эмбриональных стволовых клеток, в которых любой ген может быть модифицирован [29].

Клеточные линии, содержащие модифицированный ген, могут быть привнесены в развивающийся зародыш, что позволяет получить химерное животное, несущее искусственно созданную мутацию (рис. 5).

Молекулярно-генетическим механизмом, позволяющим осуществлять инактивацию гена, является гомологичная рекомбинация между экзогенной ДНК, несущей задуманные исследователем изменения, и геномной ДНК объекта.

3.1 Векторные конструкции

Классическая схема получения нокаутированных мышей включает несколько этапов: получение векторной конструкции, с последующим внесением ее в культуру эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и отбор трансформантов. Трансформированные ЭСК вносят в зародыш, и полученных химерных животных скрещивают для получения линии мышей, гомозиготных по полученной мутации.

В зависимости от поставленной задачи используются два типа векторов: замещающий и вставочный. Первый тип векторов позволяет заменить участок гена мишени, в то время как второй интегрирует в изучаемую последовательность.

Строение обоих типов векторов одинаково, кроме ориентации фланкирующих последовательностей. Наиболее часто используются замещающие вектора. Вектор для трансформации несет клонированную последовательность изучаемого гена, с внесенными в нее необходимыми изменениями. Это может быть: внесение стоп-кодона, приводящее к синтезу короткого неактивного пептида; делеция одного или нескольких экзонов; делеция промоторной области; вставка, приводящая к нарушению нормального функционирования гена и любые другие изменения, приводящие к отсутствию функционального продукта изучаемого гена или значительно снижающие его активность. Также в эту последовательность вносится положительный селективный маркер (МПС), которым является ген neo. Продукт этого гена дает несущим его клеткам устойчивость к антибиотикам неомицину и канамицину. Модифицированная последовательность должна быть фланкирована неизмененными участками, по которым будет проходить рекомбинация. Эффективность рекомбинации зависит от длины фланкирующих последовательностей [22], что в свою очередь зависит от возможностей вектора. При длине гомологичного плеча около 5 тыс. п.н. процент рекомбинации составляет 0,001.

В качестве вектора можно использовать бактериальные искусственные хромосомы (BAC), со вставками фрагментов генома мыши. В этом случае размер одного плеча может составлять до 150 тыс. п.н., а размер делеции до 25 тыс. п.н. Наилучший процент рекомбинации (8,3%) получен авторами с использованием длины плеча 110 тыс. п.н. [26].

Существует вероятность, что рекомбинация пройдет не по исследуемым нами участкам генома, а в любой другой сходной области. При этом ген neo (МПС) сохранится, и в отобранном пуле ЭСК будут присутствовать рекомбинантные клетки, не несущие необходимых изменений. Эта проблема решается внесением в векторную конструкцию маркера отрицательной селекции (МОС). Им может служить ген тимидин-киназы простого вируса герпеса (HSV-tk) или ген дифтерийного токсина А (DT-A), продукты которых убивают эукариотические клетки. Положение МОС с наружной стороны гомологичного плеча вектора позволяет элиминировать его после прохождения гомологичной рекомбинации. В случае же негомологичной рекомбинации, МОС оказывается интегрированным в геном трансформированной клетки, что приводит к ее элиминации. Наличие двух маркеров селекции (положительного и отрицательного) позволяет быстро и эффективно проводить отбор нужных трансформантов [23,19].

3.2 Внесение вектора в эмбриональные стволовые клетки

Для трансформации используют эмбриональные стволовые клетки мышей. Помимо того, что культура ЭС клеток способна расти in vitro, при пересадке во взрослую мышь или эмбрион клетки имеют свойство приживаться. ЭС клетки, в отличие от специализированных соматических клеток, сохраняют генетические потенции без тканевой специализации. Эти клетки имеют "минимальный" фенотип: минимум рецепторов и программ для взаимодействия с микроокружением, поскольку лишь 5% из 500 генов транссигнализации экспрессировано в пролиферирующих ЭСК. Второй важнейшей характеристикой ЭСК в культуре является практически неограниченный потенциал пролиферации, обусловленный особенностями фенотипа незрелых клеток.

Третьей особенностью ЭСК является рост суспензионными клонами без какой-либо примеси продвинутых клеток, прикрепленных к подложке. Каждый клон в такой культуре является производным одной прародительской ЭСК [1].

Эмбриональные стволовые клетки мыши впервые получены в 1981 году [8], что дало возможность для развития работ по инактивации генов. Внесение линеализированного вектора в ЭС клетки возможно несколькими методами: микроинъекция, трансфекция (электропорация), трансдукция (вирусная инфекция). Перечисленные методы имеют свои преимущества и недостатки.

Микроинъекция позволяет с частотой до 100 процентов вносить экзогенную ДНК в клетку, а частота гомологичной рекомбинации составляет около 0,67%. Этот метод, несомненно, является наиболее эффективным. Однако для осуществления микроинъекции требуется дорогое оборудование и высокая квалификация экспериментатора. Помимо этого, сам метод очень трудоемок и занимает много времени. Векторные конструкции микроинъекцией можно вносить и в зиготу, но отобрать нужные трансформанты в этом случае невозможно.

Наиболее экономичными и достаточно эффективными методами внесения экзогенной ДНК в клетку являются электропорация и ретровирусная инфекция. К их достоинствам, в первую очередь, следует отнести возможность одноразово обработать сотни тысяч клеток, которые благодаря системе позитивной-негативной селекции достаточно быстро проходят отбор. наследственный эмбриональный генный таргетирование

Это существенно упрощает и делает экономически выгодным, по сравнению с микроинъекцией, процедуру получения трансформированных клеток. Оба метода имеют свои недостатки: больший процент негомологичной рекомбинации при внесении векторных систем электропорацией по сравнению с другими методами, ограниченые размеры ретровирусных векторов и т.д. [21].

Наиболее часто внесение векторов в клетку проводят с помощью электропорации. В то же время ретровирусная инфекция позволяет вносить экзогенную ДНК не только в ЭС клетки, но и в эмбрионы. Итак, линия трансформированных клеток получена и поддерживается. Следующий этап - внесение клеток в эмбрион мыши (как правило, на стадии бластулы).

Химерный зародыш подсаживают в матку ложно беременной самки. Полученную таким образом химеру скрещивают с нормальным, но имеющим отличия (например, цвет) животным. Если полученные в первом поколении мыши имеют фенотип линии, из которой получены ЭС клетки, то их можно использовать для насыщающего скрещивания. Результатом будет получение линии животных, гомозиготных по созданной мутации.



3.3 Метилирование ДНК в контроле генома

Одним из способов видоизменения гена является его замена на бессмысленную последовательность ДНК -- тогда ген "выключается". Исследователи систематически "выключают" гены и наблюдают, к каким последствиям на уровне организма приводит это "выключение". Такая методика называется "генетический нокаут".

Она позволяет подробно изучить функцию конкретного гена во время эмбрионального развития и после рождения животного. Можно проследить, как каждый ген влияет на развитие организма и возникновение той или иной патологии. В связи с этим, метод ещё получил название "генетическое планирование". К настоящему моменту уже проведены опыты по "выключению" десяти тысяч генов мыши, это половина всего мышиного генома.

Для развития организма достаточно одной клетки с единичной копией ДНК, которая при делении точно воспроизводится от клетки к клетке. Это относится практически ко всем живым многоклеточным существам. У человека все его клетки содержат идентичную ДНК. Клетки крови, печени, мозга, стволовые клетки - все они одинаковы по ДНК. Чем же определяется многообразие имеющихся у человека высокоспециализированных клеток и тканей? Это достигается за счет включения или выключения генов, ответственных за специализацию клетки. Именно механизмы контроля работы, или как принято говорить, экспрессии генов являются основной темой исследований нашей группы. Одним из таких механизмов является метилирование генов - ковалентное присоединение метильной группы в 5 положении пиримидинового кольца цитозина. ДНК, содержащая метилированные цитозины, является транскрипционно неактивной, и гены, располагающиеся вблизи метилированных районов, молчат.

Роль метилирования ДНК и механизм его негативного воздействия на работу генов в процессе жизнедеятельности позвоночных организмов (на моделях лягушки, мыши и клеточных линий человека).

Метилирование ДНК у позвоночных приобретает смысловую нагрузку в виде подавления транскрипции близлежащих генов двумя основными способами: за счет прямого воздействия на ДНК, в составе которой метилированный цитозин ингибирует связывание транскрипционного фактора со своим участком, и за счет специфического связывания с метилированным районом специализированных метил-ДНК узнающих белков, которые, в свою очередь, привлекают сложные механизмы подавления транскрипции путем модификации близлежащих гистонов.

3.4 "Программируемый нокаут генов"

Следует отметить, что не все гены можно инактивировать на стадии зародыша. И, естественно, нельзя получить клетки или животных, нокаутированных по так называемым генам домашнего хозяйства. Однако для генов, принимающих участие в эмбриональном развитии, разработан подход, позволяющий проводить их инактивацию после развития организма. Данная стратегия позволяет "выключать" гены в определенных условиях ("программируемый нокаут генов", англ. conditional knockout), а именно в необходимой исследователю ткани или группе клеток и/или под воздействием индуцирующего вещества.

Это можно осуществить с помощью методики, сочетающей гомологичную рекомбинацию, как в случае классического нокаута генов, и системы сайт-специфической рекомбинации. Сайт-специфические рекомбиназы - это ферменты, узнающие особые участки ДНК и совершающие обмен между ними. Наиболее часто используются Cre рекомбиназа бактериофага P1 и Flp рекомбиназа (флипаза) дрожжей. Эти ферменты распознают нуклеотидные последовательности в 34 основания, называемые, соответственно, loxP и frt сайты [16]. Если эти последовательности расположены в одной ориентации, рекомбинация по ним приведет к делеции фланкированного участка. Если же ориентация последовательностей различна, то это приведет к инверсии фрагмента между ними. Использование стратегии "программируемого нокаута гена" требует создания двух линий мышей. Линия А несет интегрированную в геном последовательность гена Cre под контролем ткане-специфичного или индуцибельного промотора. Линия В содержит два loxP сайта, фланкирующих подлежащую удалению последовательность исследуемого гена (экзон, промотор и т.д.) [25]. Вставки в геномную последовательность loxP сайтов и гена Cre осуществляются с использованием тех же приемов, что и при классическом нокауте генов, но не должны затрагивать функциональные последовательности.

Полученные таким образом гомозиготные линии мышей скрещивают. У потомков от этого скрещивания исследуемый ген будет инактивирован в ткани или группе клеток, где будет активен промотор, контролирующий активность гена Cre [25]. Используя стратегию "программируемой инактивации гена", можно добиться результатов, недоступных при использовании стандартной процедуры нокаута генов.



Глава 4. Метод генного таргетирования и его внедрение в современную медицину

4.1 Генное таргетирование и трансгенез у млекопитающих

Мышь была любимым модельным животным для генетических исследований в течение многих десятилетий и была очевидным выбором для первых попыток ввести новые гены в геном млекопитающих. Работа в нескольких лабораториях определила условия для манипулирования оплодотворенными яйцами мышей и бластоцистами в культуре.

Используя эти методы культивирования, ДНК вируса SV40 была введена в бластоцисты, которые впоследствии были имплантированы в псевдопрегнантные приемные матери.

ДНК SV40 можно было обнаружить в потомстве, но было невозможно с уверенностью продемонстрировать, была ли ДНК интегрирована в геном хозяина или осталась в виде эпизомов [25]. Через несколько лет была создана первая трансгенная мышь путем заражения эмбрионов вирусом лейкемии Молони [26].

ДНК-копия вирусной РНК присутствовала в геноме трансгенных мышей и передавалась потомству по-Менделевски, поэтому вирусная ДНК была введена в мышиную зародышевую линию. Последующее развитие позволило ввести и сверхэкспрессировать большое количество трансгенов у мышей, а также у других млекопитающих [27]. Однако интеграция чужеродной ДНК в геном происходит случайным образом и количество копий варьируется. Хотя трансгенная технология является важным инструментом в науке о жизни, она недостаточно точна в отношении вставленного Гена и не может быть использована для манипулирования эндогенными генами заранее определенным образом. Эти врожденные проблемы с трансгенной техникой сверхэкспрессии ограничивают ее полезность.

После создания технологии генного таргетирования в ряде лабораторий было проведено несколько важных модификаций и разработок, позволивших значительно расширить сферу ее применения. Гениальная разработка генного таргетинга была сделана путем введения в существующие гены сайтов распознавания для фермента рекомбиназы Cre, так называемых lox ^P-сайтов. При скрещивании мышей, несущих такие "флоксинговые" гены, с трансгенными мышами, экспрессирующими рекомбинанту Cre, целевой ген потомства модифицируется действием Cre [42-44]. Другая сайт-специфическая рекомбиназа, Flp, также часто использована для того чтобы построить условно пристреливать генов в мышах [45] . Активность гена Cre, или Flp, можно контролировать, помещая его под подходящий промотор для достижения тканеспецифического генного таргетирования [46] . Экспрессия Cre и, следовательно, таргетирование floxed гена могут быть ограничены, например, Т-клетками (промотор lck), сердечной мышцей (сердечный промотор миозина), нейронами (промотор енолазы) или эпителием (промотор цитокератина).

Рис. 6.



Положительный-отрицательный отбор используется для обогащения клеток Эс, содержащих целенаправленное разрушение гена. Как в генном таргетинге (A) , так и в случайной интеграции (B), верхняя линия показывает вектор таргетинга, средняя-хромосомный ген, а нижняя-модифицированный ген. Гены, на которые нацелена гомологичная рекомбинация, содержат элемент neo ^R, но не HSV-tk, поскольку последний находится вне последовательностей в целевом векторе, гомологичном последовательностям в хромосомном гене. Напротив, случайное интегрирование вектора приводит к введению HSV-tk, а также neo ^R. Методы скрининга выбирают положительно для neo ^r положительных клонов и отбрасывают те neo ^R + клоны, которые несут HSV-tk.

Экспрессия Cre может также контролироваться временно, путем введения элемента в промотор, который требует лиганда, такого как препарат для индукции [47] . Тетрациклин, тип I-интерферон и тамоксифен (который связывает к элементу эстрогена приемн-связывая) все были использованы для того чтобы получить снадобь-индуцибельные промоторы. Таким образом, желаемый ген может быть нацелен путем введения препарата. Путем вводить место tamoxifen в ткан-специфический промотор, пристреливать гена можно получить выборочно в некоторой ткани когда мышь обработана с снадобьем.

Технология Cre-lox также может быть использована для замены существующего гена другим [48]. Такой "стук" был использован, например, для замены мышиного иммуноглобулина или генов MHC на человеческие, чтобы” очеловечить " мышь в отношении иммунной функции. Он также использовался для замены одного аллеля на другой, например, последний является аллелем, предположительно вызывающим заболевание.

Генное таргетирование изменило научную медицину, позволив экспериментально проверить гипотезы, касающиеся функции конкретных генов. До начала генного таргетирования наше понимание роли генов в высших организмах было выведено из наблюдений спонтанных мутаций у пациентов и экспериментальных животных, исследований связей и ассоциаций, введения генных продуктов животным и, в некоторой степени, из экспериментов с клеточными культурами.

Однако культура клеток не является полезной для понимания функций и заболеваний, связанных с многоклеточными, интегративными реакциями. Представления о таких системах органов,как нервная система, сердечно-сосудистая система и иммунная система, были в лучшем случае фрагментарными, как и знания о развитии млекопитающих.

Как выразился физиолог сердечно-сосудистой системы Хеймо Ehmke, " клетки не имеют артериального давления " [49]. Возможность наблюдения за воздействием на неповрежденный организм разрушающего кандидата гена трансформировала эти направления исследований.

Например, физиологи сердечно-сосудистой системы перешли от крыс к мышам в качестве моделей, снизив масштаб своих инструментов и методов для изучения генетической регуляции гемодинамики. Родилась новая эра генетической физиологии.

Геномы человека и мыши содержат около 22 400 генов. Несколько тысяч из них уже были исследованы методом генного таргетирования. В совокупности эти исследования предоставили богатый объем информации о функции генов в развитии и болезнях. Они помогли объединить механистическую молекулярную биологию с интегративными науками о жизни, такими как эмбриология, физиология и иммунология, и побудили новые технические разработки в физиологических науках. Для медицины особенно информативным было моделирование заболеваний человека с помощью генного таргетирования у мышей.

На этом этапе, возможно, будет полезно вспомнить критерии, впервые предложенные Клодом Бернаром для научного метода в медицине [50] : ученые-медики используют наблюдения, гипотезы и выводы, чтобы предложить объяснения, теории для природных явлений.

Предсказания этих теорий проверяются экспериментально. Любая теория, которая достаточно убедительна, чтобы делать предсказания, может быть проверена воспроизводимым образом Таким образом. Поэтому научный метод по существу является осторожным средством построения обоснованного, основанного на доказательствах понимания нашего природного мира. Эксперименты имеют решающее значение в этом процессе.

До появления генного таргетинга в генетической медицине не было средств для экспериментального тестирования. Если провести аналогию с подходом Роберта Коха к инфекционным заболеваниям [51] генетическая медицина могла бы применить первый из постулатов Коха (т. е. наблюдать ассоциацию между микробом или в данном случае геном или аллель и болезнью) и с появлением клонирования генов, второй (изолировать микроб/ген от больного индивидуума и установить его в культуре), но применение третьего постулата Коха (индуцировать болезнь путем передачи микроба/гена в организм хозяина) требовало нацеливания генов.

Мутируя ген, чтобы разрушить его функцию (нокаут) или переключая его на ассоциированный с болезнью аллель (нокдаун), болезнь индуцируется, если гипотеза верна.

В настоящее время разрабатываются альтернативные подходы, основанные на генетической эпидемиологии, но имеющиеся в настоящее время методы не обладают точностью экспериментов, основанных на гипотезах . Этого отступления в научную теорию может быть достаточно, чтобы сделать вывод, что только нацеливаясь на гены-кандидаты, стало возможным формально установить причинную связь между геном и болезнью. Давайте теперь рассмотрим некоторые конкретные примеры влияния генного таргетинга в медицине.



Рис.7.

Молекулярно-генетические доказательства для передачи зародышей отремонтированного гена HPRT [39]. Южное пятно показывает геномную ДНК, гибридизованную с зондом, специфичным для последовательности в целевом векторе. Клетки ES были от мышей agouti, бластоцисты от черных мышей и ген HPRT находится на X-хромосоме.

Опухоль была от химерной мыши, которая несла целевой ген, как и целевая линия клеток ES. В потомстве F1 самки agouti-мышей, полученные из целевых клеток ES, несли целевой ген HPRT, в то время как он не присутствовал ни у черных мышей, полученных из реципиентных бластоцист, ни у самцов agouti-мышей. В нижней части показана стратегия таргетинга, включающая мутацию делеции в гене HPRT (а), конструкцию таргетинга (в), ген HPRT, скорректированный генным таргетингом (С), и зонд (19*), используемый для гибридизации (d).

Первой областью, на которую обратили свое внимание экспериментальные генетики после рождения генного таргетинга у млекопитающих, были моногенные заболевания. Синдром Леша-Нихана, дефектный метаболизм нуклеотидов, вызванный мутацией в гене HPRT, фактически служил модельным условием при разработке технологии, как в лабораториях Эванса, так и в лабораториях Смитов.

Одной из причин выбора этого конкретного медицинского состояния было то, что для HPRT были доступны условия отбора для выделения трансдуцированных клеток. Первое исследование hprt - / - мышей было разочаровывающим, так как ни нейропатологических, ни поведенческих особенностей заболевания человека не наблюдалось [15, 17].

Это побудило провести анализ путей спасения пуринов у мышей и привело к выводам о том, что мыши в значительной степени зависят от аденинфосфорибозилтрансферазы (APRT) для спасения пуринов и поэтому не так чувствительны к дефициту HPRT, как люди. Введение ингибитора АПРТ мышам HPRT-/- типа индуцировало стойкое самоповреждающее поведение, напоминающее клинические особенности заболевания человека [14]. Это является иллюстрацией необходимости сложного анализа интегративных функций при характеристике фенотипа мышей, нацеленных на ген.

Муковисцидоз является одним из наиболее распространенных моногенных заболеваний и был выбран для генно-таргетных исследований Смитисом и его коллегами [11, 12]. Дефектный ген был выявлен в результате изучения связей в семьях пациентов с последующим молекулярным клонированием. Он оказался активированным цАМФ хоридным каналом и был назван регулятором трансмембранной проводимости муковисцидоза (CFTR). Нокаутировав CFTR у мышей, было создано состояние, которое воспроизводило многие особенности болезни человека. Таким образом, CFTR-/- гомозиготы проявляли дефектный транспорт хлоридов в эпителии дыхательных путей и кишечника, неспособность к процветанию, мекониевый илеус и патологические изменения желудочно-кишечных желез. Эти исследования были одними из первых, чтобы создать модель заболевания человека с помощью генного таргетинга на мышах. За ними последовала лавина таких нокаутирующих моделей.

Патогенез наследственных заболеваний сердца был успешно изучен с помощью методов генного таргетирования [17, 18]. Например, таргетирование генов, кодирующих компоненты сократительного аппарата в кардиомиоцитах, приводит к кардиомиопатии; таргетные мутации в белках коннексина разрывных соединений вызывают дефекты проводимости; нарушенные гены транскрипционных факторов, участвующих в развитии сердца, приводят к врожденным порокам сердца; а таргетирование генов, контролирующих энергетический метаболизм, вызывает кардиомиопатию.

Сложные заболевания, включающие действие более чем одного гена, а также взаимодействие генов с окружающей средой, представляют собой особую проблему для медицинских исследований. Наследование, проникновение и взаимодействие обычно плохо изучены, было трудно проанализировать вклад индивидуального генетического фактора, и различие между причинно-следственной связью и корреляцией было проблематичным. Чтобы доказать причинно-следственную связь в такой сложной системе, эксперименты должны позволять обнаруживать эффекты изменения только одной переменной за один раз. Генное таргетирование сделало такие эксперименты возможными и позволило доказать причинно-следственную связь при сложных заболеваниях.