Ультраструктурные изменения костной ткани при огнестрельных ранениях и пути их коррекции

ГЛАВА 3. УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МОРФОЛОГИИ ОГНЕСТРЕЛЬНЫХ ПЕРЕЛОМОВ

3.1 Методика проведения эксперимента на биоманекенах

Для выявления особенностей пространственной организации тонкой структуры костного матрикса, а также выявления фундаментальных механизмов его разрушения был спланирован первый этап экспериментальных работ, заключающийся в проведении исследований на постмортальных образцах костной ткани человека, как в норме (30 образцов костной ткани лиц, погибших от неогнестрельных травм), так и с наличием огнестрельных переломов плоских костей черепа и диафизарных переломов костей бедра и голени (100 образцов).

Исследования на данном этапе состояли из следующих подэтапов:

1. Исследования тонкой структуры костного матрикса пластинчатых и трубчатых костей в норме методом сканирующей электронной микроскопии (10 образцов).

2. Исследования тонкой структуры костного матрикса пластинчатых и трубчатых костей в норме методом атомно-силовой микроскопии (10 образцов).

3. Исследования тонкой структуры костного матрикса пластинчатых и трубчатых костей в норме методом рентген-структурного анализа (10 образцов).

4. Исследование морфологии огнестрельных переломов пластинчатых и трубчатых костей методом сканирующей электронной микроскопии (50 образцов).

5. Исследование морфологии огнестрельных переломов пластинчатых и трубчатых костей методом атомно-силовой микроскопии (25 образцов).

6. Исследование морфологии огнестрельных переломов пластинчатых и трубчатых костей методом рентген-структурного анализа (25 образцов).

С целью получения экспериментального материала для вышеописанных исследований производили выпиливание костных образцов из скелетированных черепов и длинных трубчатых костей, как интактных, так и подвергшихся воздействию огнестрельных ранящих снарядов.

Выпиливание производилось с захватом раневого канала, вблизи и на отдалении от него (рис. 2).

А Б

Рис. 2. Забор образца затылочной кости. А - зоны огнестрельного перелома; Б - на отдалении от раневого канала

3.2 Изучение морфологии огнестрельных переломов методом сканирующей электронной микроскопии

Структурные механизмы разрушения плоских костей.

Электронно-микроскопические исследования образцов теменной кости в норме показали, что основной структурно-функциональной единицей плоской кости является остеон, который представляет собой канал, образованный путем прокладывания туннелей остеокластами с последующим их заполнением концентрическими слоями коллагена и протеогликанов, секретируемых остеобластами и связанных линиями цемента (спайновыми линиями) (рис. 3).

Рис. 3. Сканирующая электронная микроскопия кости. Система гаверсовых каналов здоровой теменной кости

На сканограммах сколов, производимых в продольном относительно укладки большинства остеонов направлении, определяется, что коллагеновые волокна в компактной части трубчатых костей имеют строго определенную ориентацию. Коллагеновые волокна входят в состав концентрических костных пластинок остеона, вставочных пластин и костных трабекул. Как правило, в составе остеона коллагеновые волокна располагаются в виде концентрических слоев, расположенных под определенным углом друг к другу, что обеспечивает биомеханическую устойчивость системы (рис. 4).

По данным сканирующей электронной микроскопии образцов области огнестрельного перелома наиболее значимыми механизмами разрушения плоских костей являются разрывы компактного вещества и деформации смещения пластов костного матрикса.

Рис. 4. Сканирующая электронная микроскопия кости. Минерализованные коллагеновые волокна в матриксе здоровой теменной кости

Морфологически разрывы компактного вещества представляют собой микротрещины в основном линейной формы, которые происходят преимущественно вокруг спайновых линий остеонов (рис. 5).

Непосредственно на поверхности раневых каналов, как входного, так и выходного пулевых отверстий, наблюдается «обтекание» микротрещинами смещения костного матрикса по ходу траектории движения пули, что вызывает фрагментацию его на островки (рис. 6).

Деформации смещения пластов занимают второе место по объему разрушения костного матрикса плоских костей черепа. Этот вид деформации довольно распространён на поверхностях раневых каналов как в области входных так и выходных пулевых отверстий.

Рис. 5. Микротрещины в теменной кости в зоне огнестрельного перелома

Рис. 6. Множественные микротрещины костного матрикса в области огнестрельного перелома теменной кости

Морфологически деформации смещения пластов выявляются в виде сносов поверхностных слоев компактного вещества кости, вызванных, по нашему мнению, воздействием избыточного давления ударной волны (рис. 7).

Рис. 7. Деформация смещения пластов по типу упорядоченного сноса компактного вещества на поверхности раневого канала входного пулевого отверстия

При этом структура поверхности раневого канала на месте сноса имеет более упорядоченный вид в области входных пулевых отверстий, чем в области выходных, что может быть обусловлено характером движения огнестрельного ранящего снаряда. Так, показано, что снос поверхностных слоев компактного вещества в области выходных отверстий более турбулирован, а форма дефектов имеет полиморфную структуру (рис. 8).

Рис. 8. Деформация смещения пластов по типу турбулентного сноса компактного вещества на поверхности раневого канала выходного пулевого отверстия теменной кости

Что же касается характера деформации смещения вне непосредственной близости к раневым дефектам, то в глубине компактного вещества плоских костей черепа на отдалении 3-5 см от раневых каналов, деформации имеют вид разрывов стенок ячеистых структур.

Данные деформационные разрывы костного матрикса могут иметь вид как простых разрывов (рис. 9), так и разрывов со смещением слоёв костного матрикса (рис. 10).

Рис. 9. Трещины в стенке гаверсова канала в глубине компактного вещества теменной кости в зоне огнестрельного перелома

Рис. 10. Трещины и деформации смещения в стенке гаверсова канала в глубине компактного вещества теменной кости в зоне огнестрельного перелома

На месте вышеописанных деформаций смещения выявляется образование лакуно- и каверноподобных очагов, которые могут иметь достаточно полиморфные края и дно.

Основной объём лакун, находящихся непосредственно на поверхности раневых каналов, имеют ровные, как бы оплавленные края, и однородное дно с разрыхленным костным матриксом и одиночными микротрещинами (рис. 11).

Рис. 11. Лакуна на поверхности раневого канала входного пулевого отверстия теменной кости. Края лакуны ровные, как бы оплавленные. В дне лакуны микротрещины

Морфологически данный вид лакун представляет собой не что иное, как разлитые поверхности воздушно-ударных эрозий в раневом канале.

В особую форму можно выделить лакуны с ассиметричными краями, один из которых пологий, а противоположный - более крутой и подрытый (рис. 12).

Рис. 12. Лакуна на поверхности раневого канала входного пулевого отверстия теменной кости. Имеются подрытый и пологий край. Матрикс в дне полого края подвержен деформации смещения и разрывов

В подрытом крае дном лакуны является впадина или глубокая расщелина, которые могут уходить вглубь костного матрикса. В пологих же краях дно лакун выполнено напластованными друг на друга смещёнными слоями костного матрикса, которые зачастую имеют вид гофрированных, а иногда и ступенчатоподобных структур на поверхности раневых каналов. Лакуны данного типа достаточно склонны к группированию и, нередко сливаясь, углубляются в компактное вещество на 3-5 миллиметров, что было обнаружено на послойных сколах образцов.

Было зафиксировано, что в глубине компактного вещества микрокаверны имеют аналогичную лакунам овальную форму и могут достигать диаметра до 300 мкм. Большая часть из них образуется в очагах разрежения костного матрикса или же по продолжению поверхностных дефектов.

В зоне воздействия ударных волн в плоских костях наблюдается лизис цемента и микропористая трансформация костного матрикса, что особенно выражено в области входных и выходных пулевых отверстии (рис. 13).

Рис.13. Микропористая трансформация костного матрикса теменной кости в области огнестрельного перелома

Стоит отметить, что в целом для плоских костей черепа кавернообразование вдали от раневого канала не является характерным механизмом разрушения.

Структурные механизмы разрушения диафиза длинных трубчатых костей.

Сканирующая электронная микроскопия образцов костной ткани диафиза трубчатой кости показала, что структурно-функциональной единицей трубчатой кости на ультраструктурном уровне в норме является темплат, представляющий собой дискретную структуру, состоящую из определенным образом взаиморасположенных фибриллярного белка коллагена и кристаллов гидроксиапатита. Канальцы костного матрикса имеют мембраны, представленные муфтами уплотненного матрикса толщиной от 1 до 5-7 мкм (рис. 14).

Рис. 14. Структура поверхности гаверсового канала интактной большеберцовой кости барана

Мембраны костных канальцев со стороны просвета густо пронизаны множеством отверстий диаметром от 100 до 300-450 нм. Поверхность данных наноотверстий имеет сетчатую структуру и состоит из слабо минерализованных нитей коллагена, имеющих слабо выраженную минерализацию.

При этом отмечено, что основная часть данных нитей имеет строго упорядоченное расположение с формированием пространственных структур наподобие винтовой резьбы, имеющих шаг 15-20 нм. Описанные отверстия дают начало наноканалам, которые прогрессивно уменьшаясь в диаметре, направляются вглубь компактного вещества кости (рис. 15).

Рис. 15. Наноканальцы, уходящие вглубь костного матрикса в интактной большеберцовой кости барана

Как показывают данные электронно-микроскопических исследований образцов огнестрельных переломов диафизов трубчатых костей, ведущую роль в разрушении костного матрикса диафиза трубчатых костей играет кавернообразование.

При этом установлено, что данные каверны располагаются на поверхности раневого канала и в глубине компактного вещества и не имеют непосредственной анатомической связи с костными канальцами. На поверхности раневого канала каверны имеют вид лакун с разреженным дном и приподнятыми краями (рис 16).

Рис. 16. Лакуна с приподнятыми краями на поверхности раневого канала большеберцовой кости барана

На отдалении от раневого дефекта кости, в глубине компактного вещества, они имеют вид замкнутых полостей диаметром до 500 мкм, которые образуются путем роста и слияния расширенных пор (рис. 17).

Костный матрикс претерпевает эктазии своей нанопористой структуры с трансформацией нанопор в мезо- и микропоры, диаметрами от 100 нм и более 1500 нм, соответственно (рис. 18).

Рис. 17. Каверна с приподнятыми краями, расположенная в глубине компактного вещества области огнестрельного перелома большеберцовой кости барана

Рис. 18. Слияние микрополостей в крупную каверну в глубине компактного вещества области огнестрельного перелома большеберцовой кости барана

В коллагеновых волокнах, расположенных в очагах разрежения костного матрикса, утрачивается свойственное им чередование «широких» и «узких» участков. К обнаженным волокнам агрегируются форменные элементы крови (рис. 19).

Рис. 19. Микропористая трансформация костного матрикса большеберцовой кости барана в зоне огнестрельного перелома

Проведённый энергодисперсионный анализ выявил концентрирование в дне лакун кислорода - 2,4Ат% и железа - 1,9%Ат% (в контроле 0,6Ат% и 0,09Ат%, соответственно), которые выделяются из гемоглобина разрушенных эритроцитов, а также натрия - 1,754% и магния - 0,974% (в контроле 0,027 Ат% и 0,125 Ат%, соответственно). Причиной этого, по-видимому, является тканевой отек. На краях лакун и в области спайновых линий обнаружено повышение содержания кальция - 90,6Ат% (в контроле 79,3 Ат%) и снижение содержания фосфора до 0,3Ат%, (в контроле 19,6Ат%). Приведённые данные локального химического анализа явно показывают, что в периферических участках каверн происходит концентрирование вещества костного матрикса, что может быть обусловлено действием ударной волны. Логично предположить, что в данном случае края лакун являются зонами сжатия распространяющейся ударной волны. Микротрещины, склонные к росту и слиянию, являются наиболее важным структурным элементом деформации костного матрикса в краях лакун костного матрикса трубчатых костей.

3.3 Изучение морфологии огнестрельных переломов методом атомно-силовой микроскопии

Исследования, проведённые методом атомно-силовой микроскопии (АСМ), показали, что в норме в плоских костях толщина минерализованных коллагеновых волокон составляет около 100 нм, и имеется чёткая D-периодичность (рис. 20).

Рис. 20. АСМ интактной затылочной кости. Размер скана 2000 нм. Изображение минерализованных коллагеновых волокон с выраженной D-периодичностью (период 65-67 нм)

На поверхности волокон хорошо выявляются кристаллы гидроксиапатита, имеющие размер 20-25 нм, покрытые гидратной оболочкой и располагающиеся вокруг главных участков коллагена в виде черепицеподобных структур (рис. 21).

Рис. 21. АСМ интактной затылочной кости. Размер скана 10 000 нм. Изображение черепицеподобной укладки кристаллов апатита

Коллагеновые волокна в интактных трубчатых костях покрыты муфтами, образованными агрегированными кристаллами апатита и имеющими укладку в виде зерен. Данные апатитовые агрегаты определенным образом располагаются вокруг главных участков D-периодов коллагеновых волокон, придавая им вид сплюснутых с обеих сторон сфер (рис. 22).

Рис. 22. АСМ интактной трубчатой кости. Размер скана 15 000 нм. Изображение структуры рельефа поверхности минерализованных коллагеновых волокон с четко выраженной D-периодичностью (период 65-67 нм) и непропорционально широкими главными участками за счет отложения кристаллов апатита

В трубчатых костях протяженность апатитовых сфер, расположенных по длиннику коллагеновых волокон, достигает 175 нм, а диаметр 200-250 нм. Главные участки D-периодов выступают в виде ступенек высотой 25-50 нм (рис. 23).

При атомно-силовой микроскопии образцов костей, взятых непосредственно в зоне огнестрельных переломов, регистрируется почти полное исчезновение черепицеподобной укладки кристаллов апатита. Коллагеновые волокна лишаются апатитовых темплат, происходит обнажение нитей тропоколлагена и регистрируется расширение до 72-75 нм периодов «главных» и узких участков (в норме 65-67 нм) (рис. 24).

Рис. 23. АСМ интактной затылочной кости. Размер скана 2000 нм. Изображение поверхности минерализованных коллагеновых волокон с четко выраженной D-периодичностью (период 65-67 нм) и выступающими главными участками в виде ступенек высотой в пределах 100 нм

Рис. 24. АСМ в области входного пулевого отверстия затылочной кости. Размер скана 10 000 нм. Демонстрируется участок с неполной дезинтеграцией коллагеновых волокон. Стрелкой указано коллагеновое волокно с сохраненной D-периодичностью

При исследовании структуры коллагеновых волокон на протяжении обнаруживаются многочисленные очаги истончения и прореживания нанофибрилл, а также объёмные очаги дезинтеграции структур D-периодичности (рис. 25).

Рис. 25. АСМ затылочной кости. Размер скана 10 000 нм. Изображение структуры рельефа поверхности минерализованных коллагеновых волокон теменной кости в области пулевого входного отверстия. Демонстрируется участок полной дезинтеграции коллагеновых волокон

При этом в зоне огнестрельного перелома определяется «замусоривание» свободного пространства интерстиция костного матрикса обломками аморфизированной минеральной фазы и обрывками разрушенных коллагеновых волокон (рис. 26).

Рис. 26. АСМ затылочной кости. Размер скана 20 000 нм. Демонстрируется участок полной дезинтеграции коллагеновых волокон и замусоривание обломками аморфной фазы костного матрикса в области входного пулевого отверстия

При огнестрельных переломах регистрируется значительное увеличение адгезионных сил твердой фазы костного матрикса с 16,0 до 53,0 нН. В области же неструктурированной фазы костных образцов, анатомически соответствующей свободному пространству нанощелей, расположенных между коллагеновыми волокнами и нанокристаллами апатита, наблюдалось практически двукратное увеличение адгезионной силы (с 25,4 до 41,0 нН).

Полученные локальным микроинденсированием данные, свидетельствуют об увеличении толщины гидратной оболочки нанокристаллов гидроксиапатита и накоплении в расширенных порах компактного вещества более вязкой воды с повышенным уровнем сил межмолекулярного взаимодействия.

3.4 Изучение морфологии огнестрельных переломов методом рентген-структурного анализа

Анализ данных, полученных с помощью рентген-структурного анализа, показал, что для контрольных образцов костных тканей интактных костей, а также образцов, взятых из областей, отдаленных на 5-10 см от раневого канала, основной кристаллической фазой гидроксиапатита является его гексагональная модификация - Ca₅(PO₄)₃(OH). Кроме того, в образцах присутствует моноклинная модификация апатита - Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ в количестве 8 ± 2 объемных процента и около 20 объемных процентов аморфной фазы.

В пробах взятых непосредственно вблизи входного и выходного отверстий раневого канала моноклинная модификация гидроксиапатита практически отсутствует и значительно возрастает доля аморфной фазы. По мере удаления от этой области возрастает количество моноклинной модификации и падает содержание фазы аморфной.

Указанные обстоятельства, и, прежде всего, аморфизация твердой фазы свидетельствуют о проявлении размерных эффектов нанообъектов, обусловленных, в данном случае, уменьшением диаметра нанокристаллов апатита.

3.5 Изучение морфологии огнестрельных переломов методом микротвердометрии

По данным микротвердометрии твердость наружной кортикальной пластинки теменной кости в норме колеблется в пределах 61,1 кг/мм², губчатого вещества - 51,8 кг/мм² и внутренней кортикальной пластинки - 51,6 кг/мм². Указанные показатели свидетельствуют о том, что наружная кортикальная пластинка теменных костей в сравнении с подлежащими анатомическими слоями более хрупкая. При исследовании образцов теменной кости в области входного раневого канала обнаружено существенное снижение показателя микротвердости наружной кортикальной пластинки до 47,7±0,9кг/мм² (в интактной кости - 61,1±1,6кг/мм²). При этом показатели микротвердости губчатого вещества и внутренней кортикальной пластинки сохраняются в пределах контрольных значений, составляя 51,0 кг/мм² и 50,6 кг/мм², соответственно.

По данным микротвердометрии зоны огнестрельного перелома диафизов длинных трубчатых костей регистрируется падение показателей во всех макроанатомических зонах (таблица 4). Так, в наружной кортикальной пластинке показатель снижается с 59,2±1,0 кг/мм² в контроле - до 51,5± 1,3 кг/мм² в зоне, прилегающей к раневому каналу; в губчатом веществе, соответственно: с 61,2±1,2 кг/мм² до 50,7±0,9 кг/мм² и во внутренней кортикальной пластинке - с 67,1±1,0 кг/мм² до 57,2±0,8 кг/мм². В целом снижение показателей колеблется в пределах 20% во всех анатомических отделах трубчатой кости. На отдалении до 10 см также регистрируются тенденции снижения показателей твердости, но преимущественно в кортикальных пластинках. Так в наружной кортикальной пластинке показатель микротвердости снизился до 54,4±1,8 кг/мм² (в контроле 59,2±1,0 кг/мм²), в губчатом веществе удерживался в пределах контрольных значений - 59,4±1,8 кг/мм² (в контроле 61,2±1,2 кг/мм²). Более заметно изменение показателя микротвердости во внутренней кортикальной пластинке, который снизился до 59,2±1,3 кг/мм² (в интактной кости - 67,1±1,0 кг/мм²).

Таблица 4. Показатели твердости трубчатых костей, (М ± m), кг/мм²

Примечание:

* - достоверно для р < 0,05 относительно контрольной группы.

В итоге, в зоне раневого канала компактное вещество трубчатых костей разупрочняется достаточно равномерно во всех анатомических зонах. Однако на отдалении от раневого канала разупрочняющее действие ударной волны распространяется преимущественно по кортикальным пластинкам.

В целом анализ данных, полученных при выполнении данного этапа исследования огнестрельных переломов, показал, что костная ткань, в зависимости от её структурных и микромеханических свойств, при воздействии огнестрельного ранящего снаряда разрушается по-разному.

Так, плоские кости черепа разрушаются преимущественно по вязкому типу с образованием в большинстве случаев дырчатых переломов с ровными краями. Основными механизмами разрушения костного матрикса при этом являются деформация смещения пластов и его разрывы.

Разрушение трубчатых костей в области диафиза происходит преимущественно по вязко-хрупкому типу с образованием оскольчатых переломов. Здесь основными механизмами разрушения являются трещины, разрывы, лакунарно-кавернозные деформации, а также гомогенизация и уплотнение костного матрикса в области канальцевых мембран.

При этом был выявлен и общий механизм разрушения обоих структурно-анатомических типов кости - пористая трансформация костного матрикса с формированием нано-, мезо- и микропор. Под воздействием факторов огнестрельных ранящих снарядов, как в плоских, так и в трубчатых костях, происходит аморфизация гидроксиапатита, что проявляется, прежде всего, в уменьшении размеров его нанокристаллов. Наряду с этим проведение рентген-структурного анализа показало увеличение напряженности в кристаллической решетке апатита.

Немаловажным явилось выявление того факта, что все патологические деформации костного матрикса анатомически не были связаны с системой костных канальцев и преимущественно располагались непосредственно на территории костного матрикса. Этот топологический фактор указывает на то, что разрушение происходит не только за счёт прямого аэро- и гидродинамического удара. Вероятно, когда при огнестрельной травме под действием энергии бокового удара формируется временная пульсирующая полость, происходят фазовые переходы матриксной воды, изменяется степень её упорядоченности. При этом появляется так называемый расклинивающий эффект и утрачиваются свойства воды, необходимые для поддержания нормального течения всех процессов жизнедеятельности костной ткани.

В целом, предложенный системный методологический подход, опирающийся на активное использование современных исследовательских нанотехнологий, позволил получить принципиально новые данные о тонких структурных механизмах разрушения костной ткани при действии факторов огнестрельного ранящего снаряда, которые не были изучены ранее.

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ РАНЕЛАТА СТРОНЦИЯ НА СТРУКТУРУ КОСТНОГО МАТРИКСА ПРИ КОНСОЛИДАЦИИ ОГНЕСТРЕЛЬНЫХ ПЕРЕЛОМОВ ДЛИННЫХ ТРУБЧАТЫХ КОСТЕЙ КОНЕЧНОСТЕЙ

4.1 Обоснование выбора модели для исследования влияния стронция ранелата на структуру костного матрикса при консолидации огнестрельных переломов длинных трубчатых костей конечностей