Фармакотехнологическое изучение липофильной фракции, полученной из цветков T. patula

В мерную колбу вместимостью 50мл помещали 1мл раствора А и доводили объем до метки 70%-ным спиртом. Измеряли оптическую плотность раствора на спектрофотометре СФ-56 при длине волны 370нм в кювете с толщиной слоя 10мм. В качестве раствора сравнения использовали 70%-ный спирт.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на кверцетин и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

,

где

D-оптическая плотность исследованного раствора;

646-удельный показатель раствора кверцетина при длине волны 370нм;

m-масса сырья в граммах;

W-потеря в массе при высушивании сырья в процентах.

Результаты представлены в таблице 8

Таблица 8

Содержание суммы флавоноидов в сырье T. patula

№	Сумма флавоноидов, %	х - хi	(х - хi)2	Метрологические характеристики
1. 2. 3. 4. 5. 6.	4,65 4,58 4,89 4,52 4,60 4,61 =27,85	- 0,01 + 0,06 - 0,15 + 0,12 + 0,04 +0,03	0,0001 0,0036 0,0225 0,0144 0,0016 0,0009	S=0,053 Sx=0,129 х=0,135 =2,91% х±х=4,640,135

2.5 Количественное определение каротиноидов в цветках T. patula

5 г (точная навеска) измельченного сырья помещали в коническую колбу вместимостью 100мл с притертой пробкой. С помощью пипетки наливали 85мл гексана. Экстрагировали при периодическом перемешивании в течение 1,5ч. Экстракт отфильтровывали через бумажный фильтр. 10мл экстракта помещали в предварительно высушенную и взвешенную выпарительную чашку, упаривали на водяной бане при 100-105С в течение 30 мин.

Содержание масла в сырье (в ) рассчитывали по формуле:

X = ,

где

а - привес чашки, г;

А - навеска абсолютно сухого сырья, г.

Содержание масла в цветках бархатцев прямостоячих составило 12,99%.

Для определения содержания суммы каротиноидов 0.2мл гексанового экстракта помещали в мерную колбу вместимостью 25мл. Довели объем до метки тем же растворителем. Определяли оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре СФ-56 при длине волны 450нм в кюветах с толщиной слоя 10мм. В качестве раствора сравнения использовали гексан. Параллельно определяли оптическую плотность раствора стандартного образца, приготовление которого проводят в соответствии с ФС 42-1730-86 «Масло облепиховое».

Содержание суммы каротиноидов С (в пересчете на -каротин) в миллиграмм-процентах рассчитывают по формуле:

,

где

D₁-оптическая плотность исследуемого раствора;

D₀-оптическая плотность раствора стандартного образца дихромата калия;

0.00208-количество -каротина в мг, в растворе, соответствующем по окраске раствору стандартного образца дихромата калия.

Содержание суммы каротиноидов в полученном образце составило 80,8мг/%.

Таблица 9

Содержание каротиноидов в сырье T. patula

№	Сумма каротиноидов, мг/%	х - хi	(х - хi)2	Метрологические характеристики
1. 2. 3. 4. 5. 6.	80,80 86,32 81,64 78,21 77,16 80,59 =484,72	- 0,01 - 5,53 - 0,85 + 2,58 + 3,63 +0,20	0,0001 30,5809 0,7225 6,6564 13,1769 0,0400	S=1,306 Sx=3,199 х=3,36 =4,15% х±х=80,793,36

2.6 Определение эфирного масла

2.6.1 Получение эфирного масла из цветков T. patula

ГФ XI издания предлагает 4 способа получения эфирного масла. Нами проведены сравнительные эксперименты по определению характеристик процесса отгонки масла и особенностям его состава при использовании трех методик с применением прибора Гинзберга и Клевенджера.

Сравнительное изучение методов отгонки эфирного масла из цветков T. patula показало, что выделение масла методом Гинзберга не наблюдалось. По методу Клевенджера выделение эфирного масла длилось в течение двух часов. При добавлении органического растворителя (толуола) длительность процесса отгонки уменьшалась, а объем масла увеличивался. Поэтому для количественного определения эфирного масла в сырье нами был использован 3-й метод Клевенджера.

2.6.2 Количественное определение эфирного масла в сырье T. patula

Навеску измельченного сырья помещали в колбу, приливали 300 мл воды, колбу соединяли с паропроводной трубкой и заполняли водой градуированную и сливную трубки через кран при помощи резиновой трубки, оканчивающейся воронкой. Затем через боковую трубку при помощи пипетки вливали в приемник около 0,5 мл толуола и точно замеряли его объем, опуская для этого уровень жидкости в градуированную часть трубки. Колбу с содержимым нагревали и кипятили с интенсивностью, при которой скорость стекания дистиллята составляет 60-65 капель в мин.

Через 5 мин после окончания перегонки открывали кран, постепенно спуская дистиллят так, чтобы эфирное масло заняло градуированную часть трубки приемника, и еще через 5 мин замеряли объем эфирного масла.

Содержание эфирного масла в объемно-весовых процентах (Х) в пересчете на абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

,

где

V- объем раствора масла в толуоле, в мл;

V₁ - объем толуола, в мл;

m - масса сырья, в г;

W - потеря в массе при высушивании сырья, в %.

Содержание эфирного масла в пересчете на абсолютно сухое сырье составило 0,135%.

Таблица 10

Содержание эфирного масла в сырье T. patula

№	Содержание эфирного масла, в %	х - хi	(х - хi)2	Метрологические характеристики
1. 2. 3. 4. 5. 6.	0,131 0,147 0,138 0,141 0,139 0,133 =0,829	+ 0,009 - 0,007 + 0,002 - 0,001 + 0,001 + 0,007	0,000081 0,000049 0,000004 0,000001 0,000001 0,000049	S=0,002 Sx=0,006 х=0,006 =4,36% х±х=0,14±0,006

2.6.3 Органолептические признаки полученного масла

Эфирное масло из цветков T. patula представляет собой желто-зеленую жидкость, со своеобразным резким запахом.

Выводы по главе 2

1. С помощью макро- и микроскопического анализа установили принадлежность данного растения к семейству Asteraceae, род Tagetes, вид T. patula;

2. Фитохимически в сырье установлено наличие биологически активных веществ: флавоноидов, каротиноидов, терпенов, кумаринов, стеринов;

3. Определены товароведческие показатели сырья (влажность %, содержание общей золы и золы, не растворимой в 10% хлористоводородной кислоте (%), которые соответствуют требования ГФ XI издания;

4. С помощью метода Клевенджера (3-й метод) было выделено эфирное масло, содержание которого в сырье составило 0,13%. Проведен органолептический анализ полученного масла;

5. В сырье установили содержание каротиноидов 80,8 мг/% и флавоноидов 4,64% в пересчете на абсолютно - сухое сырье.

Глава 3. Получение липофильной фракции, и ее анализ

3.1 Получение липофильной фракции

Для экстракции из сырья липофильных биологически активных веществ обычно используют растительные масла и органические растворители: хлороформ, гексан, четыреххлористый углерод, диэтиловый эфир и т.д. Нами в качестве экстрагента был выбран хлороформ, т.к. по данным литературы в него переходят не только глицериды и терпены (в т.ч. каротиноиды), но и многие метоксилированные флавоноиды. Экстракцию сырья проводили по следующей методике: 20 г цветков T.patula сушили на воздухе, измельчали и исчерпывающе экстрагировали в аппарате Сокслета до получения практически бесцветного экстрагента. Растворитель полностью удаляли сначала с помощью роторного испарителя, затем на водяной бане в выпарительной чашке и окончательно в сушильном шкафу при 50С. В результате получили 1,3976 г густого экстракта желто-коричневого чвета. Всего по данной методике нами было получено 20 г экстракта, для его химического и биологического анализа.

3.2 Качественный анализ липофильной фракции

Качественный анализ полученной фракции на наличие биологически активных соединений проводили с помощью качественных реакций, бумажной (БХ) и тонкослойной (ТСХ) хроматографии, УФ-спектроскопии.

3.2.1 Качественный анализ липофильной фракции на наличие стероидных соединений

1. Реакция Сальковского

Несколько мг экстракта растворяли в 2 мл хлороформа. К полученному раствору осторожно, по стенкам пробирки, добавляли концентрированную серную кислоту. Через некоторое время хлороформный слой окрасился в оранжево-красный цвет.

2. Реакция Либермана-Бурхарда

Реакцию проводили на выпарительной чашке. Несколько мг экстракта растворили в 2 мл хлороформа, добавили 10 капель уксусного ангидрида и 3 капли концентрированной серной кислоты. Наблюдали синюю окраску, переходящую в красно-бурую.

Наличие фитостеринов в экстракте определяли также с помощью ТСХ на силикагеле ЛС-5/40 в системах растворителей: петролейный эфир - ацетон (7:3)

В качестве реагентов-проявителей использовали концентрированную серную кислоту и реактив Либермана-Бурхарда, который готовили осторожным смешиванием 20 мл охлажденного до 0С укусного ангидрида и 5 мл концентрированной серной кислоты. На хроматограммах наблюдали пятно, которое под действием конц.H₂SO₄ окрашивалось в темно - бурый цвет (Rf = 0.78), а после обработки реактивом Либермана-Бурхарда в зеленую, переходящей в синюю, окраску (Rf = 0.84).

На основании проведенных исследований можно сделать вывод о том, что экстракт содержит фитостероиды.

3.2.2 Качественный анализ липофильной фракции на наличие каротиноидов и других терпенов

Для предварительного исследования экстракта на наличие каротиноидов 0,1 г растворяли в 2 мл хлороформа, добавляли 2 капли хлорида сурьмы (III). Наблюдали синее окрашивание, характерное для каротиноидов.

Обнаружение каротиноидов методом ТСХ проводили на пластинках “Silufol” и на стеклянных пластинках с закрепленным слоем силикагеля ЛС 5/40. Исследуемый экстракт обрабатывали гексаном и полученные извлечения подвергали хроматографированию в системе растворителей: петролейный эфир - бензол (6:9). В видимом свете наблюдали три желтых пятна. Хроматограмму опрыскивали насыщенным раствором треххлористой сурьмы в хлороформе, пятна окрашивались в синий цвет. Rf пятен: 0,15; 0,40; 0,69, соответственно. Другую хроматограмму, из той же системы растворителей, обрабатывали концентрированной серной кислотой. По истечению 2 - 3 минут также наблюдали три пятна сине - зеленого цвета.

Хроматографирование в тех же условиях использовали для препаративного разделения каротиноидов. Зону, имеющую наиболее интенсивную окраску в видимом свете и после обработки треххлористой сурьмой, элюировали гексаном и исследовали с помощью УФ - спектроскопии.

В УФ - свете наблюдали максимумы поглощения при длинах волн _max (гексан) 472, 444 и 420 нм. Такие максимумы, по данным литературы, характерны для каротиноидов, в частности, виолоксантина. Кроме того извлечение давало реакции, характерные для виолоксантина: при добавлении ледяной уксусной кислоты появилась окраска зеленого цвета, а при добавлении концентрированной серной кислоты - синее.

На ТСХ в системе растворителей диэтиловый эфир - гептан (1:2) помимо пятен, соответствующих каротиноидам, наблюдали четыре пятна с голубой и зеленоватой флюоресценцией. Вещества не давали положительных реакций при обработке хроматограмм спиртовым раствором AlCL₃; 5%-ным раствором Na₂CO₃ и 1%-ным водным раствором FeCL₃. три из этих веществ были выделены с помощью препаративной ТСХ. Они представляли собой масла с характерным запахом и имели УФ - спектры в этаноле в области 215 - 225 нм, следовательно, это не ароматические вещества. И так как по значению Rf на ТСХ, и окраске, они совпали с веществами обнаруженными нами в эфирном масле, мы предположили, что это терпены.

3.2.3 Качественный анализ липофильной фракции на наличие фланоидных соединений

Для предварительного обнаружения флавоноидов в экстракте выполняли цианидиновую реакцию (проба Синода).

0,1г густого экстракта растворяли при нагревании в 5 мл 96%-ном этиловом спирте, добавляли порошок металлического магния и, осторожно, концентрированную хлористоводородную кислоту. Появление красного окрашивания свидетельствовало о наличии флавоноидов.

Дальнейшее исследование экстракта проводили с помощью ТСХ и восходящей БХ. Использовали системы растворителей:

1) н - бутанол : уксусная кислота : вода (4 : 1 : 5) - для БХ;

2) этанол - хлороформ (0,5:9) - для ТСХ.

На бумажной хроматографии обнаружили пятно, имеющее в УФ - свете желтую окраску (Rf = 0,62). Хроматограммы обрабатывали: 10%-ным раствором Na₂CO₃ ; парами аммиака; реактивом Бенедикта для приготовления которого 17,3 г цитрата натрия и 11,7 г Na₂CO₃ 10Н₂О и смешивали с 1,73 г CuSO₄ 5H₂O, растворенном в 10мл дистиллированной воды. (Реактив позволяет обнаружить орто - дигидроксигруппировку в боковом фенольном радикале).

На ТСХ также наблюдали одно пятно, имеющее темно - коричневую окраску в УФ - свете и значение Rf = 0,60. Хроматограммы обрабатывали концентрированной серной кислотой и 5% -ным раствором NaOH.

Результаты анализа представлены в таблице 11.

Таблица 11

Качественный анализ флавоноидов с помощью ТСХ

Окраска на хроматограмме
	В видимом свете	В УФ - свете	Раствор аммиака	5% Na2CO3	10% AICL3	Реактив Бенедикта	Конц. H2SO4	5% NaOH
БХ	Бледно-желтая	желтая	Ярко-желтая	желтая	Желто-зеленая	Ослабление первоначальной окраски	_	_
ТСХ	_	Желто-коричневая	_	_	_	_	Ярко-желтая	Желтая

Результаты анализа позволяют предположить, что обнаруженное вещество является флавонолом, имеющим орто-дигидроксигруппировку в боковом фенольном радикале.

Для более точного установления строения, вещество выделяли из экстракта. Для этого 10г экстракта растворяли при нагревании в небольшом количестве хлороформа и оставляли при комнатной температуре . Через несколько дней выпал желто-зеленый осадок (0,1 г). После перекристаллизации из водного этанола получили светло-желтые кристаллы с Т.пл. 260-263С.

УФ - спектр вещества в этаноле имеет два максимума поглощения при длине волны 260 и 375 нм, что характерно для флавонолов. Для установления положения гидроксильных групп УФ-спектры вещества снимали в присутствии комплексообразующих и ионизирующих добавок. Результаты приведены в таблице 12.

Таблица 12

УФ-спектральные характеристики вещества, выделенного из липофильной фракции

max, нм () 210-5 М раствор в этаноле
C2H5OH	+NaOAc	+NaOAc, +H3BO3	+AICL3	AICL3, HCI	C2H5ONa
260 375	+10 390 +15	270 400 +25	270 435 +60	270 430 +55	290 +20 450 +75

Батохромный сдвиг I полосы поглощения при прибавлении к его этанольному раствору флавоноида (рис.6) ацетата натрия указывает на наличие ОН - группы у седьмого атома углерода (рис.7), а батохромный сдвиг той же полосы на 75 нм при прибавлении этилата натрия (рис.8) на наличие ОН - группы у С₄ . Присутствие орто-диоксигруппировки в боковом фенольном радикале подтверждается батохромным сдвигом I полосы на 25 нм после добавления NaOAc и H₃BO₃ (рис.9). На гидроксилирование положений С₃ и С₅ указывает значительный батохромный сдвиг I полосы после прибавления к этанольному раствору вещества AICL₃ (рис.10), причем этот сдвиг практически сохраняется после добавления HCI (рис.11). Происходит лишь небольшое смещение в сторону более коротких волн (гипсохромный сдвиг).

Рис.6. Спиртовой раствор флавоноида



Рис. 7. Спиртовой раствор флавоноида с добавкой ацетата натрия

Рис. 8. Спиртовой раствор флавоноида с добавкой этилата натрия

Рис. 9. Спиртовой раствор флавоноида с добавкой NaOAc и H₃BO₃

Рис. 10. Спиртовой раствор флавоноида с добавкой AICl₃

Рис. 11. Спиртовой раствор флавоноида с добавкой HCI

Таким образом мы доказали, что выделенный флавоноид является флавонолом и имеет свободные гидроксильные группы у С₇; С₃; С₄ и С₅ . Однако вещество не совпадало на хроматограммах по значению Rf с достоверным образцом кверцетина, но совпадало как по окраске, так и по значению Rf c достоверным образцом патулетина, который по данным литературы содержится некоторых видах бархатцев. Проба смешения выделенного вещества с патулетином не давала депрессии температуры плавления.

На основании проведенных исследований мы сделали вывод, что в липофильной фракции содержится патулетин (3,5,7,3,4 - пентагидрокси - 6 - метоксифлавон).

3.3 Количественное определение каротиноидов в липофильной фракции

0.1г сгущенного хлороформного извлечения, высушенного до постоянной массы при 60С, поместили в колбу вместимостью 100мл с притертой пробкой и добавили 75мл гексана. Экстрагировали при постоянном перемешивании в течение 1.5 часа. Полученный экстракт фильтровали через бумажный фильтр в колбу вместимостью 100мл. Фильтр промывали гексаном, и полученный объем экстракта довели до метки. 1мл полученного раствора перенесли в колбу вместимостью 25мл и довели объем до метки тем же растворителем. Измеряли оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре СФ-56 при длине волны 450нм.

В качестве раствора сравнения использовали гексан. Параллельно измеряли оптическую плотность раствора стандартного образца дихромата калия (в соответствии с ФС 42-1730-86 «Масло облепиховое»).

Содержание суммы каротиноидов С (в пересчете на -каротин) в миллиграм-процентах рассчитывали по формуле:

,

где

D₁-оптическая плотность исследуемого раствора;

D₁- оптическая плотность раствора стандартного образца;

0,00208- количество -каротина в мг, в растворе, соответствующем по окраске раствору стандартного образца дихромата калия.

Результаты представлены в таблице 13.

Таблица 13

Содержание каротиноидов в липофильной фракции

№	Сумма каротиноидов, мг/%	х - хi	(х - хi)2	Метрологические характеристики
1. 2. 3. 4. 5. 6.	62,8 61,93 60,29 65,78 64,32 61,47 =376,59	- 0,03 + 0,84 + 1,48 -3,01 - 1,55 +1,30	0,009 0,7056 2,1904 9,0601 2,3025 1,69	S=0,817 Sx=2,00 х=2,10 =3,34% х±х=62,772,10

3.4 Количественное определение флавоноидов в липофильной фракции

В липофильной фракции: Около 0,1 г, предварительно высушенного до постоянной массы, липофильной фракции (точная навеска) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляли 70 мл 95%-ного спирта и растворяли при нагревании на водяной бане при 60С. Раствор охлаждали, доводили тем же 95%-ным спиртом до метки и перемешивали (раствор А). Затем раствор фильтровали через бумажный фильтр “синяя лента”, отбрасывая первые 10мл фильтрата. 4 мл полученного раствора переносили в мерную колбу объемом 25 мл, доводили раствор тем же 95%-ным спиртом до метки и перемешивали (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б измеряли на спектрофотометре СФ-56 в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно 95%-ного спирта при длине волны 370 нм.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на кверцетин рассчитывали по раствору стандартного образца. 0,04 г (точная навеска) стандартного образца (ФС 42-12090-72), высушенного до постоянной массы при 130 С, в 95 % этаноле в колбе вместимостью 50 мл, доводили объем раствора 95% этанолом до метки и перемешивали. Помещали 1 мл полученного раствора в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем раствора 95 % этанолом до метки и перемешивали.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на кверцетин в липофильной фракции (Х), в процентах рассчитывали по формуле:

,

где

D₁ - оптическая плотность испытуемого раствора;

D₀ - оптическая плотность кверцетина (ГСО);

m₀ - масса кверцетина, в г;

а - навеска липофильной фракции, г.

Количественное содержание суммы флавоноидов в липофильной фракции (Х) в процентах в пересчете на кверцетин по удельному показателю поглощению при длине волны 370 нм ( 646) рассчитывали по формуле:

,

где

D₁ - оптическая плотность испытуемого раствора;

646 - удельный показатель поглощения кверцетина при длине волны 370 нм.

Результаты представлены в таблицах 13, 14.

Таблица 13

Содержание флавоноидов в липофильной фракции по раствору стандартного образца

№	Сумма флавоноидов, %	х - хi	(х - хi)2	Метрологические характеристики
1 2 3 4 5 6	8,52 8,54 8,69 8,97 8,43 8,87 =52,02	+ 0,15 + 0,13 - 0,02 - 0,30 + 0,24 -0,20	0,0225 0,0169 0,0004 0,09 0,0576 0,04	S=0,087 Sx=0,213 х=0,22 =2,58% х±х=8,670,22

Таблица 14

Содержание флавоноидов в липофильной фракции по удельному показателю поглощения

№	Сумма флавоноидов, %	х - хi	(х - хi)2	Метрологические характеристики
1. 2. 3. 4. 5. 6.	7,55 7,49 7,86 7,41 7,37 7,63 =45,31	0 + 0,04 - 0,31 + 0,14 + 0,18 - 0,08	0 0,0016 0,0961 0,0256 0,0324 0,0064	S=0,073 Sx=0,178 х=0,19 =2,47% х±х=7,550,19

Выводы по главе 3

1. Установлено, что для экстракции сырья с целью получения липофильной фракции лучшим растворителем является хлороформ, так как в него перешли не только стероиды и терпены (в том числе каротиноиды), но и метоксилированный флавоноид.

2. Проведен качественный анализ липофильной фракции и установлено наличие в ней биологически активных веществ, таких как: стероидов, каротиноидов и метоксилированных флавоноидов.

3. С помощью физико-химических методов (ТСХ, БХ и УФ спектроскопии) доказано, что липофильная фракция содержит один метоксилированный флавоноид, который по литературным данным соответствует патулетину.

4. Количественное содержание каротиноидов в липофильной фракции составило 62,7мг/%; флавоноида 8,7% (по раствору стандартного образца) и 7,6% (по удельному показателю поглощения).

Глава 4. Разработка технологии мази с липофильной фракцией из цветков T. Patula

4.1 Исследование биологической доступности мазей

Биологическая доступность мази зависит от целого ряда факторов, в том числе от способности лекарственного вещества к высвобождению из мази - важный показатель качества мази.

Для этого мы пользовались модельным опытом in vitro - диффузия в желатиновый гель при прямом контакте мази со средой.

В чашки Петри (4 штуки) разливали 3 % раствор желатина, содержащий 1% хлорида железа (III). Хлорид железа используется как индикатор, с которым образуется окрашенное соединение. Пробы мазей помещали в колодцы, диаметром 8 мм и высотой 10 мм. По величине диффузии лекарственного вещества из мази. Измерение проводили через 24 часа.

Для исследования были выбраны три основы: «Олиогель», эмульсионную и «Аквасорб». На каждой основе приготовили три мази, содержащие 5% липофильной фракции из цветков T.patula.

Далее выявили наиболее активную мазь. Наибольший диаметр окрашенной зоны был у той, в которой основа лучше всех высвобождала действующие вещества.

Диаграмма высвобождения действующих веществ из мази на различных основах.



Из приведенной выше диаграммы видно, что оптимальной основой, способной хорошо высвобождать действующее вещество, является «Олилгель».

Исходя из полученных данных, можно сделать вывод о целесообразности разработки технологии мази на основе «Олиогель», с содержанием липофильной фракции 5%.

4.2 Разработка технологии и состава мази с липофильной фракцией из цветков T. patula

Учитывая данные литературы о действии каротиноидов и флаваноидов, и принимая во внимание наше исследование, представляется целесообразным разработка 5% мази с содержанием липофильной фракции 0.5.

Состав мази на основе «Олиогель»

Липофильная фракция из

цв. T.patula 0.50

Аэросил 0.45

Масло подсолнечное 9.15

Общая масса 10.0

Физико-химические свойства ингредиентов

Аэросил - аморфная непористая двуокись кремния. В воде набухает. Так же не растворим в спирте. Устойчив к воздействию температур, повышает температурную устойчивость мазей в условиях жаркого климата. Очень хорошо смешивается с жирами и маслами, образуя гели.

Характеристика лекарственной формы

Мягкая лекарственная форма - комбинированная мазь на гидрофильной основе.

Расчет и составление прописи

Липофильная фракция из

цв. T.patula 0.5

Аэросил 0.45

Подсолнечное масло 9.15

Общая масса 10.0

Технология

Отвешенное количество липофильной фракции растворяли в масле подсолнечном. Затем добавляли Аэросила в качестве загустителя и тщательно перемешивали до характерного потрескивания.

Оценка качества мази

Определение однородности мази проводили по общепринятой схеме. Мазь однородная с характерным запахом.

Выводы по главе 4

1. Проведен выбор оптимальный основы - носителя.

2. Теоретически обоснована технология мази на базе выбранной основы.

Глава 5. Разработка способов идентификации биологически активных веществ липофильной фракции в мази

5.1 Определение флавоноидов химическими физико-химическими методами

5.1.1 Химические методы

Цианидиновая реакция или проба Chinoda

0.1 г мази растворяли при нагревании в 5мл 96%-ног этилового спирта, добавляли порошок магния и концентрированной хлористоводородной кислоты. Появлялось слабое малиновое окрашивание, характкризующее наличие флавоноидов.

Реакция с хлоридом железа

0.1г мази растворяли в спирте этиловом 96% ном, добавляли 2-3 капли хлорида железа (III). Наблюдали появление сине-зеленого окрашивания.

5.1.2 Физико-химические методы

Для определения подлинности флавоноидов в растительных лекарственных препаратах широко применяется метод бумажной хроматографии. Использовали системы растворителей: н-бутанол : уксусная кислота : вода (4 : 1 : 5).

На БХ обнаружили пятно имеющее в УФ-свете желтую окраску (Rf=0.62). Хроматограммы обрабатывали: 10%-ным раствором AICL₃ в этаноле; 5%-ным раствором Na₂CO₃; парами аммиака; реактивом Бенедикта. Установили, что в исследуемой мази проявляется пятно со значением Rf, принадлежащем флавоноиду липофильной фракции. Это позволяет сделать вывод о целесообразности использования метода БХ для идентификации полученной мази.

Также нами был использован спектрофотометрический метод.

Методика приготовления исследуемого раствора.

Около 1,0г (точная навеска) растворяли при нагревании в небольшом количестве хлороформа и оставляли при комнатной температуре. Через 2ч выпал желтый осадок, который отфильтровали. Полученный осадок поместили в колбу на 25мл, растворили в небольшом количестве 96%-ного этанола и довели объем до метки тем же растворителем. Измерили оптическую плотность исследуемого раствора на спектрофотометре СФ-101 в области длин волн от 250-500 нм в кювете с толщиной слоя 10мм. В качестве раствора сравнения использовали этанол.

Из полученных оптических спектров видно, что спиртовой раствор мази имеет выраженный максимум поглощения при 260 нм и небольшое плечо при 375 нм. Полученные максимумы соответствуют максимумам поглощения спиртового раствора флавоноида липофильной фракции (260 и 375 нм).

5.2 Определение каротиноидов химическими физико-химическими методами

5.2.1 Химические методы

Реакция с треххлористой сурьмой

0,5г мази растворяли в 1-2мл хлороформа. К полученному раствору по каплям добавляли концентрированную серную кислоту. Наблюдали зеленое окрашивание, переходящее в синее.

5.2.2 Физико-химические методы

Как свидетельствуют литературные данные, для идентификации каротиноидов в растительных препаратах применяется метод ТСХ.

ТСХ проводили на пластинках “Silufol” и на стеклянных пластинках с закрепленным слоем силикагеля ЛС 5/40. 5%-ную мазь растворяли в гексане и полученный раствор подвергали хроматографированию в системе растворителей: петролейный эфир : бензол (6 : 9). В видимом свете обнаружили четыре пятна. Хроматограмму обработали насыщенным раствором хлорида сурьмы (III) в хлороформе: три пятна окрашивались в слабо-синий цвет с Rf 0.16; 0,38 и 0,71 соответственно.

Также получили другую хроматограмму, в той же системе растворителей, которую обработали концентрированной серной кислотой. Через некоторое время наблюдали три пятна зелено-голубого цвета.

Кроме хроматографических методов, для идентификации каротиноидов применяется спектрофотометрия.

Для изучения аналитических возможностей спектрофотометрического метода были измерены УФ-спектры хлороформных растворов 5%-ной мази. Методика приготовления исследуемого раствора:

Точную навеску мази (около 2г) растворяли в гексане в мерной колбе, вместимостью 50мл. Доводили объем до метки гексаном. Оптическую плотность полученного раствора измеряли на спектрофотометре СФ-101 в области длин волн от 300 до 500 нм в кювете с толщиной слоя 10мм. В качестве раствора сравнения использовали гексан.

Оптические спектры гексанового раствора мази имеют максимумы поглощения в области 444 и 420 нм, которые близки по значению максимумам поглощения гексанового раствора липофильной фракции (472, 444 и 420 нм), что позволяет осуществлять идентификацию каротиноидов в полученной мази.

5.3 Разработка способа стандартизации мази по количественному содержанию суммы каротиноидов

Точную навеску мази (около 2г), поместили в колбу вместимостью 100мл с притертой пробкой и добавили 75мл гексана. Экстрагировали при постоянном перемешивании в течение 1.5 часа. Полученный экстракт фильтровали через бумажный фильтр в колбу вместимостью 100мл. Фильтр промывали гексаном, затем отбрасывали, а полученный объем экстракта довели до метки гексаном. 1мл полученного раствора перенесли в колбу вместимостью 25мл и довели объем до метки тем же растворителем. Измеряли оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре СФ-56 при длине волны 450 нм. В качестве раствора сравнения использовали гексан. Параллельно измеряли оптическую плотность раствора стандартного образца дихромата калия (в соответствии с ФС 42-1730-86 «Масло облепиховое»).

Содержание суммы каротиноидов С (в пересчете на -каротин) в миллиграм-процентах рассчитывали по формуле:

,

где

D₁-оптическая плотность исследуемого раствора;

D₁- оптическая плотность раствора стандартного образца;

0,00208- количество -каротина в мг, в растворе, соответствующем по окраске раствору стандартного образца дихромата калия.

Полученные результаты и их метрологические характеристики приведены в таблице 15.

Таблица 15

Содержание каротиноидов в 5% ной мази

№	Содержание каротиноидов в мази, %	х- хi	(х - хi)2	Метрологические характеристики
1. 2. 3. 4. 5. 6.	3,14 3,20 2,96 3,17 3,16 3,21 =18,84	0 - 0,06 + 0,18 - 0,03 - 0,02 - 0,07	0 0,0036 0,0324 0,0009 0,0004 0,0049	S=0,038 Sx=0,092 х=0,096 =3,07% х±х=3,140,096

Как свидетельствуют полученные результаты, содержание каротиноидов в мази находится в пределах 3,14 мг/% (допустимые отклонения 3,07%).

Данная методика может быть рекомендована для стандартизации полученной мази.

Выводы по главе 5

1. Разработаны способы идентификации флавоноидов в мази химическими, хроматографическими и спектрофотометрическими методами.

2. Предложены методики определения подлинности каротиноидов.

3. Разработан способ количественного определения каротиноидов в мази: спектрофотометрический метод. Содержание каротиноидов в пересчете на -каротин 3,14мг/%.

Глава 6. Фармакологическое изучение липофильной фракции и, приготовленной на ее основе 5%-ной мази

6.1 Изучение гепатозащитного действия липофильной фракции из цветков T. patula

Ранее проведенными исследованиями на кафедрах биохимии (Фролова Л.Н., Василенко Ю.К.) и технологии лекарств (Богданов А.Н.) некоторые субстанции, полученные из цветков бархатцев прямостоячих: масляной экстракт, спиртовая вытяжка и новогаленовый препарат, обладали выраженной гепатозащитной активностью, которая по ряду показателей превышала действие фламина [48]. В связи с этим представляется интерес изучить гепатозащитное действие полученной нами липофильной фракции, содержащей каротиноиды и флавоноиды. Модель четыреххлористого гепатоза воспроизводили путем перрорального введения 3 раза через день 50%-ного масляного раствора CCl₄ в дозе 0,15мл/100 г массы тела. Липофильную фракцию вводили в дозах 3 и 30 мг/кг перрорально за 7 дней до воспроизведения модели CCl₄ - поражения печени. В качестве препарата сравнения использовали эссенциале в дозе 30 мг/кг [20]. Контролем служили животные, которым вводили такой же объем растворителя (вазелиновое или подсолнечное масло). Эффективность гепатозащитного действия оценивали по нормализации некоторых показателей функционального состояния печени. Активность аланинаминотрансферазы (АлАт) в сыворотке крови определяли по методу Reitman S. и Frankel S., щелочной фосфатазы (ЩФ) по методу Бесселя, Лоури, Брока [68]. Для определения содержания в сыворотке крови общего билирубина использовали метод Йендрашика, общего холестерина - метод Илька [69]. Содержание гликогена в печени определяли по реакции с фенолом в кислой среде после щелочного гидролиза и выражали в г/кг [74]. Количество триглицеридов в гомогенате печени (мкмоль/г) измеряли по Gottfried S.P., Rosenberg B. В модификации Сенбетовой [70]. Для определения ТБК-активных продуктов в печени крыс за основу был взят метод Ohkawa и соавт [73]. Определение нуклеиновых кислот и белка проводили спектрофотометрически по разнице экстинкций при 270 и 290 нм и по разнице экстинкции при 260 и 280 нм соответственно [71]. Как видно из данных, представленных в таблице, лечебно-профилактическое применение липофильной фракции в дозах 3 и 30мг/кг привело к значительному снижению, по сравнению с контролем, содержания в печени ТБК-активных продуктов на 67% и 78%, Р0,001 соответственно. Одновременно наблюдалось изменение показателей липидного обмена в сторону их нормализации: снижение в печени триглицеридов на 24% и 33%, Р0,01 и снижение в сыворотке крови холестерина на 34% и 40%, Р0,01 соответственно. При этом содержание холестерина достоверно не отличалось от уровня интактных животных. Применение липофильной фракции в условиях CCl₄-гепатоза оказало также выраженное нормализующее действие на белковый обмен в печени. При этом наблюдалось повышение содержания в печени нуклеиновых кислот при применении исследуемой фракции в дозе 3мг/кг на 20%, Р0,05, а дозе 30мг/кг - на 44%, Р0,01, что достоверно не отличалось от значений интактных животных. Содержание же белка в печени увеличилось соответственно на 156% и 168%, Р0,001, что даже превышало уровень интактных значений.

Таблица 16

Влияние липофильной фракции на биохимические показатели функционального состояния печени при остром CCl₄-гепатозе у крыс

Группы. Показатели	Интактные	Контроль 1 (CCl4-гепатоз + вазелиновое масло)	CCl4-гепатоз + вазелиновое масло + липофильная фракция, 3мг/кг	CCl4-гепатоз + вазелиновое масло + липофильная фракция, 30мг/кг	Контроль 2 (CCl4-гепатоз + подсолнечное масло)	CCl4-гепатоз + подсолнечное масло + эссенциале, 30мг/кг
Аланинаминотрансфераза сыворотки крови, мкат/л	0,590,054 n=6	1,790,019 n=6	1,680,042 n=6 Рк0,05	1,720,033 n=5 Рк0,05	1,820,075 n=4	1,070,074 n=5 (-41%) Рк0,01
Щелочная фосфотаза сыворотки крови, мкат/л	1,130,218 n=6	1,880,188 n=6	1,580,167 n=6 Рк0,05	1,330,125 n=5 (-29%) Рк0,05	1,890,031 n=4	1,770,183 n=5 Рк0,05
Холестерин сыворотки крови, мкмоль/л	1,710,052 n=6	2,530,170 n=6	1,670,106 n=6 (-34%) Рк0,01	1,510,207 n=5 (-40%) Рк0,01	1,690,068 n=4	1,930,044 n=5 Рк0,05
Общий билирубин сыворотки крови, мкмоль/л	8,280,513 n=6	18,000,962 n=6	21,330,68 n=4	15,672,211 n=5 Рк0,05	17,580,418 n=4	14,660,91 n=5 (-17%) Рк0,05
Триглицериды печени, мкмоль/г	35,23,39 n=6	160,05,99 n=6	121,46,32 n=6 (-24%) Рк0,01	107,05,90 n=5 (-33%) Рк0,001	101,85,84 n=4	99,62,86 n=5 Рк0,05
Гликоген печени, г/кг	16,911,520 n=6	4,350,580 n=6	2,790,206 n=6 Рк0,05	5,5050,924 n=5 Рк0,05	7,330,640 n=4	5,000,960 n=5 Рк0,05
ТБК-активные продукты печени, нмоль/мг белка	0,310,0206 n=4	0,440,024 n=6	0,140,010 n=5 (-67%) Рк0,001	0,0970,010 n=5 (-78%) Рк0,001	0,390,042 n=4	0,360,008 n=4 Рк0,05
Белок печени, мг/г	112,12,07 n=6	87,66,19 n=6	224,228,15 n=6 (+155,8%) Рк0,01	234,716,12 n=5 (+168%) Рк0,001	92,76,48 n=4	126,914,00 n=5 Рк0,05
Нуклеиновые кислоты печени, мг/г	45,22,30 n=6	35,21,80 n=6	42,21,98 n=6 (+20%) Рк0,05	50,62,83 n=5 (+44%) Рк0,01	34,241,632 n=4	37,552,00 n=5 Рк0,05

Примечание: Рк - уровень достоверности по отношению к соответствующему контролю.

В то же время остальные показатели либо достоверно не отличались от таковых у контрольной группы животных (активности АлАт и ЩФ крови), либо изменялись в сторону углубления поражения, как, например, содержание билирубина в крови и гликогена в печени при применении липофильной фракции в дозе 3 мг/кг.

Использование же данной фракции в дозе 30 мг/кг привело к нормализации активности щелочной фосфатазы в крови, но активность аланинаминотрансферазы, содержание билирубина в крови и гликогена в печени в этом случае достоверно не отличались от контрольных показателей.

В отличие от этого, лечебно - профилактическое применение эссенциале в дозе 30мг/кг привело к нормализации активности аланинаминотрансферазы и снижению по сравнению с контролем содержания билирубина в крови на 16%, Р0,05, в то время как остальные показатели не отличались от контрольных значений.

Таким образом, липофильная фракция из цветков бархатцев в условиях CCl₄-поражения печени достаточно эффективно подавляет накопление в печени перекисных ТБК-активных продуктов, нормализует и улучшает показатели липидного обмена и даже активирует белково-синтетическую функцию печени. При этом в дозе 30 мг/кг это действие более выражено и сопровождается также нормализацией активности щелочной фосфатазы.

В сравнении с эссенциале липофильная фракция в отношении одних показателей обладает выраженным преимуществом, а в отношении других уступает этому препарату. Если же сравнить липофильную фракцию в более эффективной дозе (30мг/кг) с эссенциале в той же дозе, можно сказать, что липофильная фракция нормализует и улучшает значительно большее число показателей (щелочная фосфатаза, холестерин, триглицериды, ТБК-активные продукты, белок и нуклеиновые кислоты печени), чем эссенциале (аланинаминотрансфераза и билирубин крови).

Разнонаправленное действие липофильной фракции и эссенциале возможно, объясняется тем, что их защитная активность проявляется на различных стадиях развития повреждения печени под влиянием CCl₄ . Известно [75], что при метаболизме CCl₄ образуются высокореакционные свободные радикалы, которые могут повреждать белки, ядерный материал (нуклеиновые кислоты), а также инициировать процесс свободно-радикального окисления ненасыщенных жирных кислот фосфолипидов, входящих в состав биологических мембран. Повреждение мембран, нарушение их проницаемости, накопление в клетке токсических перекисных продуктов в конечном итоге приводит к гибели гепатоцитов.

Эссенциальные фосфолипиды, как компоненты природных мембран, способствуют регенерации, т.е. восстановлению уже поврежденных клеточных и субклеточных мембран, не оказывая, по-видимому, существенного влияния на интенсивность самого процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ), приводящего к повреждению мембран, о чем свидетельствует сохранение достаточно высокого уровня ТБК-активных продуктов в печени при применении эссенциале. В результате репарации клеточных мембран и нормализации их проницаемости наблюдается снижение выхода ферментных белков и билирубина из печени в кровь, что приводит к снижению в сыворотке крови активности аланинаминотрансферазы и содержания билирубина.

Соединения, содержащиеся в липофильной фракции, достаточно эффективно тормозят процесс ПОЛ в печени, поскольку наблюдается значительное снижение в ней ТБК-активных продуктов, особенно выраженное при использовании фракции 30 мг/кг т.е. эти соединения обладают антиоксидантным действием и, тем самым, препятствуют разрушению мембран клеток. Антиоксидантное действие соединений липофильной фракции может быть связано с тем, что они способны выступать в качестве “ловушек” свободных радикалов, инициирующих ПОЛ. Инактивируя свободные радикалы, данные соединения будут препятствовать не только усилению ПОЛ, но также и повреждению клеточного генома [76], нормализуя, тем самым, процессы биосинтеза белков, что и отмечалось в наших исследованиях.

Можно предположить, что защитный эффект липофильной фракции в условиях CCl₄-гепатоза реализуется на начальных стадиях развития патологического процесса. В то же время защитный эффект эссенциале связан с тем, что он способствует восстановлению разрушенных мембран, т.е. реализуется уже после развития повреждений. С этим, вероятно, связана установленная в наших опытах недостаточная эффективность эссенциале как лечебно-профилактического средства на модели острого поражения печени. Более эффективно эссенциале должен действовать как лечебное средство, что выявляется на моделях хронических патологий печени. Изученная нами липофильная фракция, тормозя патологический процесс на начальных стадиях его развития, более эффективно, чем эссенциале, “работает” как лечебно-профилактическое средство.

6.2 Изучение ранозаживляющей активности липофильной фракции из цветков бархатцев распростертых

В связи с выявленной нами способностью липофильной фракции (ЛФ) стимулирования процесса биосинтеза белка, на модели CCl₄-гепатоза можно предположить, что ЛФ способна стимулировать процессы регенерации, что будет обуславливать ранозаживляющую активность данной фракции. В медицинской практике для лечения ожогов и ран используют масляные каротиноидосодержащие препараты растительного происхождения - масло шиповника, облепиховое масло, «экзофит» и другие. Наиболее широко для терапии ожоговых повреждений применяется облепиховое масло. Однако спрос на облепиховое масло полностью не удовлетворяется, так как в плодах облепихи очень низкое содержание масла, происходит уменьшение сырьевой базы этого растения и его культивирование является довольно трудоемким.

Целью данной работы явилось изучение ранозаживляющей активности липофильной фракции из цветков бархатцев распростертых на модели термического ожога.

Ожоги моделировались на крысах- самцах (по 8 животных в каждой группе) массой 180-200 г. Шерсть у животных на месте нанесения ожога (область спины) выстригали, а остатки шерстяного покрова удаляли смачиванием выстриженной области 15% раствором сернистого натрия. Через 2 минуты после нанесения раствора сернистого натрия, депилированный участок промывали теплой проточной водой и высушивали марлевой салфеткой. Во время нанесения ожога животные находились под наркозом, вызванным введением этаминала в дозе 40 мг/кг. Ожог получали при помощи стеклянного цилиндра с плоским дном (диаметр 10 мм), заполненного кипящей водой (100⁰С). Время экспозиции составляло 15 секунд. Через 1 час, после температурного воздействия, на поврежденный участок кожи, наносили раствор ЛФ в подсолнечном масле с содержанием исследуемого объекта 50 мг/%. В качестве препарата сравнения использовалось заводское облепиховое масло с содержанием каротиноидов 50 мг/%. В эксперименте также были выделены группы животных, ожоги которых обрабатывались очищенным подсолнечным маслом, которое использовалось в качестве основы для получения раствора липофильных веществ из цветков бархатцев и получения облепихового масла. Также имелась контрольная группа животных, ожоги которой не обрабатывались ни чем. Изучаемые вещества наносились на ожоговую поверхность при помощи ватного тампона без наложения повязки один раз в день в течение всего срока наблюдения. О темпах заживления раневых поверхностей судили по динамике изменения весовых показателей ожогов, которые получали путем снятия выкроек ожога на плотную пленку с последующим их взвешиванием на весах.

Результаты эксперимента представлены в таблице 17.

Таблица 17

Влияние липофильной фракции из цветков бархатцев на размеры ожогов (в весовых показателях, мг)

группы животных время наблюдения	Контроль n=8 мг	Подсолнечное масло n=8 мг	маслян. р-р липофильной фракции n=8, мг	Облепиховое масло n=8, мг
через 1сутки	175,5±11,86	159,6±14,72 -9,06%	133,6±7,29 * -23,87%	164,8±13,16 -6,10%
через 4суток	174,4±8,99	148,3±12,94 -14,97%	72,3±3,71 * -58,54% # -51,25%	137,4±17,22 -21,22%
через 7суток	163,3±10,68	124,3±13,78 * -23,88%	43,8±2,14 * -73,18% # -64,76% ¤¤- 32,62%	65±4,45 * -60,20%

Примечание. * - достоверно (Р<0,05 ) по отношению к контрольной группе животных.; # - достоверно (Р<0,05 ) по отношению к группе животных, получавших масло подсолнечное ; ¤ - достоверно (Р<0,05) по отношению к группе животных, получавших облепиховое масло.

Как видно из представленных данных, размеры ожогов у животных, обрабатываемых препаратом из цветков бархатцев, уже на первые сутки нанесения ожога, достоверно меньше (на 24 %) по сравнению с животными из контрольной группы. Исходя из этого, можно говорить о том, что ЛФ бархатцев уменьшает развитие воспалительного процесса при нанесении ее сразу после термического воздействия. На четвертые сутки эксперимента весовые показатели ран уменьшались в группе животных, леченных ЛФ из бархатцев, на 58% и на 51% по отношению к контролю и к группе животных, обрабатываемых подсолнечным маслом, соответственно. В остальных группах также происходило уменьшение размеров ожогов, но эти изменения достоверно не отличались от контрольных значений. На 7-е сутки, после снятия струпа, у животных получавших ЛФ, дно раны было чистым, розового цвета и находилось на уровне кожных краев. К этому времени у животных, леченных облепиховым маслом, струп отошел частично лишь у нескольких особей, а в остальных группах этого и вовсе не наблюдалось. При изучении весовых характеристик размеров ран на седьмые сутки после нанесения ожога у животных, для лечения которых использовали ЛФ, наблюдалось снижение размеров повреждения на 73%, а при использовании подсолнечного и облепихового масла этот показатель уменьшился на 24% и 60,2% соответственно. В контрольной группе животных размеры ожоговых поверхностей за этот период значительно не изменились. Следует отметить, что эффективность действия ЛФ была достоверно выше эффективности действия масла облепихового, поскольку весовые показатели ожогов у крыс, получавших ЛФ, были ниже на 33 % по сравнению с теми же показателями у животных, получавших облепиховое масло.

Дальнейшие измерения размеров ран не производились, так как уже на одиннадцатые сутки в группе животных, лечение которых проводилось при помощи ЛФ из цветков бархатцев распростертых, наступило полное заживление пораженных участков и началось восстановление волосяного покрова. В тоже время у животных, леченных облепиховым маслом, поврежденные участки кожи восстановились примерно на 15-16 сутки с начала эксперимента.

Т.о. проведенные исследования показали, что сумма веществ, содержащихся в липофильной фракции (каротиноиды и флавоноиды) обладает выраженной способностью усиливать регенерацию поврежденных термическим ожогом участков кожи. Эффективность этого действия достоверно превышает таковое облепихового масла.

6.3 Изучение ранозаживляющей активности мази липофильной фракции из цветков бархатцев распростертых (Tagetes patula) при термическом и химическом повреждении

Установленное в наших исследованиях выраженное противоожоговое действие липофильной фракции послужило основанием для создания на базе ЛФ лекарственной формы для наружного применения, которая бы сохранила ранозаживляющую активность биологически активных веществ из цветков бархатцев. Была разработана мазь, с содержанием липофильной фракции 5%, на основе «олеогель».

Изучение влияния мази ЛФ на заживление раневых поверхностей проводили на моделях ожоговых повреждений кожных покровов лабораторных животных (крыс) под воздействием термических и химических агентов. Термические ожоги воссоздавали по методике описанной раннее в главе, посвященной изучению ранозаживляющего действия ЛФ. Химический ожог получали при помощи 50% раствора серной кислоты по следующей схеме [72].

Ожоги моделировались на крысах- самцах (по 8 животных в каждой группе) массой 180-200 г. Шерсть у животных на месте нанесения ожога (область спины) выстригали, а остатки шерстяного покрова удаляли смачиванием выстриженной области 13% раствором сернистого натрия. Через 2 минуты после нанесения раствора сернистого натрия, депилированный участок промывали теплой проточной водой и высушивали марлевой салфеткой. Во время нанесения ожога животные находились под наркозом, вызванным введением этаминала в дозе 40 мг/кг. Химический ожог наносили с помощью ватного тампона, смоченного в 50% -м растворе серной кислоты. Обращали внимание на стандартность получаемых ран, размеры которых не превышали 400 мм².

Помимо опытной группы животных в эксперименте также была выделены группа животных, не получавших лечения (контроль) и группа, для лечения которой использовали мазевую основу «олеогель» и группа, ожоги которой обрабатывались препаратом сравнения - мазью календулы. Выбор данного лекарственного средства объясняется, прежде всего, тем, что оно, как и мазь из ЛФ, растительного происхождения, имеет сходный с ней химический состав и обладает ранозаживляющей активностью.

Термическое повреждение кожи привело к образованию на первые сутки после нанесения ожоговой травмы у всех животных струпа серо-бурого цвета плотно соединенного с краями раны. Нанесение на ожоговые поверхности мази ЛФ и календулы уже на 2 сутки после поражения привело к достоверному, по отношению к нелеченным животным, уменьшению весовых характеристик раневых поверхностей на 42% и 31% соответственно (таб.16). При дальнейшем применении мазей наблюдалось постепенное восстановление поврежденных участков кожи через 4, 6 и 8 суток. При этом по эффективности действия мазь ЛФ и календулы достоверно не отличались между собой, и на 8 сутки их использования произошло уменьшение размеров ожогов по сравнению с контролем на 62 и 52% соответственно. В группе животных, ожоги которых обрабатывались мазевой основой - «олеогель», размеры ран не отличались от данных значений контрольной группы. Это позволяет сделать вывод о том, что действие мази ЛФ в первую очередь реализуется за счет тех веществ, которые содержаться в ЛФ.

Таблица 18

Влияние мази липофильной фракции из цветков бархатцев на размеры термических ожогов (в весовых показателях, мг)

группы животных время наблюдения	Контроль n=6, мг	основа «олеогель» n=6,мг	мазь бархатцев n=6, мг	мазь календулы n=6, мг
1	2	3	4	5
через 2 суток	190,0±11,63	170,6±8,97	110,0±10,30 * -42,1% # -35,5%	130,8±9,44 * -31,2%
через 4суток	181,5±11,40	152,5±13,22	96,6±7,32 * -46,8% # -35,9%	106,6±7,12 * -41,3%
через 6суток	158,1±9,84	132,1±10,14	68,7±6,40 * -56,5% # -48,0%	71,0±8,22 * -55,1%
через 8 суток	112,0±13,65	82,6±6,77	42,6±1,17 * -62,0% #	53,9±8,08 * -51,9%

Примечание: * - достоверно (Р<0,05 ) по отношению к контрольной группе животных.;

# - достоверно (Р<0,05 ) по отношению к группе животных, получавших «олеогель»;

¤ - достоверно (Р<0,05 ) по отношению к группе животных, получавших мазь календулы.

При лечении ожогов, вызванных нанесением серной кислоты, в группе животных, обрабатываемых мазью ЛФ, наблюдалось на 5 сутки достоверное уменьшение весовых характеристик раневых поверхностей по сравнению с аналогичными показателями контрольных животных на 45%, а под влиянием мази календулы на 31% (таб.17). При этом размеры ран у животных, лечение которых проводилось при помощи мази ЛФ, были на 21% меньше, чем у животных получавших мазь календулы. Последующие наблюдения показали, что регенерация раневых поверхностей, обрабатываемых мазью ЛФ, более эффективна, чем в случае применения мази календулы, т.к. весовые показатели раневых поверхностей в первом случае были достоверно ниже, чем во втором (табл. 19). При отдельном использовании основы, на которой готовилась мазь ЛФ, весовые показатели ран достоверно не отличались от контроля.