Фармакотехнологическое изучение липофильной фракции, полученной из цветков T. patula

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство здравоохранения

Российской Федерации

Пятигорская государственная фармацевтическая академия

Дипломная работа

Фармакотехнологическое изучение липофильной фракции, полученной из цветков T. patula

Подгорная Жанна Валерьевна

по специальности 040500 - фармация

Пятигорск, 2004 год

Введение

Актуальность темы. Общеизвестно, что фитопрепараты в современной медицине составляют более 1/3 от всех потребляемых лекарственных средств. Это определило рост потребности в растительном сырье для их производства как на российском так и на мировом рынках.

Поэтому актуальной задачей является поиск и мобилизация новых, раннее не используемых официальной медициной растений. В настоящее время многие исследователи уделяют большое внимание изучению дикорастущих видов, имеющих обширный ареал произрастания, с целью выявления возможности их использования для выделения биологически активных веществ. К тому же, на протяжении многих лет в центре внимания химиков и фармакологов находятся природные флавоноиды и каротиноиды, характеризующихся широким спектром биологического действия (так, для одних только флавоноидов известно около 50 (!) видов активности).

Бархатцы прямостоячие (Tagetes patula) - широко распространены на Северном Кавказе, в некоторых районах введены в культуру. Они характеризуются высоким содержанием каротиноидов, флавоноидов и других биологически активных веществ, но в настоящее время недостаточно изучены и не нашли свое применение в медицине.

Цель и задачи исследования: Целью данной работы является получение фракции, одновременно содержащей флавоноиды и каротиноиды, изучение ее фармакологической активности, качественного и количественного состава, а также разработка технологии и методов стандартизации лекарственного препарата на ее основе. Для осуществления поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести фитохимическое исследование сырья;

- определить основные морфолого-анатомические признаки цветков T. patula.

- разработать методику получения липофильной фракции;

- провести фармакологические испытания полученной фракции;

- провести качественный и количественный анализ содержания основных биологически активных веществ в сырье и липофильной фракции;

- разработать мазь на основе липофильной фракции и методы ее стандартизации.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Общая характеристика рода Tagetes

1.1.1 Фармакогностическая характеристика рода Tagetes и его таксономическое положение в семействе Asteraceaee

Бархатцы (Tagetes L.) - однолетние травянистые растения из семейства сложноцветных (Asteraceae).

Корзинки цилиндрические или чашеобразные, большей частью одиночные, редко собранные в соцветия. Обертка из одного ряда пяти сросшихся кожистых листочков, покрытых продолговатыми и линейными рассеивающими плоскими железками. Общее цветоложе плоское, голое. Цветки диска трубчатые обоеполые, золотисто-желтые, оранжевые или бурые; краевые цветки женские язычковые однорядные (у культурных, махровых форм расположенные во много рядов) золотисто-желтые, светло-и темно оранжевые или бурые. Лопасти столбика туповатые, у срединных цветков более длинные, закрученные, у краевых - язычковых - расходящиеся. Хохолки у неодинаковых и неравных пленочек, из которых одни сросшиеся тупые, другие большей частью свободные, заостренные в ость. Стебель прямой, большей частью ветвистый, листья супротивные или очередные, перисто-раздельные с просвечивающими редкими округлыми, бурыми железками [36].

Из 26 видов, распространенных в Америке от Аризоны до Аргентины, к нам занесены в культуру три: бархатцы отклоненные (T. patula), бархатцы прямостоячие (T. erecta), бархатцы мелкие (T. minuta) [36,50,51].

Бархатцы - растения с обильным цветением до глубокой осени.

Известно также таксономическое положение в семействе сложноцветных (Asteraceae): [36]

семейство: Asteraceae

подсемейство: Carduoideae

колено: Heleniaceae

род: Tagetes

1.1.2 Основные группы биологически активных веществ рода Tagetes

Таблица 1. Фенольные соединения [46,16]

Биологически активные вещества	Структура
Кверцетагетрин
Тагетиин
Патулетрин
Патулетин
Кверцетагетин
Кемпферитрин

Таблица 2. Терпеноиды [65,66]

Биологически активные вещества	Структура
Тагетон
Дигидротагетон
в - оцименон
Виолоксантин
в - каротин

Таблица 3. Полиацетиленовые соединения [77]

Биологически активные вещества	Структура
5-(3-бутен-1-инил)-2,2ґ-битиенил
5-(4-гидрокси-1-бутинил)-2,2ґ-битиенил
5ґ-метил-5-(3-бутен-1-инил)-2,2ґ-битиенил

1.1.3 Биологическая роль рода Tagetes и его применение в медицине

Цветки бархатцев в народной медицине применяют при рожистых воспалениях кожи, настой бархатцев используют в качестве диуретических, потогонных, антигельминтных средств. Флавоноид из T.patula. - патулетин - снижает проницаемость капилляров в большей степени чем кверцетол, обладает гипотензивным действием. Геленин (флавоноид из T.patula.) применяется как новый медикамент оказывающий специфическое действие на сетчатку глаз. Все флавоноиды из бархатцев обладают диуретическим действием и Р витаминной активностью. Известен нематоцидный эффект бархатцев и их фитонцидные свойства. Препараты, полученные из бархатцев распростертых оказывают противоязвенное, противовоспалительное и ранозаживляющее действие. Для некоторых препаратов из бархатцев выявлена противовирусная, антистафилакоковая и противогрибковая активность [51,48,52].

Биологической активностью обладает эфирное масло надземной части цветущего растения Tagetes (T.minuta или T.grandilifera.). В состав масла входят тагетон, дегидротагетон, в - оцименон, карбон, а также в - оцимен и его ацетат. В парфюмерии и косметике используется в ограниченных количествах. Известны сведения о полезных ароматерапевтических свойствах в качестве антидепресанта, для снятия нервных напряжений и расстройств [48,53].

1.2 Физико-химическая характеристика флавоноидов и методы их анализа

1.2.1 Общая характеристика флавоноидов

Флавоноиды - одна из самых многочисленных групп природных соединений. Их число составляет около 2000. В основном они являются производными бензо--пирона, в составе которого лежит фенилпропановый скелет, состоящий из С₆-С₃- С₆ углеродных единиц:

фенилпропановый скелет

В зависимости от степени окисления и гидроксилирования скелета флавоноиды подразделяются на группы: флавоны, флавонолы, флаваноны, изофлавоны, антоцианидины, катехины, ауроны, халконы, ксантоны [9,37].

В растениях флавоноиды встречаются в свободном виде и в виде гликозидов.

В качестве сахаров в флавоноидных гликозидах встречаются: D - галактоза, D - ксилоза , D - манноза , L -арабиноза , L - рамноза. Из уроновых кислот обычно встречаются D - глюкуроновая кислота. В настоящее время все известные флавоноидные гликозиды делятся на три группы:

1) О - гликозиды, в которых сахар связан с агликоном полуацетальной связью через атом кислорода. О - гликозиды в зависимости от количества сахаров, положения и порядка присоединения делятся на монозиды, биозиды, дигликозиды.

2) С - гликозиды или гликофлавоноиды, которые подразделяются на С - гликозиды, С-О - дигликозиды, С - O -биозиды. В гликофлавоноидах углеродные заместители связаны с агликоном через атом в шестом или восьмом положениях.

3) Комплексные соединения - представляют собой ацилированные гликозиды. В зависимости от положения ацильного заместителя они делятся на гликозиды денсиноидного типа (агликоны которых обычно связаны с ароматическими кислотами, известны также и сложные эфиры с алифатическими кислотами) и гликозиды со сложноэфирной связью в сахарных заместителях [37].

Флавоноиды локализуются главным образом в цветках, листьях и плодах, реже в корнях и стеблях; содержание их в растениях колеблется от 0.5 до 30%.

В чистом виде флавоноиды представляют собой кристаллические соединения с определенной температурой плавления, желтые (флавоны, флавонолы, халконы и др.,), бесцветные (изофлавоны, катехины, флаваноны), а также окрашенные в красный или синий цвет (антоцианы) в зависимости от pН среды.

Агликоны флавоноидов растворяются в эфире, ацетоне, спиртах, практически нерастворимы в воде. Гликозиды флавоноидов, содержащие более трех остатков сахаров, растворяются в воде, но нерастворимы в эфире и хлороформе. Флавоноидные гликозиды обладают оптической активностью.

1.2.2 Методы выделения флавоноидов

Метод выделения зависит от характера растительного материала и типа флавоноида, который необходимо выделить. Выбор растворителя для экстракции зависит от полярности флавоноида. Более полярные растворители используют для экстракции гликозидов и антоцианов, а менее полярные для агликонов. Изофлавоны, флавоны, дигидрофлавоны, сильно метилированные флавоны и флавонолы экстрагируют бензолом, хлороформом, эфиром, этилацетатом. Гликозиды, сильно гидроксилированные флавоноиды, ауроны, халконы, легко переходят в спирты различной концентрации или ацетон [9].

После экстракции, спиртовое извлечение упаривают, к остатку добавляют горячую воду, охлаждают, удаляют неполярные соединения (жирное масло, эфирное масло) из водной фазы хлороформом или четыреххлористым углеродом. Затем флавоноиды из водной фазы извлекают последовательно этиловым спиртом (агликоны), этилацетатом (монозиды) и бутанолом (биозиды, триозиды). Для разделения компонентов каждой фракции используют колоночную хроматографию на силикагеле, полиамидном сорбенте или целлюлозе.

1.2.3 Методы идентификации флавоноидов

Для идентификации флавоноидов используют их физико-химические свойства; температуру плавления, удельное вращение (гликозидов), УФ-, ИК-, ПМР - спектры, сравнивая их со спектрами известных образцов [21].

УФ- спектр флавоноидов характеризуется наличием, как правило, двух максимумов поглощения. Поглощение максимумов и их интенсивность характерны для различных групп флавоноидов [37].

Реакции, специфичные для всех групп флавоноидов, отсутствуют. Наиболее часто используются следующие реакции:

1. Цианидиновая реакция или проба Chinoda

Флавоноиды, флавононы и флавоны при восстановлении магнием в присутствии хлористоводородной кислоты дают красное или оранжевое окрашивание, обусловленное образованием антоцианидинов:

цианидин хлорид

2. Борно-лимонная реакция. 5 - оксифлавоны и 5 - оксифлавонолы взаимодействуют с борной кислотой в присутствии лимонной, образуя ярко-желтое окрашивание с желто-зеленой флюоресценцией (образование батохромного комплекса):

3. Реакция с треххлористой сурьмой. 5 - оксифлавоны и 5 - флавонолы, взаимодействуя с треххлористой сурьмой, образуют комплексные соединения, окрашеные в желтый или красный цвет:

4. С раствором аммиака. Флавонолы, флаваноны и флавоны дают желтое окрашивание с раствором аммиака, при нагревании переходящее в оранжевое или красное: халконы и ауроны дают красное или пурпурное окрашивание без нагревания. Антоцианы в присутствии аммиака или карбоната натрия дают синее или фиолетовое окрашивание.

5. Флавоны, халконы, ауроны, содержащие свободные ортогидроксильные группировки в кольце В, при обработке спиртовых растворов средним уксуснокислым свинцом образуют осадки, окрашенные в ярко - желтый и красный цвета.

6. С целью обнаружения флавоноидов в растительном материале широко используется хроматография на бумаге и в тонком слое сорбента. Обнаружение компонентов на хроматограмме осуществляется просматриванием их в УФ - свете. При этом флавононы, флавонол-3-гликозиды, флаваноны, халконы обнаруживаются в виде коричневых пятен; флавонолы и их 7-гликозиды - в виде желтых пятен [9,37].

1.2.4 Количественное определение флавоноидов

Количественное определение в последние годы проводят различными физико-химическими методами, так как они имеют ряд преимуществ перед химическими методами (например, гравиметрией, титриметрией) - таких, как быстрота, точность, возможность выделения отдельных флавоноидов и определение их незначительных количеств. К этим методам относятся: фотоколориметрия, спектрофотометрия, денситометрия с использованием хроматограммы на бумаге и в тонком слое сорбента [37].

Фотоколориметрический метод основан на цветных реакциях флавоноидов с солями различных металлов (алюминия, циркония, титана, хрома), с лимонно - борным реактивом и на реакции восстановления цинком или магнием в кислой среде.

Особенно ценным считается хроматденситометрический метод, сущность которого заключается в выделении и разделении флавоноидов с непосредственной количественной денситометрической оценкой окрашенной зоны на хроматограмме.

ГФ XI издания для количественного определения рекомендует метод дифференциальной спектрофотометрии.

Сравнительно редко для количественного определения флавоноидов применяют полярографию и метод амперометрического титрования [37].

1.3 Физико-химическая характеристика терпеноидов и методы их анализа

1.3.1 Общая характеристика терпеноидов

Терпеноиды - это огромная группа природных соединений, чрезвычайно распространенных как в мире животных, так и в мире растений. Терпеноиды в растительном мире представлены в виде эфирных масел практически всех пахнущих растений, смолообразованием и смоловыделением растений под общим названием «живица» [66].

Таблица 4. Классификация терпеноидов

тип	число углеродных атомов	Пример
		строение	название
гемитерпены	5		изопрен
монотерпены	10		гераниол
сексвитерпены	15		фарлезол
дитерпены	20		геранил-гераниол
сестертерпены	25		офноболин А
тритерпены	30		сквален
тетратерпены	40		фитоин
политерпены	от 7*103 до 3*105		каучук

Гемитерпены в растениях содержатся в очень малых количествах и были найдены с помощью высокоэффективной масс-спекрофотометрии. В следовых же количествах и также во всех растениях присутствуют фосфорилированные гемитерпны-²-изопентилпирофосфат и ³-изопентилпирофосфат, являющиеся ключевыми интермедиаторами в биосинтезе терпенов [66,62].

Монотерпены - достаточно летучие вещества, с сильным и оригинальным ароматом, что используется в производстве душистых веществ. В силу своей летучести, они постоянно испаряются растениями в процессе вегетации, а в лаборатории их выделяют из растительного сырья перегонкой с водяным паром. Монотерпены, содержащие спиртовые группы могут находиться в растениях в связанной форме - в виде гликозидов, что соответствует их удерживанию и пролонгированному использованию.

Различают ациклические (мирцен), моноциклические (лимонен, логанин, хризантемовая кислота) и бициклические ( - пинен, борнимен, камфен) терпены.

Сесквитерпены представляют собой самую обширную группу среди всех терпеноидов как по количеству соединений, обнаруженных в природе, так и по множеству структурных вариантов и разнообразию типов углеродного скелета. В наибольшем количестве и разнообразии сексвитерпены присутствуют в растениях из семейств Magnoliaceae, Rutaceae, Cornaceae и Asteraceaee. Сексвитерпены бывают ациклические (фарнезен, нероледол), моноциклические ( - бисобален, элемол), бициклические (ледол, пачулевый спирт). Полученные свойства сесквитерпенов достаточно разнообразны. Некоторые из них обладают приятным и устойчивым запахом, что позволяет использовать их в парфюмерии в качестве душистых компонентов и фиксаторов запаха. В качестве лекарственных препаратов наиболее перспективными являются сесквитерпеновые лактоны. Спектр их действия достаточно широк: они обладают бактерицидной, фунгицидной, антифидантной и антитрактантной активностью. Но особенно ярко выражена цитотоксическая активность [66,37].

Дитерпены представлены значительно в меньшей степени в растительном мире. Дитерпены также делятся на ациклические (фитол), моноциклические (цембрен), бициклические (лабдан) и трициклические (циатан). Биологическая активность дитерпенов ярко выражена: соединения этой группы терпеноидов очень часто проявляют цитотоксическую активность, причем столь эффективную, что ряд из них проходят клинические испытания; также противоопухолевое , антифидантное и антифунгицидное действие .

Сестерпеноиды - самая многочисленная группа терпеноидов, но и самая молодая. Основными источниками этой группы являются морские организмы (особенно губки). Яркими представителями этой группы являются: тетроловая кислота (антимикробная активность), маноамид (ингибитор фосфолипазы А₂, противовоспалительный эффект), спонгианолид А (ингибитор протеинкиназы С) и др.

Тритерпеноиды обычно накапливаются в растениях в виде эфиров различных кислот или в виде гликозидов. В последнем случае они образуют так называемые стероидные сапонины, а тритерпены, участвующие в этих образованиях, выделяют в группу сапогенинов. В растительном мире тритерпены представлены в свободной форме, т.е. не в качестве агликонов сапогениновых гликозидов. По структуре выделяют несколько типичных групп таких как:

- витостероиды (витеферин А)

- хинонметидные тритерпены (целастрол)

- лимоноиды (овакунон, трихимен Н)

Среди них обнаружены биологически активные субстанции различного типа: антифедантная, противовирусная, иммунно-регулирующая, цитотоксическая и т.д [66].

Тетратерпеноиды включают одну единственную, структурную группу - каротиноиды. Всего известно около 500 соединений этой группы, распространены они, в большей степени, в растительных организмах, где они и сентезируются. Основной структурной особенностью каротиноидов является наличие длинной сопряженной системы - связи. Отсюда вытекают такие свойства каротиноидов как легкость окисления и восстановления, их способность поглощать фотоны малой и средней энергии (т.е. видимый и УФ - свет) и, соответственно, быть окрашенными соединениями. А из этих свойств уже вытекают и биологические функции каротиноидов: во - первых - это участие в процессе фотосинтеза, т.к. этот процесс включает стадии поглощения света и переноса электронов; во - вторых - это светозащитные свойства, связанные со способностью поглощать световую энергию (очевидно, излишнюю для растений), без существенных изменений структуры молекулы каротиноида.

1.3.2 Методы выделения терпеноидов

Терпеновые соединения, представляют собой большую группу органических веществ растительного происхождения, отличающиеся высокой и разнообразной активностью. Они находят широкое применение в медицине как в качестве индивидуальных лекарственных веществ (ментол, тимол, камфора), так и в составе сложных лекарственных препаратов.

Объектом анализа обычно служит выделяемая из растительного материала смесь моно - и сесквитерпеновых соединений - так называемое эфирное масло (ЭМ) [65,37].

Обычными методами выделения ЭМ из природных источников для последующего анализа является экстракция, перегонка с водяным паром, концентрирование на твердых сорбентах и в криоловушках. При этом ЭМ, выделенное из растительного материала различными способами, могут существенно отличаться по составу и соотношению основных компонентов.

Экстракцию терпеноидов из твердых и жидких образцов проводят органическими растворителями с низкими температурами кипения. Часто экстракцию осуществляют в течение определенного времени (иногда до нескольких суток) в аппарате Сосклета. Полученный экстракт концентрируют упариванием в токе инертного газа или с помощью вакуумной отгонки при низких температурах. К преимуществам этого метода можно отнести возможность выделения из образца термолабильных и малолетучих соединений, к недостаткам - необходимость концентрирования экстракта, что может привести к потерям мелколетучих веществ, возможность загрязнения испарителя и колонки газового хроматографа нелетучими соединениями и продуктами их разложения.

Для выделения ЭМ из растительного материала широко используются перегонка с водяным паром. Здесь используется стеклянные приборы различной конструкции, позволяющие с точностью 0,02 мл измерить объем выделенного ЭМ. Анализ на этой стадии заканчивается и на основании величины содержания ЭМ решается вопрос о качестве лекарственного растительного сырья. В процессе перегонки ЭМ собирается в 100 мл пентана или гексана и полученная смесь исследуется с помощью ГЖХ [65].

Разработан комбинированный метода выделения ЭМ с помощью сочетания перегонки с водяным паром и экстракция терпеновых соединений из дистиллята органическими растворителями. Для анализа требуется от 1 до 15 г растительного материала, ЭМ собирается в 1 мл растворителя.

Другим методом выделения и концентрирования терпеноидов является улавливание летучих веществ сорбентами (тенакс, полисорб). Этот метод удобен в тех случаях, когда необходимо исследовать легколетучие вещества в газовых образцах. Определенный объем газа, содержащего летучие вещества, пропускают через трубку с сорбентом или капилляр, охлажденный жидким азотом.

Быстрым методом выделения является испарение ЭМ из очень малых количеств растительного материала (3 - 5 мг), помещенных непосредственно в модифицированный испаритель газового хроматографа.

1.3.3 Идентификация терпеноидов

Для идентификации терпеноидов используются различные методы хроматографии для разделения смесей терпеновых соединений. Широко применяются спектроскопические методы (УФ -, ИК -, ЯМР - спектроскопии, рентгеноструктурный метод) [65,37].

1) Физико-химические методы анализа.

Если цель исследования состоит в определении одного или нескольких компонентов в сложной смеси терпеноидов, то могут применяться различные относительно селективные физико - химические методы. Так, для определения отдельных компонентов ЭМ описано применение колориметрии окрашенных производных терпеноидов, спектрофотометрии в ИК - и УФ - областях спектра. Кислородсодержащие терпеноиды (спирты, альдегиды, кетоны) определяли с помощью неводной оксидиметрии и полярографии. Определение главных компонентов в ЭИ проводилось также методами ПМР - и¹³С - ЯМР - спектроскопии.

2) Хроматографические методы

а) ТСХ (тонкослойная хроматограмма) и БХ (бумажная хроматограмма)

Большую роль в исследовании смесей терпеновых соединений сыграла хроматография на бумаге и в тонком слое сорбента. Эти сравнительно доступные методы позволяют проводить качественное и полуколичественное определение основных компонентов ЭМ. Для разделения ЭМ применяются системы растворителей различной полярности. Детектирование проводят облучением хроматограмм в УФ - светом или с помошью реагентов - проявителей (к. Н₂SO₄ , иногда с добавлением ванилина или анисового альдегида, SbCI₃ или фосфорномолибденовой кислоты и др.), образующих окрашенные соединения с определяемыми веществами. Недостатками ТСХ и БХ является относительно большая длительность анализа, сравнительно малая эффективность разделения, невозможность точного количественного определения компонентов смеси.

б) ВЭЖХ (высоко эффективная жидкостная хроматограмма )

ВЭЖХ с успехом используется для анализа смесей терпеновых соединений. Важным преимуществом ВЭЖХ является возможность анализа малолетучих и термолабильных соединений .

Полупрепаративная ВЭЖХ позволяет разделить сложные смеси терпеноидов на фракции, что значительно упрощает их последующее исследование с помощью ГЖХ.

в) ГЖХ (газо-жидкостная хроматограмма)

ГЖХ наиболее широко используется для сложных смесей терпеновых соединений. Это обусловлено следующим: терпеноиды имеют температуру кипения от 150 до 350 ⁰С и достаточное парциальное давление для проведения анализа этим методом. ГЖХ в настоящее время является наиболее эффективным методом разделения сложных смесей, она может использоваться в сочетании со спектроскопическими методами идентификации. Для анализа смесей терпеноидов успешно используют различные неподвижные фазы (НЖФ) широкого диапазона полярности - от неполярных (SE - 30, OV - 101) до полярных (карбовакс 20М).

Чувствительность метода ГЖХ определяется типом используемого детектора. При исследовании смеси терпеновых соединений преимущественно используются пламенно-ионизационный детектор и детектор по теплопроводности, чувствительность которых составляет в среднем соответственно 10^-10 - 10^-13 и 10^-8 - 10^-10 гсек [65,75].

3) Предварительное фракционирование и вспомогательные реакции

Наиболее простым, но очень эффективным способом предварительного фракционирования смесей терпеноидов является их адсорбционная хроматография на силикогеле. При использовании в качестве растворителя чистого алкана, например пентана, из колонки элюируются только терпеновые углеводороды. Более полярные растворители (эфиры, галогенуглеводороды) элюируют кислородсодержащие терпеноиды. Использование ступенчатого градиентного элюирования при увеличении содержания диэтилового эфира в пентане позволяет разделить отдельные группы кислородсодержащих монотерпеновых соединений. Первыми элюируются эфиры, затем альдегиды и кетоны, последними - спирты, при этом порядок элюирования терпеноидов дает ценную информацию о характере функциональных групп [65].

1.3.4 Количественное определение терпеноидов

Каротиноиды являются одной единственной группой тетратерпенов. Широкое разнообразие физико - химических характеристик (полярность, эктинкция, растворимость и др.) каротиноидов используется при разработке простых и эффективных методов их качественного и количественного анализа.

Для извлечения из сырья липофильных биологически активных веществ (к ним относятся и каротиноиды) в качестве экстрагентов используют: жиры и масла, СО₂, органические растворители (хлороформ, гексан, четыреххлористый углерод и т.д.). Также применяются системы несмешивающихся растворителей различной полярности - двухфазные системы экстрагентов (ДС 7). Ранее были показаны преимущества экстракции ДСЭ по сравнению с экстракцией сырья растительным маслом. Было установлено, что количественное содержание липофильных веществ в масляных экстрактах, полученных с применением ДСЭ, значительно выше, чем при экстракции растительного сырья маслом.

В последнее время наибольшее распространение для количественного анализа каротиноидов получили методы ВЭЖХ, зачастую не требующие предварительной подготовки образцов и решающие проблему различной полярности анализируемого класса соединений, применения градиентного элюирования в обращенно - фазовом варианте. Вместе с тем необходимо отметить, что метод градиентного элюирования обладает рядом недостатков, делающих реализацию его затруднительной. Для количественного определения каротиноидов, а также их суммы, применяют спектрофотометрический метод [66,65].

1.4 Общая характеристика мазей и мазевых основ

1.4.1 Мази как лекарственная форма

Мазь - мягкая лекарственная форма для наружного применения. Мази представляют собой высоковязкие жидкости, способные образовывать на поверхности кожи или слизистой оболочки ровную, несползающую сплошную пленку. При комнатной температуре мази вследствие высокой вязкости сохраняют форму и теряют ее при повышении температуры, превращаясь в густые жидкости. По дисперсологической классификации мази должны быть отнесены к свободным всесторонне дисперсным бесформенным системам с пластично - или упруговязкой дисперсионной средой. От типичных жидкостей они отличаются отсутствием заметной текучести.

Мази состоят из основы и равномерно распределенных в ней лекарственных (действующих) веществ.

В форме мазей в настоящее время применяются лекарственные препараты, относящиеся практически по всей фармакологическим группам.

В мази вводятся как твердые, так и жидкие лекарственные вещества различной вязкости (жидкость Бурова, эфирные масла, деготь, ванилин и др.) [10,24].

Классификация мазей

Мази классифицируют по типу основ дисперсионных систем.

Классификация мазей по типу основ:

1. Мази на гидрофильных основах.

2. Мази на гидрофобных основах.

3. Мази на эмульсионных (дифильных) основах:

а) мази на основах типа эмульсии В/М;

б) мази на основах типа эмульсии М/В;

Классификация мазей по типу дисперсных систем:

1. Гомогенные мази:

а) мази - сплавы

б) мази - растворы

в) экстракционные мази

2. Суспензионные мази:

а) двухфазные системы

б) трех - и многофазные системы

3. Эмульсионные мази:

а) мази - эмульсии типа М/В

б) мази - эмульсии типа В/М

4. Комбинированные мази.

Существует так же классификация по месту применения и по консистенции.

Лекарственные вещества, используемые в производстве мазей

Лекарственные вещества являются носителями фармакологического действия, определяющего медицинский смысл назначения мази. В количественном отношении эта группа представляет меньшую часть и обозначается «Exupiendum» (восприемлимое).

ВВ (вспомогательные вещества) обеспечивают надлежащий объем лекарства, необходимую концентрацию лекарственного вещества и нужные физические свойства - мягкую консистенцию, способность образовывать на поверхности кожи или слизистой оболочки ровную, сплошную, несползающую пленку.

Совокупность ВВ называют основой «Basis Ungventum». Мазевые основы играют важную роль в обеспечении необходимой массы и надлежащей концентрации лекарственных веществ, оказывает существенное влияние на стабильность мазей. Степень высвобождения лекарственных веществ из мазей во многом зависит от природы и свойств основы, скорости и полноты резорбции [10,25].

1.4.2 Классификация основ для мазей

В современной фармации используется множество мазевых основ. Мазевые основы можно разделить на три группы:

1. Гидрофобные;

2. Гидрофильные;

3. Эмульсионные дифильные;

1) Гидрофобные мазевые основы

К группе гидрофобных мазевых основ относятся липофильные, углеводородные, силиконовые, полиэтиленовые и полипропиленовые гели.

Липофильные основы представляют собой или отдельные жиры (свиной, гусиный, бычий, тюлений), или комбинации твердых и жидких основ, имеющих упруго - эластичную консистенцию.

Все большую популярность завоевывают так называемые модифицированные жиры, полученные из растительных масел, жидких жиров гидрогенизацией, фракционированием (саломас, комбижир, хлопковое масло, гидрогенизированное подсолнечное масло и др.) [33].

Углеводородные основы представляют собой смесь жидких и твердых углеводородов с числом атомов С₁₇ - С₃₅.

Сравнительно широкое применение в производстве мазей углеводороды нашли в связи с тем, что они не окисляются и не прогоркают при длительном хранении, устойчивы к воздействию кислот и щелочей, окислителей и восстановителей. Недостатком этой группы является медленная и неполная передача лекарственных веществ, тканями, т.е. углеводороды не всасываются кожей и слизистыми оболочками. Представителями этой группы основ являются: вазелин, петролятум, парафин, церезин, вазелиновое масло, искусственный вазелин [24].

Силиконосодержащие безводные основы.

Эти основы получают путем сгущения жидких силиконовых масел аэросилом или сплавлением жидкостей с другими гидрофобными компонентами.

Полиэтиленовые или полипропиленовые основы. В эарубежной практике в качестве основ для мазей применяют композиции, известные под названиями:Plastibase, Selene, Equle, и др. Они представляют собой смеси полиэтилена низкой и высокой плотности с вазелиновым маслом [33].

2) Гидрофильные основы

В эту группу основ объединены водные растворы и гели низко - и высокомолекулярных веществ.

Гидрофильные основы не оставляют на коже жирного следа, легко смываются водой. Эти основы способны легко отдавать медикаменты из наружной водной фазы в ткани организма.

Растворы и гели полисахаридов.

Для их приготовления используется МЦ, которая набухает в воде, образуя вязко пластичные гели. Наибольшее применение в производстве основ этого типа нашли эфиры целлюлозы: МЦ, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы (Na - КМЦ). Их растворы безвредны для организма, но вследствие высокой прочности Na - КМЦ может нарушать кислотный барьер кожи.

Полиэтиленовые основы (ПЭГ)

Могут представлять собой как отдельные мономеры, полученные полимеризацией окиси этилена и имеющие упруго - вязкую пластичную консистенцию, так и смесь, твердых и жидких ПЭГ. Своей высокой химической и фармакологической индифферентностью эти основы завоевали большую популярность. ПЭГ основы хорошо адсорбируют экссудат, растворяют труднорастворимые в воде лекарственные вещества и не вызывают их гидролиза, легко удаляются с кожи смыванием водой [25].

Гели глинистых материалов

Бентонитовые глины обладают высокой адсорбирующей способностью, эмульгирующими свойствами и дают возможность готовить мази с маслянистыми жидкостями (деготь, скипидар). Мази на бентонитовых основах хорошо пристают к коже, адсорбируют кожные экссудаты, не пачкая белья. Ценными свойствами глины является высокая химическая индифферентность, позволяющая вводить в мази иод, KМnO₄.

Аэросил - аморфная непористая двуокись кремния. В отличие от бентонита, эфиров целлюлозы и др., набухающих компонентов, аэросил не набухает. В мазях аэросил применяется как структурообразующий компонент, повышает температурную устойчивость мазей в условиях климата [32].

Гели на основе сополимеров акриловой кислоты

Среди большого разнообразия полимерных материалов основной интерес представляют акриловые полиэлектролиты, применяемые в качестве носителей лекарственных веществ.

Карбопол - производное полиакриловых кислот, используемые в качестве гелеобразователя.

САКАП - белый мелкодисперсный порошок, относится к ограниченно набухающим сополимерам [33].

3) Эмульсионные дифильные мазевые основы

Это искусственно созданные композиции, обладающие липофильными и гилрофильными свойствами.

Благодаря своеобразному составу мазевых дифильных основ, в них удается вводить как водорастворимые, так и жирорастворимые лекарственные вещества, диспергировать воду или водные растворы медикаментов.

В группе дифильных мазевых основ различают:

- Эмульсионные,

- «абсорбционные», мазевые основы.

Эмульсионные основы содержат в своем составе воду. Для их образования и стабилизации необходимо присутствие ПАВ - эмульгаторов. Эти основы могут быть двух видов: «М/В» и «В/М».

Мази, приготовленные с использованием эмульсионных основ, характеризуются малой вязкостью, сравнительно невысокими адгезивными свойствами. Они легко наносятся на кожу и легко удаляются.

«Абсорбционными» мазевыми основами называют безводные комбинации разнообразных компонентов мазевых основ с эмульгатором, обладающие способностью инкорпорировать воду или водные растворы лекарственных веществ с образованием эмульсии типа «В/М».

В качестве абсорбционных мазевых основ используются безводные композиции вазелина, вазелинового масла, свиного сала с безводным ланолином, жирными высокомолекулярными спиртами и др. ПАВ [33,25].

Требования, предъявляемые к мазевым основам

Мазевые основы должны обладать совокупностью свойств [12,24,32].

1. Обладать мажущей способностью;

2. Обладать хорошими абсорбирующими свойствами;

3. Быть химически стойкими, т.е. не изменяться под действием света, не окисляться на воздухе, не реагировать с вводимыми в них лекарственными веществами;

4. Быть индифферентными в фармакологическом отношении;

5. Не подвергаться обсеменению микроорганизмами;

6. Соответствовать своему основному лечебному назначению;

7. Не должны пачкать одежды, не быть излишне липкими, легко смываться;

8. По возможности сохранить первоначальное значение рН кожи и слизистой оболочки.

1.4.3 Стандартизация мазей. Контроль качества

Однородность мази и ее внешний вид определяют визуальным контролем. Однородность определяется по методике ГФ ХI издания. Для этого берут 4 пробы мазей по 0.02 - 0.03 г, помещают по две на предметные стекла, плотно прижимают до образования пятен диаметром 0.2см. При рассмотрении невооруженным глазом в трех из четырех проб не должно обнаруживаться видимых частиц. Если же частицы видны в большом числе пятен, определение повторяют на 8 пробах. При этом допускается наличие видимых частиц не более чем в двух пятнах [10].

Определение размера частиц в мази проводят по методу, описанному в ГФ XI издания. Проводят на биологическом микроскопе, снабженным окулярным микроскопом МОВ - 1 при увеличении окуляра 15* и объектива 8*, Проба мази должна быть не менее 5г и представлять собой объединенные точечные пробы (одномоментно отобранные), взятые примерно в равных количествах из верхнего, среднего нижнего слоев упаковочной единицы. Убеждаются в однородности точечных проб (визуально), затем смешивают их. Если концентрация лекарственных веществ в мазях превышает 10%; то их разбавляют соответствующей основой до 10%. Из средней пробы мази берут навеску 0.05г и помещают на необработанную сторону предметного стекла. Другая сторона предметного стекла обработана следующим образом: на середине его алмазом, или каким - либо другим абразивным материалом наносят квадрат со стороной 15мм и диагоналями. Линии окрашивают с помощью карандаша по стеклу. Предметное стекло помещают на водяную баню до растворения основы, прибавляют каплю 0.1% раствора Судана III для жировых, углеводородных и эмульсионных основ типа В/М или 0.15% раствор метиленового - синего для гидрофильных и эмульсионных типа М/В, перемешивают. Пробу накрывают покровным стеклом (24*24мм), фиксируют его путем слабого надавливания и просматривают в четырех полях зрения сегментов, образованных диагоналями квадрата. Для анализа одного препарата проводят 5 определений средней пробы. В поле зрения микроскопа должны отсутствовать частицы, размер которых превышают нормы, указанные в частных статьях [11].

Мази стандартизируют по содержанию лекарственных веществ, значению рН их водных растворов и степени дисперсности твердых частиц в суспензионных мазях.

Определение дисперсности частиц мази проводится микроскопическим методом. Для анализа одного препарата проводят 5 определений средней пробы. В поле зрения микроскопа должны отсутствовать частицы, размер которых превышает нормы, указанные в частных статьях. Нормы степени дисперсности индивидуальны для каждой мази [10].

Определение рН мази необходимо для контроля над поведением лекарственных веществ и основы во время хранения. Сдвиг рН свидетельствует об изменении физико-химических свойств последних.

Значительное влияние на терапевтическую ценность мази как лекарства и ее поведение при хранении и фасовке в тару оказывают структурно-механические свойства.

Мази и мазевые основы обладают некоторыми свойствами твердых тел - отсутствием текучести при малых напряжениях сдвига, заметной прочностью и упругостью. В связи с этим консистенция мази должна определяться механическими параметрами, такими как вязкость, прочность, адгезия, модуль сдвига, тиксотропия и т.д.

Выводы по главе 1

1. Растения рода Tagetes нашли широкое применение в народной, но не в официальной медицине. Они содержат важные биологически активные вещества, в том числе каротиноиды, терпены и флавоноиды и могут служить источником их выделения.

2. Для экстракции флавоноидов и терпенов используют разные органические растворители. Способы выделения основаны на их физико-химических свойствах.

3. Для установления строения этих групп соединений и количественного определения их в сырье применяют химические и физико-химические методы анализа. Из них наиболее чувствительными и широко используемыми являются различные виды хроматографии (ТСХ, БХ, ВЭЖХ, ГЖХ) и спектрофотометрии в различных областях оптического спектра: видимой и ИК.

4. Отсутствие токсических эффектов флавоноидов и терпеноидов, в частности каротиноиды, имеют широкий спектр фармакологического действия, что позволяет использовать их в качестве лечебных и лечебно-профилактических средств.

5. На основании вышеизложенного мы поставили перед собой цель провести фармакотехнологическое исследование цветков бархатцев отклоненных как перспективного источника получения суммы липофильных веществ (терпеноиды и каротиноиды) и флавоноидов, и разработать на их основе лекарственную форму.

Глава 2. Фармакогностический анализ T. patula

2.1 Анатомическое строение и диагностические признаки цветков Tagetes patula

2.1.1 Макроскопический анализ цветков T. patula

Бархатцы отклоненные Tagetes patula - является характерным представителем семейства Asteraceae.

Для исследования нами были выбраны цветки бархатцев отклоненных, собранные во время цветения. Образцы сырья (цветки) T. patula были заготовлены в г. Пятигорске. Сырье представляет собой цельные или частично осыпавшиеся корзинки диаметром 5-7 мм. Обертка серо-зеленая, однорядная; цветоложе плоское, голое. Краевые цветки однорядные, язычковые, темно-оранжевого цвета. Цветки диска трубчатые, обоеполые, оранжевые. Лопасти столбика туповатые, у средних цветков более длинные, закрученные, у краевых - язычковых - расходящиеся. Вкус солоновато-горький. Запах сырья сильно ароматный

2.1.2 Микроскопический анализ цветков T. рatula

Изучение анатомического строения цветков бархатцев отклоненных проводили на высушенном сырье. Просветляли препараты кипячением в 10% растворе хлоралгидрата. Срезы приготавливали лезвием безопасной бритвы от руки и после соответствующей обработки заключали в глицерин-желатиновую смесь. Изучение анатомического строения проводили на временных препаратах.

Клетки мезофилла язычковых цветков лопастные, в силу чего образуются крупные межклетники (рис.1). Проводящие пучки мелкие, состоящие из немногочисленных элементов ксилемы и флоэмы, механическая обкладка отсутствует. Клетки нижнего, наружного, эпидермиса в поперечном сечении квадратные или прямоугольные (рис.2,Б). При рассматривания с поверхности они несколько крупнее клеток верхнего эпидермиса: у одних растений мельче и с сильно извилистыми боковыми стенками, у других -- крупнее и с менее извилистыми боковыми стенками. Кутикула продольно-бороздчатая на поперечном срезе мелкозубчатая. Клетки верхнею эпидермиса (рис.2,А) сосочковидные, в основании с ровными боковыми стенками. Сосочки варьируют по высоте: низкие под покровным стеклом имеют вид кружков, а более высокие полегают, Кутикула сосочков продольно-бороздчатая: бороздчатость более частая, чем у нижнего эпидермиса. Высота сосочков на поперечном срезе может быть больше ширины их основания. Желтые хромопласты имеются во всех клетках мезофилла и эпидермисов, особенно они обильны в основании эпидермальных клеток. На язычковых цветках наблюдаются 1-рядные многоклеточные волоски редко с 2-рядной верхушкой (рис.3; 1-4). На трубчатых цветках клетки эпидермиса сильно вытянуты, длинные, боковые стенки их прямые или слабо извилистые. На свободной части трубчатых цветков волоски широкие (рис.3; 9-10), с перехватами, тонкостенные, 1-рядные, многоклеточные, реже 1-клеточные, содержащие хромопласты (рис.4). На листочках обертки на верхней их части присутствуют обильные, 1-рядные, многоклеточные железистые волоски, изредка встречаются раздвоенные и простые 1-рядные (рис.3; 5-8). Железки расположены в углублениях обертки и сопровождаются секреторными ходами, заполненными желтоватым маслянистым содержимым (эфирным маслом) (рис.5).



Рис. 1. Поперечный срез язычкового цветка T. patula

1 - клетки мезофилла; 2 - межклетники; 3 - проводящий пучок; 4 - нижний эпидермис; 5 - зубчики кутикулы; 6 - верхний эпидермис; 7 - хромопласты.

Рис. 2. Верхний (А) и нижний (Б) эпидермис с поверхности язычкового цветка

1 - эпидермальные клетки с высокими и низкими сосочками; 2 - складчатость кутикулы



Рис. 3. Типы волосков соцветия T. patula

1-4 - волоски язычковых цветков; 5-8 - волоски обёртки соцветия; 9, 10 - волоски трубчатых цветков

Рис. 4. Хромопласты язычкового цветка T. Patula

Рис.5. Вместилище с остатками эфирного масла в эпидермисе обертки соцветия T. patula

2.2 Определение товароведческих показателей цветков T. рatula

2.2.1 Определение влажности

Содержание влаги в исследуемом сырье проводили согласно методики приведенной в ГФ XI издания, т.1 (стр.285). Цветки предварительно измельчали до размера частиц не более 10 мм.

Влажность сырья (Х), в процентах, определяли по формуле:

,

где

m - масса сырья до высушивания, в г;

m₁ - масса сырья после высушивания, в г

Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5

Определение влажности сырья T. patula

№	Влажность	х- хi	(х - хi)2	Метрологические характеристики
1. 2. 3. 4. 5. 6.	5,8 6,3 6,0 5,7 5,5 5,9 =35,2	- 0,1 + 0,4 + 0,1 - 0,2 - 0,4 0	0,01 0,16 0,01 0,04 0,16 0	S=0,118; Sx=0,290; х=0,3; =5,15%; х±х=5,90,3

2.2.2 Определение общей золы

Определение общей золы в цветках T. patula проводили по методике рекомендованной ГФ XI издания, т.2 (стр24). Содержание общей золы (X), в процентах, вычисляли по формуле:

,

где

а - масса золы, в г;

В - навеска сырья, в г

Пересчет на абсолютно сухое сырье проводили по формуле:

,

где

х - количество общей золы, в %;

Н - влажность сырья, в %

Результаты анализа представлены в таблице 6.

Таблица 6

Определение общей золы в сырье T. patula

№	Зола, %	х - хi	(х - хi)2	Метрологические характеристики
1. 2. 3. 4. 5. 6.	9,8 9,3 9,1 8,7 9,1 9,2 =55,2	- 0,6 - 0,1 + 0,1 + 0,5 + 0,1 0	0,36 0,01 0,01 0,25 0,01 0	S=0,146 Sx=0,358 х=0,38 =4,08% х±х=9,20,38

2.2.3 Определение золы, не растворимой в 10 % хлористоводородной кислоте

Определение золы, не растворимой в 10 % хлористоводородной кислоте проводили согласно методике рекомендованной ГФ XI издания, т.2 (стр.25). Содержание золы (X), в процентах, вычисляли по формуле:

Результаты анализа представлены в таблице 7.

Таблица 7

Определение золы, не растворимой в 10 % хлористоводородной кислоте, в сырье T. patula

№	Зола не растворимая в 10 % хлористоводородной кислоте, %	х - хi	(х- хi)2	Метрологические характеристики
1. 2. 3. 4. 5. 6.	1,87 1,77 1,81 1,83 1,85 1,84 =10,97	- 0,04 + 0,06 + 0,01 0 - 0,02 - 0,01	0,0016 0,0036 0,0001 0 0,0004 0,0001	S=0,014 Sx=0,035 х=0,037 =2,0% х±х=1,830,037

2.3 Скрининг сырья T. patula на возможное присутствие основных классов биологически активных веществ

Скрининг проводили в извлечениях из цветков T. patula, полученных по следующей схеме:

2.3.1 Определение каротиноидов

- К 1 мл хлороформного извлечения аккуратно добавляли 10% раствор треххлористой сурьмы. Наблюдали появление синего окрашивания.

- К 1 мл хлороформного извлечения, по стенке пробирки, осторожно, добавляли концентрированную серную кислоту. Наблюдали появление темно-синего окрашивания.

2.3.2 Определение антраценпроизводных

Водное извлечение разливали в 2 пробирки по 2 мл. В одну пробирку добавляли 1 мл 10 % раствора едкой щелочи. Вторая пробирка являлась контрольной. Вишнево-красное окрашивание, указывающее на наличие антраценпроизводных, отсутствовало.

2.3.3 Определение дубильных веществ

В две пробирки помещали по 2 мл водного извлечения. В одну пробирку добавляли несколько капель железоаммонийных квасцов. Вторая пробирка являлась контрольной. Черно-зеленое окрашивание, указывающее на наличие дубильных веществ, отсутствовало.

2.3.4 Определение оксикоричных кислот

Наличие фенолкарбоновых кислот определяли с помощью ТСХ и БХ в системе растворителей: 15% уксусная кислота и н-бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:1). Хроматограммы рассматривали в УФ-свете с последующей обработкой реактивами: свежеприготовленными диазосоединениями в растворе Na₂CO₃; 2% раствором FeCl₃ и 0,5н спиртовым раствором NaOH. Наличие пятен, характерных для оксикоричных кислот не наблюдали, что указывает на их отсутствие в сырье.

2.3.5 Определение азотистых оснований

К 3 мл извлечения прибавляли 3 капли (0,1 мл) 50 % раствора серной кислоты до рН 1,0 - 2,0 и фильтровали на часовое стекло. При прибавлении к фильтрату 3 капель (0,1 мл) 1 % раствора кремневольфрамовой кислоты появление мути, а затем осадка, не наблюдали, что указывает на отсутствие азотистых оснований.

2.3.6 Определение кумаринов

5,0 г цветков T. patula заливали 20 мл спирта этилового 95 % и нагревали на водяной бане до кипения, после чего оставляли настаиваться. Спиртовое извлечение отфильтровывали, упаривали на водяной бане до 5 мл. С полученным экстрактом проводили реакцию, позволяющую быстро провести предварительное обнаружение кумаринов. Для этого извлечение поместили в 2 пробирки по 2,5 мл. В одну прибавляли 5 мл 10 % раствора едкого натра и нагревали на водяной бане. После охлаждения в каждую пробирку добавляли по 4 мл дистиллированной воды. Появление желтой окраски в первой пробирки свидетельствует о наличие кумаринов.

2.3.7 Определение стеринов

Наличие стеринов можно доказать реакцией Либермана-Бурхарда (качественная реакция на стероидное ядро). 1 мл извлечения выпаривали досуха в выпарительной чашке, добавляли 2 мл этилового спирта, затем 2-3 капли уксусного ангидрида, перемешивали. Наслаивали аккуратно по стенке чашечки концентрированную серную кислоту. Наблюдали переход окраски от зеленой до фиолетовой, что свидетельствует о наличие стеринов.

2.3.8 Определение витаминов (аскорбиновой кислоты)

0,5 г измельченных цветков T. patula заливали 5 мл дистиллированной воды, перемешивали, оставляли на 15 мин и фильтровали. К 1 мл полученного извлечения прибавляли по каплям 0,04 % раствора 2,6 - дихлорфенолиндофенолята натрия в воде. Образование белого осадка не наблюдалось, что свидетельствует об отсутствие аскорбиновой кислоты.

2.3.9 Определение белка и аминокислот

а) биуретова проба на пептидную связь. В пробирку помещали 0,5 мл извлечения, прибавляли несколько капель биуретового реактива, слегка взбалтывали. Окрашивание, свидетельствующего о наличие белка не наблюдали.

б) нингидриновая реакция на -аминокислоты. В пробирку вносили 0,5 мл извлечения прибавляли несколько капель 3 % спиртового раствора нингидрина, нагревали до кипения. Окрашивания, свидетельствующего о наличие -аминокислот и белка не наблюдали.

2.3.10 Определение флавоноидов

Со спиртовым извлечением из цветков T. patula проводили следующие качественные реакции на флавоноиды:

а) Цианидиновая реакция. 3 мл извлечения упаривали досуха на водяной бане, остаток растворяли в 96 % этаноле. Полученное извлечение добавляли в сухую пробирку с 0,5 г металлического магния, приливали 5-7 капель концентрированной хлористоводородной кислоты. Через 5 минут наблюдали появление красного окрашивания, что свидетельствует о наличие флавоноидов.

б) К 1 мл извлечения добавляли 1-2 капли раствора хлористого железа. Наблюдали появление сине-зеленого окрашивания, что указывало на наличие фенольных соединений.

в) К 1 мл извлечения прибавляли 3-5 капель раствора основного ацетата свинца. Наблюдали образование желтого осадка, что подтверждает наличие флавоноидов.

2.3.11 Определение сапонинов

Определение проводили на основе физических свойств сапонинов - реакции пенообразования.

10 мл водного извлечения помещали в пробирку, в другую - 10 мл спиртового извлечения, в третью - 10 мл воды (контроль). Все пробирки встряхивали в течение 10 мин. Образования стойкой пены не наблюдалось.

2.4 Количественное определение флавоноидов в цветках T. patula

Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1мм. Около 1г (точная навеска) сырья помещали в колбу со шлифом вместимостью 150мл, прибавляли 30мл 70% спирта. Колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Затем колбу охлаждали до комнатной температуры и фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию повторяли еще раз указанным выше способом, затем еще 1 раз 70% спиртом в течение 30 мин. Извлечение фильтровали через тот же фильтр, в ту же мерную колбу, промывали фильтр 70%-ным спиртом и доводили объем фильтрата 70%-ным спиртом до метки (раствор А).