Этионамид, протионамид

Канамицин

Амикацин

Ципрофлоксацин

Офлоксацин

Циклосерин

Капреомицин

Рифабутин

Парааминосалициловая кислота

Тиоацетазон

Такая систематизация обусловлена различиями в их активности и токсичности. Препараты I ряда сочетают высокую активность против M.tuberculosis и умеренную токсичность. Препараты II ряда характеризуются либо меньшей активностью, либо более высокой токсичностью, либо тем и другим. Препараты I ряда применяют для лечения пациентов с впервые выявленным туберкулёзом, II ряда- при неэффективности или плохой переносимости основных препаратов (Страчунский, Козлов, 2002).Кроме того, существует ряд новых препаратов, обладающих высокой активностью при относительно невысокой частоте ЛУ МБТ к этим препаратам. Однако в настоящее время это деление потеряло смысл именно в связи с широкой распространенностью резистентности микобактерий, благодаря чему при лечении ЛУ МБТ резервные и новые препараты выходят на первый план. Поэтому все препараты этой группы по решению Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) отнесены в разряд основных средств.

Для выбора режима антибактериальной терапии принципиальное значение имеет распределение препаратов по фармакологическим группам с количественной оценкой их антибактериальной активности, определяемой по МПК и порогу устойчивости к этим препаратам. Только на этой основе можно составить план рациональной антибактериальной терапии по индивидуальным схемам с учетом фактической ЛУ МБТ в клиническом изоляте от конкретного больного. При отсутствии антибиотикограммы культур, выделенных у больного, назначают стандартный режим химиотерапии на основе априорной частоты ЛУ МБТ, наблюдаемой в данном регионе или стационаре, с коррекцией и переходом на индивидуальный курс лечения после получения результатов исследования ЛУ МБТ. Практическое решение проблемы подбора эффективных антибактериальных препаратов и режима химиотерапии в реальных клинических условиях в процессе предоперационной подготовки основывается на характеристиках активности и пиков концентрации АБП в крови больных в сравнении с МПК для устойчивых культур.

Приведем характеристики основных противотуберкулезных препаратов.

Изониазид (Isoniazid). Высокоактивный препарат - гидразид изоникотиновой кислоты, дающий бактерицидный эффект для большинства лекарственно-чувствительных штаммов МБТ, находящихся в фазе репликации, и бактериостатический эффект в фазе покоя в концентрации 0,01-0,25 мкг/мл (Степашин и др., 1999).

Механизм действия изониазида заключается в инактивации фермента бактериальной клетки - миколазы-синтетазы, участвующей в синтезе миколовой кислоты, входящей в структуру ее стенки. Дефект в структуре бактериальной стенки ведет к ее гибели. Непосредственное нарушение синтеза миколовой кислоты вызывает не сама молекула ГИНК, а продукт ее окисления под воздействием фермента бактериальной клетки - каталазы-пероксидазы, в результате которого образуются активные метаболиты, оказывающие ингибирующее действие на ферменты, участвующие в синтезе миколовой кислоты. В связи с этим и механизм лекарственной устойчивости МБТ к изониазиду основан на блокаде внутриклеточного окисления препарата и образования активных метаболитов при потере пероксидазной активности в результате генных мутаций, характерных для ЛУ штаммов МБТ (Степашин и др., 1999). Однако имеются указания на возможность прямого бактериостатического действия изониазида, в высоких концентрациях реагирующего с тирозином бактериального протеина и разрывающего пути метаболизма в клетках (Herman, 1980). Эти данные подтверждают эмпирически установленную связь между дозой, концентрацией и экспозицией изониазида с уровнем его антибактериальной активности. Благодаря хорошему проникновению изониазида, внутриклеточная концентрация препарата соответствует его содержанию в плазме, в связи с чем он оказывает активное действие на вне- и внутриклеточно расположенные МБТ. Однако вследствие частоты лекарственно-устойчивых МБТ, выделяемых в клинических изолятах, изониазид не включен в большинство схем химиотерапии для лечения ЛУ туберкулеза легких, что без учета порога ЛУ МБТ и возможности его преодоления путем увеличения дозы и применения рациональных путей его введения является ошибочным.

Антибактериальная активность изониазида зависит также от массивности и плотности популяции МБТ - чем большая доза микобактерий попадает в организм и чем большая плотность популяции образуется в очаге поражения, тем большая доза и более высокая концентрация изониазида требуется для достижения бактерицидного эффекта (Бондарев, 1972; Yomans, 1956).

Наконец большое значение для достижения терапевтического эффекта имеет соотношение времени экспозиции и концентрации препарата. В опытах invitro было установлено, что при концентрации изониазида 8мкг/мл полное подавление размножения МБТ достигается после одночасовой экспозиции, а для достижения бактерицидного эффекта требуется экспозиция в 2 - 3 часа. Однако при уменьшении концентрации препарата до 2 мкг/лм для достижения соответствующего эффекта требуется экспозиция от 4 до 5 суток (Armnstrong, 1960).

Суммарная частота ЛУ к изониазиду в клинических изолятах МБТ - 88,1%, с порогом устойчивости к 1мкг/мл - 41,0%, к 5 - 10 мкг/мл - 25,4% и к 25 мкг/мл - 14,9% (Репин,2007).

Пик концентрации изониазида в крови после приема тест-дозы: 10 мг/кг peros - 1 - 5 мкг/мл. Внутривенное введение той же дозы обеспечивает пик концентрации от 8 до 10 мкг/мл с поддержанием эффективных концентраций в течение 3 - 4 ч. Время полувыведения изониазида - 4 ч. у слабых инактиваторови меньше - у сильных (Репин,2007).

Рифамицины(Rifamycine)Антибиотики группы рифамицина обладают широким спектром действия, включающим МБТ.

Механизм действия рифамицинов на МБТ основан наинактивации бактериальной ДНК-зависимой РНК-полимеразы путем образования стабильного комплекса молекулы антибиотика с ферментом бактериальной клетки, благодаря чему нарушается транскрипции ДНК. Результатом ингибирования РНК- полимеразы является нарушение синтеза нуклеиновых кислот и белков и гибель бактериальной клетки. Аналогичного процесса ингибирования полимеразы и синтеза РНК в животных клетках не происходит ввиду отсутствия способности фермента эукариотических клеток к образованию стабильного комплекса с молекулами антибиотика.

Механизм возникновения лекарственной устойчивости МБТ к рифамицинам функционирует в результате спонтанных мутаций. В популяции микобактерий с критической численностью образуются бактерии с измененной РНК-полимеразой, теряющей способность к формированию стойкого комплекса с молекулами антибиотика, блокирующего действие фермента. Таким образом осуществляется механизм устойчивости, связанный с изменением мишени для действия антибиотика. Далее вступает в действие механизм селекции мутантных бактерий с измененной «нечувствительной» РНК- полимеразой в условиях неадекватной химиотерапии, как правило, и являющейся основной причиной развития ЛУ штаммов МБТ с высоким порогом устойчивости.

Рифампицин (Rifampycin) - полусинтетический дериват рифамицина-В. Препарат хорошо всасывается в желудочно-кишечном тракте и равномерно распределяется в тканях и жидкостях организма. Благодаря хорошему проникновению через тканевые барьеры, рифампицин проникает в фагоциты и убивает внутриклеточно расположенные микобактерии. МПК рифампицина для чувствительных микобактерий составляет 1мкг/мл. В зависимости от локализации генной мутации возникает различный уровень ЛУ МБТ - отнизкой, с МПК 1 - 2 мкг/мл, до средней устойчивости с МПК 16 - 20 мкг/мл и высокой устойчивостью до 50 мкг/мл и более. Время полувыведения из крови составляет от 1 до 3 ч (Репин,2007).

Этамбутол (Ethambutol) - синтетическийпрепарат, обладающий бактериостатическим свойством. МПК для чувствительных штаммов МБТ составляет 0,5 - 2 мкг/мл, относительная устойчивость с МПК 2 мкг/мл и больше, средняя устойчивость ЙЙ степени - 5 мкг/мл и больше и полная устойчивость ЙЙЙ степени - 16 мкг/мл и больше (Репин, 2007).

Механизм действия этамбутола основан на блокаде синтеза миколовой кислоты и нарушении формирования бактериальной стенки вследствие ингибиции фермента арабинозинтрансферазы и синтеза арабина, необходимого для соединения миколовой кислоты с пептидогликаном бактериальной клетки.

Механизм устойчивости обусловлен спонтанной мутацией, ведущей к высокому уровню экспрессии мутантного гена, благодаря которому обеспечивается синтез арабина вопреки действию лекарственного препарата. Частота выявления мутантных генов в устойчивых штаммах МБТ составляет 50% (Степашин и др., 1999). Порог устойчивости МБТ также зависит от локализации генной мутации.

Суммарная частота ЛУ в клинических изоляторах - 15,5%, в том числе ЛУ к 2 мкг/мл - 9,2%, к 5 мкг/мл - 6,3% (Репин, 2007).

Пик концентрации препарата в крови после приема тест- дозы 25 мг/кг - 2 - 5 мкг/мл, что превышает порог ЛУ Й и ЙЙ степени (Репин, 2007).



2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

За период 2008-2011 гг. было проведено 3979 посевов клинических изолятов мокроты, полученных от пациентов, находившихся на лечении в Минском областном противотуберкулезном диспансере с диагнозом туберкулеза легких, с целью получения культур микобактерий туберкулеза.

Перед посевом клинического материала на питательную среду с целью выделения культуры M.tuberculosis проводилась обработка материала миколитическими разжижающими веществами с целью удаления белковых масс, деконтаминация образца с целью удаления сопутствующей бактериальной флоры и центрифугирование. Содержимое центрифужной пробирки использовалось для микроскопии и посева на:

а) плотную яичную среду (Левенштейна-Йенсена);

б) агаровую среду ( Миддлбрук 7Н10);

в) систему бульонного культивирования (MGIT).

Затем проводилась инкубация, оценка и учет результатов посева диагностического материала. Для гомогенизации и деконтаминации диагностического материала использовались стандартные методы разжижения и деконтаминации: обработка материала 10% трехзамещенным фосфорнокислым натрием.

Методика обработки:

1. Исследуемый материал заливали равным объемом 10% трехзамещенного фосфата натрия, плотно закрывали емкость и помещали ее на 10 минут на встряхиватель.

2. Пробирку с материалом, залитым деконтаминантом, помещали на 20 часов в термостат при 37 °C.

3. После этого пробирки, не открывая, уравновешивали, помещали в соответствующую центрифугу и центрифугировали при 3000 g в течение 15 минут. При указанном режиме происходит осаждение 95% присутствующих в материале микобактерий.

4. Надосадочную жидкость отбирали стерильной пипеткой на 5-10 мл и переносили ее в емкость с дезинфицирующим раствором, оставляя в каждой пробирке 1,2-1,5 мл осадка.

5. Использованную пипетку опускали в емкость с дезинфицирующим раствором.

6. К осадку стерильно добавляли несколько капель 6% соляной кислоты до получения нейтрального значения рН, определяемого индикаторной бумажной полоской.

7. Пробирку с осадком помещали в штатив в порядке регистрационных номеров материала.

8. Для снижения токсичного воздействия на микобактерии различных остатков веществ (в том числе возможных химиопрепаратов) проводили еще одну процедуру отмывки осадка 10-15 мл дистиллированной воды.

Супернатант удаляли, а осадок в объеме 0,8-1,0 мл готовили к инокулированию и приготовлению мазка:

Реактивы

1. Трехзамещенный фосфорнокислый натрий (Na₃PO₄).

2. Кислота соляная (HCl) концентрированная.

3. Бумага индикаторная универсальная.

Приготовление растворов

1. 100 г трехзамещенного фосфата натрия растворяли в 800 мл дистиллированной воды и доводили объем раствора до 1 л.

2. 6 мл концентрированной соляной кислоты добавляли к 94 мл дистиллированной воды.

Первой ступенью идентификации является микроскопия всех выделенных культур с окраской мазков по Цилю-Нильсену.

Реагенты

1. Карболовый фуксин Циля 1 фл (100 мл)

2. Солянокислый спирт (концентрат) 1 фл (10 мл)

3. Метиленовый синий 1 фл (100мл)

Набор обеспечивает 200 исследований (при расходе 0,5 мл реагента на одно исследование).

Подготовка к анализу

Предметные стекла перед проведением исследования тщательно мыли и обезжиривали смесью для обезжиривания предметных стекол производства «АБРИС+».

Полученные мазки тщательно высушивали и затем фиксировали сухим жаром. Фиксация достигается посредством несильного нагревания (примерно до 70⁰С) предметного стекла, которое для этого трижды провели над пламенемспиртовки мазком вверх.

Приготовление рабочего растворасолянокислого спирта.

Для приготовления рабочего (3%) раствора солянокислого спирта, во флакон емкостью 100 мл вносили концентрат солянокислого спирта (10 мл) и добавляли 90 мл этилового спирта (960). Раствор тщательно перемешивали.

Методика окраски:

1. Помещали на мазок полоску фильтровальной бумаги и наносили на фиксированный мазок несколько капель карбол-фуксинЦиля и подогревали над пламенем спиртовки до появления паров. Эту температуру поддерживали в течение 1--2 минуты, не доводя до кипения. Охлаждали мазок до комнатной температуры.

2. Сливали краску, удаляли фильтровальную бумагу и основательно промывали в водопроводной воде.

3. Обрабатывали рабочим раствором солянокислого спирта до полного визуального обесцвечивания (1--3 минуты).

4. Промывали в воде.

5. Докрашивали (несколько капель) метиленовым синим 1--2 минуты.

6. Основательно споласкивали в воде и высушивали фильтровальной бумагой.

Окрашенные мазки исследовали в масле, с иммерсионным объективом.

Выделение чистой культуры осуществляли традиционным способом _ посевом на плотную питательную среду Левенштейна-Йенсена.

Реактивы

· Калий однозамещенный фосфорнокислый KH₂PO₄.

· Магний лимоннокислый Mg₃(C₆H₅O₇)₂ Ч 14H₂O.

· Магний сернокислый MgSO₄ Ч 7H₂O.

· L-аспарагин C₄H₈N₂O₃ Ч H₂O.

· Глицерин C₃H₈O₃.

· Малахитовый зеленый C₅₂H₅₄O₁₂N₄.

· Вода дистиллированная.

Состав среды

1) Приготовлениераствора минеральных солей:

· Калий однозамещенный фосфорнокислый 2,4 г

· Магний лимоннокислый 0,6 г

· Магний сернокислый 0,24 г

· L-аспарагин 3,6 г

· Глицерин 12,0 мл

· Вода дистиллированная 600 мл

Вышеперечисленные ингредиенты растворяли в теплой дистиллированной воде вуказанной последовательности при слабом подогревании (не доводя до кипения) наводяной бане. L-аспарагин растворяли отдельно и вносили последним.

Затем солевой раствор стерилизовали в автоклаве при 1 атм. (121 °С) в течение 30 минут. Срок хранения раствора составляет 3-4 недели при комнатной температуре.

2)Приготовление раствора малахитового зеленого:

· Малахитовый зеленый 2 г

· Стерильная дистиллированная вода 100 мл

Взвешенный порошок малахитового зеленого растворяли в стерильной теплой дистиллированной воде и помещали раствор втермостат на 2 часа для большего растворения (часто помешивали, поскольку порошок растворяется очень плохо). Затем профильтровывали растворчерез бумажный фильтр, разливали по флаконам и стерилизовали при 1 атм. (121 °С) в течение 30 минут.

3)Приготовление яичной массы.

Свежие диетические куриные яйца без трещин и дефектов скорлупы тщательномыли в теплой проточной воде с помощью ручных щеток и щелочного мыла.Далее яйца тщательно промывали в проточной воде и погружали в 70% этиловыйспирт на 30 минут.

Тщательно мыли руки с мылом и щеткой. Затем в стерильном боксе разбивали яйца стерильным ножом в стерильную посуду, доведя общий объем яичной массы до 1 л.

Тщательно взбивали яичную массу стерильным венчиком при минимальной скорости.

Приготовление среды

В большую стерильную емкость, соблюдая правила стерильности, помещали следующие растворы:

1. раствор минеральных солей 600 мл;

2. гомогенизированную яичную массу 1000 мл.

Смесь тщательно перемешивали и профильтровывали через стерильный марлевыйфильтр, имеющий не менее 4 слоев марли. Добавляли 20 мл раствора малахитовогозеленого, тщательно перемешивали, избегая образования пены, и в течение 15 минутразливали в пробирки приблизительно по 5 мл, следя за тем, чтобы в растворе не сформировался осадок.

Свертывание среды:

Для свертывания среды использовали специальные аппараты-свертыватели«АСПС». Пробирки с разлитой в них средой помещали в специальные штативы сподобранным углом наклона для формирования косяка среды высотой 8-10 см. Штативы устанавливали в свертыватель и проводили коагуляцию при 82-83 °С в течение40 минут.

В работе использовался коммерческий набор для деконтаминации-разжижения BBL™ Mycoprep™, в который входит: NaOH- 20.0г; Na₃C₆H₅O₇X2H₂O(три натрий цитрат)-14.5г;

Каждая ампула содержит NALC(C₅H₉NO₃S) - 0.375г Буфер: Na₂HPO₄ - 2.37г; KH₂PO₄-2.27г. Конечная pH=6.8

Процедура:

· Готовили BBL™ Mycoprep™ фосфатный буфер, путем растворения одного пакета в 500 мл дистиллированной воды, автоклавировали при 121⁰С 15 минут;

· ослабив винтовую крышку флакона BBL™ Mycoprep™ реагента, фиксировали ампулу внутри флакона и сламывали еесжатием. Слегка встряхивали для растворения NALC;

· в ламинарном боксе, используя стерильную центрифужную пробирку, переносили в нее равные количества исследуемого материала и NALC- NaOH (по 10 мл);

· закрывали пробирку и перемешивали на вортекс-миксере;

· оставляли смесь при комнатной температуре на 15 минут;

· добавляли подготовленный фосфатный буфер до 50-мл отметки на пробирке и смешивали. Центрифугировали в течение 15 минут при ускорении 3000 g;

· осторожно сливали надосадочную жидкость, добавляли малое количество фосфатного буфера с рН=6.8 (от 0.5 до 2.0 мл) и ресуспендировали осадок.

Техника посева и инкубации

Достоверная клиническая интерпретация результатов микробиологического исследования достигается при обязательном соблюдении следующего правила: микроскопическое и культуральное исследования должны производиться параллельно только из одной и той же пробы диагностического материала.

· набирали стерильной мерной пипеткой 1,0 - 1,2 мл полученного после обработки и нейтрализации осадка, оставив приблизительно 0,2 мл для последующего приготовления мазка для микроскопии;

· вносили равные объемы набранного обработанного материала (примерно по 0,5 - 0,6 мл) в 2 пробирки со средой Левенштейна-Йенсена, материал же, обработанный при помощи NALC- NaOH засевали на косяки агараМиддлбрук 7Н10 и в пробирки MGIT.

Остаток осадка забирали той же пипеткой и наносили на подготовленные и пронумерованные предметные стекла 1-2 капли осадка для получения мазка; подготовленные мазки оставляли сушиться на воздухе, после чего фиксировали их троекратным проведением в пламени и окрашивали по Циль-Нильсену.

По завершении посева всех проб засеянные пробирки с плотными средами перемещали в горизонтальные штативы - диваны и помещали в термостат при температуре 37°С. При посеве на агары и в бульон Миддлбрук чашки Петри и пробирки герметично упаковывали в автоклавные пакеты, пробки пробирок оставляли слегка отпущенными.

Детекция роста микобактерий с помощью автоматизированной системы бульонного культивирования BACTECMGIT 960

Посев диагностического материала в пробирки MGIT

Инокуляция осадка обработанного материала в индикаторные пробирки MGIT проводили с помощью стерильной пипетки в условиях стерильности:

· снимали откручивающуюся крышку с пробирки MGIT;

· добавляли содержимое флакона с обогатительной добавкой OADC (15 мл) во флакон с лиофилизированными антибиотиками PANTA;

· переносили 0,8 мл смеси PANTA /OADC в пробирку MGIT;

· вносили 0,5 мл осадка диагностического материала в пробирку MGIT и параллельно производили посев 0,2-0,5 мл материала на плотную среду Левенштейна-Йенсена;

· убедившись, что пробка плотно закручена, производили загрузку пробирки в прибор ВАСТЕС 960 в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

Инкубация пробирок в системе

1. Открывали один из ящиков прибора ВАСТЕС MGIT 960 и нажимали появившуюся на экране кнопку «tubeenter» («Загрузка пробирки»). При этом загорается лампа сканера для считывания штрих-кода с пробирки.

2. Считывали сканером штрих-код пробирки с инокулятом и устанавливали ее в гнездо, рекомендуемое прибором.

3. Ежедневно проверяли показания прибора на предмет появления положительных и отрицательных результатов.

4. О положительном результате (рост микобактерий) свидетельствовал красный сигнал положительного индикатора на соответствующем ящике и значок на дисплее прибора.

5. При появлении информации о положительном результате открывали указанный ящик, нажимали появившуюся на экране кнопку «positive», извлекали соответствующую пробирку из гнезда (вместо красной индикации, указывавшей непосредственно на место «положительной» пробирки, появляется зеленая, указывающая на освободившееся гнездо) и сканировали штрих-код.

6. Пробирки, рост микобактерий в которых не зафиксирован прибором в течение 42 дней, оценивались системой как отрицательные. Об отрицательном результате (отсутствие роста микобактерий) свидетельствовал зеленый сигнал отрицательного индикатора на соответствующем ящике и значок на дисплее прибора.

7. При появлении информации об отрицательном результате открывали указанный ящик, нажимали появившуюся на экране кнопку «negative», извлекали указанную пробирку из гнезда и сканировали ее штрих-код.

Оценка результатов культивирования на автоматизированной системе

Положительный результат, свидетельствующий о росте культуры в индикаторной пробирке, регистрировали с 4-го дня после инокуляции, положительный сигнал в 1-3-е сутки может быть расценен как микробная контаминация образца. Для подтверждения роста микобактерий, а также идентификации МБТ в позитивной пробирке проводили следующие процедуры:удалив позитивную или негативную пробирку из прибора, визуально оценивали прозрачность бульонной среды для определения возможного роста микобактерий. Обычно рост культуры МБТ проявляется в виде характерных придонно расположенных хлопьев, которые при незначительном встряхивании поднимаются и распространяются по всей среде, при этом жидкая среда сохраняет прозрачность. Помутнение среды в позитивной пробирке свидетельствует о возможной контаминации посторонней флорой.

Готовили мазок по методу Циля-Нильсена для выявления кислотоустойчивых микобактерий.

Производили субкультивирование на плотной яичной среде для подтверждения роста типичных колоний микобактерий.

Производили субкультивирование на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей 1000 мкг/мл салицилата натрия или 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты, для дифференциации МБТ и нетуберкулезных микобактерий.

При необходимости, для того чтобы убедиться в отсутствии контаминации позитивной емкости посторонней микробной флорой, готовили мазки с окраской по Граму и производили пересев содержимого пробирки на чашку с кровянымагаром. Наличие роста на чашке в результате инкубации в течение 24 часов при 37°С свидетельствует о микробной контаминации материала.

Чувствительность выделенных штаммов к ряду ПТП (изониазид, рифампицин, этамбутол (E), стрептомицин (S) и другие) определяли путем высева чистых культур на плотную питательную среду Левенштейна-Йенсена, методом абсолютных концентраций, регламентированного инструкцией по применению «Организация определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза» от 30.12.2002 г. (регистрационный номер 107-1102), разработанной в ГУ «НИИ пульмонологии и фтизиатрии».

Определение лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза кпротивотуберкулезным препаратам первого ряда

В нашей стране получило распространение определение лекарственной устойчивости методом абсолютных концентраций на среде

Левенштейна-Йенсена.

Метод абсолютных концентраций

Метод позволяет исследовать любое количество микобактерий в диагностическом материале, поскольку для определения лекарственной устойчивости используются штаммы микобактерий, предварительно выделенные на питательных средах. Так как сроки выделения возбудителя на питательных средах составляют не менее 1 - 1,5 месяцев, результаты определения лекарственной устойчивости указанным методом обычно получают не ранее, чем через 2 - 2,5 месяца после посева материала. При определении лекарственной устойчивости микобактерий на плотных средах культура считается чувствительной к той концентрации препарата, которая содержится в среде, если число колоний микобактерий, выросших на одной пробирке с препаратом, не превышает 20, а посевная доза соответствует 1-10⁷ микробных тел. Культура расценивается как устойчивая к данной концентрации препарата только при наличии в пробирке с этой концентрацией 20 колоний и более при обильном росте в контрольной пробирке, не содержащей лекарственного препарата.

Разведение противотуберкулезных препаратов и приготовление питательных сред

В питательную среду Левенштейна-Йенсена, не содержащую крахмала (крахмал адсорбирует лекарственные препараты), непосредственно перед свертыванием добавляли рабочие разведения противотуберкулезных препаратов первого ряда в указанных концентрациях. Для приготовления питательных сред с целью определения лекарственной устойчивости микобактерий использовались химически чистые субстанции противотуберкулезных препаратов (Sigma-Aldrich INC). Для приготовления из химически чистой порошковидной формы препарата рабочих растворов, содержащих необходимые для исследования концентрации активной субстанции, расчеты производили с учетом процента активности препарата.Активность препарата может варьировать от одной его серии к другой серии. Сведения об активности приводятся на этикетках или упаковках лекарственных препаратов. Взвешивание производили на электронных весах с точностью до четвертого знака после запятой.

Определение лекарственной устойчивости методом абсолютных концентраций.

Непосредственно перед постановкой опыта по определению лекарственной устойчивости убедились в том, что отобранные для исследования культуры микобактерий не загрязнены посторонней микрофлорой. Проверенные и отобранные для постановки опыта культуры микобактерий расставляли в штативе в порядке номеров. При определении чувствительности микобактерий к противотуберкулезным препаратам каждую серию приготовленной питательной среды с препаратами проверяли, засевая на нее заведомо чувствительную культуру микобактерий туберкулеза (справочный штамм лаборатории, H37Rv). Контрольную культуру засеяли так же, как и испытуемые. Если среда с препаратами приготовлена правильно, то контрольная культура не должна расти при тех концентрациях препаратов, при которых не растут чувствительные к данному препарату штаммы. Появление роста контрольного штамма в пробирке спрепаратом указывает на то, что при приготовлении среды с препаратами допущена ошибка или на то, что неправильно приготовлена бактериальная суспензия.

Процедура исследования:

· в полученную бактериальную суспензию внесили по 0,2 мл суспензии в верхнюю 1/3 косяка во все пробирки с питательной средой, приготовленной для определения устойчивости культуры данного номера, тщательно сверяли номер культуры засеваемой суспензии с номерами, написанными на пробирках. Во избежание ошибок все пробирки, подготовленные для засева одной культуры, расставляли в одном ряду штатива;

· по завершении засева всех суспензий засеянные пробирки перемещали в горизонтальные штативы-диваны и помещали в термостат при температуре 37°С; при этом поверхность косяка питательной среды находилась в горизонтальной плоскости, а наклон штатива исключал смачивание пробки материалом засева;

· по истечении 3 суток инкубации засеянные пробирки переводили в вертикальное положение;

· инкубирование проводили в течение 21 дня при обязательном еженедельном просмотре.

Оценка результатов

Результат определения лекарственной устойчивости учитывали на 21 день после посева. При скудном росте в контрольной пробирке все пробирки с препаратами оставляли еще на 1,5недели в термостате до получения выраженного роста в контроле, после чего выдавалиокончательный ответ. Культуру считали чувствительной к данной концентрации препарата, если в пробирке со средой, содержащей препарат, выросло менее 20 колоний при обильном росте в контрольной пробирке. Культура считалась устойчивой к той концентрации препарата, которая содержится в данной пробирке, если в пробирке со средой выросло более 20 колоний при обильном росте в контроле.

Исследования проводились по методу абсолютных концентраций на среде Левенштейн-Йенсена со следующими концентрациями препаратов 1 ряда: стрептомицин (Str) - 4 µг/мл, изониазид (Inh) - 0,2 µг/мл, рифампицин (Rif) - 40 µг/мл, этамбутол (Emb) - 2 µг/мл. Одновременно те же штаммы тестировались на агаремиддлбрук7Н10. Концентрации препаратов в агареМиддлбрук 7Н10 следующие: Str-2,0µг/мл; Inh-0,2µг/мл; Rif-1,0µг/мл; Emb-5,0µг/мл.

Концентрации для пробирок MGIT: Str -0,8 мкг/мл, Inh 0,1 мкг/мл, Rif 1,0 мкг/мл, Emb 3,5 мкг/мл. Учет результатов производили в течение 8-ми недель от момента посева. Бактериальная суспензия, приготовленная как описано выше засевали по 0.5 мл в пробирки с ростовой добавкой и разведениями антитуберкулезных препаратов по инструкции производителя и инкубировали в термостате в герметично закрытых полиэтиленовых пакетах. Для определения лекарственной устойчивости требуется от 3-х до 14-ти дней. Во всех случаях исследования лекарственной резистентности положительный результат анализа обязательно подтверждался при контрольном микроскопическом исследовании на наличие кислотоустойчивых бактерий и отсутствие роста загрязняющей микрофлоры.



3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Был проведен анализ частоты и структуры лекарственно-устойчивого туберкулеза в 2008, 2009, 2010 и 2011гг. среди вновь выявленных больных туберкулезом и контингентов бактериовыделителей, состоявших на учете в Минском областном противотуберкулезном диспансере. За период 2008 - 2011гг. бактериологической лабораторией Минского областного противотуберкулезного диспансера было выполнено 3979 микробиологических исследований на определение лекарственной устойчивости МБТ к ПТП. Из них ЛУ была подтверждена у 3252 (2008г - 766 чел., 2009г - 800, 2010г - 849, 2011 - 837) больных туберкулезом.

На рисунке7 показано процентное соотношение всех типов резистентности культур микобактерий туберкулеза, выделенных от больных в противотуберкулезном диспансере в 2008-2011 гг.

Рис. 7 -Распределение профилей резистентности среди штаммов M.tuberculosis 2008-2011гг.

Как видно из рис.8, при рассмотрении общего количества штаммов резистентность распределяется так: полностью чувствительные штаммы составляют 18,5% всехизолятов, монорезистентные -20,6%, полирезистентные-11,7%, штаммы же с множественной лекарственной устойчивостью составляют 26,8% всей исследованной бактериальной популяции. Учитывая тот факт, что «дикие» штаммы M.tuberculosis, циркулирующие в популяции, за исключением единичных мутантов отличаются полной чувствительностью к противотуберкулезным препаратам, налицо постепенная смена генотипа и фенотипа региональных микобактерий на резистентный тип.

В таблице 2 те же профили резистентности представлены более подробно:

Таблица 2 - Профили резистентности ТБ штаммов, выделенных в диспансере, 2008-2011 гг.

	Неопредел. сл.	Новые сл.	Леченные	Всего(n=3252)
	N=17	%	N=978	%	N=2274	%	N=3252	%
Монорезистентность
INH			55	1.7	258	7.9	313	9.6
RIF			36	1.1	154	4.7	180	5.5
SM	7	0.2	105	3.2	332	10.2	444	13.7
EMB			23	0.7	110	3.4	133	4.1
Всего монорезист.	7	0.2	219	6.7	854	26.3	1080	33.2
Полирезистентн.
H+E			56	1.7	27	0.8	83	2.6
H+S	3	0.09	117	3.6	123	3.8	243	7.5
R+S	1	0.03	66	2.0	119	3.7	186	5.7
R+E			17	0.5	33	1.0	50	1.5
S+E			34	1.1	38	1.7	72	2.2
R+S+E			38	1.2	42	1.3	80	2.5
H+S+E			50	1.5	40	1.2	90	2.8
Всего полирезист.	4	0.1	378	11.9	422	12.8	804	24.7
MDR
H+R			70	2.2	228	7.0	298	9.2
H+R+E			44	1.4	116	3.6	160	4.9
H+R+S	5	0.2	151	4.6	377	11.6	533	16.4
H+R+E+S	1	0.03	116	3.6	304	9.3	421	12.9
Всего MDR	6	0.2	381	11.7	1025	31.5	1412	43.4

Как видно из таблицы, региональные штаммы, резистентные к одному ПТП составляют более 33% в общем количестве случаев, более 79% для ранее леченных больных и до 21% у вновь выявленных случаев. Резистентные к изониазидурифампицинусоставляют до 44% в общем количестве случаев, более 73% для ранее леченных больных и 27% у вновь выявленных случаев. Полирезистентность составила 25%, 48% у впервые выделенных больных и 52% у ранее леченых больных. Хотя самые высокие показатели относятся к штаммам M.tuberculosis, выделенным от ранее леченых пациентов и представляют собой вторичную резистентность, из таблицы видно, что уровень первичной резистентности катастрофически велик.

Особенностью современной эпидемиологической ситуации по туберкулезу в мире является резкое возрастание частоты первичной лекарственной устойчивости, и Беларусь не является исключением. Среди факторов, способствующих возникновению вторичной резистентности, на первом месте стоит недисциплинированность и несознательность больных, по разным поводам уклоняющихся от систематического приема противотуберкулезных препаратов.

Значительно реже лекарственная устойчивость развивается из-за плохой переносимости отдельных препаратов, заставляющей прерывать их прием или назначать менее действенные режимы лечения. Быстрое нарастание частоты лекарственной устойчивости стало главной причиной недостаточной эффективности современных режимов химиотерапии туберкулеза.

В таблице 3 показаны изменения в соотношении резистентности разных типов по всем случаям за период с 2008 по 2011гг.



Таблица 3 - Временные изменения в профилях резистентности штаммов M.tuberculosis, выделенных в 2008-2011

	Годы
	2008	2009	2010	2011
	N=766	%	N=800	%	N=879	%	N=837	%
Монорезистентность
INF	67	7.0	73	7.3	89	8.5	84	8.3
RIF	37	3.8	50	5.0	48	4.6	55	5.5
SM	115	12.0	113	11.3	101	9.7	108	10.7
EMB	24	2.5	36	3.6	35	3.3	38	3.8
Всего монорезист.	243	25.3	272	27.2	273	26.1	285	28.3
Полирезистентность
H+E	21	2.2	19	1.9	20	1.9	25	2.5
H+S	73	7.6	52	5.2	58	5.5	57	5.7
H+E+S	17	1.8	16	1.6	29	2.8	28	2.8
R+E	17	1.8	10	1.0	13	1.2	10	1.0
R+S	52	5.4	37	3.7	45	4.3	51	5.1
R+E+S	28	2.9	16	1.6	17	1.6	19	1.9
E+S	17	1.8	16	1.6	19	1.8	20	2.0
Всего полирезист.	225	23.5	166	16.6	201	19.1	210	21
MDR
H+R	57	5.9	69	6.9	74	7.1	71	7.0
H+R+E	44	4.6	43	4.3	34	3.2	39	3.9
H+R+S	109	11.3	143	14.3	144	13.8	132	13.1
H+R+E+S	88	9.1	107	10.7	123	11.8	102	10.1
Всего MDR	298	30.9	362	36.2	375	35.9	344	34.1

По сравнению с 2008 годом (79.6%), общий уровень резистентного туберкулеза повышался в 2009 году до 80.2%, в 2010 - 86.9%. В 2011 году общее количество резистентных штаммов M.tuberculosis снизилось до 84%. Из них резистентность к одному противотуберкулезному препарату (монорезистентность) увеличилась с 25.3% в 2008 году до 28.3% в 2011году, а резистентность более чем к одному противотуберкулезному препарату (полирезистентность) уменьшилась с 23.5% в 2008 году до 21% в 2011году. Резистентность как минимум к изониазиду и рифампицину (мультирезистентность) по сравнению с 2008 годом (30.9%) в 2009 году достигла максимума (36.2%) и далее начала постепенно уменьшаться и в 2011 году составила 34.1%.

На рис.8 показано процентное соотношение между чувствительными и резистентными штаммами, выделенными от ранее не леченных больных туберкулезом в 2008 - 2011гг.

Рис. 8 - Распределение профилей резистентности среди штаммов M.tuberculosis, выделенных от «новых» случаев, 2008 - 2011гг.

Как видно из рисунка, полностью чувствительные ко всем четырем противотуберкулезным препаратам культуры встречаются в 15,5 % всех «новых» случаев. Монорезистентные составили 19% , полирезистентные- 32,7%, 32,8 % культур были мультирезистентными.

Распределение типов чувствительности - 15.5% на 84.5% свидетельствует о высоком уровне первичной резистентности. Обычно на развитие резистентности требуется от одного до полутора месяцев, за это время, при условии, что больной получает неправильное лечение, популяция возбудителя в организме успевает пройти селекцию и выживают только те микобактерии, которые успели мутировать. Поэтому в данном случае мы можем иметь дело с неточностями в сборе первичных эпидемиологических данных отбольных: многие из них по разным причинам скрывают факты приема в прошлом какого-либо из противотуберкулезных препаратов. Другое объяснение высокого уровня резистентности может заключаться в том, что культуральное исследование проводится не перед началом лечения такого больного, а минимум через один месяц после начала курса химиотерапии.

Результаты изменения профилейрезистентности в динамике с 2008 до 2011 гг. по штаммам M.tuberculosis, выделенным от ранее не леченных больных, представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Профили резистентности штаммов M.tuberculosis, выделенных от ранее не леченных больных, временное распределение

	Годы
	2008	2009	2010	2011
	N=225	%	N=247	%	N=248	%	N=258	%
Монорезистентность
INF	12	5.3	12	4.9	14	5.6	17	6.6
RIF	6	2.7	8	3.2	10	4.0	12	4.7
SM	35	15.6	22	8.9	22	8.9	26	10.1
EMB	3	1.3	6	2.4	7	2.8	7	2.7
Всего монорезист.	56	24.9	48	19.4	53	21.3	62	24.1
Полирезистентность
H+E	13	5.8	16	6.5	13	5.2	14	5.4
H+S	30	13.3	34	13.8	26	10.5	27	10.5
H+E+S	11	4.9	10	4.1	17	6.8	12	4.7
R+E	5	2.2	5	2.0	4	1.6	3	1.2
R+S	14	6.2	18	7.3	16	6.5	18	7.0
R+E+S	11	4.9	10	4.1	8	3.2	9	3.5
E+S	8	3.6	7	2.8	8	3.2	11	4.3
Всего полирезист.	92	40.9	100	40.6	92	37.0	94	36.6
MDR
H+R	14	6.2	17	6.9	19	7.7	20	7.8
H+R+E	9	4.0	14	5.7	10	4.0	11	4.3
H+R+S	31	13.8	40	16.2	40	16.1	40	15.5
H+R+E+S	23	10.2	28	11.3	34	13.7	31	12.0
Всего MDR	77	34.2	99	40.1	103	41.5	102	39.6



Как видно из таблицы, учёт и анализ лекарственной устойчивости в Минской области за период с 2008 по 2011 год выявил значительное увеличение удельного веса общей (с 23.4% до 25.9%) и множественной лекарственной устойчивоcти (с 34.2% до 39.6%) по отношению ко всем бактериовыделителям.

В мировой литературе указывается на редкость полирезистентных форм туберкулеза, однако во многих странах Восточной Европы, странах СНГ в последнее десятилетие происходит их рост. Это говорит о неэффективности имеющихся программ по борьбе с туберкулезом, которые не создают условия для полного излечения впервые выявленных больных.

На рис. 9 представлено процентное соотношение между типами резистентности культур, выделенных от больных, получавших ранее лечение от туберкулеза.

Рис. 9 - Распределение профилей резистентности среди штаммовM.tuberculosis, выделенных от леченных больных, 2008-2011гг.

Как видно из рисунка, преобладает количество штаммов M.tuberculosis, резистентных как минимум к изониазиду и рифампицину, то есть мультирезистентных (34.4%). Монорезистентные штаммы M.tuberculosisу таких больных составляют 31.9% от общего количества. Еще меньший процент отходит к полирезистентным штаммам. Это свидетельствует о том, что вторичная резистентность, развивающаяся в результате неправильного лечения, например, монотерапии, или преждевременного прерывания курса химиотерапии, как правило, распространяется более, чем на один противотуберкулезный препарат. В случае выделения от ранее леченного больного чувствительной культуры, можно предположить недавнюю реинфекцию.

В таблице 5 показано изменение соотношения типов резистентности у ранее леченных больных по годам с 2008 по 2011.

Таблица 5 - Профили резистентности штаммов M.tuberculosis, выделенных от леченных больных, 2008 - 2011 гг.

	Годы
	2008	2009	2010	2011
	N=541	%	N=553	%	N=601	%	N=579	%
Монорезистентность
INF	55	10.2	61	11.0	75	12.5	67	11.6
RIF	31	5.7	42	7.6	38	6.3	43	7.4
SM	80	14.8	91	16.5	79	13.1	82	14.1
EMB	21	3.9	30	5.4	28	4.7	31	15.3
Всего монорезист.	187	34.6	224	40.5	220	36.6	223	48.4
Полирезистентность
H+E	8	1.5	3	0.5	7	1.6	9	1.6
H+S	43	7.8	18	3.3	32	5.3	30	5.2
H+E+S	6	1.1	6	1.1	12	2.0	16	2.8
R+E	12	2.2	5	0.9	9	1.5	7	1.2
R+S	38	7.0	19	3.4	29	4.8	33	5.7
R+E+S	17	3.1	6	1.1	9	1.5	10	1.7
E+S	9	1.7	9	1.6	11	1.8	9	1.6
Всего полирезист.	133	24.5	66	11.9	109	18.5	114	19.8
MDR
H+R	43	7.9	52	9.4	55	9.1	51	8.8
H+R+E	35	6.5	29	5.2	24	4.0	28	4.8
H+R+S	78	14.4	103	18.6	104	17.3	92	15.9
H+R+E+S	65	12.0	79	14.3	89	14.8	71	12.3
Всего MDR	221	40.8	263	47.5	272	45.2	242	41.8

В таблице видно, что количество выделяемых резистентных культур всех типов от таких больных снижалось с 70.6% в 2008 году до 69.2% в 2011 году. Самый высокий уровень из всех типов резистентного туберкулеза имеет мультирезистентный тип. Его показатели составили в 2008 году 40.8%, в 2009 показатель достиг своего пика 47.5%, в 2010 - 45.2%, затем, в 2011 снизился до 41.8%. Эти изменения можно объяснить тем, что определенная часть таких больных-это хроники, среди которых отмечается высокий уровень смертности, с другой стороны, каждый год определенная часть больных, в свое время неправильно лечившихся или прервавших курс химиотерапии, обращается к врачам с рецидивом болезни.



ВЫВОДЫ

1) За период 2008 - 2011гг среди региональных штаммов M.tuberculosis в 81,7% доминировали резистентные. Монорезистентных было 30,7%, полирезистентных - 28,8%, мультирезистентных - 40,6%. С 2008 по 2011 гг. наблюдается тенденция к увеличению уровня общей резистентности M. tuberculosisвМнской области.

2) Таким образом, проведенный мониторинг частоты и структуры лекарственно-устойчивого туберкулеза за период 2008-2011гг. показал, что в современных эпидемиологических условиях у больных туберкулезом определяется высокий уровень первичной множественной лекарственной устойчивости - до 10,2%. Уровень вторичной МЛУ в 2011 г. составил 26,8%.

3) За последние четыре года отмечена тенденция к утяжелению структуры устойчивости за счет нарастания частоты множественной лекарственной устойчивости к четырем препаратам с 20,1% в 2008 г. до 23,4% в 2011 г.

4) На сегодняшний день показатели первичной и вторичной резистентности остаются на тревожно высоком уровне, а их структура весьма неблагоприятна



ЛИТЕРАТУРА

1. Бардисявичене И. Сравнительная эффективность BACTEC 460 ТВ и ИФА в диагностике туберкулеза легких. Проблемы ускоренной бактериологической диагностики туберкулеза / И. Бардисявичене, А. Сосновская // Материалы научно-практической конференции - Обнинск, 1996. - 35 с.

2. Бондарев, И.М. Лечение больных туберкулезом легких переносимыми дозами тубазида / И.М. Бондарев // Проблемы туберкулеза. - 1972, №8 - С. 8-12.

3. Браженко, Н.А. Фтизиопульмонология: учеб. пособие для студ. высш. учеб.заведений / Н.А. Браженко. - М.: Академия, 2006. -- 368 с.

4. Вишневская Е.Б. Особенности выделения ДНК для ПЦР при туберкулезе внелегочных локализаций/ Е.Б. Вишневская// Проблемы туберкулеза. - 1998. - №5 - С. 23-26.

5. Фтизиатрия: учебное пособие / И.С. Гельберг [и др.]; Гриф МО Республики Беларусь. - Минск: Вышэйшая школа, 2009. - 334 с.

6. Голышевская, В.И. Современное состояние микробиологической диагностики туберкулеза в России / В.И. Голышевская, Э.В. Севастьянова // Актуальные проблемы туберкулеза и болезней легких: материалы научной сессии, посвященной 85-летию ЦНИИТ РАМН. - М., 2006. - С. 17-18.

7. Люминесцентная микроскопия: Учебное пособие для проведения курсов обучения: «Культуральные методы диагностики туберкулеза», «Выявление туберкулеза методом микроскопии» / В.И. Голышевская [и др.]. - Тверь, 2008. - 36с.

8. Дорожкова И.Р. Мониторинг лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза в России за 1979-1998 гг. / И. Р. Дорожкова[и др.] // Проблемы туберкулеза. - 2000, №5. - с. 19-22.

9. Микробиологические методы диагностики туберкулеза / В.В. Ерохин [и др.]. - Тверь: Триада, 2008. - 40 с.

10. Копылова, И.Ф. Туберкулез органов дыхания у детей и подростков: учебное пособие / И.Ф. Копылова, С.В. Смердин, М.Г. Вертячих. - Кемерово: КемГМА, 2007. - 146 с.

11. Кошечкин, В.А. Туберкулез: Tuberculosis: Учебное пособие / В.А. Кошечкин, З.А. Иванова. - М.: РУДН, 2006. - 276 с.

12. Кошечкин, В.А. Туберкулез / В.А. Кошечкин, З.А. Иванова. - М.: Гэотар-Меиа, 2007. - 16 с.

13. Манкеев С.М.Пролонгированные фторхинолоны. Новые возможности лечения мультирезистентного туберкулеза/ С.М. Манкеев //Большой целевой журнал о туберкулезе - 2001, №11. - 12 с.

14. Мишин, В.Ю. Туберкулез легких с лекарственной устойчивостью возбудителя / В.Ю. Мишин - Москва: ГЭОТАР Медиа, 2009. - С. 39-41.

15. Перельман М.И.Проблемы туберкулеза / М.И. Перельман [и др.] // Проблемы туберкулеза. - 2001, №5. - с. 5-7

16. Репин Ю.М. Лекарственно-устойчивый туберкулез легких / Ю.М. Репин. - Санкт-Петербург: Гиппократ, 2007. - 28 с.

17. Севастьянова Э.В.Разработка критериев оценки качества и эффективности микробиологических исследований в учреждениях противотуберкулезной службы и общей лечебной сети / Э.В. Севастьянова [и др.] // Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2009, № 3. - С. 55-60.

18. Степаншин Ю.Г.Молекулярные механизмы устойчивости микобактерий туберкулеза к лекарственным препаратам / Ю.Г. Степаншин [и др.] // РС ВИНИТИ. - 1999, №5. - С. 1- 6.

19. Страчунский Л.С. Современная антимикробная химиотерапия. Руководство для врачей / Л.С. Страчунский, С.Н. Козлов. - М.: Боргес, 2002. - 432 с.

20. Хоменко А.Г.Эффективность химиотерапии туберкулеза легких с лекарственно-устойчивыми микобактериями / А.Г. Хоменко [и др.] // Проблемы туберкулеза. - 1996, № 6. - С.42-44.

21. Armstrong A. Time concentration relationships of isoniazid with tubercle bacilli in vitro / A. Armstrong [et al.] // Am. Rev. Resp. Dis. - 1960, Vol. 81. - P. 498.

22. Balter M. AIDS now World's fourth biggest killer/ M Balter.// Science. - 1999, № 3. - Р. 1101-1102.

23. Coates A.R.The role of sensitivity tests in short-term chemotherapy / A.R. Coates [et al.] // Bull In Union Tuberc. - 1983, № 58 (2). - Р. 111-114.

24. ColeS.T.,Tuberculosis / S.T.Cole [et al.] // Nature. - 1998, Vol. 393. - P. 537-544.

25. Herman R.P.Isoniasid interaction with tyrosine as a possible mode in action if the drug in mycobacteria / R.P.Herman [et al.] // Antimicr. Agents Chemother. - 1980, Vol. 17. - P. 170 - 178.

26. Loudon R.G.Tuberculosis / R.G. Loudon // Am. Rev. Resp. Dis. - 1968, Vol. 135. - P. 297-300

27. MaranetraK.N.Quinolones and multidrug-resistant tuberculosis. Chemotherapy / K.N.Maranetra, - 1999. - №45, Suppl 2. - Р. 12-18.

28. Mitchison D.A.Influence of initial drug resistance on the response to short-course chemotherapy of pulmonary tuberculosis / D.A. Mitchison//Am Rev Respir Dis. - 1986, Vol. 133. - P.423-430.

29. PerelmanM. J.Tuberculosis in Russia / M. J. Perelman // Am Rev Respir Dis. - 2000. - Vol. 4, 12 - P. 1097-1103.

30. Rieder H.L.Tubercule / H.L. Rieder // Am. Rev. Resp. Dis. - 1985, Vol. 115. - P. 179-186

31. ViljanenM. K.Survey of drug-resistant tuberculosis in Northwestern Russia from 1984 through 1994 / M. K. Viljanen [et al.] // Eur J ClinMicrobiol Infect Dis. - 1998, Vol. 17. - P. 177-183.

32. Yomans A.The effect of the Anti-isoniazid substantle on the chemotherapeutic activity if izoniazid in vivo / A. Yomans, G. Yomans // Am. Rev. Tuberc. a. Pulm. Dis. - 1956, Vol. 5. - P.764.

Размещено на Allbest.ru