Принципиальное решение проблемы быстрого обнаружения, идентификации возбудителя туберкулеза и определения его лекарственной чувствительности было найдено в результате разработки технологии биологических микрочипов.

Идея создания биологического микрочипа возникла еще в конце 1980-х гг. одновременно в Великобритании, Югославии и СССР. В Советском Союзе эти работы были инициированы и проводились под руководством выдающегося ученого, академика А.Д. Мирзабекова, который не боялся разрабатывать принципиально новые направления, даже когда результат было трудно предугадать. Технология биологических микрочипов была последним и любимым "детищем" Мирзабекова, когда он возглавлял Институт молекулярной биологии им.В.А. Энгельгардта РАН и заведовал лабораторией биочипов. Суть этой технологии заключается в следующем.

Обычно для выявления или количественного анализа какого-либо вещества в окружающей среде или биологическом материале, полученном от пациента, проводят реакцию с реактивом, специфически взаимодействующим с этим веществом. В результате такой реакции образуется вещество с новыми физическими или химическими свойствами, количество которого определяют с помощью анализатора. В случае если образующееся вещество обладает цветом или может светиться под действием возбуждающего света, обнаружение и количественный анализ образовавшегося продукта определяют с помощью спектрофотометров или флуориметров. По количеству образовавшегося продукта судят о наличии и содержании в анализируемом образце того или иного вещества.

По такому же принципу работает и биологический микрочип. Он представляет собой твердую подложку с небольшими ячейками. В каждой ячейке иммобилизовано (закреплено) собственное вещество-реагент, которое служит зондом (щупом, пробой) для проведения той или иной реакции. Все реагенты расположены в определенном порядке и взаимодействуют с анализируемым образцом как ключи с замком. В том месте чипа, где есть соответствие (комплементарность) между молекулами исследуемого вещества и молекулами зонда, образуется новый продукт - дуплекс, который и определяется анализирующим оборудованием. Картина распределения ячеек биочипа, содержащих дуплексы, является индивидуальной характеристикой анализируемого образца.

Существуют биочипы, изготавливаемые методом синтеза зондов непосредственно на подложке. Плотность ячеек в таком чипе очень высока: на площади 1 мм² может быть расположено более тысячи ячеек, а весь чип содержит миллионы ячеек. Такие биочипы предназначены для анализа крупных фрагментов ДНК, иногда для анализа всего генома организма. Стоимость таких чипов, как и анализирующего оборудования, очень высока. Принципиально другой тип чипов изготавливается путем нанесения раствора, содержащего зонд, на заранее подготовленную, "активированную" поверхность подложки. Такие "специализированные" чипы, имеющие гораздо меньшую плотность (на 1 мм² расположены десятки ячеек), предназначены для работы с ограниченными фрагментами ДНК. Стоимость таких биочипов гораздо меньше.

Совместные исследования учен РАН - разработчиков технологии биочипов - с сотрудниками Московского городского научно-практического центра борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения г. Москвы (МНПЦБТ) и Центрального научно-исследовательского института туберкулеза РАМН (ЦНИИТ), специалистами в области микробиологии и молекулярной диагностики туберкулеза привели к идее создания биочипа для обнаружения возбудителя туберкулеза и определения его чувствительности к рифампицину и изониазиду (одновременная устойчивость к этим двум препаратам определяется термином "множественная лекарственная устойчивость" - МЛУ).

В настоящее время известно, что резистентность МБТ к изониазиду определяется мутациями в четырех основных генах: katG, inhA, ahpC/oxyR, kasA, а также в менее изученных furA и ndh.

В более 95% случаев резистентность МБТ к рифампицину у больных туберкулезом обусловлена мутациями в коротком фрагменте (81 пара нуклеотидов) гена rpoB, кодирующего в-субъединицу РНК-полимеразы МБТ.

Работы по созданию такого биочипа были начаты в 1997 г. Разработанный биочип позволяет в течение суток обнаружить в образце, полученном от пациента, наличие возбудителя туберкулеза и выявить его лекарственную чувствительность. В 2004 г., после клинико-диагностических испытаний, проведенных в МНПЦБТ и ЦНИИТ, тест-система "ТБ-БИОЧИП" и прибор для обработки результатов анализа получили Государственную регистрацию в Федеральной службе РФ по надзору в сфере здравоохранения и социального развития.

"ТБ-БИОЧИП" представляет возможность параллельного выявления чувствительности МБТ к рифампицину и изониазиду с определением 29 типов мутаций по гену rpoB и 19 типов мутаций по генам katG, oxyR, inhA, обнаруживая не менее 95% рифампицин - и более 80% изониазидустойчивых штаммов. Более того, как показали исследования профессора И.Р. Дорожковой в МНПЦБТ, с помощью этой тестсистемы можно определять лекарственную чувствительность к рифампицину и изониазиду у L-форм Mycobacterium tuberculosis.

Таким образом, сегодня фтизиатры имеют уникальный инструмент для определения лекарственной чувствительности МБТ непосредственно после поступления больного туберкулезом в клинику, что позволяет немедленно начать направленную противотуберкулезную терапию и уменьшить риск внутрибольничного заражения туберкулезом. Эта же тест-система может быть использована для контроля эффективности применяемой терапии и своевременного обнаружения у пациента лекарственно устойчивых МБТ.

К тому же возможности разработки новых биочипов для идентификации микобактерий, контроля проводимого лечения далеко не исчерпаны. В связи с этим лабораторная диагностика туберкулеза стоит на пороге эры молекулярно-биологических методов, имеющих огромные перспективы.

В 1969 г. Деланд и Вагнер разработали методику полуавтоматического определения метаболизма бактерии путем измерения количества CO₂, освободившегося в процессе роста, и декарбоксилирования субстрата класса С, введенного в питательную среду. Этот радиометрический способ широко применялся для гемокультур с использованием систем BACTEC 460 ТВ. В 1980 г. данный метод был внедрен для выделения микобактерий из клинических образцов, а также для постановки тестов на лекарственную чувствительность.

Проведен ряд клинических испытаний для сравнения радиометрической системы BACTEC 460 TB с плотной средой в целях первичного посева и тестов на лекарственную чувствительность. Несколько исследований системы BACTEC 460 TB, результаты которых были опубликованы в 1980-1985 гг., продемонстрировали великолепные результаты со значительной экономией времени, особенно в отношении негативных по мазку образцов.

Согласно отчетам, при использовании системы BACTEC 460 TB достигается увеличение случаев положительного роста культуры на 1 5-20% в сравнении с обычными плотными средами (например, Левенштейна-Йенсена), при этом средний период определения положительного роста составляет 8-14 дней в сравнении с 3-5 неделями для плотной среды. Внедрение системы BACTEC 460 TB явилось революционным решением для лабораторных тестов на выявление микобактерий и явилось "золотым стандартом" для выполнения посевов и тестов на чувствительность.

Высокая эффективность системы BACTEC 460 TB обусловлена использованием жидкой среды. Кроме того, для снижения времени выявления к среде добавляется вещество для улучшения роста. После внедрения системы BACTEC 460 TB установлено, что жидкая среда достоверно превосходит плотную в отношении выявления микобактерий, сроков, детекции и тестов на лекарственную чувствительность. Описаны случаи, когда определенные виды микобактерий растут только в жидкой среде. В 1993 г. Центром контроля и профилактики заболеваний рекомендовали каждой клинической лаборатории использовать жидкую среду вместе с плотной для выявления микобактерий. В последующих исследованиях была отмечена растущая тенденция использования жидкой среды для обеспечения быстрой и максимально точной детекции микобактерий в клинических образцах. Однако жидкая среда более восприимчива к контаминации бактериями, которые обычно присутствуют в виде обычной флоры в некоторых клинических образцах, и иногда сохраняются после проведения деконтаминации. Таким образом, добавление антибактериальных препаратов необходимо для подавления контаминации в жидкой среде. В системе BACTEC 460 TB для этих целей применяется комплекс антибактериальных препаратов PANTA™ (полимиксин B, амфотерицин B, налидиксовая кислота, триметоприм, азлоциллин), благодаря которому уровень контаминации снижается до пределов, сопоставимых с плотной средой. Комплекс PANTA также используется в жидких средах, разработанных и появившихся в последние несколько лет.

Одним из недостатков системы BACTEC 460 TB является использование радиоактивного субстрата класса С. Из-за строгих требований к обработке и утилизации радиоактивных веществ, возникла необходимость в разработке методики без использования радиометрических технологий. Компания Becton & Dickinson (BD) разработала новую систему - индикаторную пробирку для выращивания микобактерий Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT™), не использующую радиометрию, но обеспечивающую такие же - быстрые, точные и надежные - методы тестирования, как и BACTEC 460 TB. BBL MGIT™ - система с ручным управлением, а BACTEC MGIT 960 (MGIT 960) - полностью автоматизированная система для роста, детекции микобактерий и тестов на лекарственную чувствительность M. Tuberculosis.

1.1 Принцип работы полностью автоматизированной системы BACTEC MGIT 960 для выявления микобактерий туберкулеза и постановки тестов на лекарственную чувствительность к противотуберкулезным препаратам

1.1.1 Характеристика питательной среды, используемой в пробирке MGIT

Содержимое пробирки MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube) - это питательный бульон, благодаря которому достигается более эффективное выделение микобактерий и их ускоренный рост. Пробирка содержит 7 мл стерильного питательного бульона Мидлбрук 7H9, в которую перед использованием вносится обогатительная добавка BACTEC MGIT Growth Supplement OADC (олеиновая кислота, альбумин, декстроза и каталаза). Она крайне важна для роста многих микобактерий, особенно бактерий, принадлежащих к группе M. tuberculosis. Для предотвращения контаминации необходимо добавить MGIT PANTA.

1.1.2 Принципы детекции и постановки тестов на лекарственную чувствительность к противотуберкулезным препаратам

Кроме жидкой среды Мидлбрук 7H9, в пробирке MGIT содержатся: бескислородный флюорохром, трис - 4, 7-дифенил-1, 10-фенантролин пентагидрат хлорида рутения, помещенный на дно пробирки и покрытый силиконом. Во время бактериального роста внутри пробирки происходит поглощение свободного кислорода и его замещение углекислым газом. По мере расходования свободного кислорода прекращается ингибирование флюорохрома. Флюоресценция становится видимой при облучении пробирки ультрафиолетовым светом и автоматически регистрируется фотодатчиками, встроенными в прибор BACTEC 960. Интенсивность свечения прямо пропорциональна уровню расходования кислорода и регистрируете в единицах роста (GU - growth units).

Пробирки MGIT инкубируются при температуре 37°C с последующим анализом, осуществляемым вручную при ультрафиолетовом излучении, либо путем помещения в прибор MGIT 960, где пробирки проходят инкубацию и мониторинг степени флюоресценции каждые 60 минут. Рост микобактерий и других бактерий вызывает усиление флюоресценции. В случае с M. tuberculosis в момент положительного посева пробы наблюдается около 105-106 колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1мл среды. Прибор оценивает пробу как отрицательную при отсутствии роста в течение шести недель (42 дня). Рост бактерий также может быть определен визуально в случае неоднородности и/или помутнения среды либо наличия в ней грануловидных или хлопьевидных вкраплений. Рост некоторых нетуберкулезных микобактерий (большинство из них обладает быстрым ростом) приводит к легкой замутненности, в то время как бактерии, вызывающие контаминацию, обычно вызывают выраженную мутность среды.

В основе теста на лекарственную чувствительность микобактерий туберкулеза лежит модифицированный метод пропорций. В процессе определения происходит сравнение скорости роста микобактерий туберкулеза - в контрольной пробирке и в пробирках с лекарственными препаратами. Для проведения теста используются специальные держатели для 2, 3, 4, 5 и 8 пробирок. В первую пробирку не вносится лекарственный препарат - контрольную, в остальные пробирки добавляются известные концентрации тестируемых лекарственных препаратов, рост в которых сравнивается с ростом в контрольной пробирке. Если тестируемый лекарственный препарат активен по отношению к выделенным микобактериям, он будет ингибировать рост и подавлять флюоресценцию, при этом в контрольной пробирке рост не ингибируется и, соответственно, уровень флуоресцентности в данной пробирке будет выраженнный. Мониторинг роста осуществляется при помощи прибора BACTEC MGIT 960, который автоматически интерпретирует результаты на наличие чувствительности или резистентности к препарату.

1.1.3 Результаты и отчетность

Если в инокулируемой пробе присутствуют жизнеспособные микобактерии, они растут в питательной среде и обнаруживаются визуально, а также при помощи флюоресценции. О результатах сообщается только в том случае, если пробирка MGIT определена прибором как положительная и мазок, взятый из этой пробирки, также положителен на КУМ. В редких случаях пробирка MGIT может быть определена прибором как отрицательная, при этом мазок может быть положительный.

В таком случае сообщается о положительных результатах. Отчеты необходимо отсылать сразу после готовности результатов. Если идентификация требует дополнительного времени, о результатах можно сообщить как о культурах, положительных на КУМ, ожидающих идентификации. Предпочтительнее идентифицировать комплекс M. tuberculosis молекулярным зондом, при возможности, или другими экспресс-методами; о результатах сообщать сразу после идентификации.

Отчеты о негативных культурах составляются после получения протокола исследования и визуального осмотра негативных пробирок. Контаминированные культуры регистрируются после подтверждения мазком и субкультивированием на кровяном агаре.

Виды отчетов:

a. Мазок из пробы (флюорохромное окрашивание или метод Циль-Нильсена) - сообщается о положительном либо отрицательном результате и об использованном методе окрашивания. (В течение 24 часов после получения пробы, по рекомендации Центра контроля и профилактики заболеваний, отчет нужно предоставить).

b. Культура: положительная (подтверждение - мазок на КУМ). Желательно, после выполнения идентификации - комплекс M. tuberculosis или MOTT bacilli (по рекомендации Центра контроля и профилактики заболеваний сообщить в течение приблизительно 14 дней). В дальнейшем идентифицировать микобактерии и составить отчет.

c. По завершении теста на лекарственную чувствительность определяется выявлена ли чувствительность или резистентность к каждому исследуемому препарату и сообщается в течение 28 дней (по рекомендации Центра контроля и профилактики заболеваний).

d. Культура: отрицательная после подготовки протокола об инкубации (по рекомендации Центра контроля и профилактики заболеваний в течении 42 дней).

Производительность системы

По данным исследований, с использованием жидких сред, как правило, вырабатывается больше положительных культур, чем при использовании плотных сред, при этом имеет место значительное сокращение времени выявления положительного роста. Данные многочисленных сравнительных исследований производительности BACTEC MGIT 960, BACTEC 460 TB и обычных плотных сред представлены на научных конференциях и опубликованы в журналах.

1.1.4 Недостатки метода

a. Невозможность наблюдения структуры и окрашивания колонии в жидкой среде.

b. Если в процессе деконтаминации и ингибирования добавкой PANTA остается хотя бы одна живая контаминирующая бактерия, она может вызвать заражение всей среды. Контаминация может скрыть рост микобактерий.

c. Положительную культуру из клинической пробы невозможно соотнести с колониеобразующими единицами (КОЕ), присутствующими в пробе - иногда это используется для определения важной нетуберкулезной инфекции.

d. Пробирка MGIT, кажущаяся положительной, может содержать смесь культур более одного вида микобактерий. Микобактерии с более быстрым ростом могут вызвать положительную флуоресценцию раньше медленнорастущих микобактерий. Поэтому в случае признаков наличия более одного вида микобактерий в мазке на КУМ, взятом из культуры, большую роль играет субкультивирование положительной пробирки MGIT на агарной пластинке Мидлбрука.

e. Иногда высокая конечная рН пробы может вызвать ложную кратковременную флуоресценцию датчика.

f. Смесь антибиотиков PANTA, необходимая для подавления контаминирующих бактерий, может также оказывать ингибирующий эффект на некоторые виды микобактерий помимо комплекса M. tuberculosis. Подобное ингибирование различно у разных видов бактерий и происходит в рамках одного вида. Однако общее выделение нетуберкулезных бактерий достигается на более высоком уровне в жидкой среде, нежели в плотной.

1.1.5 Тесты на лекарственную чувствительность к препаратам первого ряда: стрептомицин, изониазид, рифампицин, этамбутол (SIRE)

Тесты на чувствительность к антибактериальным препаратам имеют исключительную важность для назначения эффективного лечения, особенно в случаях обнаружения лекарственной резистентности к противотуберкулезным препаратам. Они также важны для последующей коррекции антибактериальной терапии, в случае ее неэффективности.

Тест на чувствительность к препаратам - стрептомицину (S), изониазиду (I), рифампицину (R) и этамбутолу (E), сокращенно SIRE, проводимый при помощи прибора BACTEC MGIT 960, представляет собой быстрый и качественный метод определения чувствительности M. tuberculosis к четырем указанным лекарственным средствам в критически допустимых концентрациях. Кроме того, при необходимости можно проводить тесты с высокой концентрацией стрептомицина, изониазида и этамбутола.

1.1.5.1 Принципы проведения теста

Культуры, выделенные от пациентов, больных туберкулезом, выращиваются с добавлением известной концентрации тестового лекарственного препарата. Также используется контрольная пробирка без добавления лекарственного средства. Если изолят больного растет на контрольной пробирке, но не растет в среде с добавлением лекарственного препарата, он определяется как чувствительный к данному препарату. С другой стороны, если он растет в обеих пробирках, тем самым устанавливается его резистентность к указанному препарату.

Существуют несколько методов проведения теста на чувствительность, самый распространенный - метод пропорций. В таком методе резистентность для большинства лекарственных средств устанавливается на уровне 1 %. Это означает, что если общая тестируемая бактериальная популяция 1 % или более резистентна к лекарственному средству, она считается резистентной в клинических целях. На протяжении длительного времени в методе пропорций используется плотная агаровая среда Мидлбрук. После 3-4 недель инкубации для определения резистентности на среде, содержащей лекарственный препарат, подсчитывается процент колоний по сравнению со средой, в которой отсутствуют лекарственные препараты.

В 1980 г. был внедрен метод пропорции на основе бульона, известный под названием - радиометрический тест на чувствительность BACTEC 460 TB. В этом методе используется радиометрическая среда BACTEC 12B с субстратом класса C14.

Бактериальный инокулят в контрольном образце в 100 раз меньше инокулята в содержащей лекарственный препарат среде. CO₂, образующийся во время роста и метаболизма микобактерий в такой среде, измеряется и обозначается как индекс роста (Growth Index - GI). Как только GI в контрольном образце достигает значения 30 (обычно после 4-6 дней инкубации - максимум 1 2 дней), сравнение показателей GI в содержащей лекарственный препарат среде и не содержащей его является основой пропорции резистентности.

Тест на чувствительность с использованием BACTEC MGIT 960 был внедрен на основе аналогичных принципов, при этом увеличение флуоресценции в датчике измеряется автоматически и обозначается как значение роста (Growth Value - GV).

Если лекарственный препарат добавляется в среду, обладающую бактериостатическими или бактерицидными свойствами по отношению к тестируемым микобактериям, он ингибирует рост, таким образом, кислород поглощается либо в малых количествах, либо не поглощается совсем, поэтому отсутствует флуоресценция датчика. Результаты теста на лекарственную чувствительность, полученные при использовании системы BACTEC MGIT 960, идентичны данным, получаемым при помощи системы BACTEC 460TB, длительность исследования также примерно одинаковая. Концентрации лекарственных препаратов в тесте на чувствительность SIRE с использованием BACTEC MGIT 960 несколько ниже, чем в методе пропорций на плотной среде (во избежание ложных результатов чувствительности).

Тест на чувствительность BACTEC MGIT 960 был подвергнут детальной оценке путем сравнения со средой Мидлбрук 7H10, а также с системой BACTEC 460 TB System.

1.1.5.2 Тесты, применяемые при более высоких концентрациях лекарственных препаратов

Рекомендуется всегда тестировать лекарственные препараты ряда SIRE в критических концентрациях. Однако в некоторых ситуациях показано тестирование при более высокой концентрации. Оно играет роль для изолятов, имеющих низкий уровень резистентности, т.е. изолят проявляет резистентность при предельной концентрации, но чувствителен к высокой концентрации препарата. Поэтому во многих лабораториях сначала проводится тест при критической концентрации препарата, и в случае резистентности изолята он тестируется при высокой концентрации.

При высоких концентрациях тестируют только стрептомицин, изониазид и этамбутол. Из трех данных препаратов изониазид наиболее важен, поскольку врачи-клиницисты могут посчитать необходимым продолжить использование изониазида в терапевтическом режиме, если выделенная культура пациента резистентна при критической концентрации и чувствительна при высокой концентрации (т. н. "резистентность низкого уровня"). В продаже имеются указанные высокие концентрации стрептомицина, изониазида и этамбутола для BACTEC MGIT 960.

Конечная концентрация препарата в среде должна быть следующей:

стрептомицин 4,0 мг/мл среды

изониазид 0,4 мг/мл среды

этамбутол 7,5 мг/мл среды

1.1.5.3 Учет результатов

По завершении теста (4-21 день) на приборе появится сообщение о готовности результатов. Необходимо просканируйте штрих-код держателя и распечатать отчет. В распечатке прибора указаны результаты теста на чувствительность к каждому лекарственному препарату. Результаты имеют качественный характер: чувствительный (S),резистентный (R), либо результат теста не определен (X).

Прибор интерпретирует результаты, когда единица роста (GU) в контроле роста достигает значения 400 (в течение 4-13 дней). В этот момент оцениваются показатели единицы роста флакона с лекарственным препаратом.

S-чувствительный - единица роста пробирки с лекарственным препаратом составляет менее 100.

R-резистентный - единица роста пробирки с лекарственным препаратом составляет 100 и более.

X-ошибка - неясные результаты, получаемые при определенных обстоятельствах, которые могут повлиять на процедуру теста, например, при достижении единицей роста контрольного образца величины ?400 менее чем за 4 дня. В подобных случаях тест необходимо повторить с чистой, активнорастущей культурой, которая подтверждена как комплекс M. tuberculosis. Некоторые лекарственноустойчивые штаммы растут в среде очень медленно, и со стандартным инокулятом результаты могут быть не достигнуты в течение 13 дней. В таком случае необходимо также повторить исследование.

Глава 2. Материалы и методы исследования