Молекулярно-генетические методы в диагностике и дифференциальной диагностике туберкулеза

Размещено на http://www.allbest.ru

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

ГОМЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

Медико-диагностический факультет

Кафедра Фтизиопульмуналогии

Молекулярно-генетические методы в диагностике и дифференциальной диагностике туберкулеза.

Курсовая работа

Исполнитель Д-503 гр.

Гореньков Роман Юрьевич

Научный руководитель

асс. Бондаренко В.Н.

ГОМЕЛЬ 2011г.



Содержание

Перечень сокращений

Введение

Глава 1. Основы проведения метода ПЦР

1.1 основной принцип ПЦР

1.2 Осуществление рутинных методик ПЦР

Глава 2. ПЦР диагностика туберкулеза легких

2.1 Особенности метода

2.2 Забор материала

2.3 Предобработка проб

2.4 Условия хранения материала и предварительно обработанных проб

2.5 Условия транспортирования материала

2.6. Аналитический этап

2.7 Референтные значения

2.8 Постаналитический этап

Глава 3. ПЦР диагностика внелегочных форм туберкулеза

Глава 4. Роль метода ПЦР в дифференциальной диагностике различных заболеваний органов дыхания

Глава 5. Материалы и методы исследования

5.1 Материалы исследования Термоциклер

5.2 Методы исследования

5.2.1 Предварительная обработка мокроты

5.2.2 Подготовка пробирок и посев образца для автоматизированной системы BACTEC MGIT 960

5.2.3 Молекулярно-генетическое исследование для идентификации видов микобактерий из культурального материала

5.2.4 Молекулярно-генетическое исследование для определения устойчивости комплекса Mycobacterium tuberculosis к Рифампицину и/или Изониазиду

Заключение

Список литературы



Перечень сокращений

ПЦР - полимеразно-цепная реакция

МБТ - микобактерии туберкулеза

dNTP - дезоксинуклеозидтрифосфатов

PBS-буфер - натрий-фосфатный буфер

ОТБ - очаговый туберкулез легких



Введение

ДНК-диагностика - это один из наиболее современных высокотехнологичных методов исследования. ДНК-анализы широко применяются в диагностике инфекционных заболеваний, позволяя обнаруживать даже единичные микроорганизмы в организме человека.

ДНК-диагностика объединяет несколько методов исследования, самый распространенный из них - метод ПЦР (полимеразной цепной реакции, Polymerase chain reaction, PCR diagnostics) . На сегодняшний день ПЦР -анализ является одной из наиболее распространенных и динамично развивающихся технологий лабораторной диагностики. Ежегодно на рынке появляется все больше тест-систем, предназначенных для выявления как возбудителей различных заболеваний, так и мутаций генов человека, животных и растений. Количество ПЦР-лабораторий неуклонно увеличивается, а ПЦР-анализ становится все более востребованным среди специалистов и пациентов. Первоначально сам принцип метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) был разработан Кэри Мюллисом в 1983г. Открытие ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние 20 лет, и за разработку ПЦР-анализа Кэрри Мюллис уже в 1993 г. был удостоен Нобелевской премии в области химии [2]. Особое место метод ПЦР нашел в диагностике туберкулеза. Традиционные микробиологические методы выявления возбудителя не всегда позволяют подтвердить диагноз туберкулез. Метод люминесцентной бактериоскопии и посева на питательные среды обладают низкой чувствительностью и обнаруживают М.tuberculosis в среднем лишь у 50-60% больных активным туберкулезом легких. В связи с этим внедрение в практику новых молекулярно-генетических методов исследования способствует проведению диагностики туберкулеза в максимально короткие сроки и с наибольшей чувствительностью.



Глава 1. Основы проведения метода ПЦР

1.1 Основной принцип ПЦР

Любой метод ДНК-диагностики основан на специфической гибридизации двух нитей ДНК, комплементарных (структурно дополняющих) одна другой. Примерной (хотя и весьма приблизительной) аналогией может служить серологическая реакция, основанная на специфической реакции белка-антитела с соответствующим антигеном. Специфичность связывания нитей в спирали ДНК основана на связях А-Т и Г-Ц. Праймеры комплементарны искомым участкам ДНК, и поэтому они способны связываться с конкретными участками гена. Достройка нитей ДНК, начиная с добавленных праймеров, требует наличия в реакционной смеси пурин-и пиримидинтрифосфатов (АТФ, ТТФ, ГТФ и ЦТФ), а также присутствия ДНК-полимеразы, которая соединяет их в цепочку согласно последовательности второй нити ДНК [3].

1.2 Осуществление рутинных методик ПЦР

Исследуемым материалом для ПЦР могут служить соскобы эпителиальных клеток, кровь, плазма, сыворотка, плевральная и спинномозговая жидкости, околоплодная, суставная жидкость, бронхоальвеолярный лаваж, сок простаты, слюна, моча, мокрота, слизь и другие биологические выделения, биоптаты.

Забор материала производится в условиях процедурного кабинета соответствующего профиля. После забора пробы как можно скорее должны быть доставлены в ПЦР-диагностическую лабораторию.

Забор образцов необходимо производить при помощи стерильного, желательно одноразового, инструментария только в одноразовые стерильные пластиковые пробирки или в стеклянные пробирки, предварительно обработанные в течение часа хромовой смесью, тщательно промытые дистиллированной водой и прокаленные в сушильном шкафу при температуре 150 °С в течение 1 часа.

1. Выделение ДНК из клинического образца производится любым способом. Основное требование - достаточно стандартный выход продукта и интактность, сохранение двухнитевой структуры.

Проведению ПЦР предшествует стадия выделения и преципитации ДНК из исследуемого материала. Это обеспечивает концентрирование обнаруживаемой ДНК инфекционного агента в минимальном объеме жидкости, используемой в ПЦР. В случаях, когда не требуется достижения высокой чувствительности анализа, например, при идентификации МБТ после первичного культивирования, достаточна их обработка, позволяющая лишь разрушить микробную стенку: нагревание в лизирующем буфере, ультразвуковая обработка или использование ферментов (лизоцим) без последующего выделения ДНК.

При отсутствии в пробе ингибиторов Taq-полимеразы (гемоглобина или других) и наличия десятка копий ДНК-матрицы в объеме, вносимом в пробирку со смесью всех реагентов ПЦР, подготовка пробы может быть полностью исключена. Например, вирус гепатита В в сыворотке крови и многие возбудители инфекционных менингитов в спинномозговой жидкости можно детектировать методом ПЦР без всякой подготовки, без предварительного выделения из них ДНК. В большинстве случаев из исследуемой пробы крови, сыворотки, лейкоцитов, биоптатов, мочи, мокроты для исключения ложноотрицательного результата следует выделить ДНК тем или иным способом [1]. Благодаря этому происходит концентрирование исследуемой ДНК-матрицы в малом объеме и удаление ингибиторов Taq-полимеразы.

В настоящее время используется несколько способов подготовки образца для проведения ПЦР. Процедура подготовки пробы включает лизис микроорганизма и экстракцию нуклеиновой кислоты. С целью разрушения клетки используют простое кипячение, замораживание-оттаивание в присутствии лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты и протеиназу. Выбор метода диктуется природой микроорганизма, а точнее - природой его клеточной стенки.

Для экстракции ДНК используют два основных метода. Во-первых, применяют классическую процедуру фенольно-хлороформной экстракции. При этом достигается хорошая очистка ДНК и, в первую очередь, от ингибиторов Taq-полимеразы, но неизбежны большие потери нуклеиновой кислоты, особенно заметные при работе с образцами небольшого объема с низкой концентрацией инфекционного агента. Другой способ, применяемый для очистки нуклеиновой кислоты, основан на использовании сорбентов. Подготовка материала с его использованием занимает меньше времени и более проста в исполнении, хотя не всегда может быть применена, так как не гарантирует удаление возможных ингибиторов.

2. Амплификация. Полимеразная цепная реакция ДНК проводится в специальном приборе (термоциклере или амплификаторе), который, согласно введенной программе, изменяет температуру в рабочих ячейках, держит ее в течение заданного времени и переходит к следующему этапу.

Каждый цикл ПЦР обычно состоит из трех температурных режимов.

а) Нагрев до 95 °С в течение 30-40 сек. При этом выделенные молекулы ДНК подвергаются денатурации, т. е. происходит разделение ДНК на две нити. полимеразный туберкулез микобактерия легкие

б) Охлаждение до оптимальной температуры (обычно 48-66 °С). При этом разделенные нити ДНК могут обратно воссоединиться по комплементарным участкам. Однако, при наличии в образце целевых участков ДНК, синтетические ДНК-зонды (праймеры, длиной 15-30 п.н.) специфически связываются (гибридизуются) с комплементарными участками ДНК, например хламидии или герпесвируса. Тем самым ограничиваются искомые участки генов, определяя точки начала и окончания предполагаемого продукта ПЦР. Время отжига 20-60 сек.

в) После завершения гибридизации праймеров с искомыми участками ДНК, температуру смеси повышают до 72 °С. Эта температура оптимальна для фермента Таq ДНК-полимеразы, которая начинает быстро достраивать одну и другую цепочку ПЦР-продукта, начиная с места фиксации, соответственно, одного и второго ДНК-зонда. Этот процесс называется элонгацией (т. е. удлинением) ПЦР-продукта, сами же продукты ПЦР именуют ампликонами. Время протекания синтеза - 20-40 сек.

При первом цикле ПЦР получается некоторое число ампликонов различной длины, которые служат субстратом во втором цикле реакции, где количество специфических продуктов удваивается еще раз. В каждом из последующих циклов (всего до 35-40) происходит двукратное возрастание числа целевых продуктов ПЦР-ампликонов.

Специфичность ПЦР и количество амплифицируемой ДНК, которое определяет чувствительность, могут значительно варьировать в зависимости от концентрации и качества 5 основных компонентов реакционной смеси (ДНК-матрицы, Taq-полимеразы, праймеров, дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP) и ионов Mg) и температурного режима ПЦР.

Даже при оптимальных концентрациях фермента, ионов Mg, праймеров и dNTP специфичность и чувствительность ПЦР очень сильно зависит от температуры отжига праймеров (2-я стадия цикла ПЦР): неспецифичность ПЦР-амплификации повышается при снижении температуры отжига ниже оптимальной и при повышении концентраций праймеров и dNTP выше оптимальных, а при повышении температуры отжига выше оптимальной снижается выход специфической амплифицируемой ДНК вплоть до ее полного исчезновения.

3. Детекция.

Способы учета результатов ПЦР:

Качественная оценка (электрофоретический метод)

Во многих случаях при ПЦР-диагностике достаточно получить ответ "да" или "нет", как, например, при первичном выявлении инфекционных возбудителей, судебно-медицинских исследованиях, определении генных мутаций, специфических онкогенов и др. Обычным способом разделения продуктов ПЦР и идентификации специфического гена является электрофорез в агарозном или (реже) полиакриламидном геле. Методики электрофоретического разделения достаточно стандартизированы и дают вполне воспроизводимые результаты. Результат должен быть безусловно отрицательным в контроле без изучаемой ДНК и положительным - в пробе с ДНК, содержащей искомый участок гена. Положительный контроль может представлять собой целевую ДНК или участок гена, клонированный в плазмиде или амплифицированный с помощью ПЦР

Для учета результатов качественной ПЦР может быть использован и метод флуоресцентной детекции. Для этого по окончании ПЦР определяют наличие или отсутствие специфического сигнала с помощью специальных флуориметров (так называемый flash-метод). Поскольку здесь нет необходимости и в электрофоретическом оборудовании, то очевидна существенная экономия рабочих зон и реагентов для лаборатории.

Методы учета результатов ПЦР без применения электрофореза наиболее уместны и выгодны для многопрофильных лабораторий, где ПЦР-методы составляют лишь некоторую часть общего производственного процесса.

В таких крупных лабораториях часто определяется лишь ограниченный круг наиболее востребованных микроорганизмов. На медицинских рынках предлагается целый ряд flash-наборов для диагностики заболеваний, передающихся половым путем, и ряда вирусных инфекций. Этот ассортимент патогенов вполне достаточен для многих больничных лабораторий, и они могут с начала своей деятельности сделать акцент на подобных методах анализа.[4]

Количественная оценка результатов ПЦР

В ряде клинических ситуаций возникает вопрос о динамике патологического процесса и/или эффективности проводимой терапии. Эти вопросы наиболее актуальны при обследовании пациентов с хроническими инфекциями (гепатиты В и С, МБТ, вирус иммунодефицита человека и др.). При диагностике исходят из того, что накопление продуктов ПЦР (ампликонов) пропорционально содержанию копий искомого гена в исследуемой пробе.

Естественно, учет результатов количественной ПЦР можно проводить и с помощью гель-электрофореза с анализом интенсивности специфических сигналов ПЦР. Обязательным условием правильной количественной оценки результатов ПЦР являются надежные положительные контрольные пробы с известным содержанием копий искомого гена (например, 1000 копий гена МБТ на одну ПЦР-реакцию). Ряд последовательных разведений количественного контроля дает возможность построить калибровочные кривые, по которым можно оценивать содержание генокопий в клинических образцах .

Ключевым достижением в проведении количественной ПЦР стала разработка флуоресцентных ДНК-зондов, которые добавляются в реакционную смесь наряду с "обычными" праимерами и дают возможность отслеживания хода ПЦР во времени (так называемая real-timе-ПЦР), которая в 1993-1994 гг. была внедрена в соответствующих приборах и диагностических системах (принцип ТаqМаn). Существует еще несколько методов конструирования ДНК-зондов для количественной ПЦР.

Методология ТаqМаn предусматривает синтез флуоресцентных ДНК-зондов, специфичных к средней части ампликона (между праймерами) и имеющих на концах две метки. Одна из них - флуоресцентная молекула, другая - молекула-гаситель этой флуоресценции. Таq-полимераза в ходе ПЦР не только достраивает нуклеотидную цепочку, но и разрушает связанный флуоресцентный зонд. При этом флуоресцирующая метка выходит в свободное состояние, освобождаясь от влияния гасителя. Поэтому интенсивность флуоресценции по мере амплификации продуктов ПЦР возрастает пропорционально числу ампликонов и, соответственно, числу копий исходной ДНК. Специальный прибор, являющийся гибридом термоблока-амплификатора и флуориметра, осуществляет регулярные замеры флуоресценции в каждой пробирке (принцип real-time-ПЦР). В результате после 20-40 циклов ПЦР для каждого образца получают индивидуальные кривые. По калибровочным кривым с контрольными образцами возможно вычислить, сколько копий искомого гена содержится в изучаемом образце.

Важная особенность проведения ПЦР флуоресцентным методом состоит в том, что пробирки с ПЦР-смесью не нужно открывать при учете результатов. Благодаря этому уменьшается вероятность загрязнения помещений продуктами амплификации и отпадает необходимость в выделении специальных рабочих зон для проведения электрофореза.[5]



Глава 2. ПЦР диагностика туберкулеза легких

2.1 Особенности метода

Высокая специфичность

Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов в отличие от метода иммуноферментного анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами. ПЦР аналогична росту бактерий на искусственных питательных средах (процессу биологической амплификации), при которой одна микробная клетка, образуя видимую колонию, амплифицируется в 10⁵-10⁶ раз, давая возможность определить свойства бактерии, манипулируя уже с целой колонией. Как и питательные среды, которые могут быть селективными, поддерживающими рост только одного микроорганизма, или обогатительными, дающими возможность размножаться широкому кругу микроорганизмов, так и праймеры, определяющие специфичность ПЦР, могут быть строго видоспецифичными или с их помощью можно выявить целые рода или семейства микроорганизмов.

Высокая чувствительность.

Метод ПЦР обладает высокой чувствительностью, дающей возможность обнаружить единичные бактериальные клетки. Но это преимущество ПЦР уместно рассматривать при сравнении с другими молекулярно-генетическими или иммунологическими методами диагностики. Использование ПЦР позволяет определять инфекционный агент непосредственно в биологическом материале с исключительно высокой чувствительностью - порядка 1-10 микроорганизмов при высокой специфичности, обеспечиваемой последовательностью нуклеотидов синтезируемого фрагмента ДНК.

Однако высочайшая чувствительность ПЦР обычно достигается при работе с чистой культурой микроорганизма или, что еще лучше, с очищенной нуклеиновой кислотой. Эта чувствительность автоматически не трансформируется в чувствительность метода при работе с клиническим материалом. На успех определения при работе с этим материалам влияют такие факторы, как методика приготовления образца, возможное присутствие ингибитора фермента, осуществляющего амплификацию, объем образца при низких концентрациях тестируемых молекул.

 Высокая скорость получения результата анализа

Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, занимающее большое количество времени. Унифицированный метод обработки материала и детекции продуктов реакции, автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-4,5 часа. Этим он выгодно отличается от других лабораторных методов, которые дают замедленные результаты[4].

2.2 Забор материала

Забор материала осуществляют в количестве не менее 0,5 мл в одноразовые градуированные стерильные флаконы (пробирки) с широким горлом и завинчивающимися крышками объемом не менее 50 мл. Для предотвращения попадания пищи в мокроту, перед сбором мокроты нужно прополоскать рот.

Мокроту желательно собирать до приема пищи. Собирают мокроту, отделяющуюся при кашле, а не при отхаркивании.



2.3 Предобработка проб

Перед выделением нуклеиновых кислот необходимо провести разжижение мокроты, используя раствор «Муколизин». В емкость с мокротой добавляют «Муколизин» в соотношении 5:1 (5 частей «Муколизина» к 1 части мокроты), ориентируясь по градуировке емкости. В процессе разжижения мокроты (20-30 мин) емкость периодически встряхивают. Затем автоматической пипеткой, используя наконечник с фильтром, отбирают 1 мл разжиженной мокроты, помещают в пробирку с завинчивающейся крышкой или в микроцентрифужную пробирку с защелкой на 1,5 мл и центрифугируют при 5-7 тыс. g (8-10 тыс об./мин. на центрифуге) в течение 10 мин. В случае исследования на бактериальные агенты полностью удаляют надосадочную жидкость с помощью вакуумного отсасывателя с колбой-ловушкой, осадок ресуспендируют в PBS-буфере, доведя общий объем пробы до 0,1 мл[3].

2.4 Условия хранения материала и предварительно обработанных проб

· при температуре 2-8°С - в течение 1 суток;

· при температуре минус 20°С - в течение 1 недели;

· при температуре минус 70°С - длительно.

Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.

2.5 Условия транспортирования материала

Транспортирование клинического материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:

· при температуре 2-8°С - в течение 6 часов;

· в замороженном виде - в течение 1 суток.

2.6 Аналитический этап

ПЦР - диагностика туберкулеза как правило строится на использовании последовательностей ДНК специфичных для всех 4 видов группы туберкулеза. Часто для этих целей используют праймеры для выявления последовательностей IS-элементов, например, IS-986 или IS-6110, поскольку данные мигрирующие элементы характерны только для видов микобактерий группы туберкулеза и присутствуют в геноме микобактерий в числе нескольких копий. Выделение ДНК из чистых культур и клинических образцов (мокроты больных) возможно осуществлять любым приемлемым методом, например, методом Boom с использованием лизирующего буфера на основе гуанидина тиоционата и двуокиси кремния в качестве носителя ДНК.

В качестве примера праймеров для идентификации микобактерий группы туберкулеза можно привести праймеры, фланкирующие фрагмент размером 245 нп мигрирующего элемента IS-986, содержащегося в геноме M.tuberculosis в числе 2-8- копий. Последовательность праймеров:

INS1 5' - CGT GAG GGC ATC GAG GTG GC - 3'

INS2 5' - GCG TAG GCG TCG GTG ACA AA - 3'

Амплифицированный фрагмент выявляют электрофорезом в 1,6 % агарозном геле.

Данная пара праймеров была проверена на специфичность с использованием в качестве контроля 100 нг/проба ДНК близкородственных микроорганизмов; ДНК возбудителей легочных, заболеваний; ДНК микроорганизмов, входящих в нормальную микрофлору человека (например, E.coli, S.aureus и др.); образцов ДНК человека.

Испытания данной пары праймеров с параллельным бактериоскопическим и культуральным обследоваванием были проведены на клинических образцах мокроты, полученных от больных с различными клиническими формами туберкулеза. Методом ПЦР возбудитель был выявлен у 90,6% больных туберкулезом, в то время как значительно более длительными по времени микробиологическими методами микобактерии были выявлены только у 21 (39,6%) больного.[8]

2.7 Референтные значения

В норме микобактерии туберкулеза в мокроте не выявляются.

2.8 Постаналитический этап

Выдача результата выдается в виде либо положительного, либо отрицательного ответа.



Глава 3. ПЦР диагностика внелегочных форм туберкулеза

Туберкулез поражает практически любой орган. По локализации различают: костно-суставный (встречается у 47 % всех больных внелегочным туберкулезом); мочеполовых органов (37 %); глаз (5,5 %); мозговых оболочек (менингит -- 4 %); лимфатических узлов (2,5 %); брюшины (1,5 %); кожи (1,5%). 

Совсем редко встречается туберкулез других органов: перикарда, надпочечников, кишечника и т.д. Внелегочными формами туберкулеза чаще болеют взрослые (79 %) и реже -- дети и подростки (соответственно 16 % и 5%). 

Независимо от места поражения цикл воспаления везде одинаков: очаг (гранулема) -- расплавление его (казеоз) -- образование полости распада (каверна) -- возникновение при санировании фиброза (склерозирование). Начальные проявления заболевания при минимальных поражениях дают картину интоксикации организма. По мере распространения процесса его симптоматика зависит от нарушений, присущих пораженному органу. 

Рекомендуемый для исследования материал:

- при гинекологическом туберкулезе - ткань эндометрия или биоптаты маточных труб;

- при туберкулезе костей у детей - фрагменты костей;

- при туберкулезе костей у взрослых - гной, некротические массы;

- при туберкулезе суставов - параллельное исследование синовиальной жидкости и синовиальной оболочки.

- при туберкулезном менингите - менингеальная жидкость

При других внелегочных локализациях туберкулеза - биоптаты из очагов поражения (слизистая кишечника, биоптат надпочечников и т.д.).

Подготовка образцов послеоперационного и биопсийного материала к ПЦР-анализу.

Из твердых клинических образцов, отобранных для анализа методом ПЦР, отделяют по два фрагмента, так, чтобы в случае разнородности материала (фрагмент кости - грануляции, ткань почки - гной) в исследуемые фрагменты попали все типы материала. Отделенные фрагменты подвергают щелочному лизису. К 0.05 куб. см тщательно растертого стеклянной палочкой образца приливают 0.11 мл раствора, содержащего 0.1М NaOH, 1М NaCl и 0.5% додецилсульфата натрия, тщательно встряхивают и инкубируют 10 мин. на кипящей водяной бане. После охлаждения до комнатной температуры ДНК из образцов костей и суставов выделяют методом сорбции на диатомовой земле в присутствии солей гуанидина с предварительным осаждением изопропанолом.

Из образцов ткани (ткань почки, эндометрий, биоптаты маточных труб) ДНК для ПЦР после щелочного лизиса выделяют следующим образом. К каждому образцу добавляют по 900 мкл раствора, содержащего 6М роданистый гуанидин, 2% Triton Х-100 и 0.05М ЭДТА и по 10 мкл суспензии сорбента (диатомовой земли). Инкубируют 20 мин. при комнатной температуре, периодически встряхивая, затем центрифугируют 15 сек. при 10000g. Дважды проводят отмывку 0.5 мл 4М роданистого гуанидина[5]. Однократно проводят отмывку 1 мл изопропанола. Дважды проводят отмывку 70.0% этанолом и однократно - ацетоном. При проведении отмывок после добавления отмывочного реагента образцы интенсивно встряхивают и центрифугируют 15 сек. при 10000g, после чего супернатант аккуратно отсасывают или сливают. В случае, если после отмывки каким-либо из отмывочных реагентов супернатант имеет выраженную окраску, повторяют отмывку этим реагентом. После последней отмывки осадок подсушивают с открытой крышкой 5-10 мин. при 50 град. C, а затем ДНК элюируют с сорбента ТЕ-буфером (встряхивают с 50 мкл буфера и инкубируют 10 мин. с закрытой крышкой при 50 град. C) и центрифугируют 15 сек. при 10000g. Супернатант отбирают, стараясь не захватывать частицы осадка диатомовой земли, и используют для проведения ПЦР. ПЦР проводят параллельно с двумя фрагментами каждого образца.

Синовиальную жидкость от одного больного разливают по микроцентрифужным пробиркам в объеме 1.5 мл и центрифугируют 5 мин. при 10000g. Супернатант сливают. В случае если объем осадка составляет менее 20 мкл, объединяют осадки из нескольких центрифужных пробирок. Осадки инактивируют нагреванием, для чего к ним добавляют 100 мкл физиологического раствора и инкубируют 15 мин. на кипящей водяной бане. Далее ДНК выделяют так же, как из образцов тканей, и используют для проведения ПЦР.

Чувствительность и специфичность метода ПЦР для диагностики внелегочного туберкулеза ничуть не отличается от легочного туберкулеза. Можно сказать, что независимо от формы туберкулеза эффективность ПЦР диагностики остается самой высокой.



Глава 4. Роль метода ПЦР в дифференциальной диагностике различных заболеваний органов дыхания.

Заболеваний органов дыхания существует огромное количество, но мы разберем лишь часть из них, как показательный пример роли метода ПЦР в их дифференциальной диагностике с туберкулезом легких.

Таблица №1 Основные дифференциально-диагностические признаки ОТБ и сходных заболеваний.

Признаки	Пневмония	Доброкачест- венные опухоли	Пери-фери-ческий рак	Метаста- тичес-кий рак	Очаговый туберкулез
Начало заболевания	Острое	Бессимптомное
Характерные данные анамнеза	Контакт по ОРВИ, простуда, пневмония	Нет	Приз-наки основ-ной опухоли	Контакт с ТБ или «рентгено-архив» по ТБ
Влажные хрипы в легких	Часто	Нет	Редко
Изменения гемограммы	Имеются	Нет	Выражены (анемия, ^СОЭ) при значительном прогрессировании,	Чаще отсут-ствуют
Бактериоло-гия мокроты	Бактериаль-ная патогенная флора	Обычно сапрофитная флора	У 10-15% больных -МБТ(+)
Цитология мокроты	-	-	Иногда атипичные клетки	-
Бронхо-скопия	Катараль-ный эндобранхит	-	Возможно опухолевое поражение бронхов	У 20-30% ТБ бронхов
Локализа-ция теней	Чаще средние и нижние отделы	Нет строгой локализации, при периферическом раке, чаще средние и нижние отделы	Верхушка легкого
Контуры тени	Нечеткие	Четкие	Лучистые	Четкие
Вовлечение корня легкого	Иногда	Нет	Возможно, но редко	Редко
Динамика	Быстрое исчезновение теней	Отсут-ствие	Удвоение за полгода	Возможны новые тени	Обычно незначительная
ПЦР диагностика на МБТ	-	-	-	-	Положительна в 90-95%

Основываясь на данные таблицы №1 можно сказать, что для дифференциальной диагностики органов дыхания нужно учитывать множество факторов, но метод ПЦР ставит окончательную «жирную точку» на постановке диагноза туберкулеза. Единственным значительным минусом этого метода является его дороговизна.

DNA-STRIP технология

Принцип метода

На ДНК-стрипы нанесены специфические пробы, которые комплементарны амплифицируемым нуклеиновым кислотам (ампликонам). После денатурации одноцепочечные ампликоны специфически связываются с пробами на стрипах (гибридизация) и затем визуализируются в последовательной энзиматической реакции (со стрептавидином и щелочной фосфатазой).

Молекулярно-генетическое исследование для идентификации видо микобактерий из культурального материала

Методология

Тест GenoType Mycobacterium AS (Additional Species) основан на технологии DNA*STRIP® и обеспечивает идентификацию следующих

видов бактерий: M. simiae, M. mucogenicum, M. goodii, M. celatum, M. smegmatis, M. genavense, M. lentiflavum, M. heckeshornense,

M. szulgai/M. intermedium, M. phlei, M. haemophilum, M. kansasii, M. ulcerans, M. gastri, M. asiaticum, и M. shimoidei.

Процедура проведения теста подразделяется на три этапа: Выделение ДНК из культур (выросших на плотной или жидкой среде; необходимые для этого реагенты в наборе не поставляются), мультиплексная амплификация с биотинилированными праймерами (необходимая термостабильная ДНК полимераза не поставляется), реверс-гибридизация. Гибридизация включает следующие этапы: химическая денатурация продуктов амплификации, гибридизация одноцепочечных ампликонов, меченых биотином, на мембраносвязанных зондах, тщательная отмывка, добавление конъюгата стрептовидина/щелочной фосфатазы (АР) и опосредованная щелочной фосфатазой, реакция окрашивания. Простая и быстрая оценка полученных результатов проводится с помощью прилагаемого шаблона.

Оценка и интерпретация результатов

Подклеиваются стрипы и храняися в защищенном от света месте. Эталон для оценки поставляется в наборе. При использовании этого эталона оценки, наклеивается окрашенные стрипы в предназначенные для этого поля, причем полоски СС и UC должны совпадать с соответствующими линиями на эталоне. Отмечаются положительные сигналы в предпоследней колонке, определяется вид при помощи таблицы интерпретации и записывается название вида в последней колонке. Поставляемый шаблон так же предназначен для оценки результатов и должен совпадать с полосками стрипов СС и UС. На каждом стрипе всего 17 зон реакции

Контроль коньюгата (CC)

Линия в этой зоне должна быть хорошо проявлена, подтверждая эффективность связывания коньюгата и правильность субстратной реакции

Универсальный Контроль (UC)

Эта зона улавливает все известные микобактерии и представителей группы грам-положительных бактерий с высоким содержание G+C. Если эта зона и зона Контроля Конъюгата становятся положительными, но остальные полоски не указывают на специфическую микобактерию, для идентификации соответствующего вида бактерии нужны дополнительные методы.

Учитываются только те полоски, интенсивность которых такая же или выше, чем у зоны Универсального Контроля.

Контроль Рода (GC)

Окрашивание этой зоны документирует присутствие представителя рода Mycobacterium. Интенсивность этой полоски варьирует в зависимости от вида микобактерии. Полоска Контроля Рода может выпасть, несмотря на присутствие микобактериальной ДНК; если специфическая полоска присутствует, реакция амплификации проведена правильно, результат теста действителен.

Другие полоски

Специфические пробы для оценки смотрите в таблице интерпретации.

Не все полоски на стрипе могут показывать одинаковую силу сигнала.

Если нет видоспецифичных полосок, область показывающая присутствие грам-положительных бактерий с высоким содержанием G+C, в редких случаях происходящих от микобактерий, которые нельзя определить на этом наборе и для идентификации соответствующих видов бактерий нужно использовать дополнительные методы. Если добавить слишком большое количество ампликонов, можно получить дополнительные полосы

Молекулярно-генетическое исследование для определения устойчивости комплекса Mycobacterium tuberculosis к Рифампицину и /или Изониазиду

Методология

Тест GenoType® MTBDRplus основан на DNA*STRIP®-технологии и позволяет проведение молекулярно-генетической идентификации комплекса Mycobacterium tuberculosis и его устойчивости к Рифампицину и /или Изониазиду в культивированных образцах или в положительных клинических образцах мокроты. Определение устойчивости к рифампицину возможно при детекции наиболее значимых мутаций гена rpoB, (кодирующего бета субъединицу РНК полимеразы). Для определения высокого уровня устойчивости к изониазиду, исследуют ген katG, (кодирующий каталазу пероксидазу) и для определения низкого уровня устойчивости к изониазиду, изучается область промотора в гене inhA (кодирующего NADH эноил ACP редуктазу). Процедура проведения теста подразделяется на три этапа: выделение ДНК из культивированного материала (плотная/жидкая среда) или из клинических образцов (отделяемое лёгких, деконтаминированные положительные образцы мокроты) - необходимые реагенты не поставляются, мультиплексная амплификация с биотинилированными праймерами (необходимая термостабильная ДНК полимераза не поставляется), реверс-гибридизация. Гибридизация включает следующие этапы: химическая денатурация продуктов амплификации, гибридизация одноцепочечных ампликонов, меченых биотином, на мембраносвязанных зондах, тщательная отмывка, добавление конъюгата стрептовидина/щелочной фосфатазы (АР) и опосредованная щелочной фосфатазой, реакция окрашивания. Простая и быстрая оценка полученных результатов проводится с помощью прилагаемого шаблона.

Оценка и интерпретация результатов

Подклейте стрипы и храните в защищенном от света месте. Эталон для оценки поставляется в наборе. При использовании этого эталона оценки, наклейте окрашенные стрипы в предназначенные для этого поля, причем полоски СС и AC должны совпадать с соответствующми линиями на эталоне. Определите степень устойчивости и сделайте пометку в соответствующей колонке; некоторые примеры интерпретации полученных результатов приведены в следующей главе. Поставляемый шаблон так же предназначен для оценки результатов и должен совпадать с полосками стрипов СС и АС. На каждом стрипе всего 27 зон реакции



Не все полоски на стрипе могут показывать одинаковую силу сигнала.

Контроль коньюгата (CC)

Линия в этой зоне должна быть хорошо проявлена, подтверждая эффективность связывания коньюгата и правильность субстратной реакции

Зона Контроля Амплификации (AC)

Если тест выполнен правильно, контроль ампликонов, свяжется с Зоной Контроля Амплификации на стрипе. Таким образом, если эта полоска развилась, то можно исключить ошибку во время выделения и проведения амплификации или воздействие ингибиторов амплификации. В случае положительного результата тестирования, сигнал в зоне Контроля Амплификации может быть слабым или совсем невидимым. Это может быть вызвано конкурентными реакциями во время амплификации. Тем не менее, в этом случае, реакция амплификации считается выполненной успешно и не требует повторения. Отсутствие полоски АС в случае отрицательного результата, указывает на ошибку во время проведения амплификации или влияние ингибиторов амплификации. В этом случае результаты тестирования недействительны и необходимо повторное тестирование соответствующего образца.

Комплекс M. tuberculosis (TUB)

Эта зона реакции гибридизируется с ампликонами, полученными от всех представителей комплекса Mycobacterium tuberculosis. Если зона TUB отрицательная, это означает, что выделенные бактерии не принадлежат к комплексу M. tuberculosis и не могу быть диагностированы данной тест- системой.

Контроли локусов (rpoB, katG, and inhA)

Зоны Контроля Локусов улавливают специфичные для каждого локуса участки генов и должны всегда показывать положительный сигнал.

Пробы дикого типа

Пробы дикого типа охватывают важнейшие участки устойчивости каждого гена. Если все пробы дикого типа одного гена показывают положительный сигнал, значит, не зафиксировано ни одной мутации в нуклеотидной последовательности. Следовательно, штамм чувствителен к соответствующим антибиотикам. В случае мутации, определённые ампликоны не могут связаться с соответствующими пробами диких типов. Отсутствие сигнала хотя бы в одной пробе дикого типа указывает на устойчивость тестируемого штамма к соответствующему антибиотику. Во внимание должны приниматься только полоски с интенсивностью равносильной или большей, чем полоска Контроля амплификации (АС). Каждый образец полоски, отличный от образца полоски дикого типа указывает на устойчивость тестируемого штамма. Полоска, проявившаяся в зоне гена rpoB говорит об устойчивости к рифампицину, полоска в зоне гена katG позволяет сделать выводы о высоком уровне устойчивости к изониазиду. И полоска в пробе inhA соответственно свидетельствует о низком уровне устойчивости исследуемого штамма к изониазиду.

Мутантные пробы

Мутантные пробы выявляют наиболее часто встречаемые мутации, вызывающие устойчивость. (см. Таб. 1, 2 и 3). В сравнении с другими пробами, положительные сигналы в мутантных пробах rpoB MUT2A и MUT2B могут проявлять сигнал меньшей интенсивности. Только полоски с интенсивностью сигнала такой же или более интенсивной, чем в зоне Контроля Амплификации (АС), могут приниматься во внимание. Каждая полоска, отличающаяся от полосок дикого типа, указывает на устойчивость тестируемого штамма. Образцовая полоска появившаяся в пробе rpoB, позволяет сделать вывод об устойчивости исследуемого штамма к рифампицину, появление полоски katG -о высоком уровне устойчивости и полоска inhA - соответственно о низкой устойчивости к изониазиду.



Глава 5. Материалы и методы исследования

Работа проводилась на базе бактериологической лаборатории Гомельской областной туберкулёзной клинической больницы (ГОТКБ).

5.1 Материалы исследования Термоциклер

Термошейкер

5.2 Методы исследования

5.2.1 Предварительная обработка мокроты

Обработка мокроты 10% раствором трехзамещенного фосфорнокислого натрия

Трехзамещенный фосфорнокислый натрий (Na₃PO₄) хорошо подавляет сопутствующую флору и даже при 2-3-х-дневном хранении материала при +4°С не повреждает микобактерии и мало влияет на их способность к росту на питательных средах.

Обработку материала 10% раствором трехзамещенного фосфорнокислого натрия производят следующим образом:

Исследуемый материал, находящийся в стерильном флаконе, заливают равным объемом 10% трехзамещенного фосфата натрия и помещают на 10 мин во встряхиватель, затем на 18-20 часов - в термостат при 37°C. После этого материал центрифугируют при 3000g в течение 15 минут. При указанном режиме происходит осаждение 95% присутствующих в материале микобактерий.

Надосадочную жидкость отбирают, осадок отмывают 10-15 мл изотонического раствора NaCl или дистиллированной воды.

Супернатант удаляют, а осадок в объеме 0,8-1,0 мл засевают на питательную среду с параллельным приготовлением мазка.

Обработка с использованием N-ацетил-l-цистеина и гидроокиси натрия (NALC-NаOH).

Применение муколитического препарата N-ацетил-L-цистеина (NALC), используемого для быстрого разжижения мокроты, позволяет снизить концентрацию деконтаминирующего вещества (NaOH) до конечной концентрации 1% при смешивании с пробой. Этот метод повышает высеваемость микобактерий, однако требует больше затрат времени и средств. Ацетилцистеин в растворе быстро теряет активность, поэтому раствор нужно готовить ежедневно. Цитрат натрия включен в литическую смесь для связывания ионов тяжелых металлов, которые могут присутствовать в пробе и инактивировать действие N-ацетил-L-цистеина.

Обработку материала NALC-NаOH производят следующим образом:

К 10 мл или меньше диагностического материала добавляют равный объем раствора NALC-NаOH, встряхивают в течение 10-20 секунд для перемешивания пробы, затем оставляют на 15 минут при комнатной температуре. Если необходима более эффективная деконтаминация, можно повысить концентрацию NaOH до 5-6%, не увеличивая время экспозиции пробы с деконтаминирующим раствором.

После 15-минутной экспозиции доводят объем пробы до 50 мл дистиллированной водой, перемешивают и центрифугируют при 3000g в течение 15 мин. Надосадочную жидкость отбирают. Осадок немедленно засевают на питательную среду с параллельным приготовлением мазка.

5.2.2 Подготовка пробирок и посев образца для автоматизированной системы BACTEC MGIT 960

Пробирка MGIT 960 содержит модифицированную бульонную основу 7H9.Примерная формула содержит следующие компоненты на 1000 мл дистиллированной воды:

- модифицированная бульонная основа Мидлбрук 7H9 - 5,9 г

- казеиновый пептон - 1 ,25 г.

Формула корректируется с возможным внесением добавок в зависимости от функциональных требований. На дне пробирки имеется помещенный в силикон флуоресцентный датчик. Пробирку во время наполнения промывают 10% CO₂, затем закрывают полипропиленовой завинчивающейся крышкой. Крышку открывать следует только в случае необходимости внесения каких-либо веществ в среду.

Для системы BACTEC MGIT 960 предусмотрена ростовая добавка MGIT(MGIT Growth Supplement. Добавку необходимо добавлять в пробирку MGIT до инокуляции пробы. В состав ростовой добавки MGIT на 1 000 мл дистиллированной воды входят:

-бычий альбумин 50,0 г

-декстроза 20,0 г

-каталаза 0,03 г

-олеиновая кислота 0,1 г

-полиоксиэтилена стеарат 1,1 г

Для снижения риска контаминации используется смесь антибиотиков PANTA, которая вносится в пробирку MGIT до инокуляции проб вместе с обогатительной добавкой. Каждый флакон MGIT PANTA (для MGIT 960) содержит лиофилизированную смесь антибактериальных препаратов со следующей концентрацией на момент изготовления:

-полимиксин B 6,000 ед.

-амфотерицин B 600 мг

-налидиксовая кислота 2,400 мг

-триметоприм 600 мг

-азлоциллин 600 мг

Процедура подготовки пробирок MGIT и посев образца.

a. Разведение лиофилизированной добавки PANTA

* Растворить PANTA (добавку с антибиотиками для подавления роста посторонней флоры) в 15 мл обогатительной добавки MGIT Growth Supplement, добавив ее во флакон с PANTA. Оставить на 15 минут.

* Добавить 0,8 мл полученного раствора в каждую пробирку MGIT непосредственно перед посевом материала.

* Все манипуляции проводить в ламинарном боксе II- класса защиты.

b. Посев в пробирку MGIT

Все этапы работы должны выполняться только в ламинарном боксе II- класса защиты.

* Внимательно осмотреть пробирку MGIT и убедиться, что она пригодна для работы (наличие силиконового кольца на дне пробирки, объем жидкости - 7 мл, крышка плотно закрыта).

* Написать на пробирках идентификационные лабораторные номера.

* С помощью стерильной одноразовой пипетки внести 0,5 мл ресуспендированного осадка в подготовленною пробирку MGIT и 0,1-0,25 мл в пробирку с плотной питательной средой Левенштейна-Йенсена.

* Закрыть немедленно после внесения плотно крышку пробирки и аккуратно несколько раз перевернуть пробирку, чтобы перемешать содержимое.

* Обработать снаружи пробирки и пробки дезсредством, поместить пробирки в штатив и оставить на 30 минут при комнатной температуре.

* Для исключения перекрестной контаминации и поддержания оптимальной концентрации углекислого газа в пробирках, всегда необходимо открывать только одну пробирку на минимально возможное время.

с. Меры предосторожности

Основным источником контаминации среды MGIT являются микроорганизмы из окружающей среды, попавшие в пробирку во время внесения добавок и материала, поэтому необходимо соблюдать следующие правила:

1. Все добавки вносить только в ламинарном боксе II-класса защиты.

2. Не открывать несколько пробирок одновременно.

3. Открывать пробирку MGIT на максимально короткое время.

4. При внесении ростовой добавки рекомендуется пользоваться дозатором.

5. Всегда плотно закручивать крышку. Если она сидит неплотно, могут возникнуть сложности с детекцией флуоресценции.

6. Проба, внесенная в пробирку объемом более 0,5 мл, может повлиять на показатель pH среды и вызвать ложную флуоресценцию, а также может усилить контаминацию.

d. Инкубация

Все засеянные пробирки MGIT необходимо поместить в прибор. Протокол исследования на автоматизированной системе BACTEC MGIT 960 -6 недель.

Температура инкубации для микобактерий туберкулеза + 37°С, допустимые колебания температуры от + 35°С до +38°С. В процессе инкубации встряхивание и перемещение пробирок запрещено.

е. Детекция положительного роста

О появлении положительной пробирки прибор сообщает появлением красной индикации на наружной панели соответствующего ящика и значка «+», а также звуковым сигналом.

При наличии индикации о положительном результате необходимо открыть указанный ящик; нажать клавишу под иконкой «извлечь положительные пробирки»; извлечь пробирку из указанной прибором ячейки; считать штрих-код извлеченной пробирки.

Следует просмотреть пробирку и визуально определить наличие роста микобактерий. Обычно в жидкой среде микобактерии растут в виде своеобразной «зернистости» или белых хлопьев, при этом прозрачность среды может почти не меняться. Как правило, рост микобактерий сосредоточен на дне пробирки. Сильное помутнение среды может свидетельствовать о наличии контаминации посторонней флорой.

Максимальное время инкубации пробирок в приборе MGIT - 42 дня. Пробирки, в которых размножение микобактерий не зафиксировано прибором в течение указанного времени, идентифицируются системой как отрицательные. В этом случае прибор сообщает появлением зеленой индикации на наружной панели соответствующего ящика и звуковым сигналом.

Для того чтобы извлечь «отрицательные» пробирки, необходимо открыть соответствующий ящик и нажать клавишу под иконкой «извлечь положительные пробирки» - прибор укажет зеленым световым сигналом на те пробирки, которые необходимо удалить. Необходимо извлечь пробирку из ячейки и отсканировать штрих-код, а также просмотреть пробирку, пытаясь визуально определить наличие возможного роста микобактерий и контаминации (мутность, дисперсность и т.д.).

5.2.3 Молекулярно-генетическое исследование для идентификации видов микобактерий из культурального материала

Выделение ДНК

Исходным материалом для теста могут быть бактерии, выросшие как на плотной среде (Левенштайна-Йенсена, Миддлбрук), так и в жидкой (например, BACTEC, MB-check). Тест не подходит для детекции микобактерий из прямого материала пациентов. Рабочая площадь должна быть чистой от амплифицированной ДНК. Решающим моментом является нагревание образцов до 95°C в течение 20 минут, чтобы обеспечить полный лизис клеток и инактивировать вегетативные бактерии. Можно применять любые методы выделения ДНК, позволяющие получить амплифицируемую ДНК из бактерий. Следующий краткий протокол позволяет получить ДНК, подходящую для амплификации:

1а. При работе с бактериями, выросшими на плотной среде, петлей отобрать бактерии и суспендировать в примерно 300 мкл воды.

(вода должна быть пригодна для молекулярно-биологических исследований)

1б. При работе с бактериями, выросшими на жидкой среде, в работу берётся 1 мл. Бактерии осаждают при центрифугировании в ттечение 15 мин при 10000g в стандартной настольной центрифуге с аэрозоль-непроницаемым ротором в ламинарном боксе II класса.

Супернатант слить, а бактерии ресуспендировать на вортексе в 100-300 мкл воды.

2. Инкубировать бактерии из пп. 1а и 1б на водяной бане 20 минут при 95°C.

3. Обработать пробу в ультразвуковой бане в течение 15 мин

4. Центрифугировать пробу на максимальной скорости 5 мин, и использовать 5 мкл супернатанта для ПЦР. Если предполагается более

длительное хранение, то раствор ДНК необходимо перенести в новую пробирку.

Амплификация

Подготовить амплификационную смесь (по 45 мкл) в чистой от ДНК комнате. Образцы ДНК следует вносить в пробирки в отдельном помещении.

Микс на одну пробирку:

- 35 мкл PNM - поставляется в наборе

- 5 мкл 10-кратного полимеразного буфера для инкубации - не поставляется

- х мкл раствора MgCl21) - не поставляется

- 1-2 единицы термостабильной ДНК-полимеразы (см. данные изготовителя) - не поставляется

- у мкл воды для доведения объёма до 45 мкл (без учета объема фермента) - не поставляется

- Добавить 5 мкл раствора ДНК (20-100 нг ДНК) для получения конечного объема 50 мкл (без учета объема фермента)

1) В зависимости от используемой системы фермент/буфер, оптимальная концентрация MgCl2. может варьировать между 1.5 и 2.5 мМ.

Обратите внимание, что некоторые инкубационные буферы уже содержат MgCl2.

При испытательных изучениях наборов GenoType® Mycobacterium AS применялась HotStarTaq ДНК- полимераза от Qiagen. При

использовании этого фермента, на один образец необходимы следующие количества:

- 35 мкл PNM (поставляется в наборе)

- 5 мкл 10-кратного ПЦР буфера для HotStarTaq (содержит 15 мМ MgCl2) - не поставляется

- 2 мкл 25мМ раствора MgCl2 - не поставляется

- 0.2 мкл (1 Ед) HotStarTaq - не поставляется

- 3 мкл воды (для молекулярно-биологических исследований) - не поставляется

- 5 мкл раствора ДНК (вносить в отдельной чистой зоне)

Конечная концентрация MgCl2 в этой амплификационной смеси составляет 2.5 мM.

Определите количество образцов для амплификации (количество анализируемых проб + контрольные образцы). Проба контроля контаминации, например, содержит 5 мкл воды вместо раствора ДНК. Подготовить мастер-микс, содержащий все реактивы, за исключением раствора ДНК, и хорошо перемешать (не на вортексе). Аликвотировать по 45 мкл в каждую подготовленную ПЦР-пробирку.

Программа амплификации2):

15 мин 95°C 1 цикл

30 сек 95°C

2 мин 58°C

25 сек 95°C

40 сек 53°C 20 циклов

40 сек 70°C

8 мин 70°C 1 цикл

2) Относительно Taq полимеразы, использованной для валидации: если применяется определённая hot start ДНК-полимераза, время, необходимое для первого этапа нужно сократить (см.указания производителя фермента).

Продукты амплификации могут храниться при температуре от +4 до -20°C.

Для проверки реакции амплификации, можно нанести 5 мкл каждого образца прямо на 2% агарозный гель без добавления буфера.