Создание РНК-аптамеров, способных связываться с аутоантителами, вырабатываемыми организмом человека при рассеянном склерозе

На данный момент существует несколько различных систем детекции белков на основе аптамеров. Все их можно разделить на электрохимические, оптические и гравиметрические методы анализа.

Детекция белка электрохимическими методами основана на измерении разности электропроводности системы до введения белка и после. Электрохимические системы детекции бывают “односторонними” (single-site binding assay) [101, 111] и “двусторонними” (dual-site binding assay или sandwich assay) [85, 112]. Методы “одностороннего” анализа позволяют детектировать белок-мишень непосредственно при его взаимодействии с аптамером. Все они используют в качестве основы аптамеры, иммобилизованные на проводящей подложке: электроде [101, 111, 113], полипирроле [114], кремниевой подложке [115] или одностенной углеродной нанотрубке [116]. Для получения сигнала используют молекулы-репортеры - доноры или акцепторы электронов, такие как метиленовый синий [101, 114], гексацианоферраты 3+ /4+ [114], гексаамминорутенаты 3+ [117], ферроцен [113]. При этом молекула-репортер изначально либо находится вблизи проводящей подложки и сигнал наблюдается [101], либо удалена от него и сигнала нет [113]. После взаимодействия аптамера с мишенью его конформация меняется так, что происходит “переключение” - “выключение” или “включение” сигнала, соответственно. С использованием “односторонних” методов анализа созданы системы детекции б-тромбина человека [101, 111, 113, 116, 118], тромбоцитарного фактора роста BB (PDGF-BB) [114, 115], иммуноглобулина Е [114], лизоцима [117]. В случае “двусторонних” систем мишень детектируется по образованию тройного комплекса антитело-белок-аптамер или аптамер-белок-аптамер*, что повышает специфичность и чувствительность анализа. В последнем случае аптамеры должны связывать белок-мишень в разных неперекрывающихся участках. “Двусторонняя” система детекции состоит из молекулы-“захватчика”, аптамера [119, 120] или антитела [85, 112, 121-123], иммобилизованного на проводящей подложке, и молекулы-“детектора”, в качестве которых зачастую выступают аптамеры, модифицированные наночастицами металлов [120, 123, 124], ферментами [121] и целыми системами амплификации по типу “катящегося колеса” [122]. На основе “двусторонних” методов анализа созданы системы детекции б-тромбина человека [85, 120, 123], тромбоцитарного фактора роста BB (PDGF-BB) [112, 122], иммуноглобулина Е [121].

Оптические системы детекции белковых молекул-мишеней делятся на флуоресцентные и колориметрические методы анализа. Детекция флуоресценции используется довольно часто ввиду наличия большого числа различных флуорофоров и тушителей и легкости синтеза флуоресцентно меченых аптамеров. Такие аптамеры получили название сигнальных аптамеров. Одним из самых распространенных методов детекции является использование системы флуорофор-тушитель [125]. На данный момент такие системы анализа считаются полуколичественными. Другой тип флуоресцентных методов анализа основан на переносе энергии между флуоресцентными молекулами - донором и акцептором (FRET - fluorescence resonance energy transfer) [126]. При образовании комплекса аптамер-мишень происходит удалание или сближение донора и акцептора и появление или исчезновение сигнала, соответственно. Недостатком данного метода является его повышенная чувствительность, например, к природе красителя, длине спейсера, взаимодействию краситель-краситель и др. В связи с этим метод трудно применим в биологических средах из-за возрастания шумового сигнала. Использование пиренильных производных аптамеров также применяется для детекции белковых молекул-мишеней [127]. При связывании аптамера с белком-мишенью образуется пиренильный эксимер и происходит смещение максимума испускания флуоресценции с 400 нм до 485 нм. Однако данный метод также трудно применим для исследования сложных биологических проб из-за большого шумового сигнала. На основе флуоресцентных аптасенсоров были созданы системы детекции Tat белка ВИЧ [125], б-тромбина человека [126], тромбоцитарного фактора роста (PDGF) [127]. Колориметрические методы анализа белков базируются на аптамер-зависимой агрегации наночастиц золота [128-130]. Для определения тромбоцитарного фактора роста (PDGF) было предложено ковалентно иммобилизовать аптамер к PDGF на наночастицы золота [129]. При образовании комплексов аптамеров с белком-мишенью в условиях низкой концентрации мишени цвет раствора меняется от красного до розового. При средней концентрации белка образуется комплекс молекул PDGF и аптамеров, иммобилизованных на наночастицах, фиолетового цвета. В избытке белка раствор снова становится розовым из-за образования отдельных наночастиц золота, покрытых молекулами PDGF. С использованием ковалентно связанных с наночастицами аптамеров также была создана система детекции тромбина [130]. После связывания аптамера с мишенью происходит каталитическое увеличение размеров наночастиц золота в присутствии HAuCl₄ и NADH, за счет которого происходит усиление сигнала. Аналогичная система с применением каталитического нанесения слоя серебра на наночастицы золота была применена для детекции тромбоцитарного фактора роста BB (PDGF-BB) [131]. Возможно также использование и нековалентного взаимодействия аптамеров с наночастицами золота [128]. Свободные молекулы аптамеров электростатически связываются с наночастицами золота и предотвращают их агрегацию. При образовании комплекса белок-аптамер свободные от аптамеров наночастицы агрегируют под действием солей.

Гравиметрические биосенсоры определяют концентрацию белка по изменению сигнала, зависящего от массы пробы, связанной с их активной поверхностью. Их можно разделить на сенсоры, использующие затухающие волны (поверхностный плазмонный резонанс (SPR), акустические сенсоры (QCM, SAW)) и микромеханические кантиливерные сенсоры (cantilever-based sensors). SPR-аптасенсоры детектируют изменение резонансного угла, возникающее при образовании комплекса аптамер-мишень. С использованием SPR-метода были созданы сенсоры на Tat белок ВИЧ-1 [132], прионовый белок (PrP) мыши [133] и фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF) [134]. Микрогравиметрические методы анализа с применением QCM-аптасенсоров детектируют образование комплексов аптамер-мишень по изменению частоты резонансных колебаний кварцевых кристаллов. Уже созданы детектирующие системы такого типа для тромбина [135] и Tat белка ВИЧ-1 [132]. SAW-аптасенсоры также используют пьезоэлектрические кварцевые кристаллы. К таким аптасенсорам относятся системы детекции б-тромбина человека и белка Rev [136], комплекса б-тромбина и антитромбина III человека [137]. В случае кантиливерных сенсоров аптамер иммобилизуют на вершине кантиливера. При образовании комплекса аптамер-мишень кантиливер отклоняется от своего первоначального положения, что можно детектировать оптическими или электрохимическими методами. На основе таких аптасенсоров возможна детекция Taq ДНК полимеразы [138] и геликазы вируса гепатита С [139].

1.5.2 Аптамеры в качестве терапевтических средств

Аптамеры как терапевтические средства обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционными лекарственными средствами. По своей высокой специфичности и сродству к мишеням аптамеры сравнимы с антителами, но превосходят их по целому ряду характеристик, таких как лучшая способность проникать через биологические мембраны из-за меньшего размера молекулы, низкая иммуногенность, а также возможность химического или химико-ферментативного синтеза в препаративных количествах. Действие аптамеров in vivo может быть пролонгировано или замедлено посредством соответствующих модификаций. Все аптамеры, обладающие терапевтическим действием, можно разделить по выполняемым ими функциям на несколько групп: аптамеры-ингибиторы, аптамеры-приманки, регулируемые аптамеры, мультивалентные аптамеры, аптамеры-доставщики. Рассмотрим каждую из указанных групп.

Аптамеры-ингибиторы подавляют действие молекул-мишеней, образуя с ними прочные комплексы. Одним из самых известных аптамеров-ингибиторов является Pegaptanib (препарат Macugen) [67, 109]. Pegaptanib с высокой аффинностью связывает фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF). В 2004 году он прошел испытания FDA в качестве лекарственного препарата для лечения возрастной дегенерации макулы и на данный момент проходит клинические испытания в качестве лекарственного препарата для лечения диабетической ретинопатии. К аптамерам-ингибиторам, которые проходят клинические испытания, также относятся аптамеры к нуклеолину [140, 141], тромбину [142], фактору IXa [143, 144], фактору von Willebrand [143].

Высокий уровень аутоантител к ДНК характерен для пациентов, страдающих таким аутоиммунным заболеванием, как системная красная волчанка. В работе [18] описано получение РНК-аптамера к моноклональному аутоантителу G 6-9, который ингибировал связывание ДНК с аутоантителом. Эти данные говорят о возможности создания терапевтических препаратов на основе аптамеров к аутоантителам.

Аптамеры-приманки имитируют строение белок-узнающих сайтов природных НК, за счет чего образуют комплексы с ДНК- и РНК- связывающими белками. Уже созданы аптамеры-приманки к белкам семейства E2F [145, 146], Tat белку ВИЧ [147, 148], фактору транскрипции NF-kB [149, 150] и к аутоантителам человека больного миастенией [151].

Регулируемые аптамеры. Одной из проблем при создании лекарств является вопрос о длительности терапевтического действия препарата. Именно в таких случаях используют регулируемые аптамеры. Они состоят из двух компонентов: устойчивого в биологических средах аптамера, обладающего терапевтическим действием, и немодифицированного олигонуклеотида-модулятора, комплементарного части аптамерной последовательности. Попадая в организм человека, олигонуклеотиды-модуляторы деградируются нуклеазами, постепенно освобождая молекулы аптамеров, что пролонгирует их терапевтическое действие. Таким аптамером является аптамер REG-1, ингибирующий фактор коагуляции IXа [144]. Он уже прошел 1-ю и 2-ю фазы клинического исследования. 1-я фаза была пройдена удачно, результаты 2-й фазы клинических исследований пока не опубликованы.

Мультивалентные аптамеры - ди-, три- или олигомеры одного или нескольких аптамеров. Обычно такие конструкции создаются в случае известной структуры молекулы-мишени для улучшения связывающих способностей аптамера [152, 153]. Методы создания мультивалентных аптамеров основаны на использовании различных линкерных молекул для соединения аптамеров в одну конструкцию, таких как триэтиленгликольфосфатный линкер [154], фосфамидный линкер [153], полиэтиленгликолевый линкер [98], или олигонуклеотидов-"скрепок" [152, 155], комплементарных соответствующим линейным участкам аптамеров. Одним из первых мультивалентных аптамеров является аптамер к цитотоксическому Т-клеточному антигену 4 (CTLA-4) - рецептору Т-клеток [152]. Ингибирование CTLA-4 способствует Т-клеточной активации, и как следствие, антиопухолевому иммунному ответу. Как показали эксперименты, тетрамер CTLA-4 аптамера повышал иммунный ответ как в клеточной культуре, так и in vivo. К мультивалентным аптамерам относятся также гибриды аптамеров к TAR элементу ВИЧ и сайту инициации димеризации [154], тромбину [153, 156], рецептору 4-1BB [155], рецептору OX40 [98].

Аптамеры, используемые в качестве средств доставки. Мишень-направленная терапия - одна из актуальных задач современной медицины. С использованием аптамеров к рецепторам, экспрессирующимся определенными типами клеток, возможна адресная доставка различных терапевтических средств, таких как токсины, химиотерапевтические препараты, ферменты и многие другие. Весьма перспективным подходом является использование аптамеров для доставки в клетки siRNA. Одним из часто используемых в данном случае аптамеров является аптамер к PSMA, простат-специфическому мембранному антигену, гиперэкспрессия которого наблюдается в клетках рака простаты. Для создания химер аптамеров и siRNA используют систему стрептавидин-биотин и дополнительных комплементарных (“stick”) последовательностей. В первом случае биотинилированные 5'-конец аптамера и 5'-конец смысловой цепи siRNA связывает стрептавидиновый модуль. Во втором случае на 3'-конец аптамера добавляется “stick”-последовательность, а одна из цепей siRNA содержит комплементарную ей последовательность с 3'-конца. Первым способом были получены химеры PSMA-аптамера с siRNA, направленными на гены Lamin A/C, GAPDH1 и GAPDH2 [157] а также Plk-1 и Bcl-2 [158]. Вторым способом был получен химер gp120 аптамера с tat-rev siRNA [110]. Для всех химер эксперименты показали аптамер-опосредованное проникновение siRNA в клетки. Таким образом, использование аптамеров в качестве средств доставки может позволить избежать попадания лекарственных средств в здоровые клетки и этим существенно снизить токсичность препаратов для организма человека.

Как видно из обзора литературных данных, создание аптамеров к белковым молекулам-мишеням является перспективным способом решения самых разнообразных задач в области молекулярной биологии, биотехнологии и медицины. Среди белков-мишеней есть и антитела, и аутоантитела. На основе аптамера к IgE человека уже создан электрохимический односторонний биосенсор [114]; к аутоантителам человека, больного миастенией, создан аптамер-приманка [151]; получен аптамер-ингибитор моноклональных аутоантител G 6-9 к ДНК, вырабатывающихся при системной красной волчанке [18]. Однако, отбор аптамеров к аутоантителам, вырабатываемым организмом человека, больного рассеянным склерозом, в литературе не описан. В то же время аптамеры, специфически связывающие аутоантитела человека при рассеянном склерозе, могут послужить основой для создания перспективных средств диагностики и терапии данного заболевания.