Применение оптических методов основано на свойстве веществ поглощать световую энергию. При этом используются следующие характеристики свойств света: длина волны (или частота) и интенсивность света.

Длина волны определяет тот предел, до которого луч света способен взаимодействовать с любым веществом, а путем измерения интенсивности света можно количественно определять взаимодействие между веществом и энергией луча света.

При рассмотрении способа взаимодействия вещества и света энергию света представляют разделенной на отдельные единицы, носящие название фотонов, или квантов. Энергия фотона зависит от частоты излучения и определяется уравнением:

Е = ? * h,

где Е -- энергия фотона в эргах;

? -- частота колебания волны в циклах в секунду;

h -- постоянная Планка, равная 6,624*10-27 эргов в секунду.

Следовательно, излучение при определенной длине волны состоит из фотонов, имеющих абсолютно равное количество энергии. Интенсивность, или световая энергия, пропорциональна числу фотонов, которые в единицу времени проходят через единицу площади, перпендикулярной к направлению луча света.

Общая энергия молекулы для любого ее состояния может быть выражена следующим уравнением:

Еобщ = Еэлектр + Еколеб + Евращ

Каждый из компонентов общей энергии может иметь только определенную величину, называемую энергетическим уровнем. Молекула, у которой электронная, колебательная и вращательная энергии имеют их наименьшее значение, находится в так называемом основном состоянии. В этом состоянии молекула может поглощать энергию, однако лишь в определенных количествах. Если молекула подверглась воздействию фотонов, чья энергия соответствует разности энергии между основным и возбужденным состояниями молекулы, то происходит поглощение молекулой энергии и вследствие этого молекула переходит на более высокий энергетический уровень.

Более высокие уровни называют первым, вторым и т. д. возбужденными состояниями. Каждому электронному уровню соответствует одно основное и несколько возбужденных колебательных состояний, аналогично каждому колебательному уровню соответствует один основной и несколько возбужденных вращательных уровней.

С другой стороны, если существует значительная разница в энергии фотонов и разности энергий двух состояний, может не быть никакого поглощения.

Таким образом, электронные, колебательные и вращательные энергии молекулы могут иметь только определенные, дискретные значения, иначе говоря, энергии в молекуле квантизированы.

Поглощение молекулой излучения может привести в зависимости от энергии фотона к следующим изменениям:

1. увеличению электронной энергии вследствие перераспределения электронов и перехода их на более высокий уровень;

2. увеличению колебательной энергии (распределение энергии между двумя ядрами);

3. увеличению вращательной энергии (уокорение вращения диполя).

Если молекула поглощает (небольшое количество энергии, излучаемой источником в далекой инфракрасной или микроволновой области, то изменяется только ее вращательная энергия, а электронная и колебательная энергия остаются прежними. Бели же источник излучения характеризуется более высокой энергией, соответствующей близкой инфракрасной области, то возрастает как вращательная, так и колебательная энергия молекулы. Излучение более высокой энергии, соответствующей ультрафиолетовой и видимой областям, приводит к изменениям всех трех видов энергии -- вращательной, колебательной и электронной.

Молекулы вещества очень недолго находятся в возбужденном состоянии, продолжительность их существования порядка 10-8 сек. Следовательно, энергия не аккумулируется в системе, а .вещество немедленно растрачивает избыточную энергию несколькими путями, которые могут быть физическими или химическим.

Энергия может выделиться в виде тепла или флюоресцентного излучения.

Повторное излучение энергии в виде флюоресценции происходит ;в молекулах, у которых процессы деактивации протекают несколько иначе и полная деактивация путем столкновения или химической реакции затруднена. Такие молекулы могут иметь более высокую колебательную энергию в возбужденном состоянии, чем в основном состоянии. Эта колебательная энергия теряется путем столкновения на высшем электронном уровне, после чего молекула флюоресцирует, т. е. возвращается в основное состояние с выделением энергии в виде излучения. Флюоресцентная энершя меньше по величине, чем энергия падающего света, т. е. имеет большую длину волны. Флюоресценция немедленно прекращается при устранении источника радиации, что и отличает это свойство от фосфоресценции, которая продолжается некоторое время после устранения источника излучения.

Вещество может подвергнуться гомолитической диссоциации или ионизации. Выше уже отмечалось, что излучения разнятся по содержанию энергии в зависимости от длин волн. Для разрыва межатомной связи в молекуле требуется энергия порядка 50--100 ккал/моль; следовательно, для разрыва связи необходимо поглощение квантов видимого света (от 55 до 70 ккал/моль) или ультрафиолетового (около 140 ккал/моль).

Изучением химических реакций, возникающих при воздействии электромагнитного излучения, занимается фотохимия.

Определения, связанные с измерением поглощения света, основаны на двух физических законах.

Когда свет проходит через вещество, интенсивность излучения уменьшается по сравнению с интенсивностью излучения, падающего на вещество (рис. 1).

Закон Бугера--Ламберта связывает поглощение с толщиной слоя поглощающего вещества и выражается соотношением:

lg (I0 / I) = k1 * b,

где I0 -- интенсивность излучения, падающего на вещество;

I -- интенсивность излучения, прошедшего через вещество;

b -- толщина слоя вещества в сантиметрах;

k1 -- показатель поглощения -- величина, обратная той толщине слоя, проходя через который поток излучения ослабляется в 10 раз.

Второй закон поглощения Бера связывает интенсивность падающего света и света, прошедшего через раствор определенной толщины, с концентрацией раствора. При этом предполагается, что растворитель не поглощает в данной области спектра:

lg (I0 / I) = k2 * С,

где k2 -- константа, зависящая от способа выражения концентрации раствора;

С -- концентрация раствора.

Оба закона могут быть сведены в одно уравнение, которое известно под названием закона Бугера -- Ламберта -- Бера, закона Ламберта -- Бера или просто закона Бера:

lg (I0 / I) = k * b * С,

Раздел терминологии, относящейся к оптическим методам анализа, остается унифицированным, описывается согласно Государственной фармакопеи X издания с некоторыми изменениями согласно Второму изданию Международной фармакопеи.

Соотношение lg (I0 / I) известно как поглощение (А), оптическая плотность (D), или как экстинкция (Е).

Значение k зависит от единиц, в которых выражают концентрацию вещества и толщину слоя. Если выразить С в грамм-молях на 1 л раствора, а b в сантиметрах, то коэффициент поглощения будет равен молярному коэффициенту поглощения. Последний изображается греческой буквой эпсилон -- ?.

Если концентрация выражается в граммах вещества на 100 мл раствора, то эта величина называется удельным показателем поглощения и обозначается символом или Е (1 %, 1 см).

Известно также выражение поглощения при концентрации в граммах вещества на 1 л раствора -- поглощаемость -- а. Эта величина в 10 раз меньше, чем удельный показатель поглощения.

Приведенные ниже формулы определяют зависимость между величиной поглощения, Е (1 %, 1см), и молярным коэффициентом поглощения.

где М -- молекулярный вес и соответственно

Измерение поглощения в ультрафиолетовой и видимой областях производится на фотоэлектрических спектрофотометрах. В Советском Союзе выпускались однолучевые, призменные, нерегистрирующие приборы СФ-4 и СФ-4А для измерений в ультрафиолетовой, видимой и ближней инфракрасной областях спектра (от 220 до 1100 нм), нерегистрирующий прибор с дифракционной решеткой СФД-2 для измерений от 220 до 1100 нм, однолучевой, призмепной, нерегистрирующей спектрофотометр СФ-5М для измерений от 380 до 1100 нм, и двухлучевые, призменные, регистрирующие приборы СФ-2М и СФ-10 для измерений в видимой части спектра от 400 до 750 нм.

За рубежом и в современной Украине используются также нерегистрирующие и регистрирующие спектрофотометры типа Бекман (США), Перкин-Элмер (США), Уникам (Англия), Хилгер-Увиспек (Англия), Цейс (ГДР) и другие серийные приборы. Основными частями любого спектрофотометра являются источник непрерывного излучения, монохроматор, кювета для анализируемого раствора, детектор и регистрирующее устройство.

Оптическая схема простейшего спектрофотометра приведена на рис. 2.

В качестве источников излучения в приборах наиболее широко используются газоразрядная водородная лампа и вольфрамовая лампа накаливания.

Газоразрядная водородная лампа обеспечивает сплошной спектр в ультрафиолетовой области и особенно удобна для измерений от 200 до 350 нм.

Вольфрамовая лампа накаливания используется для работы в ближней ультрафиолетовой области, видимой и ближней инфракрасной области, т. е. в пределах от 320 до 3000 нм. Ртутные лампы обеспечивают очень высокую интенсивность в ультрафиолетовой и видимой областях, давая интенсивную линию спектра ртути и сплошное излучение. Ртутные лампы необходимо нагревать в течение 15 минут, прежде чем они начнут давать постоянное излучение.

Недостатком является высокая температура, которую ртутная лампа приобретает при работе.

Ксеноновые разрядные лампы применяются в ряде приборов для измерений в области от 200 до 900 нм.

Монохроматор -- приспособление для изолирования очень узкой полосы излучения ;из источника света. Смешанное излучение проходит через щель в монохроматор, в котором луч разделяется на спектр при помощи призмы или дифракционной решетки. Этот спектр фокусируется на выход щели. Путем вращения призмы или дифракционной решетки можно выделить определенную часть спектра, которая через щель направляется в кюветное отделение, где находится раствор исследуемого вещества.

Угол отклонения между первоначальным направлением луча и направлением, в котором он проходит через призму, зависит от показателя преломления материала, из которого сделана призма. Показатель преломления любого материала изменяется в зависимости от длины волны, что определяется следующим уравнением:

n = n0 + C / (? -- ?0),

где n -- показатель преломления при определенной длине волны;

? -- длина волны;

C; n0; -- константы.

Следовательно, когда луч немонохроматической радиации входит в призму, составляющие его длины волн отклоняются под разными углами. Тот же процесс повторяется при выходе луча из призмы. Таким образом, получается спектр, в котором короткие волны отклоняются от их начального направления больше, чем длинные.

Угловая дисперсия -- это изменение угла диспергированного луча с изменением длины волны. Дисперсия не изменяется линейно в зависимости от длины волны.

Разрешающая сила призмы определяется способностью инструмента разделять две спектральные линии, отличающиеся на длину волны d?.

R = ? / d? = t * dn / d?

где ?-- средняя длина волны двух линий, незначительно отличающихся друг от друга;

d?-- различие в длинах воли двух линий;

t -- толщина основания призмы;

n -- показатель преломления призмы.

Материал, из которого изготавливаются призмы, выбирается с расчетом получения максимальной дисперсии и хорошей пропускаемости в определенной области спектра. Призмы из стекла используются в видимой области, из кварца -- в ультрафиолетовой и ближней инфракрасной области. Призмы по сравнению с дифракционными решетками обеспечивают более чистый спектр.

Дифракционные решетки дешевле, чем призмы, и могут быть использованы для всех областей спектра, так как пропускаемость в данном случае не имеет определяющего значения. Дифракционная решетка состоит из большого числа параллельных линий, нанесенных на стекло или на поверхность металла. Спектры, получаемые с дифракционной решеткой, не так чисты, как призменные, потому, что образуется спектр более чем одного «порядка».

Когда свет отражается от дифракционной поверхности, спектры образуются на обеих сторонах перпендикуляра в соответствии со следующим уравнением:

n * ? = d * (sin i + sin ?),

где n -- порядок спектра;

? -- длина волны; d -- расстояние между линиями дифракционной решетки;

i -- угол падения;

? -- угол дифракции.

Дисперсия от дифракции остается практически постоянной при изменении длины волны, и разрешающая сила решетки определяется порядком спектра и числом линий на освещенной части дифракционной решетки.

R = n * N,

где R -- разрешающая сила решетки;

n -- порядок спектра;

N -- число линий.

Разрешающая сила также зависит от качества дифракционной решетки. Любые недостатки в точности нанесения линий могут привести к появлению несколько смещенного изображения линий. Обычно получают спектр несколько более высокого порядка, чем ожидаемый.

Для обеих систем диспергирования света необходимы коллимирующие и фокусирующие линзы или зеркала, обычно комбинируемые с диспергирующим устройством.

В абсорбционной спектроскопии применяются кюветы разных размеров, изготовленные из кварца или стекла. Как и призмы, кюветы сделаны из материала, обладающего высокой пропускной способностью в определенной части спектра. Кварцевые кюветы пригодны для измерений как ультрафиолетовой, так и в видимой области; стеклянные же могут быть использованы только в видимой области.

Толщина слоя в кюветах колеблется от 0,1 до 10 см. Чаще всего измерения проводят в кюветах с толщиной слоя 1 см. Трудно производить кюветы, абсолютно идентичные по пропускаемости, поэтому одну и ту же кювету обычно используют только для растворителя. Поправка на различное поглощение кювет определяется путем сравнения поглощения обеих кювет, наполненных чистым растворителем.

Следует обращать внимание на чистоту кювет и состояние их оптической поверхности, так как оба этих фактора влияют на показания поглощения.

Для измерения поглощения света необходимо фотометрическое устройство. Применяемые для этих целей фотоэлементы, фотоэмиссионные лампы и фотоумножители основаны на известном эффекте перехода световой энергии в электрическую.

Фотоэлементы дают относительно сильный ток, который может быть измерен при помощи гальванометра. Фотоэлементы чаще всего применяются в фотоэлектроколориметрах.

Фотоэмиссионные лампы -- это разреженные трубки, содержащие два электрода, один из которых при облучении испускает электроны, так как покрыт светочувствительным материалом (щелочной металл, нанесенный на слой окиси серебра или сурьмы). Возникающий при этом ток очень слабый, поэтому необходимо применять усилительные устройства.

Эмиссионные лампы применяют по следующим основным причинам. Вследствие низкого внутреннего сопротивления усиление тока в фотоэлементе затруднено. В спектрофотометре используется более узкий луч света, чем в колориметре, благодаря чему ток в фотоэлементе был бы слишком слаб для измерения. Ток фотоэлемента, подвергаемого постоянному освещению, медленно снижается во времени. Наконец, спектральный ответ фотоэлементов ограничивается видимой частью спектра, фотоэлементы почти бесполезны в ультрафиолетовой области.

Природа покрытия определяет область волн, в которой эмиссионная лампа может быть использована (от 300 до 500 нм для слоя металлического натрия и от 200 до 700 нм для слоя калия).

Фотоумножительные устройства являются дальнейшим развитием фотоэмиссионных ламп. Первичные электроны, испускаемые фоточувствительным электродом, направляются на следующий электрод, который в свою очередь испускает несколько электронов на каждый падающий на него электрон и т. д. После ряда таких этапов удается значительно усилить ток при сохранении очень небольшой величины начального тока.

2.3 Методика спектрофотометрических измерений