Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Аннотация

ОПИСАНИЕ РАБОТЫ

Изучено физику фотобиологических явлений. Проведено анализ аппаратуры, которая используется в спектрофотометрии. Собрано прибор, на котором был проведен один из блоков исследований. Снято кривые флуоресценции сыворотки крови и жирорастворимых витаминов. Изучено инициированную хемилюминесценцию. Дано сравнение методов спектрофотометрии.

Ключевые слова: микроспектрофлуориметр, люминесценция клеток, нанообъект, спектрограф.

Содержание

• Аннотация
• Вступление
• 1.Теоретические основы люминесценции
• 1.1 Физические основы люминесценции
• 1.1.1 Электронно- колебательные состояния
• 1.1.2 Закономерности перехода электронов на возбужденные уровни
• 1.1.3 Внутренняя конверсия
• 1.1.4 Флуоресценция
• 1.2 Физические и химические основы хемилюминесценции
• 1.3 Возбуждение и измерение интенсивности
• люминесценции клеток и биологических жидкостей
• 2. Приборы и техника люминесцентного
• спектрального анализа клеток
• 2.1 Вакуумный фотоумножитель
• 2.2 Лавинные фотодиоды
• 2.3. Стандартный микроспектрофлуориметр
• 2.4 Малогабаритный инвертированный микроспектрофлуориметр
• 2.5 Собранный микроспектрофлуориметр
• 2.6 Функциональная схема хемилюминометра
• 2.7 Приготовление реактивов
• 3. Экспериментальные данные и их обработка
• 3.1 Калибровка спектрографа по длине волны
• 3.2 Калибровка по интенсивности
• 3.3 Снятие характеристик флуоресценции биообъектов
• 3.4 Спектральные характеристики флуоресценции в норме и при патологиях
• 3.5 Спектральные характеристики жирорастворимых витаминов
• 3.6 Хемилюминесцентные характеристики сыворотки крови при различных патологиях
• Выводы
• Список литературы
• ВСТУПЛЕНИЕ
• Наука не стоит на месте. С каждым днем человеческий разум все глубже внедряется в самые сокровенные тайны строения материи. Никого уже не удивишь сложнейшим устройством молекул и атомов. Наночастицы стали объектом исследований множества ученых со всего мира, а важность и необходимость нанотехнологий для современной науки неоспорима. Проблема состоит в разработке новейших подходов в изучении наночастиц.
• Постановка задачи об изучении различных наночастиц требует, естественно, развития и внедрения в значительной мере новых методов и новой техники эксперимента. Важнейшими из них являются методы спектрального анализа, позволяющие изучать физико-химические процессы, протекающие в живой клетке, в органических нанообъектах (J-частицах), в различных неорганических нанообъектах.
• Бурное развитие биохимии и молекулярной биологии за последние два десятилетия выдвинуло на передний план задачу изучения молекулярной организации функциональных механизмов живой клетки и процессов регуляции, интегрирующих их в единую живую систему. Именно эти механизмы обеспечивают возможность выполнения клеткой функций: рост, смену поколений, приспособление к меняющимся условиям среды и к взаимодействию клеток. Это тем более необходимо, что нарушения в этих системах являются причиной различных патологических явлении, включая сердечно-сосудистые заболевания и рак.
• Возможности спектрального анализа связаны, прежде всего, с тем обстоятельством, что многие молекулы, входящие в состав функциональных механизмов клетки, обладают весьма характерными спектрами поглощения, а зачастую -- и люминесценции.
• Изменение спектральных и люминесцентных характеристик показывают на изменение метаболических процессов клетки в частности и организма в целом, а следовательно на наличие патологического состояния.
• Исследование спектральных и люминесцентных методов в медицинской практике и биологии имеет теоретическое и прикладное, диагностическое значение. Оно позволяет изучать механизмы действия лекарственных препаратов, физических, химических и других факторов на клетки, организм и биологические жидкости.
• Достоинства и ограничения каждого из методов определяется не только информативностью, а также свойствами исследуемого вещества ценности получаемой информации с простотой, незначительными затратами времени и средств на проведение анализа. Не смотря на то что теоретические основы люминесцентных и спектральных методов одинаковы основы исследования основаны на различных принципах.
• Цель данной работы - ознакомление с хемилюминесцентными методами и спектральными методами исследования биологических нанообъектов и биолгических жидкостей, опытом их использования в биологии и медицине, перспективами дальнейшего развития.

1.ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ

1.1 Физические основы люминесценции

1.1.1 Электронно- колебательные состояния

Электронные переходы в атомарных ансамблях зависят от начального и конечного электронного состояния. Кроме того электронные термы молекул между которыми происходит переход, в значительной мере зависит от межядерных расстояний, поэтому стационарными являются не электронные а электронно- колебательные состояния. На Рис. 1 показано два самых простых состояния системы при отсутствии электронного вырождения и их колебательные состояния (условно-горизонтальные в минимумах). Это представление разрешает объяснить происхождение и свойства оптического спектра. В стационарных условиях молекула вещества обладает конфигурацией электронных орбит с наиболее низкой из возможных потенциальной энергией и находится, как принято говорить, в основном состоянии. Тепловое движение приводит к колебаниям атомов внутри молекулы и вращению ее как целого, что сопровождается флуктуациями потенциальной энергии основного состояния. Низший энергетический уровень или основное состояние описывается кривой So, на которой горизонтальными линиями схематически показаны энергетические подуровни, соответствующие разным колебательным состояниям молекулы в основном состоянии (So) ее электронной орбиты.



Если теперь молекула сможет получить извне дополнительную порцию энергии, то она переходит в состояние с избытком потенциальной энергии и оказывается, как принято говорить, в возбужденном состоянии. Это состояние является неустойчивым, и через некоторое время (10^-8 с) отдав тем или иным способом избыточную энергию, система возвращается в исходное основное состояние. Излучение света молекулой вещества при переходе ее из возбужденного состояния в основное называется люминесценцией.

Принцип Франка-Кондона: переходы между термами не являются чисто электронными, так как меняются и колебательные состояния, а частота поглощенного состояния hн зависит от колебательного состояния исходного электронного терма. Так как в переход включается различное количество колебательных квантов основного и возбужденного термов, то границами изменения являются н₁ и н₂ . за счет собственной ширины каждого перехода, а также температурной зависимости заселенности колебательных состояний спектр поглощения ( и излучения) представляет не узкие атомные линии, а широкие куполоподобные полосы с полушириной на уровне половины интенсивности, равной н₁ - н₂. Колебательное уширение полос зависит еще от числа заполнения n и md - орбиталей электронной конфигурации. Поэтому при переходе от одного электронного состояния к другому величины изменения Дn и Дm могут быть использованы для оценки равновесных межатомных состояний. Если Дn=Дm=0 (орбитальная электронная конфигурация не изменилась), переходы дают узкие линии с шириной около 100 см^-1. При Дn, Дm ? 0 (изменилась электронная конфигурация), наблюдаются широкие линии поглощения и люминесценции.

1.1.2 Закономерности перехода электронов на возбужденные уровни

Хотя с теоретической точки зрения способ передачи молекуле дополнительной энергии и перевод ее в возбужденное состояние не имеет особого значения, на практике по этому признаку различают фотолюминесценцию (возбуждение световым излучением), рентгенолюминесценцию (возбуждение рентгеновыми лучами), катодолюминесценцию (возбуждение пучком ускоренных электронов) и т. д. Несколько особняком стоят химические способы возбуждения. Различают хемилюминесценцию, характеризующуюся тем, что молекула оказывается в возбужденном состоянии в результате экзотермической химической реакции. Частным случаем хемилюминесценции является биолюминесценция, наблюдаемая в живой природе. Однако все виды возбуждения имеют общие закономерности, которые наблюдаются при переходе фотоэлектронов на возбужденные уровни [5].

1) Переход не сопровождается нарушением спарености электронов, как в основном так и в возбужденном состояниях. Ориентация синов антипараллельная и суммарный спин электронов равный 0.

2) Время, за которое квант поглощается и переходит на возбужденный уровень равный t = 10^-15 с. Период колебательных процессов молекулы T = 10^-13 с. Поэтому за время электронного перехода положение ядер молекул практически не изменяется.

3) Каждому электронному переходу отвечает определенное направление осцилляции заряда относительно скелета молекулы. Электрон переходит на возбужденный уровень по строго определенной траектории. На основе этого введено понятие осциллятора поглощения. Молекулы которые размещены в растворе таким образом, что их осцилляторы перпендикулярны к вектору Е световой волны вообще не будут поглощать свет. В общем случае вероятность поглощения пропорциональна проекции Е на направление осцилляции.

4) Направление осцилляторов разных полос поглощения как правило не совпадают и различно ориентированы относительно скелета молекулы.

Возвращаясь к рассмотрению основных закономерностей явления люминесценции, следует, прежде всего, отметить, что поступающая извне избыточная энергия возбуждения может быть поглощена молекулой с переходом в возбужденное состояние только в том случае, если ее величина равна разнице энергий основного (So) и одного из возбужденных состояний данной молекулы. В частном случае фотолюминесценции, приведенном на рис.1, это означает, что для перехода молекулы с основного уровня S_o на первый возбужденный уровень S₁ (с разницей энергии ДE) необходим квант света с такой же энергией:

ДE₁ = h н (1.1)

где h -- постоянная Планка, равная 6,62?10^-27 эрг?с, н - частота электромагнитных колебаний света (с^-1). Или, учитывая, что

н =c/л (1.2)

где с -- скорость света в вакууме, а л -- длина волны возбуждающего излучения,

ДE₁ = hc/ л (1.3)

При соблюдении этих условий молекула может поглотить квант света и за время, равное периоду световых колебаний (10^-15 с), переходит из основного состояния S_o в возбужденное состояние S₁, как это показано вертикальной стрелкой «Возбуждение» на рис.1. Ввиду того, что за столь малый отрезок времени (10^-15 с) расстояние между составляющими молекулу атомами не успевает существенно измениться, согласно принципу Франка - Кондона, молекула оказывается на одном из высших колебательных подуровней возбужденного состояния S₁ и требуется определенное время для рассеяния соответствующей порции энергии ДE_{k 1}, чтобы молекула оказалась в низшей точке энергетической кривой S₁. Как уже упоминалось выше, возбужденное состояние молекулы S₁ является нестабильным, и через некоторое время (t ? 10^-8 с) она возвращается в исходное основное состояние So, излучая избыточную энергию ДE₂ в виде кванта света с длиной волны л ₂ , определяемой уравнением

ДE2 = hc/л₂ (1.4)

При возвращении молекулы в основное состояние она вновь оказывается, в соответствии с принципом Франка - Кондона, на одном из высших колебательных подуровней основного состояния и рассеивает порцию энергии ДE_ko, чтобы оказаться в низшей точке энергетической кривой S_o. Таким образом, излучаемая в виде кванта света энергия ДE₂ оказывается меньше поглощенной при возбуждении энергии ДE1 на величину ДE_k1 +ДE_k2 и в соответствии с уравнением (1.4) длина волны излучения л₂ оказывается больше длины волны возбуждающего кванта л₁.Это характерное для люминесценции соотношение лежит в основе установленного эмпирическим путем закона Стокса. Существуют, однако, случаи, когда за счет внутреннего перераспределения энергии длина волны люминесценции оказывается меньше длины волны возбуждающего кванта. Эта разновидность носит название антистоксовой люминесценции.

Одним из важнейших параметров люминесценции молекулы является ее квантовый выход k, определяемый как отношение числа квантов люминесценции (n_л) к числу поглощенных за то же время молекулой квантов возбуждающего излучения (n_п):

k = n_л /n_п (1.5)

При отсутствии каких-либо процессов, кроме люминесценции, число поглощенных квантов равно числу квантов люминесценции и k = 1. Однако молекула может вернуться из возбужденного состояния не только путем излучения избыточной энергии в виде света. Возможны такие процессы, как передача энергии возбуждения другой молекуле, фотохимическая реакция, рассеяние энергии в виде тепла при участии окружающей среды и т. д. Все эти процессы приводят к тому, что доля молекул, дезактивация которых происходит за счет люминесценции, уменьшается, а может и вообще стать близкой к нулю[4].

Следует иметь в виду, что молекула люминесцирующего вещества, взаимодействуя со специфически организованными биологическими макромолекулами и их комплексами, может резко менять свой квантовый выход как в сторону уменьшения (например, за счет миграции энергии возбуждения), так и в сторону увеличения.

1.1.3 Внутренняя конверсия

В результате поглощения света, в соответствии с выше сказанным, возникает франккондоновское, синглетное, электронно-возбужденное состояние. За время порядка 10^-11-10^-12 с возбужденная молекула без излучательным путем отдает избыток электронной и колеботельной энергии окружающей среде. Этот процесс насит название внутренняя конверсия. В результате все молекулы независимо от того, в кокое электронно колебательное состояние они были приведены поглощенным квантом, переходят на низший подуровень колебательного первого синглетного возбужденного состояния. От состояния S^* берут начало все следующие, конкурирующие между собой процессы, которые приводят к дезактивации возбужденной молекулы.

Вероятность каждого из них находят как частное от деления константы данной скорости реакции на суму констант всех реакций. К примеру, вероятность флуоресценции определяется как:

P₄=k₄/(k₁+k₂+k₃+k₄+k₅)

1.1.4 Флуоресценция

Флуоресценция это физический процесс, который описывается формулой

S*>S₀+hг

Возбужденная молекула проходит в основное состояние за время 10^-8-10^-9с. с излучением кванта света. При этом фотоэлектрон опускается на различные колебательные подуровни основного состояния. Осциллятор Флуоресценция совпадает с осциллятором длинноволновой полосы поглощения. Основные характеристики флуоресценции:

· спектры излучения и возбуждения

· квантовый выход

· время жизни

· поляризация

Спектр флуоресценции -это зависимость интенсивности излучения от длинны волны (частоты) света. Спектры флуоресценции сдвинуты в длинноволновую область по сравнения с длинноволновой полосой поглощения (правило Стокса) и зеркально -симметричны ей (правило Левшина). Из правила Стокса следует, что энергия кванта флуоресценции меньше энергии кванта возбуждающего света. Как упоминалось выше это обусловлено двойной потерей энергии на пути между франк-кондоновскими состояниями и равновесным электронно-колебательным основным состоянием. Также благодаря внутренней конверсии спектры флуоресценции не зависят от длинны волны возбуждающего света [4]. Длинна волны, при которой пересекаются спектры флуоресценции и поглощения, соответствует электронному 0-0 переходу. Энергия излучаемого при этом кванта света соответствует энергии синглетного электронно- возбужденного состояния, которая может использоваться при биохимических реакциях. Спектры флуоресценции индивидуальная характеристика вещества. Колебательная структура спектров флуоресценции отображает систему колебательных подуровней основного состояния молекулы.

Квантовый выход флуоресценции - отношение количества высвеченных квантов к поглощенным. Он отображает вероятность дезактивации синглетного возбужденного состояния излучательным путем.

Как правило, его величина меньше 1. Квантовый выход флуоресценции имеет постоянные значения, независимо от того светом какой длинны волны, в пределах полосы поглощения освещают вещество (закон Вавилова). Причина это-установление теплового равновесия в системе возбужденная молекула-среда с испусканием квантов света с одного и того же нижнего колебательного подуровня возбужденного состояния. Закон постоянства квантового выхода дает возможность определять спектры поглощения веществ с помощью флуориметрии, что имеет особое значение для биологических соединений, сильно рассеивающих свет. При этом изменяюс свет возбуждения свечения, чтобы определить: на сколько свет этой длинны волны эффективный для возбуждения свечения:

f(л)=n_фл /n_в

где n_фл-количество квантов флуоресценции

n_в- количество квантов возбуждающего (падающего на образец) свата. При одной и той же квантовой интенсивности возбуждающего света количество возбужденных молекул, а следовательно, и интенсивность флуоресценции будет прямо пропорциональна поглощению:.

f(л)=В(1-Т).

Исходя из этого спектр возбуждения должен совпадать со спектром поглощения. Такое совпадение имеет место для образцов с низким значением оптической плотности D (D<0,2).

Время жизни возбужденного состояния, отражает среднестатистическое время существование возбужденного состояния ( ф ). Молекулы возбужденные в один момент дезактивируются по экспоненциальному закону: ( ф представляет собой время за которое интенсивность уменьшилась в е раз. Измеренное в эксперименте ф имеет заниженное значение в сравнении с реальностью. Реальное время жизни определяется толоко внутренними свойствами молекулы. Причиной этого является безизлучательная и тепловая диссипация энергии- тушения II рода, происходящего в течении всего времени жизни возбужденного состояния. Длительность затухания флуоресценции в различных участках спектра обычно одинакова.

Поляризация флуоресценции. В молекулах осцилляторы прямого (поглощения) и обратного (флуоресценция) переходов S₀-S ориентированы одинаково. Поэтому при освещении раствора поляризованным светом флуоресценция также будет поляризованной, если за время возбужденного состояния молекулы ну успевают переориентироваться. Поляризованность флуоресценции оценивается по степени поляризации.

P_фл=(I_||-I_v)/(I_||+I I_v)

Где I_|| и I_v интенсивности световых потоков флуоресценции поляризованных взаємноперпендикулярно. Эта зависимость называется поляризационным спектром флуоресценции.

Так как интеркомбинационная конверсия, фосфорисценция и миграции энергии не являются темой датой роботы -их теоретические особенности мы на будем рассматривать.

1.2 Физические и химические основы хемилюминесценции

В соответствии с современными представлениями, много жизненно важных метаболических и физиологических процессов, которые протекают в организме, тесно связаны с СРО (свободно-радикальным окислением). Протекает ВРО по следующим этапам [6]:

Зарождение цепи (инициирование) со скоростью под действием физических и химических факторов. Эта стадия цепной реакции, в которой образовались свободные радикалы с валентно- ненасыщенных молекул исходных веществ.

Продолжение цепи есть стадией, которая протекает с сохранением свободной валентности и приводит к затратам исходных веществ и образованием продуктов реакции, в частности перекисных радикалов

(II)

Разветвление цепи характеризируется превращением активних, промежуточных частиц и появленим в системе нових радикалов. Оно приводат к возрастанию количества СР.

(III)

Обрыв цепи приводит к потере свободной валентности.

(IV)

Как видно на последнем этапе происходит обрыв цепи с излучением квантов света. Именно оно получило определение биохемилюминесценция. Инициаторами окисления выступают активные формы кислорода, излучение и окислители. Спектры свечения СРО как правило находятся в границах 360-800 нм [?]. Тушителями выступают антиоксиданты, нехватка или избыток кислорода.

По интенсивности ХЛ может бать видима глазу (некоторые насекомые, медузы). К видимому глазу излучению относят физиологическое свечение на длинне волны 400-700 нм, которое вызывает ферментативные реакции с участием АТФ, кислорода и металлов. В основе этого процесса лежат окислительные реакции, которые протекают с участием молекулярного кислорода, специфических ферментов и субстратов, в частности люциферин- люцеферазы или ксантин-ксантиоксидазы. Кроме того, биологические объекты излучают световые потоки очень низкой интенсивности в ультрафиолетовой, видимой и инфракрасной области спектра, которые регистрируются с помощью специальных приборов. Излучение клеток в инфракрасном диапазоне связано с физико- химическими процессами в белковых, полипептидных и углеводородных компонентах клетки, влияет на митоз и названо митогенным. Митогенное излучение происходит, на длинне волны 190-320 нм является следствием физико-химических процессов в белках и углеродах.

Интенсивность излучения в видимой и инфракрасной области спектра зависит от уровня обменных процессов и поэтому называется метаболическим, оно происходит на длине волны 360-1200 нм. Оно возникает в результате ферментативных окислительных реакций, которые протекают с образованием СР. Уровень спонтанной биохемилюминесценции можно повысить различными способами, которые повышают квантовый выход реакции или ускоряют процессы СРО. К первым относят непосредственно люминол, люминесцентные зонды, люцегинин, эозин и др. Ко вторым -до других - физические та химические инициаторы. К физическим инициаторам относятся: ультразвук, нагревание, облучение и другие. Химические инициаторы это соли железа, перекись водорода и др.

Тесть активаторы это соединения, которые вступают в реакции с активными формами кислорода или органическими СР, в ходе которых образуются молекулы продуктов в возбужденном состоянии.

Хемилюминесценция определяется кинетикой электронно возбужденных состояний (электронной кинетикой) в реагирующем растворе. Ее основными процессами являются: электронное возбуждение в ходе реакции, электронная конверсия между возбужденными состояниями, гашение (конверсия в основное состояние), спонтанные и стимулированные фотопереходы.

Для биомолекулярных систем, существенна также колебательная релаксация в возбужденных и основном электронных состояниях. В биомолекулярных системах к электронному возбуждению атомов и молекул также приводят многочисленные химические процессы и биологические превращения. Эти процессы отличаются разнообразными свойствами кинетики. Энергия, что приводит к электронному возбуждению выделяется в процессе элементарных актов быстрого распада тетроксида -одного с неустойчивых промежуточных продуктов СРО. Энергия тепловой эффект реакции, выделяется за счет разности энергий стойких связей продуктов распада (кетонов, спиртов, альдегидов, молекулярного кислорода) и слабых связей тетроксида.

Разница энергий разорванных и снова созданных связей равна (100 ккал/моль (400 кДж). Этой энергии достаточно для заселения возбужденных электронных состояний полученных карбоксильных соединений: кетонов, альдегидов и кислорода. Именно тетроксид получается в реакции рекомбинации СР HROO ненасыщенных жирных кислот (НЖК). Часть возбужденных продуктов тратит свою энергию электронного возбуждения в виде излучения ХЛ.

1.3 Возбуждение и измерение интенсивности люминесценции клеток и биологических жидкостей

В центре проблемы конструирования аппаратуры находятся преобразователи, переводящие биохимические процессы в электронные эффекты и электрические сигналы [1].

Как было упомянуто выше, один из основных способов возбуждения люминесценции состоит в использовании квантов света с более короткой, чем у люминесцентного излучения, длиной волны. При этом существуют различные способы возбуждения люминесценции микрообъекта для последующего микроскопического изучения его. Простейший способ представлен на рис. 2, и заключается в том, что из суммарного светового потока источника (1), сформированного коллекторной линзой (2), узкополосным фильтром (3) вырезается необходимое для возбуждения излучение, лежащее в узком спектральном интервале. Это излучение конденсором (4) фокусируется на микрообъект (5) и возбуждает его люминесценцию. Свет люминесценции объекта (5) и прошедшее через объект возбуждающее излучение (на 2-3 порядка более интенсивное, чем люминесценция) собирается микрообъективом (6), формирующим изображение микрообъекта в фокальной плоскости окуляра (8), Расположенный между микрообъективом (6) и окуляром (8) запирающий светофильтр (7) предназначен для полного устранения прошедшего через микрообъект (5) возбуждающего излучения, что дает возможность рассматривать через окуляр (8) изображение микрообъекта в свете его люминесценции.

Недостатки этого способа, называемого возбуждением люминесценции в проходящем свете, очевидны. Во-первых, наиболее ярко люминесцируют нижние слои микрообъекта, в то время как наиболее удобны для наблюдения верхние слои, т.е. способ применим только для достаточно тонких срезов. Вторая особенность, хотя и не носит принципиального характера, тем не менее, накладывает серьезные ограничения на применение этого метода и состоит в трудности отделения проходящего через объект интенсивного возбуждающего излучения.

Для исследования поверхностных слоев в этом случае используют методы исследования затухания волн, генерируемых при внутреннем отражении света.

Спектроскопия внутреннего отражения (ВО)- хорошо известный метод изучения реакций в расположенном вблизи непрерывной поверхности слое порядка длинны волны света. В основе СВО лежит явление отражения света на границе между двумя прозрачными средами с различными показателями преломления. При полном внутреннем отражении светового пучка в оптически более плотную среду в оптически менее плотной среде вблизи отражающей поверхности генерируется электромагнитная волна. Эта волна является частью отражаемого светового пучка и соответствует этой небольшой доле света, который проникает в среду с меньшим показателем преломления. Эта затухающая электромагнитная волна и является тем самым «чувствительным» элементом, который оптически взаимодействует с соединениями. Находящимся вблизи или на исследуемой поверхности. За оптическим взаимодействием в данной системе можно следить по изменению интенсивности света, который выходит из оптически более плотной среды [3]

Мы не будем углубляется в данный метод, так в работе он использоваться на будет. Стоит только отметить, что этот метод активно применяется в современной иммунологии.

Возбуждение также проводят лазерным пучком.

Лазерный пучок обладает рядом параметров, которые весьма постоянны во времени, а при взаимодействии с различными типами материалов легко и специфично меняются, причем такая модификация поддается весьма точному анализу. К ним относятся интенсивность, монохроматичность, фаза, поляризация и т. д. Достоинства лазера связаны с тем что эти параметры воспроизводятся с погрешностью менее 1 %, а сам лазерный контроль является неразрушающим (т.е. без возмущения и загрязнения исследуемой системы)

Рис.3 Схемы различных элементов внутреннего отражения:

а) призма с однократным отражением.

б) элемент с многократным отражением.

в) детектирование флуоресценции под прямым углом

г) детектирование флуоресценции по ходу отраженного луча

Исключением из рассмотренных выше приборов являются приборы исследуемые ХЛ. Эти приборы не требуют источника возбуждения, поскольку свет генерируется в ходе химической реакции. Интенсивность ХЛ пропорциональна скорости генерации продукта, а не его концентрации. Здесь измеряемым параметром является стационарное излучение света по мере взаимодействия определяемого вещества в фазе реагента.

2. ПРИБОРЫ И ТЕХНИКА ЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО СПЕКТРАЛЬНОГО АНАЛИЗА КЛЕТОК

Какие бы заманчивые перспективы не открывались в биологии клетки в связи с внедрением в практику лабораторного эксперимента методов люминесцентного спектрального анализа, возможность их реализации зависит, прежде всего, от наличия в распоряжении исследователя соответствующей техники эксперимента. Важнейшими приборами, необходимыми для этой цели, являются микроспектрофлуориметры в состав которых входят фотоусилители и фотоумножители. Перед тем как рассматривать схемы спектрофотометров остановимся на фотоумножителе.

Фотоумножитель - это прибор, в котором падающее на него излучение (оптического диапазона) «электромагнитное излучение» многократно усиливается и преобразуется в импульсы тока. Регистрируются эти импульсы либо путем усреднения по времени (метод постоянного тока), либо путем счета отдельных фотонов (метод счета фотонов). По результатам измерений этими методами можно определить поток излучения, падающего на катод ФЭУ, который считается пропорциональным в первом случае - силе тока через ФЭУ, во втором - числу импульсов, рождающихся за единицу времени [2].

2.1 Вакуумный фотоумножитель

Перед тем как рассмотреть конструкцию фотоумножителя ФЭУ-79 который мы использовали в нашей работе, укажем его оптические характеристики основные характеристики

1) область спектральной чувствительности от 300 до 800 нм

2) область максимальной спектральной чувствительности от 400 до 440нм.

Так как биообъекты имеют хемилюминесценцию именно в этом диапазоне, то в аппаратуре по исследованию биообъектов чаще всего применяется именно этот фотоумножитель.

Рассмотрим конструкцию фотоумножителя типа ФЭУ-79 (Рис. 4)

Рис. 4 Конструкция фотоумножителя ФЭУ-79

Излучение попадает на фотокатод фотоумножителя, который находится в стеклянной вакуумной камере. Электроны, выбиваются с катода, а потом ускоряются электрическим полем, двигаясь от одного динода к другому и выбивая из них все новые и новые электроны. В итоге один фотон, рождает целый каскад электронов на выходе, воспринимаемый как очень короткий электрический импульс.

Количество усилительных каскадов у ФЭУ-79 (количество динодов) равно 11. Фотокатод - полупрозрачный мультищелочной (сурьмяно-калиево- натриево-цезиевый), характеризуется квантовым выходом e.

e = n_фэ/n_фот

n_фэ - число фотоэлектронов, выбиваемых в результате фотоэффекта

n_фот- число упавших фотонов

Характерный квантовый выход ФЕУ-79 10%.

Принципом работы фотокатода является внешний фотоэффект. Но при нормальных рабочих условиях, а именно температурах (0-20^° С) бывает существенен и другой процесс, вызывающий появление в катодной камере электронов - это термоэмиссия фотоэлектронов с фотокатода. Этот эффект создает так называемый темновой ток ФЭУ (ток на выходе при отсутствии излучения на входе). Кроме этого, вклад в темновой ток дает термоэмиссия с динодов, а при высоких напряжениях могут стать существенными также различные разрядные процессы в колбе ФЭУ. Для уменьшения темнового тока существуют два принципиальных метода:

· Охлаждение ФЭУ, это вызывает уменьшение потока термоэлектронов;

· Уменьшение рабочей области фотокатода (это допустимо, так как пучок падающего света может быть сфокусирован даже на небольшую область фотокатода).

В конструкции ФЭУ-79 применен второй метод, что не исключает, естественно, и возможности использования первого, так как в хемилюминометре есть возможность охлаждения ФЭУ с помощью проточной воды. Катодная камера ФЭУ-79 является электронно-оптической линзой, которая "строит" на первом диноде изображение не всего катода (диаметром 30 мм), а только небольшой его центральной части (диаметром около 6 мм). Это ограничивает рабочую область фотокатода. Чувствительность самого фотокатода по площади можно считать постоянной, но из-за применения метода (уменьшение рабочей области фотокатода) она становится неравномерной и определяется зонной характеристикой. От положения оси электронной линзы зависит положение области максимальной чувствительности. Для каждого данного ФЭУ оно определяется отдельно.

Коэффициент усиления одного каскада ФЭУ (коэффициент вторичной эмиссии невелик) ? 3-5, однако большое число динодов позволяет достигать общего усиления от 10⁶ до 10⁸ раз. Коэффициент вторичной эмиссии зависит от энергии первичных электронов, т.е. от ускоряющего междинодного напряжения. Поэтому коэффициент усиления всего ФЭУ зависит от напряжения питания U_пит. Потенциалы динодов задаются делителем напряжения. Характерные напряжения питания ФЭУ, B, не более 1,5* U_Sa=1000

U_Sa=1000- напряжение соответствующие световой анодной чувствительности 100А/лм.

В настоящее время в биофизических исследованиях практически всегда используется метод счета фотонов, который имеет следующие основные достоинства перед методом регистрации тока:

1. Линейность в большом диапазоне измеряемых интенсивностей;

2. Высокая точность (достижима точность, при которой ошибка измерения определяется только статистическими флуктуациями потока фотонов, поскольку все фотоны "считаются" с одинаковым стат. весом);

3. Удобный для дальнейшей обработки способ выдачи информации;

4. Возможность уменьшения темнового тока (т.е. числа темновых импульсов) за счет отбора темновых импульсов по амплитуде.

Поэтому в дальнейшем мы будем рассматривать основные характеристики ФЭУ, работающего в режиме счета фотонов.

Счетная характеристика фотоумножителя это зависимость выходного сигнала (скорости счета n имп./с) от напряжения питания U_пит . Типичный ее вид представлен на рисунке (Рис. 5)



Рис. 5 Счетная характеристика фотоумножителя

спектрофотометрия флуоресценция фотобиологический

Для объяснения формы кривой счетной характеристики рассмотрим другую важную характеристику ФЭУ - амплитудное распределение выходящих импульсов.

Пускай амплитудное распределение выходящих импульсов n(A) , где n - число импульсов на выходе ФЭУ с амплитудой в диапазоне от A до A+dA. На Рис.6 приведены типичные зависимости n(A) для сигнальных и темновых импульсов (кривые 1 и 2 соответственно).



Рис.6 Зависимости n(A) для сигнальных и темновых импульсов (кривые 1 и 2 соответственно)

Зависимости сигнальных и темновых импульсов имеют две выделенные точки A₁, A₂ . Спад функции от 0 до A₁ определяется импульсами, которые возникают в результате термоэмиссии электронов с динодов. Эти импульсы усиливаются не на всех каскадах ФЭУ и поэтому имеют малую амплитуду. Для А > А₁ зависимость n_t(A) определяется в как правило импульсами, которые возникают в результате усиления катодных термоэлектронов. В этом случае n_t(A) имеет вид распределения Пуассона со средней амплитудой A₂. Поэтому, чтобы избавится от динодных импульсов, нужно установить на выходе ФЭУ пороговую схему (дискриминатор), которая не пропустит импульсы с амплитудой A < A_d=A₁. Импульсы катодного происхождения, несут информацию об измеряемом источнике. Поэтому амплитудное распределение для сигнальных импульсов катодного происхождения сдвинуто в область больших амплитуд. Дискриминация импульсов с амплитудой A < A1 не уменьшает существенно число сигнальных импульсов.

Амплитудное распределение импульсов n(A) является дифференциальной характеристикой, n(A)=dN/dA, где N(A) - число импульсов с амплитудой, меньшей чем А. При измерении на выходе ФЭУ числа импульсов, прошедших пороговую схему с уровнем дискриминации A_d, то, можно получить N(A_d) ~ т_Ad^Ґ n(A)dA , весьма похожее по форме на зеркальное отражение счетной характеристики. При этом точка A₁ будет соответствовать минимуму производной dN/dA , а точка A₂ - максимуму.

Это сходство характеристик счетных и интегральных амплитудных распределений выходных импульсов ФЭУ не случайно. Счетние характеристики снимаются при постоянном уровне дискриминации A_d = const, при этом изменяется напряжение питания, а амплитудные распределения - наоборот: при U_пит=const, но при изменяется уровень дискриминации A_д. Амплитуды импульсов на выходе фотоумножителя определяются средним коэффициентом усиления K_у ФЭУ. Измеряемые амплитуды в первом приближении пропорциональны K_у. Коэффициент усиления увеличивается с ростом U_пит, поэтому при счете импульсов увеличение U_пит эквивалентно уменьшению A_д. Поэтому, счетная характеристика можно считается аналогом амплитудного распределения. Существование трех основных зон на счетной характеристике (Рис5.) объясняется: 1-й зоны (объясняется катодными импульсами большой амплитуды), 2-й зоны (объясняется практически всеми катодными (сигнальные и темновые) импульсами), 3-й зоны (начинается счет динодных и темновых импульсов).

Для идеального ФЭУ значение n_с(U) в области 3 должно достигать некоторого предела (подсчитываются все импульсы). При больших U_пит внутри колбы возникают разрядные процессы, вызывающие появление на выходе импульсов большой амплитуды ( A_раз > A₂ ) поэтому для реальных ФЭУ этого не происходит. Именно увеличение числа импульсов объясняет загиб вверх счетной характеристики n_c(U) в области 3 (Рис. 5). Это зона неустойчивой работы ФЭУ, и ее стараются избегать.

Кроме ФЭУ, в состав счетчика фотонов, как правило входят также:

1. Усилитель выходных импульсов ФЭУ (фотоусилитель);

2. Дискриминатор-формирователь выходных импульсов, который создает импульсы формы и амплитуды, необходимой для введения их в счетчик импульсов;

3. Счетчик импульсов, измеряющий число импульсов за установленный промежуток времени и выдающий результат в удобном для обработки виде (самописец или непосредственно в ЭВМ);

4. Блоки питания ФЭУ, усилителя, дискриминатора.

Это вакуумные фотоусилители рассмотрим теперь электронные фотоусилители которые использовались в данной работе.

2.2 Лавинные фотодиоды

Лавинный фотодиод - это полупроводниковый фотоприемник , в котором повышение квантовой эффективности реализуется за счет внутреннего усиления благодаря лавинному умножению в обратно смещенном p-n переходе [2].



Рис. 7 Принцип действия лавинного фотодиода.

Для существования лавинного умножения необходимо выполнить два условия:

1) Электрическое поле области пространственного заряда должно быть достаточно большим, чтобы на длине свободного пробега электрон набрал энергию, большую, чем ширина запрещенной зоны:

2) Ширина области пространственного заряда должна быть существенно больше, чем длина свободного пробега

л<<W

Микропиксельные лавинные фотодиоды (МЛФД) представляют собой приборы нового типа для детектирования вспышек света малой интенсивности (на уровне одиночных фотонов). Основные преимущества этих детекторов, по сравнению с традиционными приборами (ФЭУ) в том, что МЛФД является более компактным прибором, нечувствительным к магнитному полю, может иметь большую эффективность регистрации света, сочетая при этом меньшую стоимость.

Использование таких фотодиодов позволяет создать компактные детекторы излучений, которые могут быть применены для разработки приборов нового поколения широкого назначения. Отметим некоторые области их применения: фундаментальные физические исследования; медицинская диагностическая аппаратура: рентгеновский томограф, ПЭТ, однофотонный эмиссионный томограф; регистрация излучений (индивидуальные дозиметры, радиационная разведка, мониторинг) и т. д.

МЛФД представляет из себя набор микроячеек - пикселей. Каждый пиксель работает в так называемом «гейгеровском» режиме и способен детектировать единичные фотоны. «Гейгеровский» режим обеспечивает очень высокий коэффициент усиления до 10⁶. Однако, пиксель работает как счетчик фотонов в режиме «да/нет» и не способен регистрировать интенсивность падающего излучения. Основная идея при создании МЛФД - это объединение множества таких счетчиков (ячеек, пикселей) в матрицу на общей кремниевой подложке. Если интенсивность световой вспышки невелика, то вероятность возникновения двух и более фотоэлектронов в каждом отдельном пикселе мала, в результате чего образующийся на общей нагрузке сигнал пропорционален числу падающих на прибор фотонов. Таким

образом, МЛФД, как целое, является прибором способным регистрировать интенсивность света (количество фотонов) с динамическим диапазоном, соответствующим числу пикселей фотодетектора.

На сегодняшний день существуют две основные конструкции МЛФД -

поверхностно-пиксельная и глубинная. Поверхностно-пиксельная позволяет создавать плотности пикселей порядка 1000 шт/кв.мм. В отличие от этого, новая глубинная технология позволяет создавать плотности вплоть до 40 000 шт/кв.мм, что значительно увеличивает динамический диапазон МЛФД и расширияет области их возможного применения.

Именно эти фотоумножители используются в фотоапаратах

2.3 Стандартный микроспектрофлуориметр

Стандартный микроспектрофлуориметр является наиболее простым в изготовлении, его принципиальная схема [1], приведена на Рис. 8. Основным элементом оптической схемы прибора служит трехпризменный светосильный спектрограф ИСП-51 со стеклянной оптикой на область спектра от 370 до 1000 нм. Сочленение спектрографа 1 с микрообъективом 14, достигается тем, что входная щель 7 спектрографа помещена в плоскость промежуточного изображения микроскопа, состоящего из микрообъектива 14 и окуляра Гюйгенса 4 (линзы 6 и 8).

Оптическая система микроспектрофлуориметра при регистрации спектров люминесценции клеток работает следующим образом. Источник света - ртутная дуговая лампа 25 - освещает коллекторную линзу 24, действующие размеры которой ограничиваются диафрагмой 23. После этого световой поток проходит через водный теплофильтр 22 (4%-ный раствор СuSO₄) и светофильтры 21, выделяющие необходимую для возбуждения люминесценции линию излучения ртути.



Рис.8 Блок-схема микроспектрофлуориметра

1- призменный монохроматор (ИСП-51); 2-мотор развертки спектра;

3-поворотная призма; 4-визирная трубка; 5-узел входной щели; 6-8- линзы окуляра Гюйгенса; 7 -входная щель; 9,11,18,34,35- зеркала; 10- кювета; 12-Светоделительная пластина с интерференционным покрытием

13- револьверный держатель микрообъектов; 14 -объектив; 15- препарат

Возбуждающее люминесценцию излучение отражается опак-иллюминатором с интерференционной светоделительной пластинкой 12 и микрообъективом 14, установленным в стандартном револьверном держателе от любого биологического микроскопа, направляется на микрообъект 15. При этом в плоскость микрообъекта проецируется изображение диафрагмы 23, являющейся, таким образом, полевой диафрагмой.

Свет люминесценции препарата, собранный высокоапертурным микрообъективом 14 и прошедший через пластинку 12 с интерференционным покрытием, поворотным зеркалом 11 и линзой 6, направляется в спектрограф ИСП-51. При этом в плоскости входной щели 7 спектрографа находится промежуточное люминесцентное изображение микрообъекта. Таким образом, входная щель 7 спектрографа вырезает требуемый участок увеличенного изображения исследуемой клетки. Этот участок и его расположение во входной щели спектрографа можно визуально наблюдать при введении в ход лучей поворотной призмы 3.

Промежуточное изображение объекта исследования в плоскости полевой диафрагмы окуляра Гюйгенса (входной щели 7 спектрографа) рассматривается с помощью визирной трубки 4. При этом окончательно выбирается для исследования участок микрообъекта. Затем поворотная призма 3 выводится из хода лучей и световой поток из входной щели

поступает в коллиматор спектрографа. Свет люминесценции выбранного участка объекта исследования, ограниченного входной щелью, разлагается призмами в спектр, изображение которого фокусируется выходным объективом фотокамеры в плоскость кассеты для фотопластинок, где устанавливается выходная щель спектрографа. Непосредственно за ней находится фотокатод фотоэлектронного умножителя со спектральной чувствительностью от 400 до 800 нм. Таким образом, регистрирующий узел вместе с выходной щелью и кожухом ФЭУ и его делитель напряжения может быть установлен вместо обычной кассеты для фотопластинок. Разрешающая способность спектрографа при этом несколько ухудшается, однако для широких линий люминесценции биологических объектов это улучшение не столь существенно. Препарат 15 размещается на предметном столике 16 от микроскопа. С помощью конденсора 17, зеркала 18 и осветителя 19 возможно освещение препарата проходящим светом от лампы накаливания. Такое освещение может быть полезным для предварительного выбора участка клетки без излишнего освещения его лучами сине-фиолетовой или УФ-области спектра. Излучение этого же источника света, выделенное узкополосным интерференционным светофильтром, может быть использовано для контроля рассеивающих свойств изучаемой области объекта, как это упоминалось выше.

Ценным качеством описанной выше базовой модели является простота ее изготовления из узлов по сути дела снятых с вооружения современных лабораторий оптических приборов. Обладая высокой чувствительностью, эта модель микроспектрофлуориметра может быть использована для исследования спектров люминесценции клеток в области 500--700 нм без коррекции регистрируемой кривой на спектральную чувствительность установки.

Основным недостатком модели являлся завал спектральной характеристики в области от 400 до 500 нм, определяемый спектральной характеристикой стандартной «желтой» интерференционной светоделительной пластинки 12. Расширить спектральный диапазон микроспектрофлуориметра можно, заменив эту пластинку на «синюю» светоделительную пластинку. Для возбуждения люминесценции будут использоваться только лучи УФ-области спектра в диапазоне от 300 до 400 нм. При этом спектральный диапазон микроспектрофлуориметра, в котором можно регистрировать спектры люминесценции объекта практически без коррекции их на спектральную чувствительность прибора, увеличивается от 420 до 700 нм.

2.4 Малогабаритный инвертированный микроспектрофлуориметр

Описанная выше установка для микроспектрального люминесцентного анализа клеток обладает большим весом и довольно громоздка [1]. В лабораторных условиях эти обстоятельства не играют существенной роли. В то же время необходимость поисков объектов исследований, наиболее удобных для решения проблемы, требует зачастую проведения экспедиционных работ. Особенно важным это бывает при изучении молекулярной организации функциональных механизмов живой клетки. В этих условиях компактность прибора, его малый вес и габариты, а, следовательно, транспортабельность приобретают существенное значение.



Рис. 9 Блок-схема инвертивного микроспектрофлуориметра

1-призменный монохроматор; 2-кулачек развертки спектра; 3- призма; 4-окуляр; 5-поворотная призма; 6-щелевая диафрагма; 7 -зеркало; 8-окуляр; 9- сменная интерференционная светоделительная пластина; 10-запирающий светофильтр; 11,13- линзы; 12-полевая диафрагма; 14- апертурная диафрагма; 15-светофильтры; 16- жидкостный теплофильтр; 17-коллектор; 18- источник света; 19- микро объектив; 20- предметный столик с препаратом;

Блок-схема малогабаритного микроспектрофлуориметра приведена на Рис. 9. Этот прибор представляет собой дальнейшую модификацию базовой модели (Рис. 8). Основное отличие заключается, прежде всего, в применении инвертированной схемы наблюдения и регистрации люминесценции. Это создает большие удобства при исследовании люминесценции и биолюминесценции клеток мелких морских животных, которых можно в специальной кювете поместить на предметный столик 20, отпрепарировать с помощью бинокулярной лупы 22 и, разместив в поле зрения объектива 19 микроспектрофлуориметра необходимый участок клетки, приступить к его спектральным исследованиям.

Остальные изменения по сравнению с базовой моделью (Рис. 8) носят непринципиальный конструктивный характер и направлены на увеличение компактности системы.

На Рис. 10 приведена функциональная схема с плоским волноводом для имуноанализа. Как мы рассказывали выше, этот прибор основан на внутреннем отражении. Из схемы видно, что принципиальная схема остается той же но в схеме уже присутствует волновод. Схемы функциональных элементов и объяснения к их работе приведено в главе 1.3



Рис. 10 Схема установки МНПВО с плоским волноводом для имуноанализа.

РМ-вакуумный фотоумножитель; РD- фотодиод, МС-монохроматор; М-зеркала; 1-импульсная ксеноновая лампа; 2- проточная ячейка; 3- прокладка; 4-волновод; 5-призма; 6- фильтр; 7-предусилитель; 8-управление импульсной лампой; 9-персональный компьютер, 10 -печатающее устройство; 11-гибкий диск.