Использование ДНК-анализа в системе противолейкозных оздоровительных мероприятий у крупного рогатого скота

Экономический ущерб от распространения гемобластозов сельскохозяйственных животных. Роль и результативность применения методов ПЦР и РИД в ранней диагностике лейкоза крупного рогатого скота и проведении противолейкозных оздоровительных мероприятий.

Рубрика Сельское, лесное хозяйство и землепользование
Вид дипломная работа
Язык русский
Дата добавления 05.09.2012
Размер файла 622,7 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Сыворотку для исследования получают из крови испытуемого животного в количестве 2-3 мл и направляют в лабораторию с сопроводительным документом, в котором указывают название хозяйства, номер (кличку), возраст, пол, породу животного.

Кровь берут в бактериологические пробирки "monovet". При невозможности быстрого исследования подготовленные сыворотки хранят в замороженном состоянии.

Разбавитель ССА и солевую смесь агара переносят в колбу и приливают дистиллированную воду, затем колбу помещают в водяную баню и выдерживают до полного расплавления гранул агара. Расплавленный агаровый гель, имеющий температуру 50-70° С, разливают слоем 2-3 мм (12-15 мл) в обезжиренные чашки Петри и оставляют их приоткрытыми при комнатной температуре в течение 1 ч. После застывания агара специальным штампом-пробойником делают лунки в геле, не допуская образования трещин между ними и отслоения агара от дна чашки. В каждой чашке делают по четыре фигуры, каждая из которых состоит из семи лунок: одна в центре, остальные по периферии. Диаметр каждой лунки составляет 7 мм, расстояние между центральной и периферическими лунками - 3 мм.

Антиген, контрольные и испытуемые сыворотки вносят в лунки каждой фигуры автоматическими пипетками со сменными наконечниками. Антиген (А) вносят в центральную лунку, две диаметрально противоположные лунки заполняют контрольной сывороткой (КС). Оставшиеся в фигуре 4 периферические лунки заполняют испытуемыми сыворотками. Лунки заполняют доверху, не допуская переливания жидкости через край. После заполнения всех лунок чашки Петри закрывают крышками и инкубируют во влажной камере при температуре 22-27°С.

Реакцию учитывают не ранее, чем через 48 ч и не позднее, чем через 96 ч. Чашки просматривают на темном фоне, направляя сфокусированный луч осветителя на дно чашки под углом 30-45°. Специфичность реакции оценивают по контрольной линии преципитата. Если она отсутствует или слабо выражена, то реакцию следует повторить.

Специфическая линия преципитации, формируемая преципитирующей контрольной сывороткой и антигеном, должна быть четкой, иметь форму прямой, располагаться на одинаковом расстоянии от лунок с антигеном и контрольной сывороткой.

Неспецифической считают линию преципитации, которая образуется между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном, но не сливается с контрольной линией преципитации, а пересекает ее или упирается в нее, образуя угол.

В зависимости от наличия специфических антител против антигенов ВЛКРС в испытуемой сыворотке реакцию оценивают как положительную или отрицательную. Положительной считают реакцию, если между лунками с антигеном и испытуемой сывороткой образуется полоса преципитации, которая соединяется с полосой преципитации контрольной сыворотки, образуя непрерывную линию, то есть идентична ей (рис.1, поз.1):

· если линия преципитации между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном отсутствует, но контрольная линия преципитирующей сыворотки образует вблизи лунки с испытуемой линией изгиб, направленный в сторону лунки с антигеном (рис.1, поз.2) - слабо положительная сыворотка;

· если контрольная линия значительно укорочена со стороны лунки с испытуемой сывороткой и имеет размытый изгиб к лунке с антигеном или образует линию преципитации, расположенную очень близко от лунки с антигеном (рис.1, поз.2) - резко положительная сыворотка.

Положительно реагирующая сыворотка может образовывать вторую линию преципитации, которая располагается ближе к лунке с испытуемой сывороткой. Эта линия указывает на наличие в сыворотке преципитирующих антител против второго антигена (р24) ВЛКРС (рис.1, поз.3).

При образовании толстой, короткой, без загибов контрольной линии преципитации, не доходящей до лунки с испытуемой сывороткой, необходимо провести раститровку этой испытуемой сыворотки физраствором до получения результата, который можно будет оценить как отрицательный, положительный или неспецифический. Для этого необходимо физиологический раствор в объеме 100-500 мкл разлить в пробирки или в лунки стандартных пластиковых плат для постановки серологических реакций (количество пробирок или лунок соответствует числу необходимых разведении). В первую пробирку или лунку с физраствором внести такой же объем сыворотки, тщательно перемешать и перенести той же пипеткой в том же объеме в следующую пробирку или лунку, затем после перемешивания - в следующую и т.д. В результате в первой пробирке или лунке испытуемая сыворотка разведена в 2 раза, во второй - в 4 раза, в третьей - в 8 раз и т.д.

Реакцию считают отрицательной, если контрольная линия продолжается до лунки с испытуемой сывороткой без загиба (рис.1, поз.4). В случаях, когда линия преципитации плохо просматривается или имеется зона опалесценции вокруг лунок, реакцию следует переставить.

Сдвиг контрольной линии преципитации в сторону лунки с антигеном или с контрольной сывороткой указывает на нарушение соотношения антигена и антител в тест-системе. В этом случае необходимо использовать другую серию диагностического набора.

Рис.1 Результаты реакции антигена ВЛКРС с отрицательной (ОС), положительной (ПС), слабоположительной (СПС), резко положительной (РПС) и положительной с антителами к р24-антигену испытуемыми сыворотками в РИД. (* - неспецифические линии преципитации)

3. Использование ДНК-анализа в системе противолейкозных оздоровительных мероприятий у крупного рогатого скота

С целью экспериментального подтверждения возможности снижения количества инфицированных телят при 100 % инфицированности матерей был поставлен эксперимент 1.

В хозяйствах ОАО "Племзавод им. Чапаева В. И." Динского района и ЗАО АФП "Нива" Каневского района Краснодарского края выделили по одной группе глубокостельных коров. Каждая группа состояла из 27 животных положительно реагировавших в РИД. После отёла у матери и телёнка брали пробы крови, которые исследовали с использованием ПЦР. Процедуру повторяли каждые полтора месяца до достижения телятами возраста 6 месяцев. Полученные данные приведены в таблице 1.

Таблица 1. Динамика выявления инфицированных провирусом ВЛКРС телят в зависимости от возраста

Хозяйство

Инфицировано телят, %

При рождении

1,5 мес.

3 мес.

4,5 мес.

6 мес.

ОАО "Племзавод им. Чапаева В.И. "

0

3,7

3,7

3,7

3,7

ЗАО АФП "Нива"

0

7,4

7,4

7,4

7,4

Последнее ПЦР исследование совмещали с плановым серологическим исследованием. По результатам первого исследования (при рождении) среди телят не было выявлено ни одного носителя провирусной ДНК. Вирусоносители в каждой из групп появились по результатам второго исследования.

Важно отметить, что в указанных выше хозяйствах животные после рождения содержаться в индивидуальных домиках, выпаиваются молоком от РИД-отрицательных коров-кормилиц. При обнаружении инфицированных телят, их изолируют от здоровых. РИД - исследования в 6 месяцев дали положительный результат именно у ПЦР-положительных телят. Таким образом, уровень инфицированности удалось остановить на 3,7 - 7,4 % рубеже при 100% инфицированности матерей.

Эксперимент 2 противоположный первому был поставлен в хозяйстве ООО СК "Октябрь" Калининского района. Здесь телята после рождения содержаться групповым способом, выпаиваются молоком и молозивом от РИД-позитивных матерей, при достижении ими 1,5 месячного возраста их помещают на телочную ферму, где так же содержат группами. Опытная группа состояла из 30 телят. Первое ПЦР исследование было проведено в 1,5 месяца, при поступлении на тёлочную ферму и дало 23,3 % положительных результатов. Второе исследование проводилось в 5 месяцев и было получено еще 10, 3 % положительных результатов. По результатам последнего шестого ПЦР исследования количество зараженных животных в опытной группе составляло 50% (Таблица 2).

Таблица 2 - Использование метода ПЦР для раннего выявления вирусоносителей в ООО СК "Октябрь"

Хозяйство

Количество инфицированных телят, %

1,5 мес

5 мес

6 мес

ООО СК "Октябрь"

23,3

35

50

Таким образом, эффективность метода ПЦР при данной технологии выращивания молодняка оказалась низка.

Для эффективного использования метода ПЦР в диагностике лейкоза крупного рогатого скота оказываются критичными два условия: индивидуальное содержание и выпойка молозивом от РИД-отрицательных животных. Так при совместном содержании телят в ранние периоды жизни происходит их контактное заражение вызванное общими поилками, кормушками, сосательным рефлексом. Несформированный активный и пассивный иммунитет способствует быстрому распространению инфекции. А выпойка молозивом от инфицированных матерей увеличивает долю ложноотрицательных результатов в ПЦР, так как вместе с таким молозивом в организм теленка поступает большое количество антител, которые снижают уровень провирусной ДНК ниже порога чувствительности ПЦР.

Были проведены исследования по выявлению носительства провируса ЛКРС у группы РИД - позитивных животных. Группа животных состояла из 30 особей в возрасте от 6 до 8 месяцев. Первое ПЦР исследование в этой группе выявило 1 вирусоносителя (3, 3%), второе (через 3 недели) - 8 вирусоносителей (26,6%), третье (ещё через неделю) - 16 вирусоносителей (53,3%). Причем 2 вирусоносителя, выявленные во втором исследовании, дали отрицательный результат в третьем ПЦР исследовании. РИД, проведённый после третьего ПЦР исследования, дал на 3 положительных результата меньше (10%), чем при первом РИД исследовании (Таблица 3).

Таким образом, нельзя противопоставлять результаты ПЦР и РИД - диагностики у животных в возрасте старше 6 месяцев, так как каждый из видов диагностики имеет свою точку приложения (в первом случае отслеживает динамику наличия провирусной ДНК, а во втором - антител) и в любой момент времени может дать ложноотрицательный результат.

Таблица 3 - Динамика выявления вирусоносителей методом ПЦР в группе РИД-позитивных животных.

N

Количество зараженных животных при 1-ом ПЦР-исследовании

Количество зараженных животных при 2-ом ПЦР-исследовании

Количество зараженных животных при 3-ем ПЦР-исследовании

30

1

8

16

%

3,3

26,6

53,3

Судя по всему, выработка антител динамически процесс более плавный, а колебания уровня провирусной ДНК происходят с более высокой частотой.

Подобный вывод подтверждает ещё один эксперимент. Исследование проводилось на крови взятой олновременно на РИД и ПЦР у коров (n=30), ранее давших положительную реакцию в РИД. Отмечено сокращение реагирующих в РИД) животных на 7 голов (на 23%). Из РИД позитивных животных, положительный сигнал в ПЦР дали 19 голов (63%). Из 7 животных отрицательно реагирующих в РИД дали положительный ПЦР результат 5 животных (70%). При использовании совместно (при одновременном взятии крови на РИД и ПЦР) удалось выявить 28 инфицированных животных (93%). Таким образом, погрешность метода РИД в проведённом исследовании составила - 23%, погрешность метода ПЦР - 37%, а при совместном одновременном использовании обоих методов - 7% (Таблица 4).

Таблица 4 - Выявление вирусоносителей при совместном использовании РИД и ПЦР в группе РИД-позитивных животных.

N

Количество РИД-позитивных животных

Количество зараженных животных выявленных при ПЦР-исследовании

Количество РИД-отрицательных животных давших положительный результат в ПЦР

Количество зараженных животных выявленных при совместном РИД и ПЦР исследовании

30

23

19

5

28

%

76,6

63,3

70

93

Так для эффективного выявления инфицированных можно многократно исследовать животных в РИД, каждый раз изолируя положительно реагирующих, а можно сократить количество исследований до 2 раз, проводя одновременно РИД и ПЦР исследования.

Заключение

По результатам работы сделаны следующие выводы:

1. При использовании метода ПЦР в ранней диагностике лейкоза крупного рогатого скота значительно снижает уровень инфицированности телят при 100% инфицированности матерей.

2. Метод ПЦР наиболее эффективен при индивидуальном содержании телят, изоляции инфицированных животных от здоровых, выпойке молозивом от здоровых коров и в возрасте около 1,5 месяцев от рождения.

3. Нельзя противопоставлять результаты ПЦР и РИД - диагностики у животных в возрасте старше 6 месяцев, так как каждый из используемых методов отражает свой определенный процесс в организме инфицированного животного: ПЦР отслеживает уровень провирусной ДНК, а РИД - количество антител. Так как эти показатели динамичны, то в любой момент времени может возникнуть ложно-отрицательный результат.

4. Погрешность метода РИД в проведённом исследовании составила - 23%, погрешность метода ПЦР - 37%, а при совместном одновременном использовании обоих методов - 7%. Для эффективного выявления провирусной ДНК можно многократно исследовать животных в РИД, каждый раз изолируя положительно реагирующих, а можно сократить количество исследований до 2 раз, проводя, одновременно РИД и ПЦР исследования.

Список использованых источников

1. Авилов В.М. Нахмансон В.М. Проблемы оздоровления крупного рогатого скота от лейкоза // Ветеринария. 1995. № 11. С.3-6.

2. Альштеин А.Д. Подходы к созданию генно-инженерной вакцины против лейкоза на основе вируса осповакцины // Тез. докл. II международной научн. конф.: Биотехнология в животноводстве и ветеринарии. М., 2000. С.149 - 151.

3. Апалькин В.А. Гулюкин М.И., Петров Н.И. Лейкоз крупного рогатого скота. СПб. 2005.106 с.

4. Барышников П.И. Ветеринарная вирусология. Барнаул. 2006.116 с.

5. Берзяк А.Г. Ковалючко В.С., Гротевич В.С., Киричук Л.И. Опыт ускоренного оздоровления племенного хозяйства от лейкоза // Ветеринария. 1990. №12. С.13-15.

6. Белов А.Д. Рогожина Г.В. О патогенезе лейкозов крупного рогатого скота // Ветеринария. 1997. № 12. С.16 - 19.

7. Белявская В.А. Возможности и ограничения использования ПЦР в диагностике и генотипировании вируса лейкоза крупного рогатого скота // Сб.: Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики как основа улучшения продуктивных качеств и здоровья сельскохозяйственных животных. Ставрополь. 2003. С.275 - 278.

8. Блинов В.А., Пилипченко О.В. Глюконеогенная функция печени у коров, поражённых лейкозом // Ветеринария. 2007. № 11. С.27-29.

9. Бурба Л.Г. Кунаков А.А. Диагностика лейкозов сельскохозяйственных животных. М., 1983.191 с.

10. Галлеев Р.Ф. Вирус лейкоза КРС (культуральные, инфекционные и иммунологические свойства). Уфа. 1999.147 с.

11. Галлеев Р. Ф Хусаинов Р.Ф. Лейкоз крупного рогатого скота. Уфа. 2009.221с.

12. Глазко В.И. Доманский Н.Н., Созинов А.А. Современные направления использования ДНК-технологий // Цитология и генетика. 1998. №5. С.80-93.

13. Гулюкин М.И. Симонян Г.А., Мироменко А. К Особенности противолейкозных мероприятий, обеспечивающих высокую молочную продуктивность // Сборник научных трудов. Екатеринбург. 2005. С.28-34.

14. Гулюкин М.И. Разработка эффективных мероприятий против лейкоза крупного рогатого скота. // Ветеринария. 2002. № 12. С.3 - 8.

15. Гулюкин, М.И. Состояние и перспективы борьбы с лейкозом крупного рогатого скота // Ветеринария. 1999. № 12. С.3 - 8.

16. Деринов А.Н., Овдиенко Н.П., Найманов А.Х. Псевдоаллергические реакции на туберкулин при лейкозе КРС // Ветеринария. 2006. №-11.С. 20-23.

17. Джапаралиев Н.Т. Прохватилова Л.Б., Ломакин А.И., Аянот П.К. Применение серологических методов и ПЦР для обнаружения вируса лейкоза крупного рогатого скота в образцах крови, молока и носовых истечений // Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику (Материалы конференции молодых ученых). Владимир. 2000. С.127-131.

18. Иванова Л.А. Опыт применения иммуноферментного анализа для выявления антител к вирусу лейкоза на заключительном этапе оздоровления. // Бюл. ВИЭВ. 1999. т.72.С. 202-209.

19. Ковалюк Н.В. Селекционно-генетический способ создания высокопродуктивного и устойчивого к персистентному лимфоцитозу крупного рогатого скота // Ветеринарный консультант. 2006. N°15. С.67-68.

20. Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф., Мачульская Е.В. Современные методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота // Ветеринария Кубани. 2007. № 1. С 23 - 28.

21. Коновалова Е.Н. Сельцов В.И., Зиновьева Н. А Характеристика симментальского скота различного происхождения с использованием ДНК-микросателлитов // Зоотехния. 2006. № 8. С.6-9.

22. Коромыслов Г.Ф. Шишков В.П. Основы профилактики и ликвидации лейкоза крупного рогатого скота // Ветеринария. 1993. № 4. С.15-18.

23. Костенко Т.С. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии. М., 1989.272 с.

24. Крикун В.А. Лейкоз крупного рогатого скота и иммунологическая толерантность. // Ветеринария. 2002. № 6. С.7-9.

25. Кудряшов А.А. Петров Н.И. Патологоанатомические изменения при лимфоидном лейкозе крупного рогатого скота // Ветеринария. 1999. № 11. С.14-15.

26. Лиманский А.П. Лиманская О.Ю. Молекулярно - генетические методы - основа программ по искоренению лейкоза крупного рогатого скота // Биотехнология. 2001. № 3. С.40-50.

27. Мадисон В., Мадисон Л. Лейкоз: пустые страшилки или общегосударственная проблема? // Животноводство России. 2006. №9. С.2-8.

28. Макаров В.В. Избранные вопросы общей эпизоотологии и инфектологии. М., 1999.224 с.

29. Мальцева Н.А. Развитие и внедрение новых биотехнологий при разработке диагностических и профилактических приемов в сфере решения проблемы лейкоза КРС // Материалы II региональной научной конференци "Студенческая наука - экономике России" Северо-Кавказский государственный технический университет. 2004. С.20 - 22.

30. Нахмансон В.М., Гулюкин М.И., Дун Е.А. Серологический метод диагностики в системе противолейкозньгх мероприятий // Ветеринария. 1997. №3. С.7-10.

31. Нахмансон В.М., Дун Е.А. Эпизоотология лейкоза крупного рогатого скота и меры борьбы с ним // Итоги науки и техники. 1990. С.146 - 149.

32. Петров Н.И. Диагностика и меры борьбы с лейкозом крупного рогатого скота. // Материалы Всероссийского совещания-семинара. Брянск. 2004. С.104-106.

33. Пономарёва И. С, Сычева М.В., Поляков М.А., Нургалиева Р.М., Карташова О.Л. Эффективность диагностики лейкоза крупного рогатого скота методами РИД, ИФА и ПЦР в хозяйствах Оренбургской области // Современные наукоёмкие технологии: материалы кконференции. 2010. Т 9. С 134.

34. Прохватилова Л.Б. Диагностика лейкоза КРС методом ПЦР // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. 1998. № 5. С.65 - 68.

35. Прохватилова Л.Б. Применение ПЦР для раннего обнаружения провируса лейкоза крупного рогатого скота у экспериментально инфицированных животных // Ветеринария. 2001. № 8. С.17 - 21.

36. Свириденко Г.М. Плюсы и минусы новой технологии // Молочная промышленность. 2003. С.10-15.

37. Симонян Г.А. Разработка и совершенствование оздоровительных противолейкозных мероприятий // Ветеринария. 2007. № 7. С.3 - 7.

38. Смирнова В.Н. Ветеринарно - санитарная оценка мяса при лейкозе крупного рогатого скота // Сб.: Актуальные вопросы диагностики, профилактики и борьбы с лейкозами сельскохозяйственных животных и птиц. 2000. Екатеринбург. С.236 - 239.

39. Смирнов A. M. Борьба с лейкозом крупного рогатого скота - важнейший элемент системы обеспечения ветеринарного благополучия российского животноводства // Сборник научных трудов. Екатеринбург. 2005. С.5-9.

40. Смирнов Ю.П. Основные пути распространения лейкоза // Ветгазета. 1999. №4. С.3-4.

41. Смирнов П.Н. Храмцов В.В., Смирнова В. В Научные и практические основы оздоровления стад от лейкоза КРС в Сибири // Сб.: Актуальные вопросы диагностики, профилактики и борьбы с лейкозами сельскохозяйственных животных и птиц. Екатеринбург. 2000. С.104 - 114.

42. Стародуб Н. Ф, Стародуб В.Н. инфекционный лейкоз крупного рогатого скота и методы его диагностики // Bio polymer sand cell 2003 №4 С 307-316.

43. Федоров Ю.Н., Верховский O. A. Иммунодефициты домашних животных // М., 1996.96 с.

44. Федотов В.П., Иванов О.В., Иванова О.Ю. Лейкоз крупного рогатого скота в Ивановской области // Ветеринария. 2007. № 5. С.23-25.

45. Шубинский Г.З., Лозовой В. П Функциональные свойства Т-лимфоцитов у больных хроническим лимфолейкозом // Иммунология. 1990. N°4. С.62-65.

46. Shanks, R. D.milk and fat yields decline in bovine leukemia virus - infected Holstein cattle with persistent lymphocytosis / Shanks R. D., Steward J. A., Levin H. A. // Agricultural Sciences. 1993. V.90. № 6. Р.6538 - 6541.

Приложение А

Схема организации генома ВЛКРС

GP51

5ґLTR gag pro pol env pX BL 3ґLTR

LTR - длинные концевые повторы (long terminal repeat);

gag - ген, кодирующий белки сердцевины (определяет группоспецифический антиген);

pro - ген, кодирующий протеазу;

pol - ген, кодирующий обратную транскриптазу;

env - ген, кодирующий белки оболочки;

pX BL - область, кодирующая Tax и Rex.

Рисунок А.1 - Схема организации генома ВЛКРС

Приложение Б

Диаграмма ПЦР

Рисунок Б.1 - Диаграмма ПЦР

Размещено на Allbest.ru


Подобные документы

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.