Главная База знаний "Allbest" Сельское, лесное хозяйство и землепользование Иммуноблотинг при диагностике губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота

Иммуноблотинг при диагностике губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота

Характерные признаки губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота. Предупреждение развития эпизоотии заболевания на территории Республики Беларусь. Проведение систематических диагностических мероприятий, принципы применения иммуноблотинга.

Рубрика Сельское, лесное хозяйство и землепользование
Вид реферат
Язык русский
Дата добавления 16.05.2012
Размер файла 31,7 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

1

15

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ

РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ

"Витебская ордена "Знак Почета"Государственная

академия ветеринарной медицины"

Реферат

на тему:

ИММУНОБЛОТИНГ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ГУБКООБРАЗНОЙ

ЭНЦЕФАЛОПАТИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Красочко П.А., Притыченко А.Н., Бойчук С.В.

Витебск 2011

Cодержание

  • Введение
  • Иммуноблотинг (Western-blott)
  • Принцип диагностики ГЭ КРС с помощью иммуноблотинга
  • Техника постановки иммуноблотинга
  • Учёт и интерпретация результатов
  • Заключение
  • Список использованных источников

Введение

Губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота (ГЭ КРС) представляет собой медленно прогрессирующее заболевание крупного рогатого скота с необыкновенно длинным инкубационным периодом, преимущественным поражением нервной системы и неизбежным летальным исходом. Характерным признаком ГЭ КРС является обнаружение дистрофических изменений с вакуолизацией нейронов в головном мозге, что делает мозговую ткань похожей на губку. Подобные заболевания встречаются и у других животных, а также у человека. Ввиду сходства клинических признаков и патоморфологических изменений эти заболевания объединены в группу трансмиссивных губкообразных энцефалопатий (ТГЭ). В настоящее время к группе ТГЭ относят следующие заболевания животных: ГЭ КРС, скрепи, трансмиссивную энцефалопатию норок, губкообразную энцефалопатию кошек, хроническую изнуряющую болезнь оленей и лосей, а также заболевания человека: болезнь Крейтцфельда-Якоба (БКЯ), синдром Герстманна-Штраусслера-Шейнкера (СГШШ), летальную семейную бессонницу, куру, невыясненную БКЯ (нв БКЯ). Единичные случаи ТГЭ встречаются у экзотических зоопарковых животных - обезьян, тигров, пум, диких жвачных.

Особую тревогу вызывает возможность адаптации приона ГЭ КРС к организму человека. Недавнюю вспышку на БКЯ в Великобритании связывают именно с преодолением межвидового барьера прионом ГЭ КРС. Считается, что заражение происходило при употреблении в пищу продуктов, содержавших PrPSc от больных коров. Это подтвердили исследования, показавшие неразличимость возбудителей на БКЯ и ГЭ КРС.

Для предупреждения развития эпизоотии ГЭ КРС на территории Республики Беларусь важным мероприятием является проведение систематических диагностических мероприятий. Перспективным направлением в диагностике ГЭ КРС является применение иммуноблотинга.

Иммуноблотинг (Western-blott)

Иммуноблотинг - разновидность гетерогенного иммунного анализа.

Назначение:

1) идентификация белков, в том числе вирусных антигенов;

2) идентификация антител.

Метод используется для диагностики губкообразной энцефалопатии (спонгиоформная энцефалопатия, бешенство коров) крупного рогатого скота. Существуют различные производители тест-систем, например, тест-системы "Western-Blot" фирмы "Prionix" (Швейцария). Особенностью тест-системы "Western-Blot" является то, что для проявления реакции используются моноклональные антивидовые антитела, меченные щелочной фосфатазой, а субстратной смесью является флуорохром, взаимодействующий со щелочной фосфатазой, и в результате реакции появляется люминесценция, выявляемая с помощью рентгеновской пленки.

Сущность. Метод основан на комбинации гель-электрофореза и реакции антиген-антитело. Сущность его заключается в переносе молекул исследуемого вещества с одного твердого носителя, используемого для фракционирования биополимеров, на другой, где с помощью иммунохимической реакции происходит их специфическое выявление. В зависимости от исследуемого вещества различают ДНК-, РНК - и белок-блотинг. Высокая степень разрешения достигается за счет электрофоретического разделения белков, глико - и липопротеинов и максимальной специфичностью детектирующих иммунных сывороток или моноклональных антител. Замена вышеуказанных меченых антител на меченые антитела пероксидазой позволяет удешевить учет реакции и повысить ее чувствительность и специфичность.

Основные этапы постановки.

Технически иммуноблотинг выполняется в три приема:

иммуноблотинг энцефалопатия рогатый скот

1) подлежащие анализу белки подвергаются разделению в полиакриламидном геле методом электрофореза в присутствии денатурирующих веществ: додецилсульфата натрия или мочевины. Этот процесс часто обозначают как SDS-PAGE, при котором разделенные белки могут визуализироваться после окрашивания и сравниваться с эталонными образцами;

2) разделенные белки переносятся с геля электрофоретически путем наложения (блотинга) на нитроцеллюлозный фильтр, помещённый в специальную камеру, и фиксируются на нём, во многих случаях, но не всегда при переносе сохраняются количественные соотношения белков;

3) на фильтры наносятся детектирующие поли - или моноклональные антитела, содержащие радиоизотопную или ферментную метку. На блоты наносят антитела к специфическому антигену, отмывают и добавляют радиоактивномеченный конъюгат для определения связавшихся с антигеном антител. Для обнаружения связавшихся антител применяют также антивидовую меченую сыворотку, иными словами, на заключительном этапе блотинг аналогичен твердофазным иммунологическим тестам. После повторного отмывания лист нитроцеллюлозы помещают в кассету с рентгеновской плёнкой для авторадиографии. На проявленной плёнке видны полосы локализации антигена, связавшего меченые антитела. Метод более удобен при использовании конъюгатов с ферментом.

Принцип диагностики ГЭ КРС с помощью иммуноблотинга

Патологическая изоформа прионного белка (PrPSc) в отличие от всех остальных белков мозга устойчива к протеиназе К. Это свойство используется для его выделения: после обработки протеиназой К в пробе остаётся только PrPSc, если проба положительная, либо не остаётся никаких белков, если проба отрицательная.

Для определения молекулярной массы белков пробы после обработки протеиназой К проводят их электрофорез в агаровом или полиакриламидном геле. Скорость перемещения белков в геле при электрофорезе зависит от их заряда и молекулярной массы. С целью упрощения иммунодетекции разделённые в электрофорезе белки переносят из гелей на мембрану при помощи процедуры блотинга. Принцип её заключается в том, что белки извлекаются из геля под действием электрического поля и сразу же адсорбируются на мембране.

Для определения иммунологических свойств перенесенных на мембрану белков проводят обработку мембраны антителами, специфичными к PrPSc, затем промывают антивидовыми антителами, мечеными ферментом. При нанесении на мембрану субстратной смеси она разлагается ферментом с образованием окрашенного или люминесцирующего продукта реакции, в зависимости от вида применяемых ферментов и субстратных смесей. Если на мембране присутствует PrPSc, происходит связывание с ним вначале первых, а затем вторых антител. При разложении ферментом, коньюгированным со вторым антителом субстратной смеси, окрашенный, либо люминесцирующий продукт реакции образуется в месте расположения прионного белка.

Таким образом, PrPSc выявляется в иммуноблотинге с учётом трёх характеристик: устойчивости к протеиназе К, определённого размера молекул при электрофорезе (27-30 kDa) и связывания со специфическим антителом.

Техника постановки иммуноблотинга состоит из следующих этапов:

Ш отбор проб;

Ш гомогенизация пробы;

Ш ферментное разрушение пробы;

Ш электрофорез;

Ш блотинг;

Ш обработка антителами;

Ш проявление реакции;

Ш учёт реакции;

Ш интерпретация результатов.

Техника постановки иммуноблотинга

Отбор, гомогенизация и ферментное разрушение пробы.

Отбор проб. Для диагностики губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота используется продолговатый мозг животных. Отбор проб производится через отверстие затылочной кости с помощью специальной ложечки.

Гомогенизация. Кусочек продолговатого мозга из области задвижки массой 0,45-0,7 г помещают в 50 мл пробирку и с помощью весов определяют точный вес пробы. К кусочку мозга добавляют 10-кратный объём буфера для гомогенизации. Затем проба гомогенизируется в течение 1 мин при помощи гомогенизатора при 20000 об/мин.

Ферментное разрушение. В связи с тем, что прион PrPSc устойчив к протеиназе К, важным моментом является его ферментация. Для этого в 96-луночный планшет с объемом лунки 0,2 мл для ферментного разрушения вносят по 100 мкл каждого гомогената, добавляют 10 мкл протеиназы К (20 ЕД/мл) и хорошо перемешивают пипетированием. Ферментное разрушение проводят при 48С в течение 40 мин. После инкубации добавляют 10 мкл останавливающего раствора для остановки протеолитической реакции.

Электрофорез.

Принцип электрофореза белков в геле основан на явлении пространственного разделения белков при их движении в электрическом поле. Белки, как биополимеры, обладающие зарядом, перемещаются в электрическом поле в направлении противоположно заряженного полюса. При этом скорость миграции белков в геле зависит от их заряда и молекулярной массы. Поскольку эти характеристики различны у разных белков, методом электрофореза можно добиться разделения сложной белковой смеси на отдельные белки.

Денатурация. Денатурация белков приводит к нарушению вторичной и третичной структур белка, “разворачиванию" молекулы. При этом заряд белка, его линейные размеры и, следовательно, скорость миграции белков в геле становятся прямо пропорциональны их молекулярной массе, что даёт возможность точно её определить, сравнивая электрофоретическую подвижность исследуемого белка с электрофоретической подвижностью белков с известной молекулярной массой. Для этого к разрушенным протеиназой К пробам добавляют PAGE-буфер по 100 мкл на лунку с целью подготовки проб для электрофореза, хорошо перемешивают пипетированием и инкубируют при 96С в течение 5 мин. Контрольный образец инкубируют при 65С в течение 2 мин. Старые пробы, которые уже были проинкубированы при 96С в течение 5 мин, также инкубируют при 65С в течение 2 мин.

Состав буфера для подготовки проб для электрофореза (40 мл):

Нанесение исследуемых проб на гель.10 мкл контрольного образца наносят на первую дорожку геля. На остальные дорожки наносят по 10 мкл исследуемых проб. Внутреннюю и наружную камеры электрофоретической камеры заполняют буфером для электрофореза NuPAGE MOPS/SDS и добавляют 500 мкл антиоксиданта (NOVEX) только во внутреннюю камеру (рис.7).

Состав буфера для электрофореза:

Электрофорез. Электрофорез проводят при 200 V в течение 30 мин, пока краска не окажется на расстоянии 1-2 см от края геля.

Блотинг.

Подготовительные этапы:

· необходимо смочить PVDF-мембрану (Millipore, Immobilon-P, 0,45 мкм) метанолом в течение нескольких секунд, затем поместить в буфер для блотинга на 10 мин;

· камеру для блотинга следует наполнить охлаждённым (+4 С) буфером для блотинга.

Состав буфера для блотинга (10х):

Трис

30,28 г

Глицин

144,13 г

Дистиллированная вода

до 1000 мл

Перед использованием к 100 мл 10х буфера для блотинга добавляют 900 мл дистиллированной воды и 100 мл метанола. Хранят при + 4 С.

Сборка “сэндвича" для блотинга:

· на губку помещают лист фильтровальной бумаги, смачивают его бидистиллированной водой, и наверх кладут мембрану;

· извлекают гель из рамки, удаляют его верхнюю часть, содержащую прорези, и нижнюю часть ниже фронта краски. Гель аккуратно помещают на мембрану, избегая попадания пузырьков воздуха между ними. До 6 гелей может быть помещено на 1 мембрану размером 15 х 18 см;

· наверх на гели кладут смоченный бидистиллированной водой лист фильтровальной бумаги, затем - губку;

· Собранный “сэндвич” помещают в пластиковую кассету, закрывают её и помещают в камеру для блотинга. Кассету следует вставлять таким образом, чтобы PVDF-мембрана была обращена к положительному полюсу, а гели - к отрицательному (рис.9).

Блотинг проводят при 150 V в течение 1 часа при +4 С при постоянном охлаждении.

Окраска белков. Мембрану удаляют и окрашивают связавшиеся с ней белки при помощи Ponceau S. Затем мембрану промывают буфером TBST до исчезновения красной окраски.

Состав буфера TBST:

NaCl

8,0 г

KCl

0,2 г

Трис

3,0 г

Дистиллированная вода

до 1000 мл

Твин-20

0,5 мл

pH буфера TBST доводят до 7,4 при помощи соляной кислоты.

Обработка антителами.

Блокирование. Для блокирования неспецифически связывающих участков мембраны её инкубируют с блокирующим буфером (5% раствор сухого молока в фосфатном буфере) в течение 0,5 часа при комнатной температуре с постоянным помешиванием на качающейся платформе.

Обработка первыми антителами. После блокирования неспецифически связывающих участков мембраны на неё наносят сыворотки, специфичные к прионному белку. Для этого используют:

- поликлональные антисыворотки к тканям мозга крупного рогатого скота;

- моноклональные антитела - 6Н4, SAF 70, F89/160.1.5.

Применение поликлональных антител снижает чувствительность реакции и ее специфичность из-за наличия в ней антител к тканям мозга, которые взаимодействуют с неразрушенными протеиназой К отдельными белками мозга крупного рогатого скота.

Для постановки реакции более эффективно использовать моноклональные антитела. Для этого 10 мкл мышиных моноклональных антител растворяют в 50 мл TBST (разведение 1: 5000). В полученный раствор антител помещают мембрану и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа (или 12-18 часов при +4 С) с постоянным помешиванием на качающейся платформе. Мембрану промывают TBST 3 раза по 5 мин.

Детекцию реакции можно проводить путем использования антимышиных антител, меченных щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена.

Обработка коньюгатом со щелочной фосфатазой.10 мкл антител козла против иммуноглобулинов мыши, меченных щелочной фосфатазой растворяют в 50 мл TBST (разведение 1: 5000). В полученный раствор антител помещают мембрану и инкубируют при комнатной температуре в течение 0,5 часа с постоянным помешиванием на качающейся платформе. Мембрану промывают TBST 5 раз по 5 мин.

Обработка коньюгатом с пероксидазой хрена. Проводится аналогично обработке коньюгатом со щелочной фосфатазой.

Проявление реакции.

Нанесение субстратной смеси для индикации щелочной фосфатазы. Мембрану помещают на 5 мин в 50 мл люминесцентного буфера. Растворяют 100 мкл CDP-Star (12,5 мМ, 50-кратный концентрат) в 5 мл люминесцентного буфера. Мембрану помещают на стекло, на её поверхность наносят 5 мл раствора CDP-Star, распределяют его равномерно по всей поверхности мембраны и инкубируют 5 мин при комнатной температуре. С поверхности мембраны удаляют субстрат при помощи мягкой ткани. На мембрану в темноте или при красном свете накладывают рентгеновскую плёнку, помещают в светонепроницаемую кассету и выдерживают при комнатной температуре примерно 5 мин. Рентгеновскую плёнку проявляют и проводят интерпретацию полученных результатов.

Нанесение субстратной смеси для индикации пероксидазы хрена. Реакция визуализируется путем нанесения на мембрану субстратной смеси (раствор диаминобензидина 0,5 мг/мл и перикиси водорода 0,5 мг/мл в фосфатном буферном растворе pH 7,4) до появления полос. Реакция останавливается промыванием мембраны водой. После высушивания мембраны на воздухе проводится учет результатов.

Фосфатный буферный раствор 0,1 М, рН 7,4:

NaCl

8,0 г

KH2PO4

0,2 г

Na2HPO4

2,8 г

KCl

0,2 г

Вода дистиллированная

До 1000 мл

Учёт и интерпретация результатов

При использовании конъюгата со щелочной фосфатазой. Контрольный образец даёт на рентгеновской плёнке тёмную линию в районе 32-35 kDa, отрицательные пробы не дают сигнала, либо наблюдается темная чёрточка протеиназы К в районе 31 kDa, положительные пробы дают тёмную линию в районе 27-30 kDa.

При использовании конъюгата с пероксидазой. После обработки субстратной смесью мембрана приобретает светло-коричневую окраску за счёт взаимодействия с субстратной смесью неспецифически связавшегося с мембраной конъюгата. Маркеры молекулярной массы видны в виде белых полос на светло-коричневом фоне. Контрольный образец даёт на мембране тёмную линию в районе 32-35 kDa, отрицательные пробы не дают специфического сигнала в виде тёмной линии, наблюдается светлая чёрточка протеиназы в районе 31 kDa, положительные пробы дают тёмную линию в районе 27-30 kDa.

Преимущества и недостатки:

Преимущества:

1) прямое определение наличия возбудителя;

2) высокая специфичность;

3) высокая чувствительность - в оптимально отработанных условиях иммуноблотингом можно обнаруживать антиген в количествах менее 1 нг в испытуемом объеме, до 20 нг прионного белка в мозге больных губкообразной энцефалопатией животных;

4) высокая скорость полученного результата анализа;

5) время блотинга путем диффузии составляет 36-48 ч. Но наиболее быстрый и эффективный способ переноса белков с гелей - электроблот, время которого в основном составляет 1-3 ч, для некоторых высокомолекулярных белков - более 12 ч.

Недостатки:

1) сложность постановки;

2) высокая стоимость тест-систем и сопутствующего оборудования.

Заключение

Применение иммуноблотинга для диагностики ГЭ КРС позволяет эффективно диагностировать это заболевание с учётом трёх характеристик его возбудителя: устойчивости к протеиназе К, определённого размера молекул при электрофорезе (27-30 kDa) и связывания со специфическим антителом.

Список использованных источников

1. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: учебник. - СПб: Специальная литература, 1998. - 592 с.

2. Красочко П.А. Иммунология: учебное пособие / П.А. Красочко [и др.]; под ред. П.А. Красочко, Н.Д. Лисова. - Мн.: Аверсэв, 2005. - 128 с.

3. Ройт А. Иммунология: учебное издание / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл; Перевод с английского. - М.: Мир, 2000. - 592 с.

4. Ярилин А.А. Основы иммунологии: учебник. - М.: Медицина, 1999. - 608 с.

Размещено на Allbest.ru


Подобные документы

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.

© 2000 — 2023, ООО «Олбест» Все права защищены