Метод клонального микроразмножения в декоративном растениеводстве

В зависимости от вида растений необходимо испытывать как твердые, так и жидкие питательные среды. Иногда жидкие среды имеют преимущество, так как обеспечивают большую подвижность трофических элементов. Например, при размножении роз более успешным было культивирование побегов на двухслойной питательной среде: нижний слой - агаризованный, верхний - жидкий. На эффективность размножения могут также влиять расположение экспланта (горизонтальное или вертикальное), тип пробок (ватные, пластмассовые, стеклянные, металлические и т.д.), а также соотношение объема эксплантов и количества питательной среды для оптимального освещения и газообмена эксплантов.

Состав питательной среды необходимо подбирать для каждого вида растений. На клональное микроразмножение влияют гормоны, минеральные соли, витамины и углеводы. При микроразмножении in vitro часто используют среды Мурасиге и Скуга, Линсмайера и Скуга, Шенка и Хильдебрандта, Нича, Гамборга, Хеллера и другие. Обычно используют среду Мурасиге-Скуга, которая содержит много неорганического азота, что стимулирует процессы органогенеза и соматического эмбриогенеза. В наших экспериментах (Кузьмина Н.А., Внукова В.В., 1997) выход морфогенных каллусов твердой пшеницы был выше на среде Мурасиге-Скуга по сравнению со средой Гамборга, которая одержала окисленные формы азота. Среда Мурасиге-Скуга также способствовала стабилизации хромосомного набора клеток твердой пшеницы при высоком содержании ауксина в среде. Вообще вопрос оптимального соотношения NH4 : NO3 остается открытым, так как литературные данные весьма противоречивы и универсального рецепта для всех видов растений нет. В качестве источника углеродного питания используют различные углеводы типа сахарозы, глюкозы, фруктозы, галактозы. Разные культуры требуют различной концентрации углеводов на разных этапах клонального микроразмножения.

К физическим факторам выращивания относятся температура и условия освещения. На первых двух этапах освещенность колеблется от 1000 до 3000 Лк, фотопериод 14 - 16 часов, но эти параметры зависят от культуры. Высокая интенсивность света может вызывать хлорозы и задерживать развитие, но при переносе в почву эти растения чувствуют себя лучше и растут энергичнее. Спектральный состав также играет немаловажную роль. Некоторые исследователи (Катаева Н.В., Аветисов В.А, 1981) указывают на синий свет как основной компонент морфогенеза. Красный свет стимулирует образование почек у табака, у салата - образование побегов, у березы - укоренение. В работах Т.Н. Константиновой с соавторами (1987) показано, что синий свет усиливает закладку вегетативных почек у побегов табака в условиях in vitro , а красный стимулирует развитие цветочных почек. Однако при добавлении цитокининов и ауксинов в различной концентрации соотношение процессов дифференциации цветочных и вегетативных почек меняется, в некоторых случаях наблюдается даже противоположный эффект. В исследованиях Р. А. Карначук и Е. С. Гвоздевой (1998) наибольший выход морфогенных каллусов пшеницы, формирующих растения и побеги, отмечен на зеленом свету. Важное значение играет также сочетание спектрального состава света и гормональных факторов среды.

Температура культивирования обычно варьирует в интервале 22 - 26оС днем и 18 - 22оС ночью. В некоторых случаях понижение температуры ведет к повышению эффективности размножения. Для повышения коэффициента размножения необходимо каждому виду с учетом его естественного ареала произрастания подбирать индивидуальные условия культивирования. Относительная влажность воздуха - 65 - 70% [8]

6. Адаптация растений к почвенным условиям произрастания

Подготовка к высадке в поле (адаптация). Это очень важный этап, во время которого в теплице ускоренно растущие растения, полученные in vitro, адаптируют к новым условиям внешней среды: проводят их закаливание, повышают устойчивость к местным патогенным микроорганизмам и различным неблагоприятным факторам внешней среды.

Существует много различных способов адаптирования растений к пересадке in vitro. Сюда входит: подбор почвенного субстрата, создание определенной влажности, обработка химическими веществами (глицерин, парафин) для предотвращения обезвоживания листьев. Некоторые древесные растения лучше приживляются, если их заразить in vitro микоризообразующими грибами. Чтобы укоренившиеся побеги адаптировались к почвенным условиям, необходимо поддерживать определенную влажность («создание тумана»), температуры и т. д.

Упрощенный способ адаптации пробирочных растений винограда заключается в следующем:

- Адаптация прямо в пробирках, снимая с них пробки, когда растения винограда достают до верха пробирки.

- Через 1,5-2 недели, когда верхушки побега с двумя развитыми листьями появляются над пробиркой, растение готово к пересадке в почву.

Пересадка растений-регенерантов в субстрат является ответственным этапом, завершающим процесс клонального микроразмножения. Наиболее благоприятное время для пересадки пробирочных растений - весна или начало лета.

Растения с двумя-тремя листьями и хорошо развитой корневой системой осторожно вынимают из колб или пробирок пинцетом с длинными концами или специальным крючком. Корни отмывают от остатков агара и высаживают в почвенный субстрат, предварительно простерилизованный при 85-90° С в течение 1-2 ч. Для большинства растений в качестве субстратов используют торф, песок (3:1); торф, дерновую почву, перлит (1:1:1); торф, песок, перлит (1:1:1). Исключение составляют семейство орхидных, для которых готовят субстрат, состоящий из сфагнового мха, смеси торфа, листьев бука или дуба, сосновой коры (1:1:1).

Приготовленным заранее почвенным субстратом заполняют пикировочные ящики или торфяные горшочки, в которых выращивают растения-регенеранты. Горшочки с растениями помещают в теплицы с регулируемым температурным режимом (20-22° С), освещенностью не более 5 тыс. лк и влажностью 65-90%. Для лучшего роста растений создают условия искусственного тумана. В тех случаях, когда нет возможности создать такие условия, горшочки с растениями накрывают стеклянными банками или полиэтиленовыми пакетами, которые постепенно открывают до полной адаптации растений.

Через 20-30 дней после посадки хорошо укоренившиеся растения подкармливают растворами минеральных солей Кнудсона, Мурасига и Скуга, Чеснокова, Кнопа (в зависимости от вида растений) или комплексным минеральным удобрением. По мере роста растений их рассаживают в большие емкости со свежим субстратом. Дальнейшее выращивание акклиматизированных растений соответствует принятой агротехнике выращивания для каждого индивидуального вида растений.

Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным условиям является наиболее дорогостоящей и трудоемкой операцией. Нередко после пересадки растений в почву наблюдается остановка в росте, опадение листьев и гибель растений. Эти явления связаны, в первую очередь, с тем, что у пробирочных растений нарушена деятельность устьичного аппарата, вследствие чего происходит потеря большого количества воды. Во-вторых, у некоторых растений в условиях in vitro не происходит образования корневых волосков, что приводит, в свою очередь, к нарушению поглощения воды и минеральных солей из почвы. Поэтому целесообразно на третьем или четвертом этапах клонального микроразмножения применять искусственную микоризацию растений (для микотрофных), учитывая их положительную роль в снабжении растений минеральными и органическими питательными веществами, водой, биологически активными веществами, а также в защите растений от патогенов.

Индийскими учеными предложен простой метод предотвращения быстрого обезвоживания листьев растений, выращенных in vitro, во время их пересадки в полевые условия. Метод заключается в том, что листья в течение всего акклиматизационного периода следует опрыскивать 50%-ным водным раствором глицерина или смесью парафина, или жира в диэтиловом эфире (1:1). Применение этого метода помогает избежать длинных и затруднительных процессов закаливания пробирочных растений и обеспечивает 100%-ную их приживаемость [8].

Для предотвращения механических повреждений корневой системы растение пересаживают в почву вместе с агаром, заглубляя его так, чтобы над поверхностью почвы оставались только развитые листы, которые выросли из пробирки и уже адаптировались к внешним условиям. Такая методика позволяет значительно упростить, ускорить и удешевить этапы роста, развития и акклиматизации растений.

Адаптация винограда. Упрощенный дешевый способ адаптации растений винограда, выращенных в стерильных условиях в пробирках, был разработан в Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН. Адаптацию проводят прямо в пробирках. Когда растения дорастают до пробки, его вынимают из пробирки. Через 1,5-2 недели, когда верхушки побегов появляются над пробирками, растения пересаживают в почву.

7. Применение клонального микроразмножения для выращивания декоративных растений

Основное преимущество клонального микроразмножения - получение генетически однородного, безвирусного посадочного материала. Предположение о возможности отсутствия вирусов в меристематических тканях больных растений впервые было высказано в 1936 г. Чунгом, а позднее, в 1943 г., и Уайтом. В 1949 г. этот факт был подтвержден экспериментально. В 1952 г. Морелю и Мартену из Национального агрономического института (Франция) удалось получить безвирусные георгины из зараженных растений.

Структурной основой используемого на практике явления служит специфика строения точки роста растений: дистальная ее часть, представленная апикальной меристемой, у разных растений имеет средний диаметр 200 мкм и высоту от 20 до 150 мкм. В нижних слоях дифференцирующиеся клетки меристемы образуют прокамбий, дающий начало пучкам проводящей системы.

Известно, что успех клонального микроразмножения зависит от меристематического экспланта. При этом отмечается закономерность: чем больше листовых зачатков и тканей, тем легче идут процессы морфогенеза, заканчивающиеся образованием целого растения. Вместе с тем, при таком развитии конуса нарастания увеличивается риск быстрой транспортировки вируса по проводящей системе. Кроме того, даже небольшой меристематический эксплант может содержать вирусы, проникшие в клетки в результате медленного распространения через плазмодесмы.

В целом, эффективность применения апикальной меристемы в качестве метода оздоровления зараженных вирусами растений может оказаться довольно низкой. Снизить риск попадания вирусов в здоровые ткани можно путем применения предварительной термо- или химиотерапии исходных растений.

Метод термотерапии применяется как в условиях in vivo, так и in vitro и предусматривает использование горячего сухого воздуха. Для объяснения механизма освобождения растений от вирусов в процессе термотерапии существуют различные гипотезы. Согласно одной их них при высоких температурах разрушаются белковая оболочка и нуклеиновая кислота вируса. Вторая гипотеза предполагает действие высоких температур на вирусы через метаболизм растений. При такой температуре начинает преобладать деградация вирусных частиц, а синтез их, наоборот, уменьшается. Растения, подвергающиеся термотерапии, помещают в термокамеры, где температура в течение первой недели повышается с 25 до 37оС путем ежедневного увеличения температуры на 2 градуса. Все остальные режимы обязательно поддерживаются в оптимальном состоянии: освещенность, высокая относительная влажность воздуха, определенный фотопериод. Продолжительность термостатирования зависит от состава вирусов и их термостойкости. Если для гвоздики достаточно 10 - 12 недельного воздействия теплом, то для хризантемы этот период превышает 12 недель.

Помимо положительного действия высоких температур на освобождение от вирусов, выявлено аналогичное влияние их на точку роста и процессы морфогенеза некоторых цветочных культур (гвоздики, фрезии) в условиях in vitro. Высокие температуры увеличивают коэффициент размножения на 50 - 60%, повышаю адаптацию пробирочных растений к почвенным условиям и позволяют получить больше безвирусных маточных растений.

Другой способ оздоровления - химиотерапия. В питательную среду, на которой культивируют апикальные меристемы, добавляют препарат вирозола в концентрации 20 - 50 мг/л. Это противовирусный препарат широкого спектра действия. Применение его позволяет увеличить число безвирусных растений с 40% до 80 - 100%.

Культура изолированных органов, тканей и клеток растений в настоящее время находит все большее применение в биологических исследованиях. Такие методы, как клональное микроразмножение растений, оздоровление от вирусной инфекции с помощью культуры апикальных меристем, регенерация растений из каллусных культур, находят сейчас практическое применение. Существенную помощь методы культивирования in vitro могут оказать генетикам и селекционерам в получении новых форм растений. Используя гаплоиды, незрелые или нежизнеспособные зародыши гибридов, сомаклональные варианты растений-регенерантов, биотехиологи вместе с селекционерами ускоряют и облегчают селекционный процесс. Более сложная техника манипулирования с клетками растений необходима для получения соматических гибридов слиянием протопластов или для генетической трансформации клеток и растений.

Второе направление - это использование культуры изолированных тканей для размножения и оздоровления посадочного материала. Этот метод, названный клональным микроразмножением растений, позволяет получать от одной меристемы сотни тысяч растений в год.

После оздоровления с помощью вышеперечисленных технологий нормальные растения-регенеранты размножают обычными методами клонального микроразмножения. Для некоторых растений, например цитрусовых, получить морфогенез из меристем малого размера не удается, поэтому требуется разработка оригинальных методов. Лимоны и апельсины оздоровляют и размножают, используя прививки меристем размером 0,14-0,18 мм на пробирочные подвои, полученные из семян. Достоинство такого подхода состоит и в том, что развивающиеся из меристем побеги не имеют ювенильных признаков, при этом цветение и плодоношение ускоряются.

Помимо фундаментальных исследований метод культуры изолированных тканей широко используется в сельском хозяйстве и промышленном производстве. Примером может служить массовое клональное микроразмножение плодовоовощных и декоративных растений, а также их оздоровление от вирусных и других инфекций. С помощью культуры in vitro можно расширить возможности селекционной работы получать клоны клеток, а затем и растения с запрограммированными свойствами. Благодаря способности клеток синтезировать в культуре вторичные метаболиты возникла отрасль промышленности, осуществляющая биологический синтез веществ, необходимых человеку.

Некоторые из указанных технологий стали традиционными, другие находятся на начальных этапах разработки. Наконец, есть такие методы, которые явно вышли из ранга вспомогательных, ускоряющих селекцию технологий. К ним можно отнести криосохранение генофонда - технологию, в настоящий момент приобретшую экологическую направленность или клональное микроразмножение растений, тесно связанное с проблемой их оздоровления от вирусных и других инфекций. Поэтому обзор этих технологий вынесен за рамки данного раздела.

Четвертый способ - размножение в биореакторах микроклубнями. Это один из способов ускоренного размножения оздоровленного материала. О. Мелик-Саркисов сконструировал гидропонную установку, позволяющую получать около 7000 микроклубней с 1 м при массе одного кт ня 5 г. Предусмотрена последующая механизированная посадка их в грунт. В отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН создана эффективная полупромышленная замкнутая система пневмоимпульсного биореактора для получения микроклубней картофеля, в которой предусмотрена возможность воздействия на направление и скорость процессов клубнеобразования. Технологии клонального микроразмножения в биореакторах разработаны не только для сельскохозяйственных, но и для декоративных растений (лилии, гладиолусы, гиацинты, филодендроны и т.д.). Однако созданные установки пока носят лабораторный, модельный характер [7-8].

Технология клонального микроразмножение роз

Материалы и оборудование: 1-летние побеги роз, скальпель, кисточка, пинцет, стаканчик с этанолом, пробирки со стерильной водой, 4% раствор хлорамина,чашка Петри, кафельная плитка, спиртовка, спички, пробирки с модифицированной питательной средой МС, ее компоненты (макроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга (МС), микроэлементы по прописи МС, хелат железа, витамины по прописи МС, источник углерода: глюкоза - 40 г/л, агар-агар 7 г/л, гормоны: гиббереллин - 0.1 мг/л, 6-БАП - 2 мг/л, рН готовой среды 5.6-5.8).

В качестве экспланта используют боковые почки из средней части 1-летнего побега. Побеги промывают водопроводной водой с мылом, ополаскивают дистиллированной водой, вырезают почку. Стерилизуют сначала 70% этанолом в течение 1 минуты, а затем в растворе хлорамина 10 минут. Трижды промывают стерильной дистиллированной водой (в каждой порции по 10 минут). Срезы обновляют, снимают почечные чешуи и переносят почки на агаризованную питательную среду в пробирки. В некоторых случаях экспланты переносят на свежую питательную среду, так как в среду выделяются полифенолы. Культивируют при температуре 18-25оС, освещенности 500-1000 люкс, 16-часовом фотопериоде. Пассируется через 3-4 недели. Для укоренения побеги переносят на среду Гамборга (В5) с добавлением 1 мг/л ИУК и увеличивают интенсивность освещения до 2000 люкс.

При переносе посадочного материала в почву используют следующие материалы и оборудование: пробирки с растениями, горшки с почвой; почву желательно прогреть или проавтоклавировать до посадки растений

Сделать пробиркой углубление в увлажненной почве в горшке. Пробирочное растение вынуть из пробирки, поместить в горшки с почвой, не отмывая агаровой среды. Уплотнить почву вокруг растения. Первые 3-5 дней желательно прикрывать растения стеклянным колпаком. Через 10 дней растения пересаживают на постоянное место в теплице [7].

Клональное микроразмножение архидей

Первые работы в области клонального микроразмножения были проведены в конце 50-х годов XX столетия и связаны с именем Жоржа Мореля, которому удалось получить первые растения-регенеранты орхидей. Культивируя в стерильных условиях верхушку побега орхидеи, размером всего 0,5 мм, он наблюдал формирование сферических структур, напоминающих видоизмененные почки. Эти структуры можно было делить, подращивать на искусственной питательной среде, опять делить и получать из них целые растения. Французские фирмы, занимающиеся разведением орхидей, использовали этот метод, и очень скоро орхидеи из мериклонов появились на цветочном рынке в огромном количестве, превратив орхидею из дорогого и редкого цветка в широко распространенное растение.

Для массового получения оздоровленных растений необходимо, чтобы быстрое клональное микроразмножение новых и уже существующих сортов стало крупномасштабным процессом. Среди растений этот способ впервые применили для размножения орхидных. Теперь так размножают многие декоративные растения. Микроклональное размножение позволяет получить из одной чешуи луковицы до 105 новых растений за 6 месяцев. Большая часть гербер, которые продаются в цветочных магазинах, получена путем клонирования. Одно растение герберы за год при клональном микроразмножении дает до одного миллиона новых генотипически и фенотипически сходных растений. При обычных способах размножения можно получить только 50-100 растений.

В настоящее время большое внимание уделяется культуре орхидей. Коллекция насчитывает, как было изложено выше, 108 таксонов собственной репродукции, в т.ч. 55 видов, из которых 23 в списке охраняемых, и 53 гибрида. Для орхидных, естественное размножение которых требует особых условий, введение в культуру и микроклональное размножение является единственным способом получения достаточного количества посадочного материала сортов и гибридных форм этой культуры в промышленном цветоводстве.

В рамках ГП «Реконструкция объектов ЦБС НАН Беларуси» была проведена работа по созданию in vitro коллекции орхидных в ЦБС НАН Беларуси

В настоящее время in vitro коллекция орхидных Отдела биохимии и биотехнологии растений ЦБС НАНБ насчитывает 35 образцов. Из них 28 относятся к представителям тропических и субтропических видов орхидей и семь к орхидным зоны умеренного климата (в том числе Cypripedium calceolus, занесенный в Красную Книгу Республики Беларусь). Для создания коллекции использовался растительный материал из фондовой оранжереи ЦБС НАН Беларуси и частных коллекций (Ракицкий С.Е., Бурчик Н.А.). 17 образцов стерильных культур получены из ФИБХ им. М.М. Шимякина и Ю.А. Овчинникова РАН (РФ), ГБС им. Н.В.Цицина (РФ) и НБС им. Н.Н.Гришко (Украина). К настоящему времени получено и выращивается в условиях оранжереи около 500 растений тропических орхидных.

Введение в культуру видовых растений, а так же гибридов первого поколения осуществлялся посевом семян в асептических условиях. Такой способ является одним из наиболее популярных и широко используемых методов размножения и введения в культуру орхидных. При этом можно использовать как сухие семена, полученные из созревших коробочек, так и недозревшие зеленые коробочки. Были получены стерильные культуры Cymbidium lowianum, Bletilla striata, Laelia purpurata, Stanhopea tigrina, Cypripedium calceolus, Dactylorhiza fuchsii, Dactylorhiza maculata. Стимулирующее действие на всхожесть семян Stanhopea tigrina и Bletilla striata оказало их культивирование до момента образования протокормов в темноте. При перенесении таких протокормов в условия освещения у них начинался синтез хлорофилла и активный рост первичного побега. При подобном способе проращивания семян снижалось количество некротизированных протокормов по сравнению с протокормами, выращенными на свету. Подросшие сеянцы пикировали на свежие среды и после формирования достаточного количества корней переходили к адаптации растений в условиях оранжереи.

Для введения в культуру сортов и гибридов использовались вегетативные органы, содержащие меристематические ткани: апикальные и латеральные почки молодых побегов, покоящиеся почки цветоносов. Основной средой культивирования полученных in vitro растений была среда MS с добавлением различных регуляторов роста. При культивировании орхидных умеренного климата так же использовалась среда BM.

Адаптация размноженных in vitro растений проводилась в 2 этапа. В качестве субстрата для первого этапа адаптации был использован измельченный сфагновый мох, предварительно обработанный кипятком. Растения высаживались в посадочные плошки на расстоянии 1-2 см друг от друга с небольшим заглублением в субстрат не более 0,5 см. Высаженные в субстрат растения переносили в изолированную теплицу с высокой влажностью и необходимой температурой воздуха. Период нахождения в таких условиях составил для всех сортов Phalaenopsis hybridum, Epidendrum radicans, Macodes petola - 3 месяца, Dendrobium sp, Dendrobium phalaenopsis “Red Lip” и Oncidium sp - 4 месяца, Oncidium lanceanum - 6 месяцев.

Появление у растений новых туберидиев и корней позволило перейти ко второму этапу адаптации - пересадке растений на смешанный субстрат.

Смешанный субстрат готовили из следующих компонентов: сосновая кора, мох сфагнум, не полностью разложившаяся часть верхового торфа, древесный уголь в соотношении 1:1:1:0,1, соответственно.

В течение 10 дней после пересадки растения находились в изолированной теплице в режиме, аналогичном первому этапу, а затем были помещены в теплицу с условиями наиболее приближенными к естественным: Phalaenopsis hybridum, Macodes petola находились в оранжерее с минимальными колебаниями температуры, которая составляла 18-20 °C, а Dendrobium sp., Dendrobium phalaenopsis «Red Lip» и Oncidium sp. в оранжерее с дневной температурой 18-20 °C и ночной 10-12 °C.

клональный микроразмножение декоративный почвенный

Заключение

Значение клонального микроразмножения:

1. Размножают редкие сорта и гибриды растений, а также растения, которые не размножаются в искусственных условиях.

2. В селекции клональное микроразмножение применяют для сохранения в культуре новых перспективных сортов, особенно полученных in vitro. Создание нужного для селекционера количества копий уникальных генотипов не требует больших масштабов. Периодически пересаживая микрочеренки, микроклубни или другие органы растений на свежую питательную среду, можно достаточно долго сохранять в культуре in vitro растения с необходимым генотипом.

3. Клональное микроразмножение используется также для быстрого получения больших количеств безвирусного материала с дальнейшей посадкой в грунт.

Растения, полученные из меристем, во многих случаях свободны от вирусов. Клональное размножение таких растений и их тестирование на отсутствие вирусов позволили получать оздоровленный посадочный материал. Таким способом размножают ценные сорта картофеля, земляники избавленные от вирусной инфекции.

4. Клональное микроразмножение помогает в сохранении редких и исчезающих видов растений. Однако эта технология размножения редких растений и их возвращение в природные экосистемы ещё нуждается в разработке.

5. Клональное микроразмножение применяют также для ускорения размножения в селекции древесных растений. В Италии, в результате черенкования пазушных побегов in vitro, за год выращивают более миллиона подвоев персиковых деревьев. Таким же образом клонируют гвинейскую масляничную пальму, многие породы хвойных деревьев (ель, сосна, лиственница, секвойя). С помощью клонального размножения отдельных экземпляров взрослых растений удается создавать декоративные древесные растения необычной формы и расцветки, например в виде шара, «плакучие», золотистого цвета и т. д. [1]

Список литературы

1. Бутенко Р. Г. Биология культивируемых клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе, Монография. - Москва, ФБК-Пресс, 1999 159 с.

2. Катаева Н. В., Бутенко Р. Г. Клональное микроразмножение растений. - М., 1983.

3. Культура клеток растений. / под ред. Р. Г. Бутенко. М., 1986.

Размещено на Allbest.ur