Комплексные пробиотические бактерии для лечения кишечных заболеваний

Естественно, нельзя отказаться от вакцинаций, дезинфекций, применения антибиотиков, антгельминтиков, кокцидиостатиков при соответствующих показаниях. Но восстановить нормальную микрофлору после их применения необходимо. Если слизистая пищеварительного тракта нарушена, эффективное производство невозможно, так как пищевые компоненты корма просто не усваиваются.

При выборе пробиотика целесообразно учитывать его фармакологические свойства. При необходимости нормализовать примембранное пищеварение, не следует использовать препараты на основе дрожжей. Сильные антагонисты на основе В. subtilis будут эффективны только при отдельных инфекциях. Нельзя полностью отказаться от антибиотиков, так как возможна реальная угроза распространения инфекции на все поголовье с резким снижением производственных показателей. Препараты, включающие лакто- и бифидобактерии, могут быть неэффективны, если производятся на основе медицинских или фармакологически неактивных в кишечнике животных и птицы штаммов микроорганизмов.

Препараты из живых бактерий получили широкое распространение во многих странах, и сфера их применения постоянно расширяется. При столь широком использовании бактерийных биопрепаратов мнения исследователей о степени их эффективности при различных формах заболеваний и самом механизме действия весьма разноречивы. Этим, отчасти, можно объяснить значительное многообразие состава и форм препаратов данного типа, предлагаемых практической медицине и ветеринарии. Примечательно, что в каждой из стран, применяющих препараты из бактерий - представителей нормальной микрофлоры, последние различаются по видовому составу и свойствам культур, набору входящих в них штаммов и формам выпуска.

Главное назначение пробиотических препаратов и кисломолочных продуктов с пробиотическими свойствами - это поддержание хорошего состояния здоровья у людей различных возвратных групп. В биотехнологических процессах производство продуктов с пробиотическими свойствами микроорганизмы выполняют следующие функции: изменят физико-химические показатели исходного сырья, осуществляют биохимические превращения исходных компонентов в соединения, обуславливающие органолептические показатели кисломолочных продуктов. Пробиотическое действие продуктов и препаратов обусловлено свойствами применяемых микроорганизмов, в частности бифидобактерий, лактобацилл и других молочнокислых бактерий. Таким образом, определяющим этапом в биотехнологии таких продуктов являются принципы подбора штаммов микроорганизмов для кисломолочных продуктов и препаратов с пробиотическими свойствами [30].

пробиотический бактерия лечение кишечный

1.1.8 Видовая характеристика бактерий родов Lactobacillus и Bacillus

Лактобациллы - род грамположительных факультативно-анаэробных бактерий. Один из важнейших в группе молочнокислых бактерий, большинство членов которой превращают лактозу и другие углеводы в молочную кислоту.

Рисунок 2. Функции пробиотических препаратов

В большинстве случаев они непатогенны, многие виды выполняют положительную роль в питании животных. На рисунке 2 показаны функции пробиотических препаратов. У животных они постоянно присутствуют в кишечнике, во влагалище, где являются симбионтами и составляют значительную часть микрофлоры кишечника. Многие виды принимают участие в разложении остатков растений. Они продуцируют молочную кислоту, а кислая среда препятствует росту многих патогенных бактерий и грибов.

Биологические свойства. Лечебный эффект препаратов, которые содержат лактобациллы, обусловлен антагонистическим действием лактобактерий по отношению к патогенным микроорганизмам, включая стафилококки, энтеропатогенные кишечные палочки, протеи, шигеллы, что определяет коррегирующее действие препарата при нарушениях бактериоценоза. Препараты лактобактерий улучшают обменные процессы, препятствуют формированию затяжных форм кишечных заболеваний, повышают неспецифическую резистентность организма. Лактобактерии реутери вырабатывают вещество реутерин, которое подавляет рост патогенной флоры в кишечнике и не влияет на рост собственной полезной флоры.

Штаммы молочнокислых бактерий используют в производстве медицинских препаратов - пробиотиков, предназначенных для восстановления нормальной микрофлоры кишечника и репродуктивной системы у женщин(после инфекционных заболеваний, антибиотикотерапии). Применение лактобактерий реутери у младенцев уменьшает выраженность колик, связанных с нарушениями микрофлоры в кишечнике.

Авторы [31] поставили перед собой задачу создать комплексный пробиотический препарат для животных, позволяющий повысить эффективность его действия за счет содержания в нем адсорбента, а также расширить спектр лечебно-профилактических свойств препарата за счет включения в его состав микроорганизмов, устойчивых к антибиотикам и позволяющих применять его совместно с антибиотикотерапией при тяжелых формах инфекции. Поставленная задача достигается тем, что комплексный пробиотический препарат для животных "БИФИТРИЛАК", содержащий микроорганизмы Lactobacillus acidophilus и Bifidobacterium bifidum, дополнительно содержит микроорганизмы Lactobacillus bulgaricus и Laсtobacillus fermentum, а также адсорбент, причем все микроорганизмы взяты в равных соотношениях с титром 0,5 ·109 жизнеспособных единиц на 1 г адсорбента, в качестве которого использован вермикулит.

Сущность изобретения заключается в расширении видового спектра микроорганизмов, применяемых в предлагаемом препарате, которые выделены из микрофлоры здоровых животных разных видов, и дополнительном введении адсорбента.

Использование такого комплекса видов микроорганизмов обеспечивает препарату высокую антагонистическую активность в отношении широкой группы болезнетворных микроорганизмов.

Авторы [32] получили комплексный препарат-пробиотик, отличающийся тем, что в качестве консорциума лактобактерий он содержит штаммы лактобактерий Lactobacillus acidophilus 57S, Lactobacillus plantarum П-75, Lactobacillus casei Сб в соотношении 4:1,0:1,0.

Бациллы - обширный род грамположительных палочковидных бактерий, образующих внутриклеточные споры. Большинство бацилл - почвенные сапрофиты. Некоторые бациллы вызывают болезни животных и человека, например сибирскую язву, токсикоинфекции (Bacillus cereus).

Бациллы являются аэробами или факультативными анаэробами, большинство представителей хемоорганогетеротрофы и растут на простых питательных средах. Некоторые виды способны к нитратредукции. Крупные и среднего размера прямые или слабоизогнутые палочки, способные к образованию устойчивых к неблагоприятным воздействиям эндоспор (экстремальным температурам, высушиванию, ионизирующим излучениям, химическим агентам), большинство видов подвижно и обладают жгутиками, расположенными перетрихиально, Bacillus anthracis образует капсулы. По методу Грама окрашиваются положительно. Недавние исследования выявили, что бактерии вида Bacillus subtilis способны к каннибализму во время споруляции путём продукции токсинов в окружающую среду и дальнейшему лизису клеток своего вида.

Авторы [33] получили комплексный пробиотический препарат, включающий клетки пробиотических лактобактерий или бифидобактерий или их смеси и полимерную добавку, помещенные в кищечно-растворимую капсулу, отличающийся тем, что клетки пробиотических лакто- и бифидобактерий принадлежат к видам Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, а полимерная добавка, выполняющая функцию связующего и являющаяся полисахаридом. выбрана из группы амилопектин, крахмал восковидной кукурузы, нативный картофельный крахмал, растворимый картофельный крахмал, пшеничный крахмал, мальтодекстрин, их смеси, причем указанные компоненты входят в состав комплексного препарата в соотношении 108-10 12 клеток пробиотических лакто- и бифидобактерий на 0,01-1 г полимерной добавки.

Bacillus subtilis является важнейшим продуцентом амилаз и протеиназ и используется в производстве. Bacillus thuringiensis, а также синтезируемые этим видом бактерий токсины, используются в биозащите растений в качестве альтернативы синтетических инсектицидов.

Автор [34] получил штамм бактерий В. Subtilis 12В-ДЕП в коллекции микроорганизмов, обладающий широким спектром антагонистической активности и устойчивостью к антибиотикам.

Преимуществами бацилл как хозяев для клонирования ДНК является высокая изученность генома многих видов, способность секретировать интактные белки в окружающую среду, нетребовательность большинства видов к питательной среде, высокая технологичность, а также возможность длительного хранения промышленных штаммов в виде высушенных спор. Поэтому для бацилл разработан ряд векторов, обеспечивающих перенос генетической информации и синтез необходимого продукта [35].

1.2 Постановка задачи исследования

В настоящее время препараты и продукты, созданные с использованием молочнокислых бактерий и бацилл, рассматриваются в качестве основы функционального питания животных, и способствуют профилактике ряда заболеваний. Положительный эффект достигается путем введения живых клеток лактобактерий и бацилл непосредственно в организм животного (так называемые пробиотики), так и путем использования этих микроорганизмов в составе заквасок при получении продуктов питания в том числе на основе молока. Полноценные рационы обеспечивают нормальное течение физиологических функций организма животных и их высокую продуктивность. Недостаток хотя бы одного питательного вещества независимо от того, служит он источником или нет, отрицательно сказывается на продуктивности и состоянии здоровых коров.

Рацион можно сбалансировать не только за счет введения дефицитных компонентов, но и с помощью добавок, повышающих эффективность усвоения корма. Биологически активные препараты позволяют извлечь из него максимум питательных веществ и энергии, они нормализуют работу пищеварительной системы и таким образом помогают полностью обеспечить физиологические потребности животного при минимальных затратах на корм. К числу кормовых добавок, в наибольшей степени соответствующим особенностям пищеварительной системы жвачных животных, относятся пробиотики. Пробиотики можно скармливать животным, в качестве отдельной добавки.

Современные методы разведения скота сопряжены с колоссальным стрессом для молодых сельскохозяйственных животных. Молодое животное отлучают от матери вскоре после рождения, переводят на искусственное кормление, чтоб достичь быстрого увеличения веса за возможно более короткий срок. В это время у животных часто появляются энтериты и диарея - видимо, как результат дисбаланса кишечной микрофлоры. Этот дисбаланс возникает из-за того, что желудок не заселяется, нормальными непатогенными м.о., которые в естественных условиях разведения животных получают из материнского молока.

Поэтому более перспективным представляется поиск многофункциональных добавок, сочетающих в себе несколько механизмов воздействия на биоценозы пищеварительной системы животных.

Важной особенностью пробиотиков является способность повышать противоинфекционную устойчивость организма, регулировать и стимулировать пищеваритльную систему. Поэтому разработка технологии получения пробиотиков на основе молочнокислых бактерий позволяет решить важную сельскохозяйственную задачу.

1.3 Экспериментальная часть

1.3.1. Методики проведения экспериментов

Методика выделения молочнокислых бактерий

Для выделения молочнокислых бактерий мы использовали обрат и фекалии теленка. Из сырого молока предварительно получали обрат, который затем автоклавировали. Посев проводили методом глубинного культивирования в предварительно подготовленных в сушильном шкафу чашках Петри. Открывая чашки Петри, разливали обрат. Микробиологическую петлю обжигали над пламенем спиртовки, затем, немного остудив, брали ею пробу фекалий теленка. Пробу предварительно подвергали разведению в дистиллированной воде, а затем делали посев на жидкую питательную среду. Далее чашки Петри помещали в термостат при температуре 37°С. Время инкубирования - 7 суток. По истечении времени инкубации мы извлекли чашки Петри из термостата. Делали 3-4 таких посевов.

Постепенно лактобактерии, образуя молочную кислоту и получив оптимальные условия для развития, подавляют развитие гнилостных бактерий, содержащихся в фекалиях[36].

Методика приготовления препарата для микроскопирования

Для приготовления препарата микробиологическую петлю обжигали над пламенем спиртовки, затем, немного остудив, брали ею культуру образовавшейся ацидофильной палочки и делали мазок на предметное стекло. Далее сушили на воздухе, фиксировали на пламени и красили метиленовым синим в течение 2-3 минут. Закрыли покровным стеклом и поместили препарат под микроскоп [37].

На рисунке 3 показаны этапы приготовления препарата для микроскопирования.

Рисунок 3. Приготовление препарата для микроскопирования

Методика приготовления питательных сред

Посуда для приготовления сред не должна содержать посторонних веществ, например щелочей, выделяемых некоторыми сортами стекла, или окислов железа, которые могут попасть в среду при варке ее в ржавых кастрюлях. Лучше всего пользоваться стеклянной, эмалированной или алюминиевой посудой. Большие количества среды (десятки и сотни литров) готовят в специальных варочных котлах или реакторах. Перед употреблением посуду необходимо тщательно вымыть, прополоскать и высушить. Новую стеклянную посуду предварительно кипятят 30 мин в 1--2% растворе хлороводородной кислоты или погружают в этот раствор на ночь, после чего в течение часа прополаскивают в проточной воде.

Этапы приготовления сред: 1) варка; 2) установление оптимальной величины рН; 3) осветление; 4) фильтрация; 5) разлив; 6) стерилизация; 7) контроль.

Варят среды на открытом огне, водяной бане, в автоклаве или варочных котлах, подогреваемых паром.

Установление рН сред ориентировочно производят с помощью индикаторных бумажек. Для точного определения рН используют потенциометр.

Разливают среды в пробирки (по 3--5 мл или по 10 мл), флаконы, колбы, матрицы и бутылки не более чем на 23 емкости, так как при стерилизации могут намокнуть пробки и среды утратят стерильность.

Среды, которые стерилизуют при температуре выше 100°С, разливают в чистую сухую посуду. Среды, стерилизуемые при более низкой температуре, обязательно разли вают в стерильную посуду.

Разливают среды с помощью воронки, на конец которой* надета резиновая трубка с зажимом Мора. Для мерного разлива применяют мензурки, бюретки, дозаторы, шприцы-пипетки и т. п.

Посуду со средой обычно закрывают ватно-марлевыми пробками, поверх которых надевают бумажные колпачки. Важно, чтобы при разливе среда не смачивала края посуды, иначе к ним могут прилипнуть пробки. К каждому сосуду обязательно прикрепляют этикетку с названием среды и той ее приготовления [38].

Методика определения антагонистической активности

Для определения антагонистической активности штаммов нами использован метод, основанный на способности биологически активных веществ микроорганизмов диффундировать в толщу агара и задерживать рост или убивать находящихся в зоне диффузии других микроорганизмов. В качестве тест - микробов использовали E. Сoli.

Для опыта готовили четыре чашки Петри со стерильным агаром на гидролизованном молоке (рН 7,3) и засевали их культурой штамма, антагонистические свойства которого изучаются. Температура культивирования - оптимальная для этого штамма. В первой чашке культуру выращивали 3 суток, во второй - 4 сутки, в третьей - 5 суток и в четвертой - 6 суток. К этому времени готовили четыре чашки Петри - три со стерильным МПА и одну с синтетической средой для культивирования микроорганизмов рода Baccillus.

На агар первой чашки засевали штамм E. coli, и Bacillus subtilis. Затем из чашек, где культивировался изучаемы штамм - антагонист, стерильным пробочным сверлом вырезали агаровые блоки диаметром 0,5 см и переносили на чашки с тест - микробами, располагая их колонии к агару.

После 24 ч инкубации делали выводы об антагонистической способности изучаемого штамма по диаметру зоны задержки роста тест - микроба.

Осуществляли методом перпендикулярных штрихов на плотной питательной среде. На агаровую пластину с питательной средой микробиологической петлей наносят культуру по всему диаметру чашки Петри. Культуру инкубировали при температуре (37±1) °С в течение четырех суток. К выросшей культуре методом штриха высевали суточные тест-культуры, делая петлей полоски шириной 1мм в направлении от штриха pocтa культуры штамма, не касаясь ее, перпендикулярно. Посевы выдерживали в термостате при температуре (37±1) °С в течение суток. Результат учитывали по величине зоны отсутствия роста тест-культур [39].

Методика определения чувствительности к антибиотикам

Известно, что многие микроорганизмы могут адаптироваться практически к любым антибиотическим веществам, однако степень адаптации в разных случаях различная.

Для определения чувствительности микробов к антибиотикам существует ряд методов: метод последовательных разведений в жидкой питательной среде или питательном агаре, метод диффузии в агар (метод дисков, насыщенных антибиотиками) и ускоренные методы. Надежным и точным количественным методом является метод последовательных разведений антибиотиков в питательной среде в стандартных условиях опыта.

Чтобы изучить формирование колоний тест - микробов резистентных к антибиотическому веществу изучаемых штамм - антагонистов, использовали методику, предложенную Кобальским в 1961 году. В стерильные чашки Петри, поставленные наклонно, заливаем слой расплавленного питательного агара, смешанного с суспензией штамма. После застывания агара в горизонтально расположенную чашку наливали питательную среду, необходимую для развития микроба. Чашку выдерживали 48 ч для роста изучаемого штамма и диффузии в агар антибиотического вещества, выделяемого штамма. После этого поверхность агара засевали суспензией тест - микроба, чашку помещали в термостат при температуре, благоприятной для развития этого микроорганизма.

В области высокой концентрации антибиотического вещества, выделяемого изучаемым штаммом (наибольшая толщина нижнего слоя), вырастали только резистентные колонии.

Этот метод позволяет установить формирование резистентных колоний тест-микробов по отношению к антибиотическому веществу, выделяемому изучаемыми штаммами бактерий.

Устойчивость к антибиотикам изучали с помощью бумажных дисков, пропитанных различными антибиотиками [40].

1.3.2 Результаты эксперимента и их обсуждение

Выделение молочнокислых бактерий

Для выделения молочнокислых бактерий мы использовали обрат и фекалии теленка, отобранные в трех районах Южно-Казахстанской области: Енбекшинский, Сайрамский и Байдибекский. Также, учитывали возраст телят, при отборе фекальных масс. Далее по методике, указанной выше, выделяли молочнокислые бактерии и микроскопировали. На рисунке 4 показано поэтапное выделение молочнокислых бактерий из фекалиев телят.

Рисунок 4. Выделение молочнокислых бактерий

Изучение морфологических и биохимических свойств штаммов микроорганизмов

Анализ данных литературы показывает, что в настоящее время наиболее перспективными в качестве основы для разработки нового пробиотика могут быть штаммы бактерий рода Lactobacillus. Совокупность биологических свойств бактерий родов Lactobacillus и биологически активных веществ, продуцируемых ими, обеспечивает комплексное действие пробиотического препарата.

Для изучения и выбора активных штаммов лактобацилл исследовали культуры штаммов L. buchueri 2, L. plantarum FK20, L. ferrmentum 90T-C4, L. fermentum B-4916, L. acidophilus 1 EC, L. acidophilus B-2104, полученных из трех районов Южно-Казахстанской области.

Культурально - морфологические и физиолого-биохимические свойства выше указанных культур представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Культурально-морфологические и физиолого-биохимиеские свойства бактерий рода Lactobacillus

Культура штамма	Культурально-морфологические свойства	Физиолого-биохимические свойства
L. buchneri 2	Грамположительные палочки размером 0.5-2,4 мкм. Oтмеченная высокая гетерогентность. На плотных питательных средах образует выпуклые колонии с цельным ровный красна на 2 сутки образуется пигмент желтого цвета.	Ферментирует без образования газа глюкозу, рамнозу, сахарозу, талактозу, лактозу. Восстанавливает лакмусовое молоко, образует аммиак аргинина.
L- planlarum FK20	Грамположительные палочки размером 1-10 мкм. На плотных питательных средах образуя выпуклые колонии с цельным ровным краем, белого цвета диаметром до 5 мм.	Ферментирует без образования газа глюкозу, рамнозу, сахарозу, галактозу, лактозу, слабо - сорбит, мальтозу, салицин, магнит. Восстанавливает лакмусовое молоко, образует аммиак аргинина.
L. fermentum В-4916	Грамположительные мелкие палочки, расположенные одиночно или в цепочках. На плотных питательных средах образует мелкие ровные, выпуклые, непрозрачные колонии.	Ферментирует глюкозу, рамнозу сахарозу, раффинозу, не сбраживает салицин. Развивается в присутствии поваренной соли (4%), восстанавливает лакмусовое молоко, образует аммиак из аргинина
L. fermentum 90Т-С4	Грамположительные мелкие палочки, расположенные в цепочки. На плотных питательных средах образует мелкие выпуклые колонии с ровным краем белого цвета	Расщепляет глюкозу с образованием кислоты и газа, Разлагает лактозу, мальтозу, галактозу, слабо - маннозу и сахарозу. Сорбит, целлобиозу, раффинозу, салицин, маннит не сбраживает. Частично восстанавливает лакмусовое молоко, образует аммиак аргинина.

Учитывая, что в состав экспериментального образца пробиотика были вкючены культуры штамма L. рlantarum FK20, приведем их исходные паспортные характеристики.

Высокой устойчивостью и ингибирующим фактором роста обладает штамм L. planlarum FK20.

Чем больше углеводов расщепляет микроорганизм, тем больше количество продуктов брожения всасывается из толстого кишечника в кровь и используется микроорганизмом. Отсутствие при этом образования газа предотвращает вспучивание.

Резюмируя результаты изучения биохимических свойств микроорганизмов, мы пришли к заключению, что L.buchneri 2 не может использоваться для изготовления пробиотика, поскольку обладает недостаточно высокой активностью кислотообразования, не развиваются в кислой среде и неустойчивы к фенолу.

L. fermentum 90Т-С4 не соответствует предъявленным требованиям, поскольку является низким кислотообразователем, неустойчив к желчи и не отличается широким спектром сахаролитических свойств.

Он обладает высокой активностью кислотообразования, устойчив к желчи и фенолу, сбраживают широкий спектр углеводов без образования газа, что необходимо для размножения в условиях желудочно - кишечного тракта.

Однако в борьбе с другими микроорганизмами (в том числе и с патогенными) за экологическую нишу недостаточно только этих качеств. Микроорганизмы пробиотического препарата могут успешно конкурировать за среду обитания, находясь не в содержимом просвете кишечника, а непосредственно фиксируясь на поверхности чувствительных к ним клеток микроорганизма.

Исходя из этого предположения, мы изучали способность микроорганизмов адгезироваться на клетках желудочно - кишечного тракта, то есть, способность распознавать чувствительные к ним клетки микроорганизма и прикрепляться к ним.

Критериями для отбора микроорганизмов, пригодных для изготовления пробиотиков, послужила активность кислотообразования и предельная кислотность сгустков, поскольку эти показатели свидетельствуют об интенсивности кислотообразования и количестве образуемой кислоты, губительно действующей на гнилостную микрофлору.

Изучаемые штаммы должны обладать высокой активностью кислотообразования. Оценку уровня кислообразования лактобактерий проводили титрометрическим методом при выращивании лактобацилл в мясо - пептоном бульоне. Результаты исследований по изучению уровня кислотообразования представлены в таблице 3.

L. fermentum B-4916 образует сгусток в молоке через 4-5 часов, однако предельная кислотность сгустка очень низкая и составляет 70°Т. Низкая кислотообразующая способность ацидофильной палочки - ценное свойство для

Таблица 3 - Оценка уровня кислотообразования лактобактерий

Культура штамма	Предельная активность кислотообразования, °Т
L.buchneri 2	85-95
L. plantarum FK20	220- 225
L. fermentum B-4916	70-75
L. fermentum 90T-C4	90-111
L. acidophilus IK	70 -80

изготовления молочных продуктов, поскольку сейчас в коллекциях представлены в основном ацидофильные палочки - сильные кислотообразователи, однако для изготовления биопрепарата - это негативный фактор.

Достаточно активным кислотообразователем является L. acidophilus B-2104, образующий сгусток в молоке через 8-12 часов.

L. plantarum FK20 свертывает молоко через 20-24 ч и 50-56 ч соответственно, кислотность сгустков не превышает 225°Т.

К микроорганизмам со средней активностью кислотообразования можно отнести L. fermentum 90T-C4, L. acidophilus B-2104, L.buchneri 2 образующие сгустки в течение 16-18 ч.

По результатам изучения морфологических и биохимических свойств высокой устойчивостью и ингибирующим фактором роста обладает штамм L. planlarum FK20. Также L. plantarum FK20 свертывает молоко через 20-24 ч и 50-56 ч соответственно, кислотность сгустков не превышает 225°Т. Анализируя полученные данные, мы определили, что наиболее полно предъявленным требованиям отвечает L. planlarum FK20.

Учитывая, что в состав экспериментального образца пробиотика были вкючены культуры штамма L. рlantarum 8Р - А3, приведем их исходные паспортные характеристики.

Бактерии штамма L. рlantarum FK20 микроскопически представляют собой грамположительные палочки, расположенные одиночно или в цепочках, размером от 1,0 до 8,4 мкм. На плотных питательных средах (MRS, капустном агаре) на 2 сутки культура образует мелкие ровные колонии белого цвета диаметром от 2 до 5 мм, выпуклые, с цельным краем, непрозрачные, без пигмента [41].

Оптимальные значения рН питательной среды составляют от 5,8 до 6,2. Культура устойчива при понижении кислотности среды. Оптимальная темтература роста - 37 ?С.

Культура штамма L. рlantarum FK20 развивается в мясопептонном бульоне с 6 % содержанием хлорида натрия, ферментирует без образования газа глюкозу, рамнозу, сахарозу, галактозу, сорбит, мальтозу, лактозу и салицин. Восстанавливает лакмусовое молоко.

Штамм молочнокислых микроорганизмов, которые непосредственно использовали в исследованиях, поддерживали и сохраняли методом пересева в стерильное обезжиренное молоко каждые 10 дней. Между пересевами культуры хранили в холодильнике при +4 - +18 °С. Однако этот метод трудоемок и требует большого количества обезжиренного молока.

Более удобным методом хранения молочнокислых микроорганизмов является их хранение в пробирках с гидролизованным молоком (рН 7,2) при температуре 2-4 °С. В таких условиях все исследуемые культуры хранились в течение двух месяцев, практически не изменяя свои свойства [42].

Молочнокислые микроорганизмы длительное время до шести месяцев сократились следующим образом: культуру засевали уколом в полужидкий агар на гидролизованном молоке (0,75 агар). После термостатирования заливали тонким слоем стерильного вазелиного масла. Масло должно быть высокой вязкости и не содержать продуктов окисления и токсических веществ, слой масла должен на 1 см превышать края агара. Культура хранилась в холодильнике.

Опыты проводили с целью отбора по сумме признаков тех штаммов, которые могли бы размножаться в условиях желудочно - кишечного тракта и использоваться для изготовления пробиотика.

Важным критерием при отборе микроорганизмов для изготовления пробиотика является их устойчивость к различным ингибирующим веществам - натрия хлориду, желчи, действию которой они подвергаются в тонком отделе кишечника, фенолу, образующемуся в толстом отделе кишечника при гнилостном распаде белков. Биохимические свойства лактобактерий представлены в таблице 4. Как видно из таблицы 4, свойства исследуемых штаммов соответствуют биохимическим свойствам. Данные свидетельствуют о том, что в присутствии 0,4; фенола в среде не размножаются штаммы L. buchneri 2 и L. fermentum В-4916. К желчи неустойчивы - L. buchneri 2.

Для изучения и выбора активных штаммов бацилл исследовали культуры штаммов B.subtilis ТПИ-9, B.subtilis ТПИ-13, B.subtilis F7, B.licheniformis 31 полученных из музея кафедры «Биотехнология».

Культурально - морфологические и физиолого-биохимические свойства выше указанных культур представлены в таблице 5.

Таблица 4 - Биохимические свойства микроорганизмов рода Lactobacillus

№	Свойства микроорганизмов	Название штаммов
		L. buchneri 2	L. planlarum FK20	L. fermentum В-4916	L. fermentum 90Т-С4
1	Рост в гидролизованном молоке с хлоридом натрия, 2% 4% 6,5%	+ - -	+ + -	- - -	- - -
2	Рост в гидролизованном молоке с желчью, 20% 30% 40%	+ - -	+ + +	- + +	+ - -
3	Рост в обезжиренном молоке с 0,4% фенола	-	+	-	-
4	Рост в обезжиренном молоке с 0,05% метиленового голубого	+	-	-	-
5	Образование: NH3 СО2	+ -	+ +	+ -	- -
6	Образование: глюкоза лактоза арабиноза ксилоза галактоза манноза рамноза мальтоза	+ + + + - - - +	+ + - + + - + +	+ + - - - + - -	- - - - + - - +

Таблица 5 - Культурально-морфологические и физиолого-биохимиеские свойства бактерий рода Bacillus

Культура штамма	Культурально-морфологические свойства	Физиолого-биохимические свойства
B.subtilis ТПИ-9	Грамположительные спорообразующие подвижные палочки, устойчивые к канамицину. На МПА образует матовые складчатые колонии.	Продуцирует каталазу, не гидролизует мочевину, гидролизует крахмал и казеин, разжижает желатин. Ферментирует глюкозу, арабинозу, ксилозу, маннит.
B.subtilis ТПИ-13	Грамположительные спорообразующие палочки размером 2,6-0,7 мкм, устойчивые к канамицину. На среде Громыко образует складчатые колонии черного цвета.	Продуцирует каталазу, не гидролизует мочевину, гидролизует крахмал и казеин, разжижает желатин. Ферментирует глюкозу, арабинозу, ксилозу, маннит.
B.subtilis F7	Грамположительные спорообразующие палочки, расположенные в цепочке. На плотных питательных средах с добавлением канамицина образует поверхностные, складчатые колонии с неровным краем диаметром до 6 мм телесного или сероватого цвета.	Продуцирует каталазу, не гидролизует мочевину, гидролизует крахмал и казеин, разжижает желатин. Ферментирует глюкозу, арабинозу, ксилозу, манит с образованием кислоты без газа.
B.licheniformis 31	Грамположительные спорообразующие палочки, расположенные в цепочке. На плотных питательных средах с добавлением канамицина образует поверхностные, складчатые колонии с неровным краем диаметром до 6 мм телесного или кремового цвета.	Продуцирует каталазу, не гидролизует мочевину, гидролизует крахмал и казеин, разжижает желатин. Ферментирует глюкозу, арабинозу, ксилозу, манит с образованием кислоты без газа.

Изучение антагонистических свойств штаммов L. plantarum FK20 и В. Subtilis F7

В связи с тем, что целью нашей работы являлось исследование микробиологических свойств комплексных пробиотических бактерий, для получения комплекса мы использовали штамм Вacillus Subtilis F7, полученный из музея кафедры «Биотехнология».

Высокая антагонистическая активность лактобактерий в отношении патогенных и условно- патогенных бактерий может быть вызвано не только продуцированием органических кислот, но и образованием антагонистических веществ. Во всех случаях изучаемые лактобактерии полностью подавляли рост и развития указанных тест-культур.

Защитные свойства лактобактерий во многом определяются их адгезивностью. Именно это свойство позволяет лактобактериям присутствовать в микрофлоре стенки кишечника, стать составной частью экологического барьера, блокиравать рецепторы клеток слизистых адгезинов патогенных микроорганизмов [43].

Успешная конкурентоспособность микроорганизмов на этапе колонизации биологических поверхностей обеспечивается не только их адгезивностью, но и выраженной антагонистической активностью.

Мы изучали анатгонистическую активность штаммов L. plantarum FK20 и В. Subtilis F7 по отношению к Е. соli.

Е. соli является представителем грамположительных бактерий. Этот микроорганизм чаще всего выделяется из кишечника животных, проявивших клинику гастроэнтерита или дисбактериоза и отстающих в росте, а также применяются в лабораторных исследованиях в случаях изыскания и изучения антибиотиков и их продуцентов.

В своих исследованиях мы не касались природы выделяемых антибиотических веществ и ограничились только качественной стороной способности исследуемых микроорганизмов подавлять развитие других видов.

На начальном этапе изучали антагонистические свойства бактерий с помощью штрихов, однако среда, пригодная для развития тест - микроба, оказалась непригодной для культивирования ацидофильной палочки и бифидобактерий.

Чтобы устранить этот недостаток, в дальнейшем использовали метод агаровых блочков.

Об антагонистической активности изучаемых микроорганизмов судили по диаметру воды задержания роста тест - микроба вокруг агаровых блочков. Метод агаровых блочков дал возможность использовать оптимальные среды и температуры культивирования для тест - микробов и микробов - антагонистов. Кроме того, благодаря этому методу, удалось проследить накопление антибиотика в процессе развития микроба - антагонист. В таблицах 5 отражены полученные результаты.

Таблица 6 - Угнетение роста тест - микробов штаммом L. plantarum FK20

Тест - микроб	Диаметр зоны задержки роста тест - микроба, мм
	3-х дневная культура штамма L. plantarum FK20	4-х дневная культура штамма L. plantarum FK20	5-ти дневная культура штамма L. plantarum FK20	6-ти дневная культура штамма L. plantarum FK20
Е. соli	Нет зоны	5	6	12
Р. vulgaris	7	10	15	18
S. enteritidis	13	15	20	20

Как видно из таблицы 5, выраженность антагонистической активности штамма FK20 зависит от возраста культуры и вида тест - микроба.

Наибольшее накопление антибиотического вещества происходило на шестые сутки культивирования. К его предельной концентрации в среде наиболее чувствительны Р. vulgaris и B. subtilis, зона задержки роста которых составила 20-22 мм в диаметре. Причем, уже в течение трех суток культивирования ацидофильной палочки в агаре накапливалось достаточное количество антибиотического вещества, губительно действующего на эти тест - микробы. Вокруг агарового блочка с трехдневной культурой штамм МD-1 зона задержки роста Р. vulgaris и B. subtilis составила 13-25 мм, вокруг 6-ти дневной 20-22 мм.

Менее чувствительным к антибиотическому веществу ацидофильной палочки оказался вид S. еnteritidis. Вокруг трехдневной культуры штамма МD-1 образовалась зона задержки его роста диаметром 7 мм, вокруг шестидневной - 18 мм.

Наибольшую устойчивость проявили клетки Е. соli. Трехдневная культура L. plantarum FK20 вообще не подавляла их развитие. При культивировании ацидофильной палочки в течение шести дней в агаре накапливалось достаточное количество антибиотического вещества для подавления Е. соli, однако диаметр задержки роста составлял 12 мм.

В результате установлено, что исследуемые штаммы не оказывают взаимоподавляющего действия друг на друга, поскольку вокруг агаровых блочков не было зон отсутствия роста микроорганизмов.

Таким образом, в опытах установлено, что штамм L. plantarum FK20 выделяет антибиотическое вещество или вещества, губительно действующие как на грамположительную, так и на грамотрицательную микрофлору. Результаты изучения антагонистической активности B. subtilis F7 отражены в таблице.

Таблица 7 - Угнетение роста тест - микробов штаммом B. subtilis F7

Тест - микроб	Диаметр зоны задержки роста тест - микроба, мм
	3-х дневная культура штамма B. subtilis F7	4-х дневная культура штамма B. subtilis F7	5-ти дневная культура штамма B. subtilis F7	6-ти дневная культура штамма B. subtilis F7
Е. соli	Нет зоны	6	9	12
Р. vulgaris	8	11	15	17
S. enteritidis	14	16	19	22

Изучение чувствительности к антибиотикам

Используя методику, приведенную выше, изучали характер взаимоотношений между штаммами L.plantarum FK20 и В. subtilis F7 при их совместном культивировании на чашках Петри. Для этого использовали шестидневную агаровую культуру FK20 и пятидневную культуру F7 (момент наибольшей интенсивности продуцирования антибиотических веществ).

В результате установлено, что исследуемые штаммы не оказывают взаимоподавляющего действия друг на друга, поскольку вокруг агаровых блочков не было зон отсутствия роста микроорганизмов.

По-видимому, при культивировании в смешанной культуре происходит резкое снижение рН среды обитания за счет кислотообразования, свойственного L. plantarum. Это служит предпосылкой для развития В. subtilis, который способен расти только в кислой среде.

Известно, что многие микроорганизмы, вначале обладающие высокой чувствительностью к действию антибиотических веществ, затем сказываются устойчивыми к ним. А это крайне нежелательное явление при лечении животных антибиотиками и пробиотическими препаратами.

Для определения спектра действия антибиотиков на штамм L.plantarum FK20 и В. subtilis F7 мы использовали диски фильтровальной бумаги, пропитанные растворами антибиотиков. Об устойчивости судили по наличию или отсутствию зон задержки роста исследуемого штамма вокруг диска. Результаты отражены в таблице 6.

Как видно из таблицы 6, L.plantarum FK20 и В. subtilis F7 устойчив к пенициллину и его синтетическим аналогам. Оба штамма устойчивы к мономицину. L.plantarum FK20 и В. subtilis F7 устойчивы к нистатину.

Однако оба микроорганизма чувствительны к тетрациклину и антибиотикам тетрациклинного ряда, которые представляют опасность для представителей облигатной микрофлоры кишечника и способствуют развитию дисбактериальных состояний.

Кроме того, рост L.plantarum FK20 и В. subtilis F7 задерживается в присутствии левомицитина. Бифидобактерии не размножаются в присутствии нистатина.

В настоящее время с целью лечения и повышения продуктивности животных очень широко применяются антибиотики, поэтому информация о том, к каким антибиотикам чувствителен микроорганизм, который должен выполнять функции пробиотического препарата, представляется весьма полезной.

Таблица 8 - Устойчивость L.plantarum FK20 и В. subtilis F7 к различным антибиотикам

Антибиотики	Диаметр зоны задержки роста, мм
	L.plantarum FK20 и В. subtilis F7
Пенициллин	нет
Ампициллин	нет
Оксациллин	9
Тетрациклин	22
Мономицин	нет
Гентамицин	нет
Стрептомицин	нет
Нистатин	нет
Левомицитин	17

На заключительном этапе работы определяли методом серийных разделений чувствительность культуры штамма L.plantarum FK20 и В. subtilis F7 к антибиотикам. В работе использовали следующие препараты: пенициллин, ампициллин, оксациллин, тетрациклин, мономицин, гентамицин, стрептомицин, нистатин, левомицитин. В ходе эксперимента определили, что культуры штаммов устойчивы к пенициллину, ампициллину, мономицину, гентамицину, стрептомицину и нистатину.

Рисунок 6. Определение чувствительности к антибиотикам

Изучение композиционного соотношения двух бактериальных культур

При конструировании препарата из двух бактериальных культур необходимо правильно подобрать их композиционное соотношение.

Для оценки эффективности различных комбинаций изучаемых культур в препарате в качестве критерия использовали величину антагонистической активности, которую изучали методом отсроченного антагонизма и методом совместного культивирования с тест-культурами. В качестве тест-культур использовали S.sonnei 32, S.typhimurium 11, S.aureus 209 и C.albicans 690.

Культуру штамма В. Subtilis F7 выращивали на агаризованной среде Гаузе в течение 24 часов, культуру штамма L. plantarum FK 20 выращивали на питательной среде MRS в течение двух суток при температуре 37°С. Состав сред представлен в таблице 7. Бактериальные культуры смывали физиологическим раствором и рассчитывали (по оптическому стандарту мутности) количество микробных клеток в 1 см-3 суспензии. Готовили ассоциации нативных микробных культур в разных количественных соотношениях для В. Subtilis F7 и L. plantarum FK 20 соответственно (об.%): 10:90; 20:80; 30:70; 40:60; 50:50; 60:40; 70:30; 80:20; 90:10. При использовании ассоциаций нативных культур (В. Subtilis F7 в концентрации 5,8*106 кл*см-3 и L. plantarum FK 20 - 10,4*106 кл*см-3) было отмечено подавление роста тест-культур во всех вариантах. Поэтому в дальнейшем исследовали образцы вариантов, разведенные в 10, 102, 103, 104 раз. При определении активности указанных вариантов В. Subtilis F7 и L. plantarum FK 20, разведенных в 10,102 раз в отношении тест-культур также происходило подавление их роста и развития. Оценивая образцы, разведенные в 103 раз, установили оптимальные соотношения вариантов В. Subtilis F7 и L. plantarum FK 20 (таблицы 8,9).

Таблица 9 - Состав питательных сред Гаузе и MRS

Среда Гаузе для В. Subtilis F7	Среда MRS для L. plantarum FK 20
1. бульон Хоттингера - 30 мл (мясная вода - 1 л и панкреатин - 10) 2. глюкоза - 10 3. пептон - 5 4. NaCl - 5 5. вода - до 1 л	1. сухое обезжиренное молоко - 33 г; 2. агаризованный раствор минеральных компонентов: 3. марганец сернокислый - 0.1 г; 4. магний сернокислый - 0.4 г; 5. калий фосфорнокислый двузамещенный - 4 г; 6. цистеин - 0.4 г; 7. глюкоза - 40 г; 8. пептон - 20 г; 9. автолизат дрожжей пекарских - 0.1 л; 10. натрий уксуснокислый - 10 г; 11. аммоний лимоннокислый двузамещенный - 4 г; 12. агар микробиологический - 2 г; 13. вода дистиллированная - до 1 л.

В разведениях 104 раз отмечено подавление роста культуры штамма S.aureus 209.

В экспериментальной работе определили, что наиболее оптимальным сочетанием В. Subtilis F7 и L. plantarum FK 20 является их соотношение 50:50 (в об.%). При такой пропорции бактерий регистрируется наиболее быстрая элиминация тест-культур.

Отсутствие роста культур S.sonnei, S.aureus было отмечено после 18 часов совместного культивирования с В. Subtilis F7 и L. plantarum FK 20, а культур S.typhimurium и C.albicans - после 24 часов выращивания.

При определении оптимальных комбинаций культур в препарате, кроме того, изучали их взаимное влияние на цитоадгезию в условиях смешанных популяций. Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что бациллы не проявляют цитоадгезивных свойств и не подавляют цитоадгезивных свойств культуры штамма L. plantarum FK 20 (СПА был равен 4,6).

Таким образом, установлено, что оптимальным соотношением бактериальных культур В. Subtilis F7 и L. plantarum FK 20 для получения нашего препарата является (в об.%) - 50:50 при количестве живых микробных клеток не менее 2*106кл*см-3 для В. Subtilis F7 и 5*106кл*см-3 для L. plantarum FK.

В дальнейшем определяли оптимальные условия глубинного культивирования выбранных штаммов, критерии оценки готовности нативных культур, порядка приготовления экспериментального образца препарата.

В экспериментах изучали возможность использования питательных сред для культивирования лактобактерий и бацилл. Несмотря на то, что в природе это довольно частые представители микрофлоры, их культивирование в искусственных средах сопряжено с рядом трудностей, так как они по потребностям в питательных веществах относятся к требовательным микроорганизмам и нуждаются в сложных органических соединениях азота, растyт на средах с подобранными смесями аминокислот, ферментативными гидролизатами мяса, казеина, различных сортов муки. Для удовлетворения питательных потребностей лактобацилл в отдельных видах аминокислот и витаминов в синтетические среды добавляют естественные экстракты (дрожжевой автолизат, печеночный и растительные экстракты) [44]. При правильном сбалансированном питании повышается лечебно-профилактическая ценность готовых препаратов, полученных из культур лактобацилл.

Основным показателем эффективности культивирования является определение количества жизнеспособных клеток в КЖ. Помимо этого, косвенно о готовности культуры можно судить по изменению микроскопической картины и значений рН. Перечисленные показатели являются достаточными для оценки готовности нативных культур и их целесообразно использовать для продолжительности культивирования.

Таблица 10 - Активность вариантов В. Subtilis F7 и L. plantarum FK 20 в отношении тест-культур через 18 часов выращивания

Соотношение вариантов В. Subtilis F7 и L. plantarum FK 20	Наличие роста тест-культур
	S.sonnei	S.typhimurium	S.aureus	C.albicans
90:10 6,3*106кл*см-3/1,0*106 кл*см-3	Наличие роста	Наличие роста	Наличие роста	Наличие роста
80:20 4,6*106кл*см-3/2,0*106 кл*см-3	Наличие роста	Наличие роста	Наличие роста	Наличие роста
70:30 4,1*106кл*см-3/2,9*106 кл*см-3	Наличие роста	Наличие роста	Наличие роста	Наличие роста
60:40 3,6*106кл*см-3/4,6*106 кл*см-3	Наличие роста	Наличие роста	Наличие роста	Наличие роста
50:50 2,9*106кл*см-3/5,2*106 кл*см-3	Подавление роста	Наличие роста	Подавление роста	Наличие роста
40:60 2,1*106кл*см-3/6,0*106 кл*см-3	Наличие роста	Наличие роста	Подавление роста	Наличие роста
30:70 1,5*106кл*см-3/6,9*106 кл*см-3	Наличие роста	Наличие роста	Наличие роста	Наличие роста
20:80 1,2*106кл*см-3/8,3*106 кл*см-3	Наличие роста	Наличие роста	Наличие роста	Наличие роста
10:90 0,5*106кл*см-3/9,4*106 кл*см-3	Наличие роста	Наличие роста	Наличие роста	Наличие роста

Таблица 11 - Активность вариантов В. Subtilis F7 и L. plantarum FK 20 в отношении тест-культур через 24 часа выращивания

Соотношение вариантов В. Subtilis F7 и L. plantarum FK 20	Наличие роста тест-культур
	S.sonnei	S.typhimurium	S.aureus	C.albicans
90:10 6,3*106кл*см-3/1,0*106 кл*см-3	Наличие роста	Наличие роста	Наличие роста	Наличие роста
80:20 4,6*106кл*см-3/2,0*106 кл*см-3	Наличие роста	Наличие роста	Наличие роста	Наличие роста
70:30 4,1*106кл*см-3/2,9*106 кл*см-3	Наличие роста	Наличие роста	Наличие роста	Наличие роста
60:40 3,6*106кл*см-3/4,6*106 кл*см-3	Подавление роста	Наличие роста	Подавление роста	Подавление роста
50:50 2,9*106кл*см-3/5,2*106 кл*см-3	Подавление роста	Подавление роста	Подавление роста	Подавление роста
40:60 2,1*106кл*см-3/6,0*106 кл*см-3	Подавление роста	Подавление роста	Подавление роста	Подавление роста
30:70 1,5*106кл*см-3/6,9*106 кл*см-3	Подавление роста	Наличие роста	Подавление роста	Подавление роста
20:80 1,2*106кл*см-3/8,3*106 кл*см-3	Наличие роста	Наличие роста	Подавление роста	Наличие роста
10:90 0,5*106кл*см-3/9,4*106 кл*см-3	Наличие роста	Наличие роста	Наличие роста	Наличие роста

В экспериментальной работе были апробированы пять полужидких питательных сред: капустная среда, среда на основе панкреатического гидролизата крови крупного рогатого скота, среда на основе молочной сыворотки и казеиново-дрожжевая среда. В таблице 10 представлены результаты культивирования культуры штамма L. plantarum FK 20 в выше указанных средах. К питательным средам добавляли 0,1% агар-агара или желатина. Прибавление этих веществ давало качественно равнозначные результаты в отношении роста и развития лактобактерий. Отметим, чтo применение агар-агара экономически более выгодно.

Выращивание проводили в статических условиях при температуре (37±1)°С. Посевная доза L. plantarum FK 20 составляла не менее 1,2*107кл*см-3.

Сравнение обобщенных данных результатов в таблице 9 показало, что наилучшие результаты были получены при использовании казеиново-дрожжевой среды и капустной среды.

При выращивании изучаемой культуры в средах на основе панкреатического гидролизата крови крупного рогатого скота и на основе молочной сыворотки концентрация клеток была невысокой.

Высокие ростовые качества казеиново-дрожжевой среды и капустной среды объясняются рациональным подбором питательных веществ.

При выращивании культуры штамма L. plantarum FK 20 в жидких питательных средах наблюдалась последовательная смена отдельных фаз в развитии популяции, отражающая общую закономерность роста и размножения бактериальных клеток.

Согласно данным, приведенным в таблице 10, при выращивании культуры на казеиновo-дрожжевой среде в интервале времени от 8 до 12 часов концентрация клеток лактобактерий достигает 1,12*1010кл*см-3, значение рН при этом составляло 4,52. Дальнейшее выращивание не целесообразно, так как происходило резкое снижение значений рН и концентрация клеток уменьшалась до 4,2 млрд.кл*см-3.

Показано, что после 8, 12 и 24 часов выращивания культуры па капустной среде в статических условиях количество клеток соответственно составляло 1,2 млрд.кл*см-3, 2,1 млрд.кл*см-3 и 7,8 млрд.кл*см-3, через 30 часов культивирования концентрация бактерий увеличилась до 10,2 млрд.кл*см-3. Значения величины рН при выращивании культуры в капустной среде в течение 30 часов изменялись от 6,28 по 4,32.

При изучении выращивания культуры L. plantarum FK 20 в жидких питательных средах в динамике определили, что в процессе культивирования лактобацилл важное значение имеет регуляция окислительно-восстановительного потенциала среды, и уровень накопления биомассы может быть повышен, коррекций величины рН и углеводного питания. Морфологические, культуральные свойства и антагонистическая активность молочнокислых бактерий, выращенных в различных питательных средах, не изменились.

Таблица 10 - Характеристика культуры штамма L. plantarum FK 20 при выращивании в жидких питательных средах в динамике

Пит. среда	Концентрация жизнеспособных клеток, млрд.кл*см-3	Значение величины рН
	Через 8 часов	Через 12 часов	Через 24 часов	Через 30 часов	Через 8 часов	Через 12 часов	Через 24 часов	Через 30 часов
Капустная среда	1,2±0,4	2,1±0,6	7,8±1,1	10,2±3,2	6,28±0,02	6,02±0,05	4,50±0,08	4,32±0,04
Среда на основе гидролизат крови	1,1±0,6	4,3±0,4	3,9±0,6	4,1±0,5	6,29±0,04	4,98±0,06	4,82±0,06	4,71±0,04
Среда на основе молочной сыворотки	2,2±0,8	3,1±0,6	3,3±0,4	3,1±0,8	5,08±0,03	5,02±0,02	4,92±0,06	4,82±0,12
Казеиново-дрожжевая среда	10,2±7,4	11,2±6,4	9,1±2,4	7,2±0,4	4,52±0,02	4,52±0,02	4,31±0,01	4,22±0,11

Для глубинного выращивания культуры штамма В. Subtilis F7 использовали жидкую питательную среду на основе гидролизата соевой муки с добавлением солей кальция хлорида, сульфатов магния и марганца, хлорида натрия и сульфата железа. Глюкозу и раствор кальция хлорида вносили непосредственно при посеве. Данная среда была отработана для штамма В. Subtilis F7.

Культуру выращивали в колбах на установке для выращивания бактерий при температуре (37±1)°С и 220 оборотах в минуту. Посевная доза В. Subtilis F7 составляла не менее 2,3*106кл*см-3. Определяли в динамике основные характеристики глубинных культур: концентрацию клеток и значение водородного показателя. Характеристика культуры штамма В. Subtilis F7, полученной при выращивании в жидкой питательной среде на основе гидролизата соевой муки представлена в таблице 11. Анализ данных, приведенных в таблице 11, показывает, что максимальное значение концентрации биомассы регистрировались на 24-30 часов роста культуры. Динамика роста бактерий В. Subtilis F7 характеризовалась закислением среды на 15 часов.

В дальнейшем после 21 часа выращивания культуры происходило увеличение значения величины рН, что соответствовало увеличению биомассы бактерий В. Subtilis F7 до значения 2,56 млрд.кл*см-3.

Таблица 11 - Характеристика культуры штамма В. Subtilis F7 при выращивании в жидкой среде на основе гидролизата соевой муки в динамике