Микроорганизмам принадлежит главная роль в биогеохимических процессах круговорота элементов и веществ, протекающих в водных и наземных экосистемах. Эти процессы прямо или косвенно влияют на состав атмосферы Земли, поэтому ключевым условием поддержания жизни является обеспечение сбалансированной деятельности природных микробных сообществ.

В течении последних десятилетий из-за интенсификации промышленного и с/х производства повсеместно усилилось загрязнение почвенного покрова различными химическими веществами. Многие из этих веществ даже в относительно низких концентрациях могут подавлять жизнедеятельность микроорганизмов и тем самым изменять существующее в природе биогеохимическое равновесие-гомеостаз. Наблюдается деградация почвенных экосистем, происходит динамическое уменьшение многообразия групп микроорганизмов (редуцентов), снижается не только количество, но и их физиологическая активность, нарушается структура биоценозов и биогеоценозов.

Выходом из сложившейся ситуации является кардинальное изменение стратегии с/х производства от глобальной "химизации" к повсеместной "биологизации". "Биологизация"-это возвращение в практику сельского хозяйства биопрепаратов из естественной почвенной микрофлоры.

В связи с этим возрастает роль физиологически значимых микроорганизмов, прежде всего в плане регуляции круговорота биогенных элементов (азота), таких как Azotobacter.

В биосфере он выполняет:

1. Деструктивную функцию, осуществляя уникальный процесс фиксации молекулярного азота, вовлекая его в биологический круговорот.

2. Средообразующую функцию, как за счёт азотофиксации, так и за счёт продукции биологически активных веществ (ауксинов, гиббериллинов, витаминов группы В, фунгицидных веществ).

На современном этапе важно определить физиологическое состояние существующих азотофиксаторов в разных типах почв, оценить их адаптационные возможности по отношению к действию различных факторов.

На основании вышеизложенного целью настоящей работы явилось исследование физиологических свойств штаммов Azotobacter chroococcum, выделенных из различных типов почв Нижегородской области.

Для решения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Подготовка почвенных образцов, отобранных в различных регионах Нижегородской области.

2. Выделение и идентификация штаммов рода Azotobacter по ключевым культуральным и физиологическим признакам.

3. Изучение влияния природных и синтетических антибиотиков на рост выделенных штаммов Azotodacter.

1. Обзор литературы

1.1 Эколого-физиологическая характеристика бактерий рода Azotobacter

1.1.1 Систематическое положение бактерий рода Azotobacter

Отдел Gracilicutes

Класс Scotobacteria

Семейство Azotobacteriaceae

Род Azotobacter

Вид Az. chroococcum, Az. agile, Az. vineladii

В 1901 году голландский учёный Бейкеринк открыл Azotobacter - аэробную бактерию, способную фиксировать молекулярный азот (Шлегель, 1987).

При первых попытках классификации азотобактера особое внимание уделялось его филогенезу ввиду сходства с водорослями и бактериями. На филогенетическую связь азотобактера с водорослями указал Бейеринк, давший организму название Azotobacter chroococcum (точный перевод видового нзвания - коричневеющий кокк - отражает одновременно и его морфологические и культуральные особенности - округлую форму клетки и способность выделять коричневый пигмент), вследствии сходства с некоторыми представителями сине-зелёных водоослей (Шлегель, 1987).

1.1.2 Цитоморфологическая характеристика и цикл развития бактерий рода Azotobacter

Бактерин рода Azotobacter характеризуются своеобразными морфологическими свойствами, сочетающими признаки палочек и кокков. Клетки молодых культур (18-24-часового возраста) имеют форму утолщенных палочек с овальными концами. Чаще они бывают сцеплены попарно. Размеры их 2,5-6х1,5-3 мкм. Цитоплазма гомогенная, мелкозернистая, нуклеоид компактный, обычно располагающийся в центре клетки. Молодые клетки подвижны, движение осуществляется с помощью перитрихально расположенных жгутиков. Кроме жгутиков, на поверхности клетки располагаются нитевидные структуры - фимбрии, служащие агрегации клеток и прикрепления их к твердым субстратам (Колешко, 1981). На твердых питательных средах, не содержащих азотных соединений, азотобактер образует крупные прозрачные, слизистые, гладкие, иногда морщинистые колонии.

У молодых клеток азотобактера плазма мелкозернистая. При старении клетки азотобактера теряют свою подвижность, укорачиваются и принимают почти кокковидную форму. В плазме появляются зерна, резко преломляющие свет. Их природа различна (жировые капли, волютин, метахроматические включения и т.д.). В этот период времени клетка (или группа клеток азотобактера) покрываются толстой слизистой капсулой. Вещество капсулы состоит из полисахаридов и содержит около 0,023% азота. Ангидрид уроновой кислоты составляет до 75% слизи азотобактера. Слизеобразное вещество азотобактера относительно устойчиво к воздействию микроорганизмов. Установлено, что полисахариды азотобактера в комплексе с солями меди и железа дают трудно разлагаемые микроорганизмами соединения. В старых культурах азотобактера могут быть найдены гигантские клетки шаровидной формы. Встречаются также очень мелки, до 0,2 мк в диаметре. Старение культур азотобактера сопровождается образованием пигмента, поэтому в зависимости от вида цвет микроорганизма может колебаться от свето-желтого до темно-коричневого (Az. chroococcum), от зеленовато-желтого флуоресцирующего (Az. agile), до розово-фиолетоваго флуоресцирующего (Az. vinelandii). Пигментообразование и интенсивность цвета зависят также от состава питательной среды и условий роста культуры (Блинков, 1959; Зайцева, 1965; Мишустин, Шильникова, 1968). Грам-, каталазоположительные, хорошо растут в аэробных условиях, оптимальная температура между 25^0-30⁰С, пределы pH 7,0-7,5 (Берги, 1997).

1.1.3 Особенности распространения азотобактера в разичных типах почв

Азотобактер развивается при наличии простых органических соединений, достаточной увлажнённости почвы, с нейтральной реакцией, а также наличии в них фосфор, кальция и ряда микроэлементов (в частности молибдена, магния и железа). Высокая требовательность к внешним факторам делает распространение азотобактера весьма ограниченным (Гиляров, Криволуцкий, 1985).

В целинных подзолах и дерново-подзолистых почвах азотобактер практически отсутствует. Это бедные гумусом (0,3-0,5%), имеющие кислую реакцию почвы, непригодные для существования данного микроорганизма. При окультировании условия для развития азотобактера улучшаются; органические и минеральные фосфорные удобрения стимулируют размножение азотобактера, а азотные минеральные в высоких дозах - подавляют его рост (Гиляров, Криволуцкий, 1985).

В кислых подзолистых почвах бактерия практически не встречается, а выделенные немногочисленные колонии оказываются ослабленными.

В серых лесных почвах в летний период, когда почва в достаточной степени увлажнена и устанавливается благоприятный температурный режим, количество азотобактера имеет наибольшее значение.

Считается, что светло-серые лесные почвы близки по свойствам к дерново-подзолистым, поэтому предполагается что и степень распространения в них азотобактер также равна, темно-серые же почвы по органическому составу близки к оподзоленным и выщелоченным чернозёмам (Звягинцев, 1987).

В почвах с повышенной степенью увлажнения и преобладанием луговой растительности азотобактер обычно встречается в течение всего вегетационного периода. К подобным почвам относятся почвы пойм, имеющие в подзолистой зоне благоприятную реакцию среды и относительно высокое содержание питательных веществ.

Болотно-низинные почвы нередко содержат азотобактер, но, вследствие неблагоприятного воздушно-водного режима, а также недостатка фосфора, кальция и микроэлементов этот микроорганизм здесь размножается слабо (Звягинцев, 1987).

В низинных целинных торфяниках азотобактер обнаруживается редко, а в верховных не встречается совсем, в связи с их сильным закислением. Окультуривание торфяных почв улучшает условия для размножения, но некоторые торфа токсичны для азотобактера (Мишустин, Шильникова, 1968).

Чернозёмы отличаются высокой активностью микробиологических процессов. Наиболее интенсивно они протекают весной и рано летом, когда почва имеет благоприятный температурный режим и достаточный запас влаги. Это нейтральные или слабощелочные почвы с высоким содержанием солей кальция и магния. Черноземные почвы более северных районов содержат азотобактер в течение всего вегетационного периода. В зоне обычных и южных черноземов данный микроорганизм встречается реже, так как в летний период эти почвы не так богаты органическими остатками. Наиболее часто азотобактер встречается в черноземных почвах лугов долин рек. Наиболее благоприятными оказывается лучше, чем в оподзоленных (Гиляров, Криволуцкий, 1985).

В целинных и неполивных, окультуренных каштановых почвах данный микроорганизм встречается лишь весной, с наступлением засушливой погоды его обнаружение очень затруднено.

В целинных почвах сероземной зоны, а также в степных солонцах азотобактер развивается в основном как весенний эфемер. По мере возрастания засоленности почв данный микроорганизм встречается реже.

Отмечено, что данный род бактерий более чувствителен к содовому засолению и менее к сульфатно-хлоридному (Мишустин, Шильникова, 1968).

Сильно окультуренные подзолистые почвы, образованные на суглинках, имеют благоприятный водно-воздушный режим, слабокислую реакцию (рН=5.5) чем обеспечивается активная деятельность полезной почвенной микрофлоры, в том числе и азотобактера (Мишустин, Шильникова, 1968).

В тропической зоне в достаточно увлажненных почвах наблюдается низкий показатель значения рН. В этих районах азотобактер замещается на более кислотоустойчивый микроорганизм Beijrinkia.

В хорошо окультуренных огородных почвах азотобактер обычно находиться в значительных количествах (Мишустин, Шильникова, 1968).

Таким образом, азотобактер может служить индикатором степени окультуренности почвы (Anderson, 2003).

1.2 Свойства азотобактера

1.2.1 Морфологическая характеристика

Азотобактер - аэробный почвенный микроорганизм, сочетающий в себе морфологию палочек и кокков.

Клетки молодых культур (вплоть до 2х суток культивирования) имебт форму палочек с закругленными концами, чаще расположены попарно. Молодые клетки подвижны, вследствие наличия на ее поверхности перитрихально расположенных жгутиков. Прикрепление бактерий, а также их агрегация осуществляется за счёт наличия нитевидных структур - фимбрий (Lin, Stewart, 1998).

Размеры клеток варьируют - 2,0-7,0х1,0-2,5 мкм. В отдельных случаях длина клеток достигает 10-12 мкм. Размножение азотобактера происходит путём простого деления клетки с образованием поперечной перегородки, иногда наблюдается перешнуровывание. В пределах рода существуют характерные распределения клеток видов азотобактера при его делении:

Клетки Az. chroococcum в начале деления располагаются концентрически, причем клетки агрегируются чаще по две. При дальнейшем делении формируются радиально расположенные ряды клеток, а также слоистость образуемой колонии. В процессе старения приобретают морфологию кокков - они округляются.

Клетки Az. vinelandii на начальных этапах формирования колонии располагаются радиально и сохраняют такое расположение на всем протяжении развития.

Клетки Az. agilis продуцируют большое количество слизи, за счёт чего колонии имеют выпуклое строение. Количество клеток в колонии значительно меньше двух предыдущих видов с расположением определенной закономерности - звездчато - рассеянный тип строения (Колешко, 1981).

Содержание ДНК в клетках азотобактера значительно ниже, чем у других видов бактерий и колеблется в пределах 0,81-0,70%. У молодых клеток азотобактера плазма мелкозернистая.

При старении клетки теряют подвижность, укорачиваются и приобретают почти кокковидную форму. В плазме появляются зерна, резко преломляющие свет. Природа этих включений различна (жировые капли, волютин, метахроматические включения и др.). В этот период времени клетки азотобактера покрываются толстой слизистой капсулой. Если капсула на поверхности клетки уплотняется, то по внешнему виду она становится похожей на хламидоспору низших грибов. Вещество капсулы состоит из полисахаридов и содержит около 0,023% азота. Ангидрид уроновой кислоты составляет до 75% слизи азотобактера. Слизеобразное вещество делает бактерию относительно устойчивой к воздействию микроорганизмов (Колешко, 1981). В старых культурах могут быть найдены гигантские клетки шаровидой формы, а также клетки очень мелких размеров (до 0,2 мкм в диаметре и мельче). При благоприятных условиях эти микроскопические клетки начинают развиваться и дают клетки нормальной величины (Шлегель, 1987).

Такое многообразие форм азотобактера в значительной степени определяется плейоморфизмом этой бактерии, а также зависит от состава среды.

Azotobacter на твердых питательных средах, не содержащих азотных соединений, образует крупные слизистые, иногда морщинистые колонии. При старении колонии данного микроорганизма приобретают характерную окраску за счет образования пигмента. Пигментообразование является одним из признаков систематики видов (Aquilanti, Favilli, 2004).

Для Az. agilis и Az. vinelandii характерно образование растворимых в воде флуоресцирующих пигментов желто-зеленого цвета. Клетки Az. chroococcum при старении накапливают меланоидные нерастворимые в воде пигменты, окрашивающие колонии в цвет от буро-коричневого до черного (Aquilanti, Favili, 2004).

1.2.2 Строение нитрогеназной системы

Характерной особенностью азотобактера является его способностью наряду со связанными формами азота усваиват молекулярный азот. Размер азотонакопления зависит прежде всего от свойств того или иного штамма азотобактера. По этому признаку различаются активные и пассивные культуры. В некоторых случаях под влиянием неблагоприятных условий среды азотобактер может терять способность усваивать молекулярный азот (Мишустин, Емцов, 1987).

Большинство культур азотобактера усваивает не более 10 мг молекулярного азота на 1 г потребленного источника углерода. Отдельные штаммы Az. chroococcum фиксировали до 15 мг азота на 1 г использованной глюкозы (Мишустин, Емцов, 1987).

Молекула атмосферного азота очень инертна, для разрыва 3-х ее химических связей необходимо затратить 225 ккал/моль.

При промышленном получении аммиака из N₂ затрачивается большое количество энергии, даже в присутствии катализаторов требуется повышение температуры до +500єС и давление до 300-350 атм., в то время как все процессы азотофиксации в клетке, идут при физиологических значениях температуры, низких давлениях и без загрязнения среды обитания. Биохимический механизм фиксации молекулярного азота воздуха сходен у всех диазотрофов. В основе его лежит процесс восстановления N₂ по уравнению:

N₂+6e^-+6H⁺>2NH₃

Реакция эта в клетке проходит при участии фермента нитрогеназы, расположенного на внутренних клеточных мембранах. Кроме того, для фиксации N₂ необходимы сильные восстановители (поток электронов), АТФ и Mg^{2+ (}Глик, Пастернак, 2002).

Нитрогеназа - сложный ферментативный ансамбль, состоящий из комплекса двух белков: Mo-Fe-белка (молибдоферредоксин) и Fe-белка (азотоферредоксина). Mo-Fe-белок - это тетрамер, содержащий 2 атома молибдена, негемовое железо и лабильный сульфид. Fe-белок является димером, тоже содержит негемовое железо и лабильный сульфид (Анисимова, 1986).

В процессе фиксации АТФ взаимодействует с азоферредоксином. При этом выделяется АДФ, а азоферредоксин претерпевает конформационную перестройку, вследствие чего его окислительно-восстановительный потенциал понижается с - 280 до - 400 мВ. Азоферредоксин становится сильным восстановителем, предает электроны на молибдоферредоксин, где и осуществляется восстановление N₂ до NH₃. Суммарно процесс фиксации азота можно выразить реакцией

N₂+6e^-+12АТФ+12Н₂О-2NH₄⁺+12 АДФ+12Н₃РО₄+4Н⁺

Нитрогеназа обладает широкой субстратной специфичностью, кроме азота она может восстанавливать цианиды, закись азота, ацетилен и др.

Нитрогеназа при участии АТФ катализирует также восстановление ионов водорода с образованием молекулярного водорода (Lin, Stewart, 1998).

Нитрогеназа - анаэробный фермент, инактивирующийся в присутствии кислорода воздуха. Он повреждает оба белка, хотя наиболее чувствителен к нему Fe-белок. Чувствительность белков нитрогеназы к О₂ определяется главным образом чувствительностью их металлоцентров, участвующих в связывании субстрата и переносе электронов. При взаимодействии нитрогеназы с О₂ может происходить 4-х ступенчатое восстановление О₂ с образованием супероксида, Н₂О₂ и синглетного кислорода. Ферредоскины и флаводоксины, переносящие электроны на нитрогеназу также могут поддвергаться необратимым окислительным повреждениям (Готтшалк, 1982).

Азотобактер относиться к облигатным аэробам. При избыточном количестве кислорода начинает резко интенсифицировать процессы дыхания, как бы стараясь выбрать весь кислород и обеспечить выполнение ею функций азотофиксации. Процесс этот малопродуктивен и кончается снижением азотофиксирующей активности. Ещё одним способом защиты от кислорода воздуха является конформационное изменение нитрогеназы с особыми FeS-белками, в результате чего повышается ее стабильность в присутствии кислорода (Громов, Павленко, 1989).

1.2.3 Регуляция нитрогеназной системы

Общее свойство всех препаратов нитрогеназы - их чувствительность к присутствию кислорода. Фермент необратимо ингибируется кислородом поэтому фиксацию азота можно называть строго анаэробным процессом. Для защиты нитрогеназы от повреждения кислородом у таких аэробов, как представители рода Azotobacter, существует два механизма.

1. Дыхательная защита. Бактерии, относящиеся к роду Azotobacter, обладают очень активной разветвленной дыхательной системой. В одной из ветвей цепи переноса электронов имеются три пункта сопряженного фосфорилирования; в двух других - только один такой пункт. Поэтому при увеличении концентрации кислорода скорость дыхания микроорганизмов может повышаться за счет частичного разобщения фосфорилирования. Это приводит к потере NADH₂, но зато нитрогеназа защищается при этом повреждения кислородом.

2. Конформационная защита. Осуществляется за счет конформационных изменений в молекуле фермента и ассоциации с защитными белками (Готтшалк, 1982).

Много исследований посвящено вопросу о влиянии на азотофиксацию связанных форм азота, так, например, малые дозы селитры не только не снижают, но даже нередко стимулируют фиксацию, но по мере повышения конценрации селитры фиксации азота понижается. При содержании 24 мг нитратного азота на 100 мл среды связывание азота уже не происходит, аналогично нитратам влияют на азотофиксацию и аммонийные соли, а при длительном культивировании азотобактера в присутствии азотистых соединений, он теряет свою способность усваивать азот атмосферы (Блинков, 1959). Дело в том, что ионы аммония подавляют синтез нитрогеназы. В регуляции образования нитрогеназы большую роль играет глутаминсинтетаза. Глутаминсинтетаза и глутаматсинтетаза нужны бактериям для включения ионов аммония в органические соединения в том случае, если ионы присутствуют лишь в низкой концентрации. Эта система обладает высоким сроством к ионам аммония, и поддерживает их концентрацию в клетке на низком уровне. Повышение концентрации ионов аммония в окружении клетки (а тем самым и внутри клетки) подавляет образование глутаминсинтетазы, а в результате - и нитрогеназы.

1.2.4 Основные физиологические свойства азотобактера

К основным физиологическим свойствам бактерий рода Azotobacter относится его резко выраженная способность усваивать азот атмосферы. Большинство штаммов усваивают не более 10 мг азота на 1 г. Потребляемого источника углерода, некоторые штаммы азотобактера способны фиксировать до 15 мг азота на 1 г глюкозы (Самсонов, 1987).

Азотобактер является полифагом, в качетсве источника углерода может использовать моно-, ди - и полисахариды, органические кислоты жирного и ароматического ряда, летучие органические соединения (пары этилового спирта, ацетона), но предпочтительным энергетическим материалом являются одно- и многоатомные спирты: этиловый, бутиловый. Отдельные штаммы и даже виды азотобактера по-разному относится к источнику углерода, - так можно встретить штаммы, не ассимилирующие лактозу, маннит, бензойную кислоту и др. если в среде несколько источников углерода, то они используются в порядке доступности (Мишустин, Шильникова, 1968).

Культура азотобактера образует значительное количество биологически активных веществ, среди них витамины группы В, гормоны растений (гиббереллины, цитокинины, ауксины (в частности, индолил-3-уксусная кислота (ИУК)) (Воробьева, 1982; Мишке, 1988).

Было установлено, что Az. chroococcum на 10-е сутки ферментации выделяет в культуральную жидкость в количестве 5 мкг/мл, а на 17-е сутки-20 мкг/л гиббереллин подобных веществ. Сам гиббереллин к концентрации 0,1-100 мкг/мл не оказывает влияния на размножение азотобактера, но имеются сведения о повышении азотофиксирующей способности при добавлении гиббереллина (Мишке, 1988).

Важнейшим природным ауксином является индолил-3-уксусная кислота. Данный фитогормон был обнаружен в бактериях, грибах, низших и высших растениях (Гамбург, 1990). Для образования ауксина грибы и бактерии нуждаются в питательной среде, содержащей глюкозу, а также необходимо присутствие триптофана, тирозина и других аминокислот. Несмотря на то, что культуры сами выделяют биологически активные вещества, внесение их в среду ускоряет процесс роста азотобактера. Под влиянием регуляторов роста увеличивается также и продуктивность азотофиксации (Мишке, 1988).

Весьма важное свойство азотобактера заключается в том, что он вырабатывает фунгистатическое вещество, представляющее собой метиловый эфир алифатической тетраеновой кислоты, содержащей гидроксильную и В-метильную группы. Обнаруженный антибиотик-азохроомицин, по данным Н.И. Придачиной, активен против значительного числа фитопатогенных грибов. Благодаря описываемому свойству при бактеризации азотобактером в ризосфере угнетается развитие микроскопических грибов, многие из которых задерживают рост растений. Так, культура Az. chroococcum снимает угнетающее действие фитотоксичного гриба Alternaria на кукурузу, а рост не заряженного растения стимулирует.

1.3 Взаимодействие азотобактера с высшими растениями и почвенными микроорганизмами