Поры, каналы и переносчики

Ядерная оболочка состоит из двух мембран. Ядерные поровые комплексы участвуют в транспорте веществ между ядром и цитоплазмой. Эти поры, аналогично каналам щелевых контактов, пронизывают две мембраны. По данным электронной микроскопии высокого разрешения, ядерная пора имеет октагональную симметрию, но устроена сложнее, чем канал щелевого контакта. Ядерная пора представляет собой два октагональных цилиндра, соединенных вместе наподобие канала щелевого контакта. Полипептидный состав поры ядерной оболочки окончательно не установлен.

Размер поры ядерной оболочки весьма велик, радиус ее функциональной части составляет -- 90 А; через нее могут проходить как небольшие растворимые вещества, так и многие крупные молекулы. Существуют специальные механизмы транспорта макромолекул внутрь ядра и из ядра в цитоплазму, однако до сих пор о них мало что известно.

ПОРИНЫ

Порины образуют поры, которые функционируют как молекулярные сита, опосредуя диффузию небольших гидрофильных молекул через наружную мембрану грамотрицательных бактерий. Исследование более чем сорока различных поринов позволило выявить некоторые их общие особенности. Мол. масса поринов варьирует от 28 ООО до 48 ООО. В мембране они обычно присутствуют в виде тримеров. Для поринов характерно высокое содержание /3-слоев. Наиболее полно к настоящему времени охарактеризованы порины из Е. coli: OmpF, OmpC, PhoE и LamB. Их основной особенностью является то, что они образуют наполненный водой трансмембранный канал, причем этот канал образован в основном ^-структурными элементами. На рис. 8.7 представлена одна из возможных моделей образования поринового канала из амфифильных, так и по селективности. Селективность связана с наличием внутри канала или около входа в канал заряженных аминокислотных остатков. Измерения проводи-

мости одиночных каналов и проницаемости пор, а также электронно-микроскопические исследования указывают на то, что строение пор не одинаково для разных поринов. В одних случаях тримеры порина образуют один большой канал, в других -- три независимых канала. Канал OmpF имеет три входа с наружной стороны клетки, которые затем сливаются, образуя единый выход в периплазму.

Три из четырех порииов Е. coli имеют много общих структурных особенностей, а их аминокислотные последовательности в значительной степени гомологичны. Эти порины образуют поры диаметром 10--12 A. Четвертый порин, Lam В, значительно отличается от трех предыдущих, хотя его аминокислотная последовательность обнаруживает некоторое сходство с ними. Ои тоже образует главным образом /3-складчатые структуры. LamB является частью системы транспорта мальтозы и обладает сродством к производным мальтозы. В отсутствие мальтозы LamB образует небольшие каналы, которые целиком блокируются при связывании мальтозы. Главной функцией LamB является стимуляция накопления мальтозы, а не работа в качестве диффузионной поры для небольших растворимых веществ. Топографию LamB исследовали с помощью различных методов, включая генетические. В результате была построена детальная модель этого канала, пронизывающего мембрану.

Предположение о том, что порины являются воротными каналами и, значит, могут находиться в закрытом состоянии, подвергалось всесторонней проверке. In vitro работа поринов может регулироваться напряжением на мембране, однако физиологическая значимость этого явления остается неясной.

И наконец, следует отметить, что из наружной мембраны митохондрий были выделены порины, работа которых регулируется напряжением на мембране. Они называются потенциалзависимыми анионселективными каналами. Эти порины не являются родственными бактериальным поринам, но они также рбразуют цилиндрическую пору из /3-структурных элементов

nAChR-канал является примером канала, работа которого регулируется нейромедиатором. Эти каналы находятся главным образом в концевых пластинках -- постсинаптических мембранах нервно-мышечных соединений скелетных мышц. При электрическом возбуждении нейрона из него высвобождается нейромедиатор аце-тилхолин. Последний диффундирует от пресинаптической мембраны нейрона к мембране скелетной мышцы. Никотиновые ацетилхо-линовые рецепторы имеют вид плотно упакованных кластеров в плазматической мембране мышечного волокна, входящей в состав концевой пластинки. При взаимодействии с ацетилхолином канал открывается, опосредуя селективное перемещение катионов. Под действием ионного тока изменяется трансмембранный потенциал и происходит электрическое возбуждение мышечной клетки, что приводит к сокращению мышцы.

nAChR-канал регулируется с помощью химических механизмов, причем сигнал действует непосредственно на канал. Химдческим сигналом является ацетилхолин, который передает возбуждение от нервного волокна к мышце. Анализ аминокислотной последовательности показал, что никотиновый ацетилхолиновый рецептор и два других нейромедиаторных рецептора -- глициновый рецептор и рецептор 7-аминомасляной кислоты -- имеют много общих структурных особенностей. Они образуют группу химически регулируемых каналов. Впрочем, несмотря на сходство аминокислотных последовательностей, эти белки имеют разную четвертичную структуру. Биохимические свойства рецептора глутамата, одного из важных иейромедиаторов головного мозга, не исследованы.

Отметим, что номенклатура и классификация нейромедиатор-ных рецепторов основаны главным образом на данных о влиянии на них различных лекарственных веществ, в особенности тех, которые выступают в роли агонистов, стимулируя рецептор наподобие естественного нейромедиатора, или антагонистов, которые блокируют стимулирующий эффект агонистов. Например, рецепторы ацетилхолина в начале этого века разделяли на никотиновые и мус-кариновые на основании их фармакологических различий. Никотиновые рецепторы ацетилхолина -- это группа родственных рецеп-торных белков. Мускариновый рецептор из клеток мозга структурно не сходен с nAChR-каналом и в действительности не является каналом. Необходимо отметить, что охарактеризованы никотиновые ацетилхолиновые рецепторы из ткани мозга, по некоторым структурным и функциональным особенностям отличающиеся от каналов коицевой пластинки.

По сравнению с другими канальными белками nAChR-канал охарактеризован наиболее полно, и связано это с тем, что существует легкодоступный источник, содержащий большие количества данного белка. Большая часть биохимических экспериментов была поставлена с использованием рецептора, выделенного из электрического органа скатов Eiectrophorus и Torpedo. Показано, что эти каналы очень похожи на каналы концевых пластинок как в структурном, так и в функциональном отношении. Гибридные белки, состоящие из субъединиц рецепторов из электрического органа Torpedo и нервио-мышечиого соединения быка, оказались полностью функциональными.

Выделенный и очищенный nAChR-канал состоит из пяти полипептидных субъединиц четырех разных типов со стехиометрией а₂08у. Две копии а-субъединиц, присутствующие в комплексе, по всей вероятности, выполняют разные функции. Субъединицы близки друг к другу по аминокислотной последовательности и различаются по кажущейся молекулярной массе. Все субъединицы фосфорилированы и гликозилированы, а к двум, а и /3, ковалентно присоединен липид.

На основе электронно-микроскопических методов реконструкции изображения была построена модель канала, приведенная на рис. 8.8. Метод негативного контрастирования ясно показыва-

ет, что канал имеет центральное отверстие диаметром 30 А с внеклеточного конца и значительно более узкое с ци-топлазматической стороны. На фотографиях четко видна пентамер-ная структура комплекса. Это означает, что пять субъединиц организованы вокруг центральной поры. Использование реагентов, образующих поперечные сшивки, показывает, что субъединицы расположены в следующей последовательности: /3--а--6--у--а, так что а-субъединицы не соседствуют друг с другом. По данным многочисленных исследований, места связывания ацетилхолина, других агонистов и конкурентных антагонистов располагаются на а-субъединицах. Следовательно, существуют два места связывания для этих химических агентов. Антагонисты препятствуют активации, вызываемой агонистами, или путем прямой конкуренции за связывание с теми же участками, или за счет связывания с каким-либо другим местом и, возможно, взаимодействия с каналом per se.

Как видно из рис. 8.8, nAChR-канал имеет длину около 140 А, причем участок длиной 70 А расположен над поверхностью бислоя с наружной стороны, образуя большие ворота канала. В клетках Torpedo канал существует в виде димерных единиц, связанных друг с другом дисульфидным мостиком между 6-субъединицами с внеклеточной стороны. Часть канала, выступающая из бислоя с цитоплазматической стороны, гораздо менее протяженна; по-видимому, она взаимодействует с элементами цитоскелета, что способствует образованию плотноупакованных кластеров канальных белков в концевой пластинке. Было высказано предположение, что эти взаимодействия опосредует особый белок мол. массой 43 000. В концевой пластинке каналы могут быть собраны в кластеры с плотностью до 10000 молекул на 1 мкм², что близко к теоретическому пределу. При взаимодействии с ацетилхолином или другими агонистами через данный участок мембраны начинает течь электрический ток, деполяризующий постсинаптическую мембрану.

Кинетическое поведение nAChR-канал а можно с успехом анализировать, если рассматривать его как аллостерический фермент, способный находиться в нескольких конформациях. Существуют как минимум три состояния, в которых может находиться канал: открытое, закрытое и инактивированное. Для индукции перехода канала из закрытого состояния в открытое, в котором он остается около 1 мс, необходимо кооперативное связывание двух молекул ацетилхолина. В инактивированиом состоянии канал остается закрытым даже в присутствии ацетилхолина. Измерения проводимости одиночного канала свидетельствуют о наличии более чем одного открытого состояния, и кинетическая модель при этом оказывается достаточно сложной. Опыты по встраиванию канала в липидный бислой показали, что липидное окружение может влиять на способность канала к переходу из одной конформации в другую.

В открытой конформации канал проницаем для катионов и небольших неэлектролитов, но не анионов. Ограничения, налагаемые на размер проходящих молекул, позволяют судить о размерах наиболее узкой части канала. Соответствующие данные представлены на рис. 8.9 вместе с данными для двух других каналов. Радиус небольшого негидратированного иона, способного проходить через канал, является разумной оценкой предельных размеров канала. Непроницаемость канала для анионов и в три раза ббльшую проницаемость для катионов, чем для незаряженных молекул, можно объяснить электростатическими взаимодействиями, возникающими благодаря присутствию в воротах канала биполярных или отрицательно заряженных групп. Селективность канала по отношению к одно- и двухвалентным катионам невелика, но согласуется с моделью, в которой ионы даже внутри канала взаимодействуют главным образом с молекулами воды, а не с элементами собственно канала. Хотя размеры nAChR-канала относительно велики, он все же слишком мал, чтобы через него могли проходить полностью гидратированные ионы. Внутренняя полость канала должна содержать группы, которые могли бы легко заменить утраченные при дегидратации молекулы воды.

О молекулярной структуре этого канала известно больше, чем о структуре какого-либо иного канала. И все же, к сожалению, не выработано единой точки зрения на то, как построен данный канал, хотя было создано много достаточно детальных моделей. Большой вклад в исследование этого вопроса внесли работы с использованием методов молекулярной генетики. Так, при помощи клонирования генов каждой из субъединиц nAChR-канала из нескольких источников были определены аминокислотные последовательности этих субъединиц, анализ которых выявил наличие высококонсервативных участков. В качестве потенциальных трансмембранных а-спиралей было идентифицировано до семи различных сегментов. Наиболее интересен один из них, обозначаемый как М5 или МА; он может образовывать амфифильную спираль с заряженными группами, расположенными с одной стороны. Большинство исследователей полагают, что узкая часть канала, пронизывающая бислой, построена из субъединиц, каждая из которых образует а-спираль. Ансамбль а-спиралей формирует центральную пору. Первым кандидатом на эту роль является амфифильная спираль, хотя модельные исследования с грамицидином А с очевидностью показали, что наличие заряженных групп не является необходимым условием для образования наполненного водой катионселективного канала. Экспериментальные данные о прямом участии амфифильной спирали в формировании канала отсутствуют; даже вопрос о том, является ли эта спираль трансмембранной, не решен окончательно. Имеются данные, что в формировании канала участвует другая спираль, М2. Эти данные были получены при изучении связывания с каналом неконкурентных антагонистов и с помощью молекулярнно-генетических методов. Хотя спираль М2 не является амфифильной, она может образовывать канал, аналогичный грамицидиновому или аламетициновому. Отметим, что другие члены группы нейромедиаторных рецепторов не имеют участков, аналогичных амфифильной спирали никотинового ацетилхолинового рецептора.

В работах Нума и др. впервые были продемонстрированы возможности применения сайт-специфического мутагенеза при исследовании подобного рода систем. Гены, кодирующие каждую из четырех субъединиц канала, клонировали в cos-клетках обезьяны и ооцитах Хепорш и наблюдали экспрессию функциональных каналов в плазматической мембране. Для изучения работы таких каналов очень ценным оказались методы регистрации токов через одиночные каналы. Есть надежда, что с развитием подобных экспериментальных подходов мы сможем получить ответы на многие давно интересующие нас вопросы о строении каналов. Использование поликлональных и моноклональных антител поможет выявить те участки полипептидов, которые ответственны за связывание ацетилхолина, а также участки, формирующие собственно канал. В настоящее время большинство исследователей полагают, что этот канал образуется из а-спиралей, как аламетициновый канал. Те же представления легли в основу модели Na ⁺-канала.

ПОТЕНЦИЛЗАВИСИМЫЙ НАТРИЕВЫЙ КАНАЛ

Потенциалзависимый натриевый канал обеспечивает быстрое увеличение натриевой проводимости, ответственное за фазу деполяризации при развитии потенциала действия в нервных и мышечных клетках. Этот канал был очищен до гомогенного состояния из нескольких источников, в частности из мозга крысы, скелетных мышц млекопитающих, сердца цыпленка и электрического органа ската Electrophorus electricus.

Очищенные каналы из Elektrophorus electricus и сердца цыпленка содержат единственную гликопротеиновую субъединицу с мол. массой -260000, в то время как каналы, выделенные из тканей млекопитающих, содержат еще одну или две меньшие субъединицы с мол. массой от ЗЗООО до 38 000. Большую часть из этих очищенных препаратов каналов удалось встроить в плоские мембраны, при этом они сохраняли присущие им in vivo электрофизиологические и фармакологические характеристики. Для успешной реконструкции канала, выделенного из тканей млекопитающих, необходим по меньшей мере один из небольших ассоциированных белков.

Натриевые каналы взаимодействуют с различными токсинами, в частности с тетродотоксином, сакситоксином и а-токсином скорпиона, которые очень прочно связываются с канальными белками и могут использоваться при количественных биохимических измерениях. Присутствие этих токсинов очень важно как для биохимической очистки каналов, так и для изучения их работы in vivo. Как и канал концевой пластинки, натриевые каналы распределены в плазматической мембране не равномерно, а собраны в кластеры. В мышечных клетках Na ⁺-каналы сконцентрированы в районе концевой пластинки вместе с nAChR-каналами.

Нума с соавторами клонировали гены, кодирующие белки натриевых каналов из Electrophorus и главную субъединицу канала из мозга крысы, и определили их нуклеотидную последовательность. Было показано, что белок натриевого канала из Electrophorus содержит 1820 аминокислотных остатков, организованных в четыре повторяющиеся гомологичные единицы. По мнению разных авторов, каждый гомологичный участок содержит 4, 6 или 8 трансмембранных а-спиралей. Некоторые из этих предполагаемых трансмембранных спиралей амфифильны и аналогичны постулированным для nAChR-канала. Имеются экспериментальные данные о том, что карбоксильный конец полипептидной цепи локализован на цитоплазматической поверхности; сообщалось также, что амфифильная 54-спираль является внецитоплаз-матической. Однако никакой дополнительной информации, позволяющей подтвердить предложенные топологические модели, не существует. Нет также данных о том, какие участки полипептида непосредственно вовлечены в образование поры. Различные модели натриевого канала концептуально близки к моделям канала концевой пластинки в том отношении, что канал per se состоит из кластера а-спиралей, образующих центральную пору. В этом случае, однако, вместо пяти различных субъединиц мы имеем четыре гомологичных домена единственной субъединицы. По всей вероятности, специфичные группы организованы в канале таким образом, что образуется «селективный фильтр».

Предельные размеры канала можно оценить, используя метод «молекулярного сита», однако при этом нельзя объяснить селективность канала по отношению к достаточно малым ионам. На рис. 8.10 приведен профиль свободной энергии для диффузии ионов Na⁺ через канал. Если лимитирующей стадией является дегидратация, то параметром, определяющим высоту энергетического барьера, будет геометрия тех компонентов, которые временно заменяют воду. Для К⁺ положение соот-

ветствующих групп не будет оптимальным, поскольку этот ион несколько больше по диаметру, а потому энергетический барьер будет выше. Напротив, для К⁺-селективных каналов соответствующий энергетический барьер будет минимален именно для ионов К ⁺.

В последнее время было построено также много моделей, описывающих регуляцию работы канала при помощи трансмембранного потенциала. В регуляции, без сомнения, участвует изменение заряда белка в ответ на наложение электрического поля. Однако никаких данных о том, какие именно участки полипептида образуют ворота или отвечают на изменение напряжения, не существует. Высказывается предположение, что это может быть амфи-фильная 54-спираль.

Данные об аминокислотной последовательности натриевого канала свидетельствуют о том, что он относится к группе потенциал-зависимых каналов. В эту же группу входят калиевый канал из Drosophila и дигидропиридиновый калиевый канал из скелетных мышц кролика. Все эти белки содержат амфи-фильный положительно заряженный сегмент, аналогичный S4-cer-менту натриевого канала. Это еще раз подтверждает вывод о том, что данный сегмент участвует в регуляции работы канала, отвечая на изменение напряжения на мембране. Отметим, что как натриевый канал из тканей млекопитающих, так и кальциевый канал следующий раздел) имеют субъединицы, функции которых неизвестны.

КАЛЬЦИЕВЫЙ КАНАЛ

Са^{2 +}-селективные каналы очень широко распространены в возбудимых клетках -- нервных и мышечных, а также в большинстве других типов клеток. Некоторые Са^{2 +}-каналы отвечают на изменение напряжения на мембране, а работа других регулируется опосредованно с помощью рецепторов. Обычно концентрация ионов Са²⁺ в цитоплазме не превышает 10"⁷ М, что в 10000 раз ниже, чем концентрация ионов Са²⁺ вне клетки. Из-за этих условий и в отличие от Na ⁺ - и К ⁺ -каналов открывание Са^{2 +} -канала может приводить к значительным изменениям концентрации этого иона в цитоплазме, что в свою очередь индуцирует разнообразные биохимические события. Например, потенциалзависимое увеличение концентрации ионов Са²⁺ в цитоплазме приводит к высвобождению нейромедиаторов.

Исходя их фармакологических данных, была проведена классификация Са²⁺-каналов. Для очистки и дальнейшей харктеристики каналов очень полезными оказались органические блокирующие агенты с высоким сродством к каналам. Единственный класс Са^{2 +} -каналов, охарактеризованных биохимически, -- это потенциалзави-симые каналы, которые блокируются различными органическими соединениями, в частности производными дигидропиридииа. Эти каналы были выделены из сердечной и скелетной мышц и оказались одинаковыми. Они состоят как минимум из двух субъединиц с мол. массой 140000 и 30000. Большая субъединица была клонирована и секвенирована и оказалась структурно близка к потенциалзависимому натриевому каналу.

Появляется все больше данных, свидетельствующих о сходстве структуры различных каналов и пор. В основе всех этих систем лежит заполненная водой пора, выстланная изнутри полярными группами. Пора может быть образована или а-спиральными, или 0-структурными элементами. Чтобы транспорт осуществлялся с высокой скоростью, в канале не обязательно должны присутствовать места связывания, обладающие высоким сродством к переносимым веществам, поскольку селективность определяется высотой энергетических барьеров, а не глубиной впадин. Селективность каналов можно в большинстве случаев объяснить тем, что в нескольких ключевых местах располагаются специфические аминокислотные остатки, определяющие характер тех веществ, которые могут проходить через канал. Возможно, воротные механизмы различных каналов также имеют много общего, но экспериментальные данные по этому поводу пока отсутствуют.

Как мы увидим позже, аналогичные структурные свойства можно обнаружить и у других транспортных белков.

Некоторые унипортеры, симпортеры и антипортеры

К настоящему времени достаточно хорошо охарактеризовано несколько систем, катализирующих транспорт одного или более растворимых веществ. При этом скорость переноса с помощью этих белковых комплексов гораздо ниже, чем даже через наиболее «медленные» каналы. Мы рассмотрим переносчик глюкозы и анионный переносчик из мембраны эритроцита, лактозопермеазу из Е. coli и группу митохондриальных переносчиков. Транспортные функции этих белков весьма разнообразны: оии катализируют облегченную диффузию одного какого-то вещества, симпорт Н ⁺ и сахара, в результате чего происходит накопление сахара в клетке, и антипорт растворенного вещества. Отметим некоторые общие свойства этих процессов.

В некоторых случаях эти транспортные белки являются оли-гомерами, обычно димерами. Однако, по-видимому, только у митохондриальных переносчиков канал образуется из структурных элементов разных мономеров. Во всех других случаях, по всей вероятности, каждая субъ-едииица функционирует независимо, даже если она является частью олигомера.

Весьма высокая степень гомологии транспортных белков указывает иа их близкое структурное родство, хотя они существенно различаются как по субстратной специфичности, так и по функциям. Это позволяет предположить, что для широкой группы функционально различных переносчиков характерны общие транспортные механизмы.

В большинстве случаев для анализа работы транспортных белков можно с успехом использовать модели с чередованием кон-формационных состояний, аналогичные модели, схематически представленной на рис. 8.2. При этом лимитирующей стадией является конформационное изменение с той стороной мембраны, где находится место связывания.

В большинстве случаев сродство переносчика к транспортируемому веществу не зависит от того, к какой стороне мембраны обращено место связывания. Однако для первичных активных транспортных систем наблюдается иная картина.

Все рассматриваемые здесь переносчики обычно чувствительны к реагентам, действие которых направлено на сульфгидрильные группы. Однако это не обязательно должно означать, что между переносчиками имеется значительное структурное сходство или они используют одинаковый механизм транспорта. Например, установлено, что ни один из восьми остатков цистеина лактозопермеазы не участвует непосредственно в транспорте. Высказывалось также предположение, что погруженные в мембрану остатки пролина распределены в транспортных белках непропорционально, однако значение этого факта остается неясным.

ПЕРЕНОСЧИК ГЛЮКОЗЫ ИЗ МЕМБРАНЫ ЭРИТРОЦИТА

Этот переносчик охарактеризован наиболее полно из всех белков, катализирующих диффузию единственного вещества через мембрану. Он переносит через эритроцитарную мембрану D-глюкозу, которая затем используется при гликолизе. Такие же или аналогичные переносчики глюкозы присутствуют и в других типах животных клеток. Большой прогресс в этой области исследований был достигнут благодаря секвенированию ДНК, кодирующей переносчик глюкозы из клеток гепатомы человека и из клеток мозга крысы. Очищенный переносчик из эритроцитов представляет собой гликопротеин с кажущейся мол. массой 55 000. По-видимому, в мембране он находится в виде димера. Если судить по данным об аминокислотной последовательности, то переносчик должен содержать 12 трансмембранных а-спиральных участков, однако экспериментальные данные не дают окончательного ответа на этот вопрос. Очищенный переносчик удалось встроить в фосфолипидные везикулы, при этом оказалось, что он ориентирован асимметрично.

Как и при исследовании канальных белков, очень важную роль сыграли опыты с использованием специфических ингибиторов, обладающих высоким сродством к переносчику. В число этих ингибиторов входят цитохалазин В и флоретин, которые связываются с переносчиком со стехиометрией 1:1. Одни ингибиторы связываются с переносчиком только в том случае, если они находятся с цитоплазматической стороны мембраны, другие специфически связываются с наружной стороны мембраны. В работе было показано, что места связывания двух указанных ингибиторов находятся вблизи С-конца полипептида.

Большинство кинетических данных и данных по связыванию согласуются с простой моделью четырех состояний, в которой предполагается, что существует единственное место связывания D-глюкозы, находящееся внутри канала. Для измерения индивидуальных констант скоростей использовали ЯМР и метод остановленной струи. Конформация загруженного канала изменяется с константой скорости 2000 с~', которая приблизительно в семь раз выше аналогичной константы для незагруженного канала. Следовательно, обмен глюкозы происходит с большей скоростью, чем транспорт как таковой, для осуществления которого незагруженный переносчик должен возвратиться через мембрану. Природа конформационного изменения неизвестна, хотя оно было зарегистрировано при помощи инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье и, как предполагают, включает скольжение а-спиралей друг относительно друга.

Между переносчиком глюкозы из клеток млекопитающих и некоторыми транспортными системами бактерий наблюдается значительная гомология. Удивительно, что такая гомология наблюдается также между переносчиком глюкозы и белками, осуществляющими симпорт Н ⁺-арабинозы и Н ⁺-ксилозы. Эти сим-портеры, как и описываемая ниже система транспорта Н ⁺-лактозы, используют для аккумуляции указанных сахаров электрохимический протонный градиент. Переносчик глюкозы из мембраны эритроцитов не транспортирует Н⁺ и не способен к транспорту против градиента глюкозы. Очень важными представляются работы по изучению взаимосвязи структуры белкового комплекса и механизма его работы.

ЛАКТОЗОПЕРМЕАЗА ИЗ Е. coll

Этот комплекс изучен наиболее полно из всех симпортных белков. Он кодируется /асУ-геном, который является частью lac-оперона, и его часто называют lac-пермеазой. Ген lacY был клонирован и секвенирован, и из штамма-сверхпродуцента был выделен белок -- продукт этого гена. Пермеазу можно изучать в цитоплаз-матических мембранных везикулах, в интактных клетках или в реконструированных протеолипосомах. Судя по дан-

ным об аминокислотной последовательности, белок имеет мол. массу 46 500, хотя результаты электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН дают другую величину. Почти не вызывает сомнения, что функциональной единицей в мембране является мономер, хотя некоторые данные свидетельствуют о существовании димерной формы пермеазы in vivo.

На основании данных об аминокислотной последовательности лактозопермеазы были построена модели, согласно которым этот белок имеет 12 или 14 трансмембранных а-спиралей. Это в основном согласуется со спектроскопическими данными, свидетельствующими о высоком содержании а-спиралей, и немногочисленными топологическими данными. На рис. 8.11 представлена модель, построенная Кабаком, с указанием сегментов, которые, согласно экспериментальным данным, являются цито- или периплаз-матическими.

Пермеаза имеет одно или более мест связывания для протона и одно -- для лактозы. Эти места бывают поочередно обращены к периплазматической и цитоплазматической сторонам мембаны, и соответствующий коиформациониый переход является лимитирующей стадией процесса. Максимальная скорость транспорта равна 25--50 с~¹. При наличии трансмембранного протонного электрохимического потенциала для лактозы составляет ~ 80 мкМ; место связывания протона, возможно, характеризуется высоким рК_л, поэтому большую часть времени протонировано. При ДД_Н ¦ = 0 значение Км для лактозы гораздо выше -- 15--20 мМ.

Транспорт лактозы обязательно сопровождается транспортом Н⁺ со стехиометрией 1:1.

Конечным результатом транспорта является перенос через бислой положительного заряда. Следовательно, важную роль в установлении равновесия и скорости транспорта играют трансмембранный электрический потенциал и разность протонного химического потенциала.

Дополнение 8.4. Генетические подходы и сайт-специфический мутагенез: важные методы изучения лактоэопермеазы

Наиболее ценные данные при изучении лактоэопермеазы были получены с помощью генетических методов. Эти работы начали проводить сравнительно недавно, но уже ясно, что такого рода подходы помогут получить важные результаты при изучении как этой, так и других транспортных систем. С помощью направленного мутагенеза было показано, что при замене аланина-177 или тирозииа-236 данная пермеаза может переносить мальтозу. Эти сайты, отмеченные на рис. 8.11 кружками, могут участвовать в связывании сахара.

Кабак и его коллеги использовали сайт-специфический мутагенез для изучения механизма функционирования пермеазы. Было показано, что замена многих аминокислот не оказывает заметного влияния на кинетику транспорта. Это означает, что данные аминокислоты не принимают прямого участия в транспорте; более того -- их замена не приводит к «глобальным» конформационным изменениям белкового комплекса и не препятствует нормальной организации комплекса в мембране.

Были выделены три мутантные формы, неспособные катализировать определение стадии транспорта. Особенно существенны для нормального транспорта гистидин-322, глутамат-325 и аргинин-302; возможно, эти аминокислоты участвуют в переносе заряда внутри мембраны. Было высказано предположение, что они образуют некую связанную водородными связями группу между спиралями 9 и 10. Пермеаза, в которой глутамат-325 заменен на аланин, не может катализировать активный транспорт или выведение лактозы, но способна осуществлять нормальный обмен лактозы. Следовательно, нагруженная форма переносчика может претерпевать нормальные конформационные изменения, блокируется же какая-то другая стадия полного цикла, возможно депротонирование пермеазы. Можно надеяться, что именно с помощью такого рода экспериментов удастся понять механизм работы данного переносчика. При этом очевидно, что в интерпретации результатов ключевую роль могло бы сыграть установление трехмерной структуры фермента.

Как у Е. coli, так и у высших организмов имеются другие системы симпорта сахара и катионов. Однако лактозопермеаза не гомологична ни переносчикам Н ⁺-ксилозы или Н ⁺-арабинозы, ни переносчику глюкозы млекопитающих. Никакой гомологии не было обнаружено также между лак-тозопермеазой и мелибиозопермеазой из Е. coli. Последняя использует в качестве движущей силы для накопления мелибио-зы симпорт не только Н ⁺, но также и Na ⁺. Способность использовать Na ⁺, по всей вероятности, исключает механизмы с перескакиванием протона по сети водородных связей в пронизывающей мембрану части переносчика. Известен также некий переносчик Na ⁺-глюкозы, который катализирует накопление глюкозы в клетках щеточной каемки кишечника.

БЕЛОК ПОЛОСЫ 3 -- АНИОННЫЙ ПЕРЕНОСЧИК ИЗ МЕМБРАНЫ ЭРИТРОЦИТОВ

На долю белка полосы 3 приходится около 25% общего количества мембранных белков эритроцита человека; сходные белки присутствуют также в неэритроидных клетках. Этот белок выполняет несколько функции, причем их можно соотнести с двумя основными доменами белковой молекулы. N-концевая часть является гидрофильной и локализована с цитоплазмати-ческой стороны эритроцитарной мембраны. Она содержит места связывания для компонентов цитоскелета, а также для ферментов гликолиза и гемоглобина. Этот домен можно удалить путем протеолиза, не затронув С-концевого домена, который остается связанным с мембраной и опосредует С1"/НСО_э~обмен, а также образует канал в мембране, через который может проникать вода. Внецитоплазматический компонент этой части белка содержит также углеводные антигенные детерминанты нескольких систем групп крови. В мембране белок полосы 3 находится в форме димера или тетрамера.

Было проведено клонирование и секвенирование участка кДНК, кодирующего белок полосы 3 из эритроцитов мыши. Эти данные послужили основой для построения модели белка полосы 3. Было высказано предположение, что он имеет 12 трансмембранных а-спиралей, при этом некоторые из них являются ам-фифильными. Экспериментальные данные, подтверждающие эту гипотезу, получены только для нескольких участков полипептида и основаны главным образом на результатах протеолиза и локализации связанных углеводов.

Обширные кинетические исследования согласуются с моделью с чередованием конформации и одним местом связывания. Однако скорость равновесного анионного обмена с помощью переносчика по меньшей мере в 10⁴ раз превышает скорость транспорта как такового. Следовательно, незагруженный переносчик не претерпевает быстрых конформационных превращений, необходимых для того, чтобы анион мог связаться с мембраной. По данным ЯМР с использованием ³⁵С1, у переносчика имеется единственное место связывания, и оно может быть обращено как внутрь, так и наружу. Результаты опытов с использованием игнибиторов транспорта тоже свидетельствуют о том, что в канале имеется единственное место связывания аниона, локализованное где-то в середине канала. При этом предполагается, что переход этого места связывания с одной стороны мембраны на другую блокируется неким «скользящим барьером», который перемещается вдоль канала в результате конформационных изменений. Лимитирующей стадией является конформационный переход нагруженного переносчика, но происходит он достаточно быстро, с частотой 10⁵ с ~¹ при 37 °С. По-видимому, такая высокая скорость предотвращает значительные конформационные изменения в белке. Природа этого конформационного перехода и точная структура канала экспериментально не определены.

Конформационный переход загруженного переносчика, лимитирующий весь транспортный процесс, лишь в очень малой степени зависит от мембранного потенциала. Это согласуется с таким кон-формационным переходом, в результате которого через мембрану перемещается 0,1 связанного с белком заряда. Если этот переход сопряжен с перемещением анионного субстрата, то он должен сопровождаться переносом противоиона, например заряженной аминокислотной группы. В отличие от этого потенциалзависимое конформационное изменение, индуцирующее открывание натриевого канала, приводит к результирующему перемещению через мембрану шести связанных с белком зарядов.

ГРУППА МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ПЕРЕНОСЧИКОВ

Гомологичность некоторых транспортных белков внутренней митохондриальной мембраны свидетельствует об их близком родстве: по всей вероятности, они произошли от общего предка в результате дивергентной эволюции. Имеются по меньшей мере три представителя этой группы: 1) ADP/ATP-транслоказа; 2) переносчик фосфата и 3) разобщающий белок. В структуре этих белков имеется много общего, и тем не менее оии существенно различаются по субстратной специфичности. ADP/ATP-транслоказа катализирует транспорт ADP и АТР через бислой. При физиологических условиях АТР транспортируется из митохондрий, a ADP переносится в матрикс. Механизм этого процесса, по-видимому, аналогичен таковому для белка полосы 3, за исключением того, что АТР несет на один отрицательный заряд больше, чем ADP, и поэтому обмен зависит от трансмембранного электрического потенциала на митохондриальной мембране. Переносчик фосфата осуществляет одновременно и симпорт Н ⁺, и, во-видимому, механизм его работы сходен с описанным ранее механизмом для Н ⁺ -лактозопермеа-зы из Е. coli. Этот белок катализирует транспорт фосфата внутрь митохондрий. Благодаря симпорту Н⁺ процесс в целом является электронейтральным и не зависит от трансмембранного потенциала. Разобщающий белок был обнаружен в митохондриях из клеток бурого жира млекопитающих; его функция заключается в диссипации протонного электрохимического градиента, создаваемого при функционировании дыхательной цепи, в результате чего генерируется тепло. Разобщающий белок может также катализировать транспорт анионов, например CI ~, так что, может быть, на самом деле он катализирует транспорт ОН ~, который невозможно экспериментально отличить от транспорта Н⁺. Этот переносчик связывается с нуклеотидами, которые ингибируют транспорт, и его работа может регулироваться жирными кислотами.

Все три переносчика, а возможно, еще и а-кетоглутарат/малат-транслоказа, имеют сходное строение; этот вывод был сделан на основе данных об их аминокислотной последовательности. Все они имеют мол. массу около 33 000 Да и состоят из трех гомологичных доменов, каждый из которых содержит ~ 100 аминокислот. По всей вероятности, эти три домена образовались в результате утроения единственного гена. Была построена модель, согласно которой каждый из гомологичных доменов дважды пересекает мембрану, а вся субъединица содержит шесть трансмембранных а-спи-ралей. С этой моделью согласуются данные по химической модификации. Отметим, что такая структура имеет много общего с Na ⁺ -каналом, состоящим из четырех родственных гомологичных доменов. ADP/ATP-транслоказа является димером и, по-видимому, содержит единственный канал, по которому осуществляется транспорт. Такой вывод основывается на результатах исследований по связыванию ингибиторов с высоким сродством.

Несколько примеров активных переносчиков, использующих энергию гидролиза АТР или фосцЪоенолпирувата

Сделаем несколько замечаний, касающихся первичных активных переносчиков. Охарактеризовано довольно много систем, с помощью которых происходит сопряжение транспорта тех или иных веществ через мембрану с гидролизом макроэргической фосфатной связи или с другой реакцией, в ходе которой высвобождается энергия. Мы не стремимся дать подробный анализ обширной литературы по данному вопросу, а хотим лишь отметить некоторые основные особенности строения и механизма работы этих транспортных систем в контексте того, что мы уже узнали о других группах транспортных белков.

Как мы уже отмечали, в основе кинетических моделей многих первичных активных транспортных систем лежит концепция чередования конформационных изменений. При этом совершенно необязательно, чтобы реакция, в ходе которой высвобождается энергия, например реакция гидролиза АТР, была прямо сопряжена с конформационным переходом, необходимым для транспорта, как это показано на рис. 8.2; важно лишь, чтобы такое сопряжение существовало с одной или несколькими стадиями кинетического цикла. Требования, предъявляемые к структуре трансмембранного «канала» первичного активного переносчика, аналогичны таковым для других переносчиков, но здесь возникает дополнительная сложность -- необходимость контроля сопряжения химической реакции, в ходе которой высвобождается энергия, и транспорта растворимого вещества.

О молекулярной структуре первичных активных транспортных систем известно даже меньше, чем о транспортных белках. Идентифицировать группы родственных переносчиков, близких по строению и механизму работы, помогают данные об их аминокислотной последовательности, которых становится все больше. Однако достоверные данные о том, каково строение участков, непосредственно вовлеченных в транспорт веществ, отсутствуют. В основе различного рода структурных моделей активных переносчиков лежит предположение о том, что трансмембранный канал, через который транспортируются вещества, образован кластером трансмембранных амфифильных а-спиралей. Сходным образом и модели, описывающие сопряжение химических реакций и транспорта веществ, опираются на весьма немногочисленные экспериментальные данные. Модели сопряжения можно разделить на две главные группы. Согласно модели прямого сопряжения, химическая реакция оказывает непосредственное влияние на перенос транспортируемого вещества, причем этот процесс не требует значительных опосредованных белком конформаци-онных изменений. Например, протоны, участвующие в гидролизе АТР, могли бы быть именно теми ионами, которые транспортируются через мембрану в ходе данной реакции. Для этого необходимо, чтобы участок комплекса, где протекает химическая реакция, и участок связывания транспортируемого вещества были расположены очень близко друг к другу. В отличие от этого в модели непрямого сопряжения химическая реакция оказывает влияние на транспортный процесс через опосредованные белком конформационные изменения. Допускается даже, что химическая реакция и активный транспорт могут быть связаны с разными субъединицами внутри комплекса. Эти модели имеют то преимущество, что с их помощью нетрудно объяснить транспорт различных веществ одними и теми же или близкородственными белками при участии одних и тех же механизмов.

Активные транспортные системы функционируют со скоростями, типичными для многих ферментов, т. е. 10²--10³ с" ¹ в условиях насыщения. В отличие от канальных белков селективность в отношении субстрата обусловливается главным образом сродством транспортируемого вещества к активному переносчику. Более того, большинство первичных активных переносчиков обычно функционирует в условиях, когда концентрация переносимого вещества с #ис-стороны близка или немного превышает Км и лимитирующей стадией транспорта является конформационный переход белка или химическая реакция, служащая источником энергии для данной системы.

И наконец, роль первичных активных транспортных систем заключается в перемещении вещества через мембрану против его концентрационного градиента в одном направлении. Поскольку переносчик после высвобождения транспортируемого вещества должен опять изменить свою ориентацию с транс на цис, необходим какой-то механизм, препятствующий возвращению на цис-сторону загруженного переносчика. Следовательно, сродство активного переносчика к транспортируемому веществу должно быть| выше с г/ис-стороны, чем с т/7Анс-стороны. Если бы это было не так, переносчик работал бы очень неэффективно при высоких концентрациях субстрата с m/юнс-стороны. В такой реакции энергия затрачивается главным образом на изменение сродства переносчика к транспортируемому веществу. Например, фосфорилирование Na ⁺ /К ⁺ -АТРазы или Са -АТРазы при помощи АТР ведет к стабилизации конформации тех переносчиков, у которых место связывания ионов обращено наружу и которые имеют низкое сродство соответственно к Na ⁺ или Са^{2 +}. В то же время связывание АТР стабилизирует ту форму Na ⁺/К ⁺-АТРазы, в которой места связывания ионов, обращенные к цитоплазме, имеют низкое сродство к К*. Следовательно, механизм сопряжения реакции, в ходе которой высвобождается энергия, и транспорта, катализируемого активными переносчиками, лучше всего рассматривать исходя из термодинамических принципов, т. е. как временную стабилизацию определенных конформации и изменение сродства к транспортируемому веществу.

Можно выделить пять групп переносчиков, которые используют свободную энергию макроэргической фосфатной связи для осуществления транспорта веществ, т. е. Природа нашла несколько путей решения этой задачи.

ПЕРЕНОСЧИКИ КАТИОНОВ ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ: АТР-ЗАВИСИМЫЕ ИОННЫЕ НАСОСЫ

Несколько про- и эукариотических ионпереносящих АТРаз составляют единое семейство и обладают сходными аминокислотными последовательностями и механизмами переноса ионов. Наиболее полно охарактеризованы Na ⁺ /K⁺-ATPa3a из плазматической мембраны животных клеток и Са^{2 +} -АТРаза из сар-коплазматического ретикулума. Большинство ферментов этой группы представляют собой единый полипептид с мол. массой 100 000; исключение составляет Na ⁺/К ⁺-АТРаза, выделенная из нескольких источников, которая содержит вторую, меньшую субъединицу с неизвестной функцией. Эти переносчики ингиби-руются ванадатом и прямо фосфорилируются АТР с образованием фосфорилированного интермедидата, играющего важную роль в транспорте. Катионные переносчики этой группы значительно различаются по ионной специфичности. Неодинакова и стехиометрия транспорта. Например, Са^{2 +}-АТРаза переносит 2Са^{2 +} /АТР в полость саркоплазматического ретикулума, в то время как Na⁺/К ⁺-АТРаза переносит 3Na⁺ наружу и 2К ⁺ в цитоплазму через плазматическую мембрану. При этом различия в работе АТРазы касаются не только стехиометрии и природы переносимых ионов, но также и того, что Са^{2 +} -АТРаза способна переносить ионы лишь в одном направлении, в то время как Na ⁺ /K⁺-АТРаза делает это в обоих направлениях.

Название «фермент Е1Е2-ТИГЩ» было введено в работе, посвященной Na ⁺/К ⁺-АТРазе. Как показали исследования, этот белок существует по меньшей мере в двух различающихся конформациях, для которых характерны разное связывание субстратов и неодинаковая подверженность мягкому протеолизу. Форма Е, соответствует конформации, в которой места связывания ионов обращены в сторону цитоплазмы и которая обладает высоким сродством к АТР. Места связывания ионов в фосфорилированной форме Е₂ обращены наружу. На рис. 8.12 изображен транспортный цикл, в котором участвуют две ненагруженные формы переносчика и две нагруженные, Е_{2 CBCM3}, со «спрятанными» внутри насосного комплекса ионами. Изучение связывания К ⁺ фосфорилированной формой переносчика показало, что оно происходит в двух разных местах.

Отметим основные особенности каталитического цикла.

Ei-форма связывает три иона Na⁺ с цитоплазматической стороны мембраны и затем взаимодействует с АТР, образуя фосфори-лированный фермент. Фосфорилируется при этом специфический ас-партат, консервативный в этой группе ферментов.

После отсоединения ADP ионы оказываются «спрятанными» внутри комплекса.

Фосфорилирование белка стабилизирует конформацию с низким сродством к Na ⁺; при этом места связывания ионов обращены наружу. Это способствует переходу Ei-P -» Ег-Р, в результате которого и осуществляется перенос.

В форме Ег-Р места связывания ионов обращены во внеклеточную среду; эта конформация обладает высоким сродством к К⁺, который связывается, катализирует дефосфорилирование и остается «спрятанным» внутри комплекса. Обратите внимание, что Na⁺ необходим для быстрого фосфорилирования, а К⁺ -- для быстрого дефосфорилирования. Ванадат связывается с формой Е₂, возможно, как некий аналог переходного состояния фосфата. У других ферментов Е^г-типа, например Са^{2 +} -АТРазы, форма Ег-Р дефосфорилируется и переходит в форму Ei, которая в свою очередь переходит в незагруженную форму.

Лимитирующей стадией каталитического цикла является, по всей вероятности, освобождение К⁺ и переход его из связанного с ферментом состояния в свободное. Этот процесс стимулируется связыванием АТР с сайтом, обладающим низким сродством. Следовательно, АТР выполняет две разные функции, выступая в качестве субстрата и аллостерического эффектора. Сколько мест связывания АТР имеет фермент, пока неясно.

Определена аминокислотная последовательность нескольких АТРаз Е|Е₂-типа, включая Na⁺/К⁺-АТРазу из не-

скольких источников, Са^{2 +} -АТРазу, Н ⁺ -АТРазу из плазматической мембраны дрожжей и Neurospora crassa и К⁺-АТРазу из S. faecalis. Исходя из профилей гидрофобности, были построены модели, согласно которым эти белковые комплексы содержат 6, 8 или 10 трансмембранных а-спиральных сегментов. Некоторые участки полипептидов, в том числе и сегмент; содержащий сайт фосфорилирования, в значительной степени гомологичны. Все белки имеют большую гидрофильную петлю, содержащую домены, с которыми, по всей вероятности, связываются нуклеотиды и где происходит фосфори-лирование.

У Са² * -АТРазы один расщепляемый трипсином сайт, чувствительный к конформационному переходу Е| -¦ Ег, находится в «трансдукционном» домене. Исследовалось также связывание Са²⁺ с ферментом; было высказано предположение, что транспорту Са²⁺ предшествует связывание двух ионов Са²⁺ с определенными участками внутри белкового комплекса. По всей вероятности, у Са^{2 +} -АТРазы места связывания Са^{2 +} с высоким сродством располагаются на значительном удалении от места связывания нуклеотидов, однако эту гипотезу нужно еще проверить. Основные особенности строения Са^{2 +}-АТРазы, представленные на рис. 8.13, согласуются с данными электронной микроскопии, согласно которым этот белковый комплекс сильно выступает из бислоя в цитоплазму. Вероятно, в условиях in vivo АТРазы Е|Ег-типа агрегируют, образуя по меньшей мере димеры, но подтвердить данное предположение экспериментально очень трудно. Тем не менее очевидно, что мономеры также способны к катализу, по крайней мере в некоторых случаях.