Поры, каналы и переносчики

Поры, каналы и переносчики

Фосфолипидный бислой является очень эффективным барьером для множества небольших растворимых молекул. Тем не менее, через плазматическую мембрану, а также через мембраны, ограничивающие различные органеллы, постоянно транспортируются полярные вещества и ионы. Этот транспорт целиком опосредован белками, и для объяснения механизма переноса растворимых веществ через мембрану было предложено много моделей.

Здесь будет полезно ввести несколько терминов, использующихся для характеристики белков или структур, участвующих в трансмембранном транспорте. В табл. 1 дается классификация транспортных белков. Прежде всего их подразделяют на каналы и переносчики. Поры и каналы часто изображают в виде туннелей через мембрану, в которых места связывания транспортируемых растворимых веществ доступны с обеих сторон мембраны одновременно. Канальные белки не претерпевают никаких конфор-мационных изменений в процессе переноса растворимых веществ с одной стороны мембраны на другую. Напротив, конформация переносчиков в процессе транспорта различных веществ изменяется.

Таблица 8.1. Классификация некоторых транспортных белков, основанная на механизме их действия и энергетике

1. Каналы

Потенциалзависимые каналы

Б. Химически регулируемые каналы

Другие каналы

11. Переносчики

А. Пассивные унипортеры Б. Активные переносчики

Первичные активные переносчики

а. Сопряженные с окислительно-восстановительными реакциями

б. Сопряженные с поглощением света

в. АТРазы

Вторичные активные переносчики

а. Симпортеры

б. Антипортеры

Переносимое вещество связывается с одной стороны мембраны, и для высвобождения его с другой стороны в переносчике должно произойти определенное конформационное изменение. При этом в любой момент времени место связывания вещества доступно только с одной стороны мембраны.

Каналы и поры также претерпевают конформационные изменения, однако последние регулируют лишь их открывание и закрывание и не касаются самого процесса переноса. Две основные группы каналов, приведенные в табл. 1, разделяются на каналы, работа которых регулируется изменением напряжения электрического поля или химическим путем. Каналы первого типа открываются или закрываются в ответ на изменение трансмембранного потенциала; наиболее изученными из них являются каналы электровозбудимых клеток, например нервных или мышечных. Каналы второго типа отвечают на действие специфических химических агентов; наиболее детально изученные из них -- каналы, связывающие нейро-медиаторы, например ацетилхолин. Так, никотиновый ацетилхоли-новый рецептор при связывании с ним нейромедиатора переходит в открытую конформацию и пропускает одновалентные катионы.

Термины пора и канал обычно взаимозаменяемы, однако под порой чаще понимают некие неселективные структуры, которые различают вещества главным образом по размеру и пропускают все достаточно малые молекулы. Под каналами чаще всего понимают ионные каналы, которые, как теперь известно, широко распространены во многих типах клеток, отличных от нервных и мышечных.

Переносчики можно разделить на две группы: пассивные и активные. Мы будем использовать термин пассивный переносчик в том случае, когда при его участии осуществляется перенос через мембрану единственного типа веществ. Переносчики-унипортеры только увеличивают поток вещества, идущий без потребления энергии, т. е. по градиенту электрохимического потенциала. Такой процесс называется облегченной диффузией. Наиболее полно изученным пассивным переносчиком является переносчик глюкозы в эритроцитах.

Активные переносчики осуществляют перенос веществ через мембрану с затратами энергии, в результате эти вещества накапливаются с одной стороны мембраны. При этом транспорт вещества должен быть сопряжен с другим, запасающим свободную энергию процессом. Почти все первичные активные переносчики являются ионными насосами, в которых перемещение иона прямо сопряжено с поставляющей энергию химической или фотохимической реакцией. Примером ионного насоса является бактериородопсин, который для переноса протонов через мембрану использует энергию фотонов видимого света. В большинстве случаев ионные насосы являются электрогенными: при работе первичного насоса осуществляется перемещение заряда, в результате чего происходит разделение электрических зарядов и на мембране создается напряжение.

Первичные активные переносчики генерируют напряжение и создают трансмембранные ионные градиенты. Вторичные активные переносчики используют такие градиенты в качестве движущей силы для транспорта растворимых веществ. Наиболее полно охарактеризованным примером такого рода является белок -- переносчик лактозы из Escherichia coli. Этот переносчик использует протонный электрохимический градиент, генерируемый дыхательной электронтранспортной цепью, в качестве движущей силы для накопления лактозы в клетке. Это пример симпорта, когда через мембрану одновременно переносятся два разных вещества. Антипортеры осуществляют транспорт веществ в противоположных направлениях. Так, например, белок полосы 3 эритроцитов осуществляет сопряженный транспорт CI ~ и НС0₃~ в противоположных направлениях через эритроцитарную мембрану.

Термины перемеаза, транслоказа и переносчик, являющиеся синонимами, часто используют по отношению к транспортным белкам, отличным от первичных активных переносчиков. Обычно термин «пермеаза» применяют при описании бактериальных транспортных белков. Термин «переносчик», по-видимому, лучше использовать по отношению к ионофорам или сходным с ними структурам, которые связываются с ионами и переносят их через бислой в составе комплекса.

Классификация транспортных белков, представленная в табл. 8.1, основана главным образом на энергетике и механизме транспорта растворимых веществ. Однако по мере установления аминокислотной последовательности все большего числа белков появляется возможность разработать другой принцип классификации транспортных белков -- на основе их структурного сходства. В табл. 8.2 показано несколько структурно родственных групп каналов и транспортных белков. При этом белки, входящие в состав одной группы, могут выполнять разные фукнции. В качестве примера рассмотрим переносчик глюкозы млекопитающих и переносчик Н ⁺-арабинозы бактерий. Первый является унипортером, который может катализировать только облегченную диффузию глюкозы, в то время как второй способен сопрягать перенос ионов Н ⁺ по протонному электрохимическому градиенту с активным транспортом другого вещества, арабинозы. Ясно, что природа может приспособить одну и ту же структуру к выполнению различных функций.

КАНАЛЫ И ПЕРЕНОСЧИКИ: РАЗНООБРАЗИЕ ФУНКЦИЙ

Функции ионных каналов и переносчиков весьма разнообразны; проиллюстрируем их на нескольких примерах. Так, регулируемые ионные каналы, участвующие в передаче сигнала, в ответ на определенный внешний стимул быстро изменяют мембранную проницаемость для определенного иона. При этом происходит изменение трансмембранного потенциала. К работе такого рода каналов предъявляется ряд требований. Во-первых, внешний сигнал должен вызывать быстрое переключение между открытым и закрытым состояниями канала. Необходимо также, чтобы быстро устанавливалось новое равновесие или стационарное значение мембранного потенциала. При этом очень существенна скорость процесса. Так, когда канал открыт, через бислой может проходить до 10⁶--10⁸ ионов в секунду. Такая величина потока является экспериментальным критерием, позволяющим отличить каналы от переносчиков. Столь большие ионные потоки означают, что открывание относительно малого числа каналов приводит к значительным быстрым изменениям электрических свойств мембраны. Рассмотрим на конкретном примере, как оценить время ответа мембраны на внешний сигнал.

Предположим, что мембрана с емкостью 1 мкФ/см² содержит некоторое число К ⁺ -каналов с проводимостью в открытом состоянии 20 пСм. Проводимость, равная 1 пСм, эквивалентна 6-10* ион/с на 1 В, так что в нашем случае через каждый канал может пройти 1,2-10⁸ ион/с на 1 В. Предположим, что на мембране существует К ⁺ -градиент с соотношением _внутрн/_{снаружи} = 52. Когда К ⁺-каналы закрыты, мембранная проницаемость по К⁺ равна нулю и К* не участвует в образовании трансмембранного потенциала. При открывании каналов происходит перенос ионов К ⁺ по градиенту концентрации до тех пор, пока не установится новое стационарное распределение.

Таблица 8.3. Сравнение скоростей транспорта для некоторых систем"

В результате диффузии ионов К + через мембрану происходит разделение зарядов. При этом достигается равновесное значение трансмембранного потенциала, которое можно определить из уравнения Нернста. Легко подсчитать, что в нашем случае оно составляет 100 мВ. Заряд, необходимый для поддержания этого потенциала, определяется емкостью С, составляющей всего лишь ~ 10" 12 моль/см2. Столь незначительное число переносимых ионов, не вызывая заметных изменений в концентрации К* как по ту, так и по другую сторону мембраны, порождает тем не менее весьма значительный электрический сигнал.

Ключевой характеристикой канала является время, необходимое для достижения нового стационарного состояния после открывания канала. Оно зависит как от емкости, так и от удельного сопротивления мембраны. Если мы примем число открытых каналов равным 50 на 1 мкм2, то время ответа составит 0,1 мс.

В табл. 8.3 приведены значения числа оборотов для нескольких ионных каналов и переносчиков. Обратите внимание, что для ионных каналов и пор характерны очень большие числа оборотов. Напротив, для лактозопермеазы Е. coli максимальное число оборотов составляет всего лишь ~ 30 с ~1. Если бы рассмотренные выше ионные каналы работали с такой скоростью, то для достижения той же удельной проводимости потребовалось бы увеличить плотность каналов в 10 млн. раз, что физически невозможно.

Для осуществления лактозопермеазой ее физиологических функций, конечно, не требуется столь большого числа оборотов, как для каналов. Ее роль состоит в транспорте лактозы -- углевода, который затем участвует в клеточном метаболизме. Для ионных насосов, использующих для работы энергию гидролиза АТР или переноса электронов, характерны максимальные числа оборотов 10²-- 10³ с¹, что довольно типично для ферментов, но гораздо меньше аналогичных значений для каналов или пор.

Однако не все переносчики работают столь медленно. Анионный переносчик белок полосы 3 из эритроцитарной мембраны играет важную физиологическую роль в усилении быстрого трансмембранного обмена С1" на НС0₃~. Одна из функций эритроцитов заключается в усилении транспорта СОг от различных тканей к легким. В венозных капиллярах СОг быстро диффундирует через эритроцитарную мембрану. В клетке под действием карбоангидразы СОг превращается в Н2СО3, затем быстро устанавливается равновесие Н2СО3 Н ⁺ + НС0₃~, и анион бикарбоната переносится через мембрану в плазму крови белком полосы 3. В результате по мере того, как эритроцит проходит по капиллярам, концентрация НС0₃~ в плазме увеличивается, причем этот процесс занимает меньше 1 с. Когда кровь достигает легких, начинается диффузия СОг в атмосферу. При этом под действием карбоангидразы в эритроцитах происходит массовое превращение Н₂С0₃ в СОг и НгО. Этот процесс в свою очередь является движущей силой для переноса аниона бикарбоната внутрь эритроцита, где он быстро превращается в СОг и НгО.

Транспортная система должна функционировать очень быстро, но в отличие от ионных каналов в аксонах здесь нет нужды в электрогенных реакциях, которые только замедлили бы быстрый массовый транспорт. Но транспорт катиона, например Na ⁺, вместе с НС0₃~был бы нежелателен, поскольку изменение концентрации соли в эритроците привело бы к осмотическому дисбалансу. Эта проблема решается с помощью антипортера, который в обмен на каждый транспортируемый ион НС0₃~ переносит в обратном направлении анион С1". Такая челночная система работает очень быстро, с числом оборотов 10⁵ с¹, что немногим меньше скорости переноса ионов настоящим каналом.

Дополнение 8.1. Время электрического ответа мембраны

Время электрического ответа т является мерой того, как быстро трансмембранный потенциал достигает нового равновесного значения после открывания специфических ионных каналов. В возбудимых мембранах этот параметр является ключевым и определяется емкостью

мембраны С и удельным сопротивлением R. Получим выражение для т.

Начнем с того, что продифференцируем по времени уравнение для емкости:

dQ/dt равно току / и равно нулю, когда напряжение достигает своего конечного значения Ук. Ток через ионный канал пропорционален разности между истинным напряжением и напряжением, определяемым из уравнения Нернста для равновесного состояния при нулевом потоке. В соответствии с законом Ома / = /R. Отсюда

Решение уравнения имеет вид

или где т = RC.

Напряжение на мембране растет экспоненциально от нуля до конечного значения 100 мВ с постоянной времени т, равной RC. Следовательно, произведение удельного сопротивления мембраны R на емкость С имеет размерность времени и характеризует время электрического ответа мембраны. Предположим, что в мембране открыто 50 каналов на 1 мкм². Это значит, что удельная проводимость мембраны составляет 10 мСм/см² и удельное сопротивление мембраны соответственно равно 100 Ом см². В этом случае RC = 0,1 мс, что находится в интервале значений, характерных для возбудимых мембран зависит главным образом от удельного сопротивления мембраны, поскольку емкость определяется в основном липидным би-слоем.

Обратите внимание, что удельное сопротивление мембраны зависит от числа каналов, времени, в течение которого они открыты, и проводимости каждого канала в открытом состоянии. С разработкой методов, позволяющих реконструировать работу одиночных каналов, появилась возможность прямо измерить эти параметры.

КАНАЛЫ И ПЕРЕНОСЧИКИ КАК ФЕРМЕНТЫ: ПРИМЕНЕНИЕ ТЕОРИИ СКОРОСТЕЙ

Кинетическую теорию переходного состояния Эйринга, используемую энзимологами, успешно применяют и в случае различных траспортных систем. В основе этого подхода лежит предположение о том, что система может находиться в нескольких дискретных состояниях, каждому из которых соответствует стандартное значение электрохимического потенциала. При этом взаимные переходы между двумя состояниями сопряжены с переходом системы через промежуточные стадии с более высокой свобод-

ной энергией, и константы скоростей переходов зависят от высоты соответствующих энергетических барьеров. Минимумы на кривых изменения свободной энергии соответствуют местам связывания транспортируемых веществ. Можно предположить, что канал или переносчик имеет одно или несколько мест связывания переносимых веществ. При достаточно высоких концентрациях переносимого вещества все эти места оказываются занятыми и скорость переноса достигает своего максимального значения У_тлх, равного максимальной скорости работы фермента. Экспериментальные подтверждения этому получены для всех переносчиков и для многих каналов.

Применение теории переходного состояния при изучении работы каналов

Применим теорию переходного состояния для анализа работы ионного канала в случае, когда ионы изначально присутствуют только с одной стороны мембраны. Примем» для простоты, что внутри канала имеется единственное место связывания и что ионы не могут свободно проникать внутрь канала или покидать его. Если внутри канала имеется много мест связывания, по которым ион может последовательно передаваться, то скорость переноса будет по-прежнему описываться уравнением Михаэлиса-- Ментен. Если принять, что трансмембранное напряжение равно нулю, то «реакцию» можно представить следующим образом:

где Е -- это канальный белок в «открытом» состоянии, Si и So -- транспортируемое вещество внутри и снаружи, ES -- комплекс субстрата с местом связывания внутри канала. На рис. 8.1 показан профиль свободной энергии для такой модели. Приведен также профиль для канала в закрытом состоянии. Прохождению иона через канал препятствует увеличение высоты одного из энергетических барьеров, но каков механизм этого процесса, пока неизвестно, за исключением, возможно, канала щелевого контакта. Закрывание канала может быть обусловлено, например, изменением положения а-спирали или только боковой цепи, в результате чего эффективно блокируется транспорт ионов через канал.

Применение критерия стационарного состояния дает уже знакомое уравнение Михаэлиса--Ментен для скорости:

„ к-, + k_{2 rc}.

где Км = - , о -- суммарная концентрация переносчика.

Рассмотрим два случая: 1) насыщающая концентрация субстрата, > Км\ 2) низкая концентрация субстрата, < А"м.

1. Насыщающая концентрация субстрата. В этих условиях все места связывания заняты и скорость переноса достигает своего максимального значения, определяемого высотой энергетического барьера для выхода из канала. Это легко увидеть, преобразовав уравнение Михаэлиса -- Ментен для случая > Км:

2. Низкая концентрация субстрата. При < Км наблюдается линейная зависимость скорости от концентрации субстрата, т.е. имеет место кинетику второго порядка. Кажущуюся константу скорости второго порядка можно получить, преобразовав уравнение Михаэлиса--Ментен для случая малых:

Полученное уравнение достаточно важно, поскольку оно описывает работу большинства, если не всех ионных каналов. Кажущаяся константа скорости второго порядка для этой реакции равна к₂/Км-Даже для столь простого случая это не истинная микроскопическая константа скорости, а комбинация констант скоростей.

Из этой простой модели следует несколько выводов.

1. Измеряемая константа скорости, которая определяет скорость транспорта по открытому ионному каналу, содержит информацию о кажущемся сродстве иона к месту связывания и о числе оборотов. В отсутствие напряжения на мембране эта константа скорости прямо связана с проницаемостью, обусловленной единичным каналом. Если внутренний барьер мал, то константа скорости транспорта будет равна ki -- константе скорости второго порядка для иона, входящего в канал. Лимитирующим фактором для этой реакции может служить диффузия, при этом к\ будет составлять 10--10⁹M"'c^_l. Если внутренний энергетический барьер велик, то константа скорости транспорта будет равна произведению -кг-

2. Зависимость скорости транспорта от напряжения определяется проводимостью. Это легко понять, если посмотреть, как падение напряжения на мембране влияет на индивидуальные микроскопические константы. Если на профиль потенциала, изображенный на рис. 8.1, наложить прямую, отвечающую линейному падению напряжения на мембране, то высота энергетических барьеров, отвечающих кг и к\, уменьшится, а к - i -- увеличится. В результате этого существенно увеличится константа скорости второго порядка для ионного транспорта, что и следовало ожидать. Простые модели типа рассмотренной нами не предсказывают линейной зависимости тока от напряжения, наблюдаемой экспериментально. Однако при введении в такие модели дополнительных энергетических барьеров кривая зависимости потока от напряжения становится очень близкой к линейной.

3. Ионную селективность можно объяснить несколькими путями. Селективность -- это способность канала пропускать некоторые ионы лучше, чем другие; ее можно количественно охарактеризовать как отношение проницаемостей или проводимостей для сравниваемых ионов. Поскольку в выражение для константы скорости транспорта входят как ки так и к₂, то причиной селективной ионной проводимости может служить как более низкий энергетический барьер на входе в канал, так и более низкий барьер для перемещения внутри канала для определенного типа ионов. Например, если у входа в канал имеются отрицательные заряды или диполи, то скорость транспорта анионов может уменьшиться, т. е. канал окажется катионселективным. Такая картина наблюдается для нескольких рецепторных канальных белков и грамицидина А. Размеры переносимых веществ также влияют на скорость транспорта. Если размер молекулы переносимого вещества больше, чем диаметр канала, то это вещество не сможет попасть в канал. И наконец, селективность может быть связана с различием в скоростях переноса разных ионов внутри канала. Например, в случае Na⁺-селективного канала энергетический барьер для переноса этого иона внутри канала существенно ниже, чем для других ионов, таких, как К⁺, что ведет к увеличению проводимости no Na⁺. Представляется маловероятным, чтобы причиной ионной селективности было увеличение сродства иона к каналу. Такое изменение, соответствующее увеличению глубины впадины на профиле потенциала, должно было бы приводить к уменьшению скорости выхода иона из канала, т. е. к уменьшению максимального потока через канал, а также к уменьшению концентрации иона, необходимой для насыщения канала, т. е. к уменьшению Км. Около значения К_м для тех каналов, которые преимущественно пропускают Na⁺ или К ⁺, достаточно высоки, 200--300 мМ, что выше обычных физиологических концентраций этих ионов.

Применение теории переходного состояния при изучении работы переносчиков

Обратимся теперь к переносчикам. Рассмотрим простой переносчик с одним местом связывания, транспортирующий молекулы через мембрану. Рис. 8.2 иллюстрирует основные свойства как первичного активного переносчика, так и пермеазы. Рассмотрим четыре состояния белка-переносчика: 1) белок обращен внутрь/связан с субстратом; 2) обращен внутрь/не связан; 3) обращен наружу/ связан с субстратом; 4) обращен наружу/не связан. Тогда транспорт можно представить в виде следующей последовательности элементарных обратимых стадий.

Субстрат связывается с участком, обращенным к одной стороне мембраны.

Происходит конформационное изменение, существенно уменьшающее кинетический барьер для перемещения иона к выходу из канала и увеличивающее энергетический барьер для движения в обратном направлении. Это конформационное изменение может быть спонтанным или может происходить с потреблением энергии. Участок переносчика со связанным субстратом оказывается теперь обращенным к противоположной стороне мембраны.

Субстрат высвобождается из комплекса с переносчиком и выходит на противоположной стороне мембраны. Для активных переносчиков сродство субстрата к белку ниже, когда место связывания обращено к /иронс-стороне мембраны.

Происходит конформационное изменение, возвращающее белок-переносчик к исходной конформации, в которой место связывания вновь обращено к j/ис-стороне.

Ключевым моментом в работе всех переносчиков является наличие высокого энергетического барьера, для преодоления которого соответствующие белки должны претерпеть конформационные изменения. Если для этого необходима энергия, то система может работать как активный переносчик. Если для конформационного перехода необходимо, чтобы молекула переносимого вещества была связана с белком, т. е. стадия 4 отсутствует, то белок будет катализировать только обмен вещества через бислой, поскольку он не может изомеризоваться в «незагруженной» форме.

Для описания работы ионных каналов и различных видов

переносчиков разработано много моделей и схем. Хотя кинетическая теория переходного состояния имеет определенные ограничения, особенно в том, что касается кинетических свойств каналов, ее применение упрощает решение многих сложных задач и позволяет единым образом подходить к рассмотрению различных транспортных механизмов.

АНАЛИЗ СТАЦИОНАРНОГО СОСТОЯНИЯ

Для кинетической характеристики транспортных систем, которые катализируют облегченную диффузию или активный транспорт, могут использоваться различные подходы к анализу стационарного состояния. Все эти подходы основаны на измерении скорости переноса растворимых веществ через мембрану, но при разных условиях. В качестве примера мы рассмотрим эксперименты, которые проводились на пермеазах и мембранных везикулах. Обычно для такого рода измерений используют радиоактивные метки. Ключевым моментом является то, что пермеаза должна не только переносить вещество через бислой, то также и возвращаться обратно. Скорость транспорта может зависеть от любой из этих стадий. Опишем вкратце некоторые подходы к анализу.

Субстрат присутствует только с одной стороны мембраны. Начальная скорость транспорта измеряется для однонаправленного потока. Обратите внимание, что для обеспечения постоянного потока транспортируемого вещества переносчик должен вернуться свободным. Измеряют поток как функцию для процесса, протекающего в любом направлении.

Равновесный обмен. Субстрат присутствует в одинаковой концентрации с обеих сторон мембраны, но радиоактивная метка -- только с одной стороны. В этом случае пермеаза может возвращаться, будучи связанной с немеченым веществом. Измеряют поток как функцию.

Меченый субстрат нахоится с цис-стороны мембраны, а в насыщающей концентрации он присутствует на противоположной стороне. Измеряют поток как функцию ^_uc. Как и в первом случае, при этом регистрируют однонаправленный поток. Такой поток называют также встречным, поскольку меченое вещество переносится против своего химического градиента.

Удельная радиоактивность субстрата с обеих сторон мембраны одинакова. В насыщающей концентрации субстрат находится на транс-стороне, a „_uc изменяется. В этом случае измеряют суммарный перенос, поскольку радиоактивное вещество пересекает мембрану в обоих направлениях. При таких условиях измерения состояние системы близко к равновесному.

Во всех случаях определяют К_тах и Км, которые при этом не обязательно совпадают для разных подходов. Для разных моделей можно получить кинетические уравнения для стационарного состояния и проверить их. Как и в классических работах по энзимо-логии, очень полезным может оказаться использование ингибиторов. При этом ингибиторы можно вводить с любой стороны мембраны, что позволяет получить дополнительную информацию.

Такого рода подходы можно применять при работе с клетками, субклеточными мембранными везикулами или искусственными реконструированными системами. Для исследования работы ионных каналов обычно применяют электрические методы, которые дают огромные преимущества.

Дополнение 8.2. Исследование транспорта в стационарном состоянии с использованием мутантной лактоэопермеазы из Е. coll

Как пример использования описанных выше подходов рассмотрим изучение транспорта в стационарном состоянии, осуществляемого одной из мутантных форм лактоэопермеазы, в которой остаток Glu в положении 325 заменен на Ala. На рис. 8.11 этот остаток находится в спирали 10. При измерениях использовали радиоактивную лактозу, при этом накопление лактозы изучали на интактных клетках, а выведение, встречный поток и обмен лактозы -- на цитоплазматических мембранных везикулах с правильной ориентацией. Пермеаза дикого типа катализирует сим-порт /3-галактозидов и Н⁺. В присутствии протонного электрохимического градиента пермеаза использует свободную энергию, высвобождающуюся при переносе Н ⁺ по градиенту, для накопления /3-галактозидов против концентрационного градиента.

При замене остатка Glu-325 на Ala активный транспорт лактозы прекращается. Для измерения накопления лактозы использовали интактные клетки, в которых пермеаза дикого типа была заменена мутантной пермеазой. Для этого к суспензии дышащих клеток добавляли -лактозу и измеряли количество лактозы, накапливаемой клетками, в зависимости от времени. Приблизительно через 3 мин перенос лактозы достигал максимальной величины, но в клетках с мутантной пермеазой оставался пренебрежимо малым. Для изучения выведения лактозы инкубировали мембранные пузырьки в течение нескольких часов в присутствии высоких концентраций радиоактивной лактозы, а затем аликвоты переносили в среду без лактозы. Быстро фильтровали везикулы, измеряли их радиоактивность с помощью сцин-тиляционного счетчика и определяли скорость потери лактозы везикулами. Время полувыведения для контрольных везикул составляло 10 с, а для пузырьков, содержавших мутантную пермеазу, оно было равно 540 с. Мутантная пермеаза неспособна транспортировать лактозу как в прямом, так и в обратном направлениях.

Совершенно другие результаты были получены, однако, при измерении равновесного обмена. Эти измерения проводят точно так же, как и измерения по выведению лактозы, только нагруженные лактозой везикулы помещают в среду, содержащую немеченую лактозу в такой же концентрации. В этих опытах скорости выведения -лактозы из везикул, содержавших в одном случае пермеазу дикого типа, в другом -- мутантную, были идентичными. Эти эксперименты показывают, что, хотя мутантная пермеаза не может осуществлять полный цикл транспорта лактозы, она способна изо-меризоваться в загруженную форму, что делает возможным трансмембранный обмен лактозы. Сходным образом мутантная пермеаза нормально функционирует в опытах по измерению встречного потока. При таком подходе везикулы нагружают немеченой лактозой, разводят средой, содержащей -лактозу в низкой концентрации, и измеряют поток меченой лактозы внутрь везикул. Этот подход также показал, что связанная с лактозой форма пермеазы нормально изомеризуется и осуществляет трансмембранный обмен лактозы.

Приведенные выше данные позволили сделать вывод о том, что мутантная пермеаза, содержащая А1а-325, не может депротониро-ваться. Таким образом, пермеаза оказывается дефектной по всем сопряженным транспортным процессам, в которых Н⁺ и лактоза переносятся вместе в цикле, требующем наличия депротонирован-ной формы переносчика для изомеризации.

Другие примеры использования такого рода подходов более подробно рассмотрены в отличной книге Штейна.

РЕГИСТРАЦИЯ ТОКА, ПРОТЕКАЮЩЕГО ЧЕРЕЗ ОДИНОЧНЫЙ КАНАЛ: ВСТРАИВАНИЕ В ПЛОСКИЕ МЕМБРАНЫ И МЕТОД ПЭТЧ-КЛАМП

Электрический ток, возникающий при быстром перемещении ионов через канал, можно легко измерить. Например, реконструированный никотиновый ацетилхолиновый рецептор -- химический воротный катионселективный канал в постсинаптических мембранах, открывание и закрывание которого регулируется с помощью химических веществ, -- имеет проводимость в открытом состоянии 45 пСм при концентрации NaCl с одной стороны мембраны 0,5 М. Это -- обычное значение проводимости для ионных каналов. При этом при напряжении на мембране 100 мВ через каждый канал проходит ток 4,5 пА, или 2,7-10⁷ ионов/с. Этот ток легко зарегистрировать с помощью соответствующей электронной аппаратуры. Следовательно, ток через единичный канал можно прямо измерить, если фоновый ток через мембрану достаточно мал. Для того чтобы исследовать свойства индивидуальных канальных молекул, необходимо измерить ток через участок мембраны в условиях, когда одновременно открыто не более одного канала. Для этого можно использовать искусственную систему, когда в плоскую мембрану встроены одиночные канальные белки. Можно также воспользоваться методом пэтч-кламп. В основе метода лежит сделанное в 1979 г. открытие, показавшее, что если чистую стеклянную микропипетку прижать к клеточной мембране и слегка втянуть воздух в пипетку, то на ее конце образуется очень тонкая, но прочная мембранная пленка. Это позволяет получать вольт-амперные характеристики любых каналов, находящихся на этом небольшом участке мембраны. Фоновый ток обычно бывает значительно меньше 1 пА, так что ток через индивидуальный канал можно легко измерить. Применение этой техники произвело настоящую революцию в изучении ионных каналов, позволив детально исследовать работу разнообразных каналов из различных мембран. На рис. 8.3 схематически показаны четыре модификации метода пэтч-кламп. В рамках данного метода можно изменять состав раствора как с одной, так и с обеих сторон мембраны, можно измерять проводимость единичных каналов, изучать энзимологию единичных молекул. Все это делает метод пэтч-кламп необычайно мощным.

Чтобы оценить возможности данного подхода, рассмотрим запись работы единичного ацетилхолинового рецепторного канала, встроенного в бислой. Ворота индивидуальных каналов могут спонтанно открываться и закрываться. Каждое отклонение записи вниз соответствует открыванию канала. Ток, текущий через открытый канал, можно измерить, а это дает возможность определить проводимость единичного канала. Время, в течение которого каждый канал остается открытым, также легко измерить. Получаемое при этом распределение времени жизни канала в открытом состоянии прямо связано с константой скорости закрывания канала. Для самой простой модели, когда имеется одно открытое и одно закрытое состояние,

распределение времени жизни канала описывается экспоненциальной функцией с характерным временем т, равным величине, обратной константе скорости первого порядка для закрывания канала. Когда функция распределения времени жизни канала в открытом состоянии отличается от простой экспоненциальной зависимости, как в случае ацетилхолинового рецептора, для объяснения экспериментальных данных необходимо использовать более сложные состояния. Можно изучать влияние на работу канала различных химических агентов; при этом необходимо отличать влияние этих агентов на кинетические параметры открывания-закрывания каналов от их влияния на проводимость одиночных каналов.

Дополнение 8.3. Определение константы связывания ингибитора по данным о проводимости единичного канала

Рассмотрим использование данных о проводимости единичного канала на примере исследования взаимодействия харибдотоксина с Са^{2 +}-активируемым К ⁺-специфичным каналом. Харибдоток-син, небольшой пептид, выделенный из скорпионов, является эффективным ингибитором этого канала. Биохимические характеристики канала не изучены, однако его работу интенсивно исследовали, используя технику регистрации тока через одиночные каналы. Для этого вначале готовили мембранные везикулы из поперечных волокон скелетных мышц крысы и проводили их слияние с плоским липидным бислоем. На рис. 8.5 приведены записи электрического тока через единичный канал, быстро переходящий из открытого состояния в закрытое. Если эти данные представить в милли-секундном масштабе, то можно будет увидеть отдельные акты срабатывания канала, как это показано на рис. 8.4.

При добавлении харибдотоксина в работе канала появляются длительные периоды, в течение которых он остается в непроводящем состоянии. Очевидно, связывание токсина каким-то образом блокирует канал. Частота появления этих «мертвых» периодов позволяет определить скорость связывания харибдотоксина с каналом; время, в течение которого каналы остаются закрытыми, зависит от константы скорости диссоциации комплекса канал--токсин.

Среднее время жизни канала в активном состоянии т\ обратно пропорционально скорости связывания токсина, а время жизни его в закрытом состоянии т - i -- скорости диссоциации:

Данные, представленные на рис. 8.5, показывают, что скорость блокирования канала зависит от концентрации токсина, а скорость диссоциации не зависит от концентрации свободного токсина.

Из этих данных легко получить как А:_дисс, так и к_связ для токсина; их отношение дает константу диссоциации. Замечательно, что получаемые параметры -- как кинетические, так и

термодинамические -- относятся к событиям, происходящим с индивидуальной молекулой.

НЕБОЛЬШИЕ МОЛЕКУЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В КАЧЕСТВЕ МОДЕЛЕЙ КАНАЛОВ И ПОР

Кинетические методы используются для анализа работы различных каналов и переносчиков, обнаруживаемых в биомембранах. Расшифрована аминокислотная последовательность многих из этих белков. Однако, до сих пор не удалось провести рентгенострук-турные исследования с высоким разрешением ни для одного из этих транспортных белков, поэтому при изучении структуры и механизмов работы каналов приходится прибегать к модельным построениям. Большие возможности дает использование малых молекул, способных образовывать поры в бислое. Особенно интересны в этом отношении три соединения: 1) нистатин -- полиеновый антибиотик, который образует комплекс с холестеролом; 2) грамидицин А -- пептид, который образует катионселективный канал, наиболее полно охарактеризованный из всех изученных к настоящему времени каналов; 3) аламетицин -- пептид, который образует регулируемый напряжением воротный канал.

Нистатин и амфотерицин В

Структурные формулы этих сходных полиенов приведены на рис. 8.6. Когда к содержащим стерол плоским мембранам с одной стороны от них добавляют нистатин, происходит увеличение мембранной проницаемости для воды, одновалентных ионов и небольших неэлектролитов. Неэлектролиты, ббльшие, чем глюкоза, пройти через канал не могут. Это говорит о том, что диаметр поры составляет около 8 А. На рис. 8.6 представлена модель канала, согласно которой от 8 до 10 молекул полнена образуют цилиндрическую структуру, в которой гидроксилированные сегменты каждой молекулы обращены внутрь, образуя заполненную водой пору. Наружная поверхность такой структуры неполярна, при этом между каждой парой молекул нистатина имеется пространство для молекулы стерола. Проводимость канала относительно низка, 5 пСм в 2 М КС1. Когда нистатин добавляют к плоской мембране с обеих сторон, две такие цилиндрические структуры, по-видимому, объединяются, образуя в два раза более длинный канал.

Необходимо отметить, что эта порообразующая молекула является амфифильной, поскольку обладает полярным и неполярным

участками. Полярная часть образуется из последовательно расположенных гидроксильных и карбонильных групп. Порообразующий комплекс, по-видимому, стабилен внутри бислоя. Обе эти структурные особенности характерны для большинства каналообразующих белков. Отметим, однако, что структура нистатиновой поры является гипотетической, хотя построена она на вполне разумных положениях и согласуется с экспериментальными данными.

Грамицидин А

Канал, образуемый грамицидином А -- гидрофобным пептидом из чередующихся L- и D-аминокислот, -- охарактеризован к настоящему времени наиболее полно. Исходя из имеющихся экспериментальных данных, была построена модель канала. Согласно модели, канал образован двумя молекулами грамицидина А, расположенными голова к голове в /3-спиральной конфигурации. В результате чередования L- и D-аминокислот образуется спираль, в которой все боковые цепи располагаются снаружи, а карбонильные группы остова -- внутри канала. Этот тип спирали не встречается больше ни в каких белках и образуется из-за необычного чередования стереоизомеров аминокислот в грамицидине А. С этой точки зрения грамицидин А является плохой структурной моделью формируемых белками трансмембраниых пор. Однако во многих других отношениях канал, образуемый грамицидином А, имеет много общих черт с другими каналами и порами. Отметим следующие его особенности.

Грамицидин А чрезвычайно гидрофобен, он не содержит ни одной полярной аминокислоты.

Проводимость единичного канала, образуемого грамицидином, довольно велика. Например, в 100 мМ RbCl катионная проводимость составляет 30 пСм на канал. Впрочем, это гораздо ниже теоретической предельной величины для поры этого размера, если перенос вещества через пору лимитируется только диффузией.

Грамицидиновый канал является катионселективным. Небольшие неорганические и органические катионы проходят через него, в то же время проницаемость по CI ~ равна нулю. Хотя этот анион достаточно мал, чтобы легко пройти через пору такого диаметра, он не транспортируется через грамицидиновый канал и не блокирует его. Этот факт весьма примечателен, если принять во внимание, что в грамицидине нет полярных или заряженных аминокислот. Такая селективность объясняется электростатическим отталкиванием анионов и диполей, образуемых карбонильными группами в воротах канала.

Проницаемость канала для одновалентных катионов изменяется в следующем порядке: Cs ⁺ > Rb ⁺ > К ⁺ > Na ⁺ > Li⁺; такая же последовательность сохраняется и для свободной диффузии этих ионов в воде. Селективность, проявляемая каналом в отношении данных одновалентных катионов, невелика, она соответствует всего пятикратному изменению коэффициентов проницаемости. Энергия активации проводимости мала, около 5 ккал/моль. В этом смысле канал функционирует так, как будто он заполнен водой. Возможности свободной диффузии катионов в растворе в значительной степени зависят от электростатических взаимодействий с водой. Небольшие ионы взаимодействуют с молекулами воды сильнее, чем крупные, и электростатическая поляризация вызывает замедление диффузии. Такого же рода силы, по всей вероятности, влияют и на лимитирующие стадии, когда катионы проходят через длинный узкий грамицидиновый канал.

Молекулы могут проходить через канал только поодиночке, поскольку его диаметр составляет всего 4 А. Следовательно, транспортируемый ион в момент вхождения в канал должен частично дегидратироваться. 'Помимо переносимого катиона в канале могут находиться от пяти до семи молекул воды, и ион будет контактировать с двумя из них, находящимися спереди и сзади от него. В канале должны присутствовать также группы, с которыми будет взаимодействовать транспортируемый ион вместо утраченных при дегидратации молекул воды. Дегидратация требует больших затрат энергии, поэтому скорее всего именно эта стадия будет лимитирующей.

Транспорт ионов через канал, образуемый грамицидином А, характеризуется при достаточно высоких концентрациях соли кинетикой с насыщением. Это указывает на то, что в канале имеется определенное число мест связывания катионов. Например, полунасыщающая концентрация для Na⁺-проводимости составляет 0,31 М. Кинетические модели переноса предполагают наличие двух мест связывания, по одному у каждого входа в канал. Связывание катиона осуществляется в результате его взаимодействия с диполями, в частности с карбонильной группой остатка 11.

Вода проходит через канал со скоростью около Ю⁸ молекул в 1 с при низкой ионной силе. Перемещение катиона под влиянием электрического поля сопровождается переносом 5--7 молекул воды, находящихся в канале, что создает электроосмотические эффекты.

Открывание и закрывание грамицидинового канала происходит соответственно в результате ассоциации мономеров, образующих димер, и диссоциации димера. Время жизни димера составляет порядка 10 мс--10 с и зависит от липидного состава мембраны и других факторов.

Когда грамицидин А находится в отрицательно заряженном липидном бислое, под влиянием поверхностных зарядов может произойти увеличение локальной концентрации катиона у входа в гра-мицидиновую пору. Это значительно увеличит проводимость канала при низких концентрациях соли.

Все сказанное выше ясно показывает, почему грамицидин А является столь важной экспериментальной моделью. Многие из его свойств аналогичны свойствам, проявляемым физиологически важными каналами, такими, как ацетилхолиновый рецептор.

Аламетицин

Аламетицин -- это один из представителей группы природных пептидов, которые образуют потенциалзависимые каналы и потому представляют собой хорошую модель для изучения регуляции работы канала с помощью трансмембранного потенциала. Молекула аламетицина состоит из 20 аминокислот, в частности, она содержит остатки а-аминоизобутирата. Основной структурной особенностью аламетицина и его гомологов является их способность образовывать а-спирали. В отличие от j3-cnnpa-ли, образуемой грамицидином А, пространство внутри а-спирали слишком мало, чтобы через него мог пройти ион. Экспериментальные данные скорее свидетельствуют о том, что до 12 молекул ала-метицина агрегируют и образуют пору. Когда аламетицин находится в такой конфигурации, полярные атомы оказываются внутри структуры. Отметим, что для обеспечения полярности наполненного водой канала не требуется присутствия боковых групп полярных аминокислот.

При низком напряжении плоская мембрана, содержащая аламетицин, не проводит электрический ток. По мере увеличения напряжения до некоего критического значения аламетициновые каналы начинают проводить ток. Напряжение на мембране может быть любого знака. Проводимость единичного канала очень высока: она составляет 5000 пСм в 1 М КС1 и свидетельствует о том, что размер пор очень велик. Если предположить, что канал образуется 12 агрегированными мономерами аламетицина, то его диаметр должен быть равен 20 А, что соответствует высокой проводимости единичного канала.

Для объяснения возможного механизма регуляции работы ала-метицинового канала путем изменения напряжения на мембране разработано несколько моделей. Все они предполагают, что диполи в а-спирали, образуемые пептидными группами, суммируются и создают общий диполь, такой, что положительный заряд локализуется на N-конце молекулы, а отрицательный -- на С-конце. Трансмембранный потенциал достаточно велик, чтобы при взаимодействии с этим постоянным диполем могло произойти изменение ориентации спирального пептида в мембране или увеличилась эффективность его включения в мембрану.

Рассмотрим простейшую модель, описывающую открывание канала при наложении поля. Согласно этой модели, под действием электрического поля увеличивается число встраиваемых в мембрану молекул аламетицина, в результате чего мономеры начинают агрегировать с образованием цилиндрического канала, причем процесс характеризуется высокой степенью кооперативности. Однако существует и другая точка зрения, согласно которой аламетицин находится в связанной с мембраной непроводящей форме уже в отсутствие напряжения и при наложении электрического поля только агрегирует с образованием канала в открытой конформации. Электрическое поле в рамках этих моделей вызывает дипольный флип-флоп-переход а-спирального пептида, стабилизируя агрегат, в котором а-спирали параллельны друг другу.

Аламетицин представляет собой хорошую модель, позволяющую объяснить процесс образования поры при ассоциации а-спира-лей; он также дает возможность продемонстрировать на простой системе, как трансмембранный потенциал стабилизирует определенные белковые конформации и тем самым оказывает существенное влияние на проводимость канала. Такими свойствами обладают не только пептиды типа аламетицина. В качестве примера можно привести синтетические пептиды и мелиттин.

Несколько примеров пор и каналов

В последнее время достигнуты большие успехи в определении строения пор и каналов на молекулярном уровне. Выявляются некоторые общие структурные элементы этих образований. Анализ аминокислотных последовательностей соответствующих молекул указывает на существование структурно родственных групп ионных каналов. Особенно ценным в этих исследованиях оказался метод реконструкции изображения; с его помощью удалось не только визуализовать отверстия в мембране, создаваемые большими порами, но и выявить симметричную организацию субъединиц вокруг центрального отверстия. Общим структурным мотивом для этих белков может быть цилиндрический канал, формируемый несколькими амфифильиыми а-спиралями разных субъединиц или отдельными доменами одной субъединицы. Впрочем, структура аламетицина и грамицидина А свидетельствует о том, что боковые цепи полярных аминокислот не нужны для формирования полярной внутренней структуры заполненного водой канала. Ни в одном из случаев не доказано достоверно, что кислые остатки непосредственно участвуют в образовании поры. Важным исключением из а-спирального семейства каналов являются пори-яы, поскольку они формируют поры из /3-слоев, а не с помощью а-спиралей.

ЩЕЛЕВЫЕ КОНТАКТЫ

Щелевые контакты -- это кластеры мембранных каналов, которые соединяют содержимое соседних клеток в тканях. Через такие каналы проходят небольшие молекулы -- метаболиты и неорганические ионы. Диаметр каналов в клетках млекопитающих составляет от 12 до 20 А. Через иих осуществляется перенос из клетки в клетку ионов и химических веществ. Таким образом, эти каналы соединяют две плазматические мембраны. Опыты по клонированию и биохимической реконструкции показали, что канал образован олигомером единственного пептида, мол. масса которого для клеток печени составляет 32000. Исходя из данных об аминокислотной последовательности, можно предположить, что в каждой субъединице имеются четыре трансмембранные а-спирали. К настоящему времени охарактеризованы белки щелевых контактов из нескольких тканей; по-видимому, они образуют обширную группу родственных белков. Эти каналы обычно находятся в открытом состоянии, но закрываются, когда понижается скорость метаболизма. Первичным сигналом для закрывания канала является, по всей вероятности, повышение концентрации Са^{2 +}, хотя при изменении трансмембранного потенциала или закислении среды также наблюдается закрывание канала. Возможно, эффект Са²⁺ является опосредованным. Другим способом регуляции работы канала может быть фосфорилирование.

Основная модель, описывающая строение и возможный механизм работы канала, представлена в работе. Для выяснения структуры канала авторы использовали электронную микроскопию. Каждый канал состоит из 12 субъединиц, по шесть от каждой клетки. Канал представляет собой гексамерную структуру с центральной порой. Каждая субъединица имеет форму стержня, пронизывающего бислой. Два гексамерных комплекса соседних мембран соединены конец к концу и образуют протяженный канал, объединяющий обе мембраны. Структура канала щелевого контакта зависит от наличия ионов Са^{2 +}. В присутствии Са^{2 +} субъединицы расположены параллельно центральной оси канала, а в отсутствие этих ионов они несколько наклонены. Это наводит на мысль, что открывание и закрывание канала происходит аналогично работе ирисовой диафрагмы фотоаппарата; субъединицы скользят друг относительно друга в ответ на сигнал к открыванию или закрыванию. Однако точный механизм этого процесса далеко не ясен.

ЯДЕРНЫЕ ПОРОВЫЕ КОМПЛЕКСЫ