Параметры функционирования митоКАТФ у животных с различной устойчивостью к гипоксии, а также у крыс, адаптированных к кислородному голоданию

Исследование параметров митоКАТФ у крыс с различной устойчивостью к гипоксии. Гомология структуры исследуемого белка. Получение поликлональных антител на белок-канал с м.м. 55 кДа. Ингибиторный анализ АТФ-чувствительного транспорта калия в нативных МХ.

Рубрика Биология и естествознание
Вид дипломная работа
Язык русский
Дата добавления 12.02.2011
Размер файла 4,7 M

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Осаждение МХ проводили общепринятым методом дифференциального центрифугирования с модификациями, разработанными в нашей лаборатории (Миронова и др., 1981). К полученному осадку добавляли среду выделения в 0,1-кратном объеме к исходной массе ткани и гомогенизировали. Полученная суспензия МХ, использовавшаяся в дальнейшей работе, содержала 80-100 мг белка/мл.

Концентрацию белка в МХ определяли по методу Лоури [Лоури, 1951], используя бычий сывороточный альбумин (БСА) в качестве стандарта.

В работе использовали самцов крыс линии Вистар, массой ~250г. Предварительные процедуры как в п.п. 1.1. После определения массы сердца, ткань измельчали в растворе, содержащем 300 мМ сахарозы, 10 мМ Hepes, 2 мМ ЭГТА и 10% протеазы в течение 10 минут. Измельченную ткань гомогенизировали стеклянным гомогенизатором с тефлоновым пестиком в 8-кратном объеме среды выделения, отнесенном к исходной массе ткани. Среда выделения содержала 300 мМ сахарозы, 10 мМ Hepes, 2 мМ ЭГТА, 0.1 % бычьего сывороточного альбумина (БСА) (pH 7.4).

МХ осаждали дифференциальным центрифугированием [Миронова и др., 1981]. К полученному осадку добавляли среду выделения в 0,1-кратном объеме к исходной массе ткани и гомогенизировали. Полученная суспензия МХ содержала 30-50 мг белка/мл.

Концентрацию белка в МХ определяли методом Лоури [Лоури, 1951].

2.3.2 Выделение и очистка митоКАТФ канала

Солюблизацию КАТФ канала из МХ печени крысы проводили по методу этанольной экстракции, разработанному в нашей лаборатории [Миронова и др., 1981] с некоторыми модификациями. Полученные МХ помещали на 20 мин в гипотонический раствор (концентрация белка составляла 3-4 мг/мл), содержащий 10 мМ Трис-HCl (pH 7,5) при 4 С. Затем экстракт центрифугировали 20 мин при 5500 об/мин. Из полученного осадка митопластов экстрагировали белок. Для этого митопласты разводили 10 мМ Tрис-HCl буфером (рН-7,4) до концентрации 44 мг/мл. К суспензии добавляли 10-кратный водный раствор 66% этанола, охлажденный до -20?С, и инкубировали при 4?С в течение 30 минут при постоянном перемешивании. Полученный экстракт центрифугировали при 5500 об/мин в течение 15 минут. Супернатант диализовали против 5 мМ Трис-HCl буфера (рН 7,4) с добавлением 0,05% в-меркаптоэтанола в течение ночи при 4?С при постоянном перемешивании с одной сменой буфера через 2 часа от начала диализа. Фракцию центрифугировали при 100000 g в ечение 1 часа.

Далее проводили ионообменную хроматографическую очистку полученного экстракта. Носитель - ДЕАЕ-целлюлоза (Sigma), объем колонки - 1 см3, диаметр - 0.5 см, h = 5 см. Скорость колонки - 40 мл/ч. Колонка уравновешивалась буфером, содержавшим 50 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА (рН 7,5). Этим же буфером далее элюировали несвязавшиеся с носителем белки. Связавшиеся белки элюировали двумя объемами ступенчатого градиента KCl (50, 100, 150, 200, 250, 300, 500 мМ KCl). После фракционирования белки каждой фракции идентифицировали методом SDS-PAAG электрофореза (10%). Гели окрашивали Кумасси-R250. Исследуемый белок с м.м. 55 кДа элюировался 250 мМ KCl.

Глава 3. Изучение энергозависимого входа К+ в МХ методом спектрофотометрии

В исследованиях использовались МХ сердца и печени крыс линии Вистар (масса животных 250г.). Вход ионов калия определяли по скорости набухания МХ в гипотонической среде с KCl. Кинетику набухания регистрировали по изменению оптической плотности суспензии МХ при длине волны 520 нм при постоянном перемешивании и термостатировании при 26С на спектрофотометре “Uvikon” (Италия). Концентрация МХ белка в ячейке составляла 0.1 мг/мл. Среда инкубации содержала: 50 мМ KCl, 5 мМ HEPES, 5 мМ NaH2PO4, 5мМ янтарной кислоты, 0.5 мМ MgCl2, 0.1 мМ ЭГТА, 5 мкМ цитохрома С, 2 мкM ротенона, 1 мкМ циклоспорина А, рН 7.2. Набухание инициировали добавлением МХ. Скорость набухания рассчитывалась по изменению светорассеяния за единицу времени.

3.1 Изучение ДНФ-индуцированного выхода ионов калия из МХ

Проницаемость митохондриальной мембраны оценивали с помощью К+-селективного электрода по содержанию и скорости выхода катиона из деэнергизованных МХ в присутствии разобщителя окислительного фосфорилирования 2,4-динитрофенола (ДНФ). Кинетику выхода калия регистрировали с помощью оригинального электрометрического усилителя, который через контроллер L-153 был соединен с компьютером IBM PC486. Измерения проводились при постоянном перемешивании и термостатировании при 26С. Концентрация МХ белка в ячейке составляла 1,5-2 мг/мл. Среда инкубации содержала: 0,3 М сахарозы, 3 мМ NaH2PO4, 10 мМ Трис-HCl, pH 7,4.

3.2 Получение и очистка антител к белку с молекулярной массой 55 кДа.

3.2.1 Подготовка белка с м.м. 55 кДа: выделение и очистка

Выделение и первичная очистка белка проводились методами, описанными в п.п. 2. Белок хранили при температуре -20С. Фракции, содержавшие белок с м.м. 55 кДа и обладавшие АТФ-ингибируемой К+-селективной активностью, накапливали, затем диализовали против 10 мМ Трис-HCl (рН 7.4) в течение ночи при постоянном перемешивании и температуре 4С. Обессоленную фракцию концентрировали обратным диализом с использованием полиэтиленгликоля-20000 (ПЭГ) при 4С. Сконцентрированную фракцию подвергали дополнительной очистке методом нативного электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). Для электрофореза использовали 10%-ый ПААГ в системе Дэвиса [Davies, 1964]. На геле наблюдалась только одна полоса - белковая зона, в которой определялась АТФ-зависимая К+-транспортирующая активность. Полосу исследуемого белка вырезали из геля, измельчали и элюировали в течение 12 часов при постоянной силе тока (8 мА) и температуре 4С. Среда элюции содержала 10 мМ Трис-HCl, 38 мМ глицина, рН 8.3. Концентрацию белка в элюате определяли методом Лоури [Лоури, 1951]. Чистоту белка контролировали методом SDS-PAAG электрофореза [Laemmli, 1970]. Выход белка составлял около 30-50 мкг из 100 г ткани печени.

К+-транспортирующие свойства выделенного белка и чувствительность к аденозин-5'-трифосфату оценивали при встраивании его в бислойную липидную мембрану.

3.3 Иммунизация и анализ препарата антител

Для получения антисыворотки проводили иммунизацию животных электрофоретически чистым АТФ-ингибируемым К+-транспортирующим белком с м.м. 55 кДа (канальная субъединица митоКАТФ), выделенным из печени крысы. В качестве доноров иммунной сыворотки использовали кроликов массой 2.4-2.6 кг.

Схема процедуры была подобрана в соответствии с требованиями Декларации совета Европейского Союза 86/609/EEC.

За неделю до иммунизации животных дела проводили забор крови из ушной вены; сыворотка в дальнейшем использовали в качестве контроля.

Антиген, смешанный с неполным адъювантом Фрейнда (60-100 мкг белка с м.м. 55 кДа растворяли в 300 мкл 0.9 % NaCl и тщательно смешивали с 600 мкл неполного адъюванта Фрейнда) вводили животным подкожно в область лопаток. Гомогенность полученной смеси определяли визуально. Антиген вводили в 10 последовательных инъекций по 100 мкл на небольшом расстоянии друг от друга, чтобы минимизировать болевые ощущения. Через 3 и 6 недель проводили повторные иммунизации по той же схеме, однако для повторных инъекций использовали полный адъювант Фрейнда. Через 7-10 дней после последней инъекции брали кровь из ушной вены (40-50 мл), выдерживали 30 минут в открытом сосуде при комнатной температуре и оставляли на ночь при 4С. Образовавшийся тромб удаляли центрифугированием (2000 об/мин), а обогащенную антителами сыворотку хранили в замороженном виде при температуре -20С.

3.3.1 Детекция специфических антител и определение титра

Для определения титра полученных антител использовали белок с м.м. 55 кДа, полученный по схеме, описанной в п.п. 5.1.1. Белок в 10 мМ Трис-HCl, рН 7.4, в концентрации 1-2 мкг/мкл сорбировали на полосы нитроцеллюлозной мембраны, в количестве равном числу разведений первичных антител, подсушивали. Затем полоски нитроцеллюлозы инкубировали в ПБС-Твин буфере (0.15 М NaCl, 0.02 М NaH2PO4 12 Н2О, рН 7.4, 0.1% Твин-20) в течение 30 минут при комнатной температуре. После этого мембраны в течение часа инкубировали с ПБС-Твин-молоко буфером (ПБС-Твин 20 + 2% сухого молока (Amersham, Германия)) чтобы заблокировать участки, неспецифичного связывания с белком.

Буфер для блокирования удаляли и мембраны последовательно инкубировали сначала с первичными специфическими кроличьими антикрысиными антителами, а затем с вторичными антителами (козьи антикроличьи, Sigma), по 1 часу, отмывая мембрану ПБС-Твин-молоко буфере (смена буфера 4-5 раз в течение часа). При этом делали несколько разведений антисыворотки (1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200, 1:6400, 1:12800, 1:25600, 1:51200) в ПБС-Твин-молоко буфере. Каждую полоску нитроцеллюлозной мембраны с белком помещали в отдельную емкость и инкубировали с антителами определенного разведения. Разведение вторичных антител - 1:500.

Перед окрашиванием полосы мембран тщательно отмывали в ПБС-Твин буфере (4-5 смен буфера в течение 30-40 минут). Окрашивание проводили пероксидазной реакцией в присутствии 0.02% перекиси водорода. Буфер для окрашивания содержал 50 мМ Трис-HCl, рН 7.5. Через 2-5 минут реакцию останавливали, промывая мембрану дистиллированной водой. Затем мембрану высушивали и хранили в темноте.

3.3.2 Вестерн-Блот анализ

Данный метод, впервые описанный Товбином и соавторами [Towbin et al., 1979] использовали для идентификации АТФ-зависимого К+-транспортирующего белка с м.м. 55 кДа в различных тканях животных.

На первом этапе проводили фракционирование МХ с помощью SDS-PAAG электрофореза [Laemmli, 1979]. Нагрузка составляла 5 мкг суммарного белка. Электрофорез вели при комнатной температуре и постоянном токе (20-30 мА на пластину) в течение 3-4 часов до достижения бромфеноловым синим нижнего фронта геля.

После электрофореза половину геля окрашивали Кумасси R-250 или серебрением [Shevchenko et al., 1996], а вторую половину уравновешивали в буфере для блоттинга (150 мМ глицина, 20 мМ Триса, 0.02 % ДСН, 20 % метанол, рН 8.3) в течение 30 минут на качалке при комнатной температуре. Затем гель покрывали нитроцеллюлозной мембраной (Sigma, диаметр пор 0.45 мкм) и помещали между листами влажной фильтровальной бумаги. Систему помещали между двумя пористыми прокладками и зажимали между двумя пластинами из плексигласа. Перенос вели при напряженности 7 В/см2 в течение двух часов при комнатной температуре. После окончания переноса нитроцеллозную мембрану инкубировали в течение 30 минут в ПБС-Твин буфере при комнатной температуре. Дальнейшая процедура такая же, как в п.п. 5.2.1.

3.4 Исследование ДНФ-индуцированного выхода К+ из митохондрий с помощью К+-селективного электрода

Функционирование КАТФ-канала в митохондриях оценивали также по инициированной 2,4-динитрофенолом (ДНФ) скорости АТФ- зависимого выхода калия из митохондрий, т.е. создавали условия для работы канала в обратном направлении (Баранова и др, 2000). В среде без субстрата дыхания и калия регистрировали выход калия из митохондрий после добавления разобщителя окислительного фосфорилирования. Выход К+ из митохондрий индуцировали добавлением 50 мкМ 2,4-динитрофенола. Кинетику выхода калия регистрировали с помощью оригинального электрометрического усилителя, который через контроллер L-153 был соединен с компьютером. Измерения производились при постоянном перемешивании. Концентрация митохондриального белка в ячейке составляла 1-1,5 мг/мл. Среда инкубации митохондрий содержала: 170 мМ сахароза, 80 мМ D-маннит, 5 мМ Na2HPO4, 10 мМ Трис-НCl (рН 7.4).

3.5 Реконструкция белка в БЛМ

Для реконструкции белка использовали БЛМ, сформированные из смеси 90 % общих липидов мозга быка и 10 % кардиолипина. Плоские бислои формировали методом Мюллера из липидов, растворенных в н-декане (Mueller et al, 1964). Суммарная концентрация липидов в н-декане равна 20 мг/мл. Трансмембранный ток регистрировали при постоянном напряжении на мембране. Проводимость немодифицированной мембраны составляла 1-3 пСм. Раствор белка вводили в буфер, омывающий одну из сторон мембраны. Буфер содержал: 20 мм Tris, 100 мМ KCl (рН 7,4). Регистрацию тока через ионные каналы в мембране проводили при помощи операционного усилителя с высокоомным сопротивлением в цепи обратной связи. Выход усилителя был подключен к компьютеру. Эксперименты проводились при 20-22єС.

3.6 Иммунноэлектронная микроскопия

Ткань печени и сердца фиксировали в 4%-ном растворе параформальдегид/0.05% глутаровый альдегид в PBS - буфере (16.7 мМ Na2HPO4· 12 H2O, 3.3 мМ KH2PO4, 150 мМ NaCl, рН 7,4) в течение 4 ч при 4°С. Обезвоживание в спиртах и пропитку образца смолой LR-White (Sigma, USA) проводили при 4°С. Полимеризацию смолы осуществляли под ультрафиолетом в течение 48 часов при комнатной температуре. Ультратонкие срезы готовили на ультратоме UC6 (Leica, Германия) и помещали на золотые сеточки, покрытые формваровой пленкой и укрепленные углем (Agar). Неспецифическое окрашивание блокировали обработкой раствором, содержащим 3% БСА и 0.5% желатина в течение 1ч. Все дальнейшие процедуры проводили в PBS содержащем 1% БСА и 0.01% тритон Х-100. После каждой инкубации образцы отмывали PBS- буфером, содержащим 0.1% тритон Х-100 и 0.1% глицин и затем в растворе БСА и желатина в течение 20 мин [18]. В качестве первичных антител были использованы полученные нами антитела к митохондриальному К+-транспортирующему белку (в разведении 1:100), инкубацию с которыми проводили в течение ночи при 4°С. После тщательной отмывки сеточки с образцами помещали на каплю вторичных антител, меченных коллоидным золотом с размером гранул 10 нм (Anti-Rabbit IgG, Sigma, USA) и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. После отмывки образцы окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали под электронным микроскопом Tesla BS-500 (Чехословакия). Специфичность метода проверяли заменой первичных антител на буфер.

3.7 MS-MALDI-TOF/TOF- анализ

MS-MALDI-TOF/TOF- анализ был выполнен на базе ГУ НИИ биомедицинской химии РАМН им. В.Н. Ореховича. Очищенный митохондриальный К+-транспортирующий белок подвергали ферментативному гидролизу трипсином в денатурирующих условиях в геле. Пептидную смесь из геля экстрагировали ацетонитрил/гидрокарбонат аммонием и затем проводили масс-спектральный анализ на времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex (Bruker, Daltonik) в режиме моноизотопической детекции 300-1800 Да. Масс-спектры анализировались через базу данных MSDC и NCBI программой Mascot (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

3.8 Очистка антител к АТФ-зависимому белку с м.м. 55 кДа

Для выделения из антисыворотки, содержащей специфические антитела, фракции иммуноглобулинов, использовали методы дробного высаливания, хроматографии и диализа [Антитела. Методы. Изд-во «Мир», 1991, т.1, с.106-107].

Антисыворотку перед высаливанием разводили в 2 раза раствором 0.9% NaCl (рН 7.5). К полученному объему антисыворотки добавляли половинный объем холодного насыщенного раствора сульфата аммония при перемешивании на ледяной бане. Смесь оставляли на 30 минут и затем центрифугировали 20 минут при 5000 g. Осадок растворяли в 0.9% NaCl (рН 7.5). Эту процедуру повторяли 2 раза. Окончательно осадок растворяли в 0.01 М натрий-фосфатном буфере (рН 7.5), содержащем 0.15 М NaCl и диализовали против этого же буфера в течение 18 часов при 4С. Нерастворившийся осадок удаляли центрифугированием (20000 g, 10 минут).

Надосадочную фракцию наносили на колонку (объем 5 см3, диаметр - 1 см, h = 5 см), заполненную ДЭАЭ-целлюлозой (Sigma) и уравновешенную 0.01 М Na-фосфатным буфером (рН 7.5). Элюирование иммунноглобулинов G (IgG) проводили двойным объемом ступенчатого градиента NaCl: 50, 100, 150, 200 мМ. IgG элюировались 50 мМ NaCl. Фракции, содержащие IgG, объединяли и концентрировали с помощью ПЭГ-20000. Полученную фракцию диализовали против 10 мМ Трис-HCl (рН 7.5) в течение ночи при 4С. Контроль чистоты фракции IgG осуществляли с помощью SDS-PAAG электрофореза [Laemmli, 1979].

3.9 Очистка антител к АТФ-зависимому белку с м.м. 55 кДа на колонке с иммобилизованным Белком А

Перед очисткой иммуноглобулинов в имеющейся сыворотке измеряли концентрацию белка на спектрофотометре Shimadzu UV-2401 РС (Япония) при длине волны 280 нм. Сыворотку разводили 0.1М Na-фосфатным буфером, pH 7.0 до концентрации белка ~2 мг/мл. Разведенную сыворотку, из расчета 20 мг общего белка, наносили на колонку объемом 1 мл, упакованную конъюгированной с белком A (Amersham, Sigma, USA). После нанесения сыворотки колонку промывали тем же буфером до полного отсутствия белка в элюате. Наличие белка в элюате регистрировали при помощи Uvicord S-II LKB (Швеция).

IgG элюировали с колонки 0.1М Na-цитратным буфером, pH 3.0. Элюат немедленно титровали 1М Трис-HCl, pH 9.0 до pH 7.0. Затем колонку отмывали 0.1 М Na-фосфатным буфером до pH 7.0.

Концентрацию белка в элюате измеряли на спектрофотометре Shimadzu UV-2401 РС (Япония) при длине волны 280 нм. Чистота IgG проверялась при помощи денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле по методу Лэммли [16]. Очищенные IgG разводили глицерином в соотношении 1:1 и хранили при температуре -20єС.

3.10 Ингибиторный анализ с использованием антител к белку

с м.м. 55 кДа

Анализ влияния специфических к белку с м.м. 55 кДа антител на параметры функционирования митоКАТФ канала проводили, во-первых, с использованием К+-селективного электрода, определяя скорость ДНФ-индуцированного выхода К+ из МХ и концентрацию ионов К+ в матриксе МХ (см. п.п. 3.2.). Во-вторых, с помощью определения энергозависимого входа К+ в МХ методом спектрофотометрии (см. п.п. 3.1.). При проведении ингибиторного анализа в качестве контроля использовалась преимунная сыворотка, а также сыворотка, содержащая специфические антитела на белок с м.м. 55 кДа, подвергнутая предварительно 5-тиминутному кипячению. Также определялось влияние антител на процесс дыхания МХ.

Глава 4. Выделение комплекса цитоплазматических мембран и микросом печени крыс

Для выделения комплекса цитоплазматических мембран и микросом печени использовали самцов крыс альбиносов линии Вистар, массой ~250г. Крыс умерщвляли декапитацией без наркоза. Печень извлекали и помещали в предварительно взвешенную среду выделения (t 0С). После определения массы и проведения перфузии 0.9% NaCl, печень продавливали через пресс и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в 8-кратном объеме среды выделения, отнесенном к исходному весу ткани.

Сначала осаждали МХ дифференциальным центрифугированием, супернатант центрифугировали на 105000 g 1 час, получившийся осадок наносили на градиент (20, 25, 30, 35% сахароза) крутили 105000g 1 час.

Происходило разделение образца на две четкие зоны, 25-30% микросомы, 20% мембраны.

4.1 Метод отбора высоко- и низкоустойчивых животных

Схема, по которой животные тестировались на устойчивость к гипоксии, была разработана проф. Лукьяновой [Лукьянова и др., 1999; Лукьянова, Коробков, 1981]. В работе использовались самцы крыс линии Вистар массой 250-300 г., которых помещали в барокамеру. Группа высокоустойчивых (ВУ) - животные, которые выдерживали острую гипобарическую гипоксию, соответствующую подъему на высоту 11500 м, в течение 10-15 мин. Группа низкоустойчивых (НУ) животных выдерживала эту высоту только в течение 1-1.5 мин.

Глава 5. Результаты и обсуждения

5.1 Параметры функционирования митоКАТФ канала у крыс с различной резистентностью, а также у животных, адаптированных к гипоксии

В этом разделе работы исследовались такие показатели, как дыхание МХ, скорость АТФ-зависимого К+ транспорта, количество К+ в МХ, а также чувствительность этого транспорта к АТФ у крыс с различной резистентностью к гипоксии.

5.1.1 Изучение параметров дыхания и окислительного фосфорилирования в МХ печени и сердца крыс с различной резистентностью к гипоксии

Несмотря на то, что участие митоКАТФ в защите миокарда и других тканей от ишемических повреждений не вызывает сомнений, механизм позитивного действия активаторов этого канала остается неясным. Для изучения этого вопроса в работе исследовались параметры дыхания и окислительного фосфорилирования в МХ печени и сердца крыс с различной устойчивостью к недостатку кислорода, а также у животных, адаптированных к гипоксии.

Изучение параметров дыхания и окислительного фосфорилирования МХ печени и сердца крыс с различной устойчивостью к гипоксии показало, что скорость дыхания МХ во всех метаболических состояниях у высокоустойчивых животных значительно ниже таковой у низкоустойчивых (Рис.5). Следует отметить, что высокоустойчивые животные - это животные, которые выдерживали острую гипобарическую гипоксию, соответствующую подъему на высоту 11500 м, в течение 10-15 мин. Группа низкоустойчивых (НУ) животных выдерживала эту высоту только в течение 1-1.5 мин.

Рисунок 5. Скорость дыхания МХ высоко- и низкоустойчивых к гипоксии

НУ - низкоустойчивые к гипоксии животные, ВУ - крысы, высокоустойчивые к гипоксии. Концентрация белка в кювете - 1-2 мг/мл. Среда инкубации: 5 мМ Tris-HCl, 200 мМ сахарозы, 50 мМ KCl, 5 мМ NaH2PO4, 3 мкМ ротенона, рН 7.2. Эксперименты проводились в закрытой ячейке при постоянном перемешивании и термостатировании при температуре 26°С.

При этом измерение дыхательного контроля времени фосфорилирования АДФ показало, что окислительное фосфорилирование, то есть синтез АТФ происходит более эффективно у высокорезистентных крыс (Рис.6).

Рисунок 6. Дыхательный контроль и время фосфорилирования МХ крыс с различной устойчивостью к гипоксии

ВУ - высокоустойчивые к гипоксии крысы, НУ - низкоустойчивые к гипоксии животные. Условия как на рис. 7.

Это свидетельствует об исходно меньшей экономичности процесса синтеза АТФ у низкоустойчивых животных. Таким образом, гипоксия, т.е. увеличение функциональной нагрузки на дыхательную цепь МХ при подъеме животных на высоту или при подаче воздуха со сниженной концентрацией кислорода, может привести к истощению резервных возможностей дыхательной цепи, что не происходит у высокоустойчивых животных.

Адаптация низкоустойчивых крыс интервальной нормобарической гипоксией по методу, предложенному в Hypoxia Medical Academy (США), проявляется у них в сопряжении дыхания, что, в свою очередь, выражается в снижении скорости дыхания, увеличении дыхательного контроля и сокращении времени, необходимого для фосфорилирования АТФ (Рис.9).

Рисунок 7. Скорость дыхания (А) и время фосфорилирования (Б) МХ сердца крыс низкоустойчивых и адаптированных к гипоксии

Как видно из рис. 7, при адаптации к недостатку кислорода животных низкоустойчивых к гипоксии, скорость дыхания МХ у них уменьшается. Кроме того, у адаптированных крыс сокращается время фосфорилирования и увеличивается значение дыхательного контроля (Рис.9 Б). Эти данные свидетельствуют о возрастании степени сопряженности дыхательной цепи МХ крыс низкоустойчивых к килородному голоданию при гипоксической тренировке.

Следовательно, адаптация приводит к переходу крыс из состояния низкой устойчивости в состояние повышеной устойчивости к гипоксии. Согласно данным Лукьяновой [Лукьянова, 2004] при адаптации крыс гипоксической тренировкой время жизни животного при подъеме на высоту, характеризующее общую неспецифическую резистентность крыс, у НУ животных увеличивается уже после первой тренировки на 120-160% (контроль принят за 0). У НУ время жизни в последующие 20 дней превышает исходную резистентность в 2 раза. У ВУ изменения во времени жизни вообще отсутствуют в первые 7 дней, после чего наблюдается небольшое увеличение, максимум до 40%. В работе делается вывод, что при адаптации гипоксической тренировкой наблюдается экономизация энергетических процессов МХ (Рис. 8).

Рисунок 8. Динамика изменения устойчивости к кислородной недостаточности при гипоксической тренировке животных с различной устойчивостью к гипоксии

Н/У - низкоустойчивые крысы, В/У - высокоустойчивые, С/У - животные со средней степенью устойчивости (выдерживающие подъем на высоту в 11500 м в течение 7 минут) [Лукьянова, 2004].

В случае, когда такая оптимизация уже существует, как у высокорезистентных животных, тренировки не приводят к увеличению времени жизни крыс в условиях гипоксии [Лукьянова, 2004]. Поэтому эксперименты по адаптации животных мы проводили на низкоустойчивых к гипоксии крысах.

3.1.2 Изучение параметров АТФ-зависимого транспорта К+ в МХ печени сердца крыс с различной резистентностью к гипоксии

В работе были определены параметры АТФ-ингибируемого энергоависимого входа К+ в МХ крыс с различной резистентностью к гипоксии, а также низкоусточивых крыс после их адаптации интервальной нормобарической гипоксической тренировкой. Как следует из рисунка 9А, скорость входа К+ в МХ высокоустойчивых крыс существенно выше, чем в МХ низкоустойчивых животных.

Рисунок 9. Скорость энергозависимого входа К+ в МХ печени и сердца крыс с различной устойчивостью к гипоксии (А), а также в МХ животных, адаптированных к гипоксии Б

НУ - низкоустойчивые, ВУ - высокоустойчивые животные. Концентрация МХ белка в ячейке 0.1 мг/мл. Среда инкубации: 50 мМ KCl, 5 мМ HEPES, 5 мМ NaH2PO4, 5мМ янтарной кислоты, 0.5 мМ MgCl2, 0.1 мМ ЭГТА, 5 мкМ цитохрома С, 2 мкM ротенона, 1 мкМ циклоспорина А, рН 7.2. Набухание инициировали добавлением МХ.

Рисунок 10. Скорость ДНФ-индуцированного выхода ионов К+ из МХ животных высоко-, низкоустойчивых к гипоксии и низкоустойчивых, адаптированных к гипоксии животных

ВУ - высокоустойчивые крысы, НУ - низкоустойчивые, Адапт. - низкоустойчивые, адаптированные к гипоксии. Измерения проводились при постоянном перемешивании и термостатировании при 26С. Концентрация МХ белка в ячейке составляла 1.5-2 мг/мл. Среда инкубации содержала: 0.3 М сахарозы, 3 мМ NaH2PO4, 10 мМ Трис-HCl, pH 7.4.

Гипоксическая тренировка приводит к увеличению скорости энергозависимого входа К+ до уровня, сравнимого с аналогичными показателями высокорезистентных крыс (Рис.9Б).

Эти данные коррелируют с результатами исследования ДНФ-индуцированного АТФ-зависимого выхода К+ из МХ, измеренного с помощью К+-селективного электрода (Рис. 10).

Следует также отметить, что адаптация приводит к изменению параметров ингибирования канала АТФ. Установлено, что Кi для АТФ в митоКАТФ сердца существенно ниже у адаптированных и высокоустойчивых животных, по сравнению с низкоустойчивыми животными (Таблица 1), что является свидетельством более тонкой регуляции К+ транспорта при адаптации крыс к гипоксии.

Таблица 1. Константа ингибирования АТФ энергозависимого входа К+ в МХ сердца и печени крыс с различной устойчивостью к гипоксии, а также у адаптированных к гипоксии

Устойчивость к гипоксии

Ki50, мкМ АТФ

Сердце

Печень

Высокоустойчивые

18.06+5.38

51.81+18.05

Низкоустойчивые

26.30+8.55

71.69+8.32

Адаптированные

17.74+9.85

35.74+8.81

* Различия достоверны с p<0.05.

При увеличении скорости входа калия в МХ следовало ожидать значительного увеличения количества калия в МХ адаптированных животных, что приводило бы к существенному увеличению объема МХ матрикса. Однако концентрация калия в МХ высокоустойчивых и адаптированных к гипоксии крыс не только существенно не изменилась, но даже уменьшилась (Рис.11А, Б). Это означает, что объем МХ не увеличился, и даже немного сократился. Полученные данные указывают на то, что адаптация, по-видимому, приводит не только к интенсификации энергозависимого входа К+, но и к активации К++-обменника, который регулирует выход ионов калия из МХ.

Выброс калия из МХ при адаптации животных к гипоксии за счет интенсификации К++-обменника при активации митоКАТФ позволяет поддерживать постоянный объем МХ и, вероятно, необходим для адаптации животных к гипоксии.

Возможно, при адаптации низкоустойчивых животных к гипоксии важное значение имеет активация не только системы АТФ-зависимого входа К+ в мтиохондрии, но и системы выхода этого иона. При этом снижение активности К++-обменника может быть причиной высокоамплитудного набухания и следующего за ним повреждения МХ при ишемии.

Рисунок 11. Количество К+ в МХ сердца крыс с различной резистентностью (А) и адаптированных к гипоксии (Б)

Измерения проводились при постоянном перемешивании и термостатировании при 26С. Условия как на рис. 10.

Известно, что при гипоксии недостаток кислорода приводит к восстановлению переносчиков дыхательной цепи, поскольку сток электронов на кислород затруднен [Лукьянова, 2004].

В соответствии с литературными данными восстановление переносчиков, локализованных на I и III комплексах дыхательной цепи, приводит к увеличению образования активных форм кислорода (АФК) [Kaplan-Bresler, 1965; Ferranti et al., 2003]. Как было показано ранее, главным участком образования АФК являются связанные с белком убисемихиноны, которые сопряжены по спину с железо-серным кластером [Ohnishi et al., 2005].

МХ превращают несколько процентов потребляемого кислорода в АФК [Lenaz et al., 2002]. Как было показано ранее, небольшие концентрации АФК необходимы для функционирования дыхательной цепи [Kondrashova and Mironova, 1971]. В то же время, повышенное образование АФК при гипоксии служит основным повреждающим фактором [Starkov et al., 1997; Barger et al., 2002].

Обнаруженная нами активация калиевого цикла, способствует слабому разобщению митохондрий и снижению мембранного потенциала. Известно, что незначительное снижение мембранного потенциала (~13%) ведет к существенному уменьшению продукции АФК (до 80%) [Korshunov et al., 1997]. Кроме того, было установлено, что активация канала сопровождается снижением концентрации АФК в клетке, способствуя сохранению уровня АТФ [Zweier et al., 1987; Pain et al., 2000].

Этот предполагаемый механизм может объяснить защитную роль митоКАТФ канала при реперфузии. Хорошо известно, что АФК являются основным повреждающим фактором при ишемии/реперфузии [Pearlstein et al., 2002; Li et al., 2002], а активация митоКАТФ канала приводит к сокращению уровня образования АФК во время фазы реперфузии [Zweier et al., 1987; Ozcan et al., 2002]. Полученные данные подтверждают развиваемую в лаборатории проф. Лукьяновой концепцию, что адаптация к гипоксии идет на фоне снижения свободнорадикальной активности, а не ее увеличения [Лукьянова, 2004].

Таким образом, полученные в работе результаты позволили доказать важную роль митоКАТФ в формировании устойчивости организма к кислородному голоданию, а также в адаптации животных к гипоксии. В работе предлагается также возможный механизм формирования такого типа адаптации.

5.2 Изучение структурной организации митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала

Изучение структурной организации митоКАТФ, учитывая его существенную физиологическую роль, особенно при гипоксии, является актуальной проблемой. Как было сказано в «Обзоре литературы», японские ученые полагают, что по структуре он близок к цитоплазматическому каналу [Suzuki et al., 1997]. Однако, проведенный в лаборатории проф. Гарлида анализ действия АТ к цито-KIR на АТФ-зависимый транспорт К+ в МХ не подтвердил эти данные [Grover and Garlid, 2000]. С другой стороны, в группе проф. Марбана было высказано предположение о том, что канал образован мультикомплексом, сосоящим из 5 МХ белков, одним из которых является АВС [Ardehali et al., 2004].Следовательно, структурная организация МХ АТФ-зависимого калиевого канала до настоящего времени окончательно не выяснена.

5.2.1 Определение гомологии белка с м.м. 55 кДа методом MS-MALDI-TOF/TOF

Первым этапом изучения белка с м.м. 55 кДа было определение гомологичности его структуры последовательностям известных белков. Для этого электрофоретически чистый белок исследовали MS-MALDI-TOF/TOF (от англ. mass spectrometry-matrix assisted laser desorbtion/ionization - time of flight/time of flight) анализом.

Согласно данным, полученным MS-MALDI-TOF/TOF анализом, белок с м.м. 55 кДа на 54% гомологичен белку-предшественнику, который, исходя из результатов анализа базы данных NCBI (программное обеспечение - MASCOT (MartixScience, Москва)), является предшественником кальретикулина. Вероятно, белок с м.м. 55 кДа является конечным продуктом систем посттрансляционной модификации данного белка-предшественника. На рисунке 14 представлена аминокислотная последовательность белка-предшественника. Последовательности данного белка, перекрывающиеся с последовательностями 55 кДа белка, выделены серым цветом.

1 MLLSVPLLLG LLGLAAADPA IYFKEQFLDG DAWTNRWVES KHKSDFGKFV

51 LSSGKFYGDQ EKDKGLQTSQ DARFYALSAR FEPFSNKGQT LVVQFTVKHE

101 QNIDCGGGYV KLFPGGLDQK DMHGDSEYNI MFGPDICGPG TKKVHVIFNY

151 KGKNVLINKD IRCKDDEFTH LYTLIVRPDN TYEVKIDNSQ VESGSLEDDW

201 DFLPPKKIKD PDAAKPEDWD ERAKIDDPTD SKPEDWDKPE HIPDPDAKKP

251 EDWDEEMDGE WEPPVIQNPE YKGEWKPRQI DNPDYKGTWI HPEIDNPEYS

301 PDANIYAYDS FAVLGLDLWQ VKSGTIFDNF LITNDEAYAE EFGNETWGVT

351 KAAEKQMKDK QDEEQRLKEE EEDKKRKEEE EAEDKEDEDD RDEDEDEEDE

401 KEEDEEDATG QAKDEL

Рис.12. Аминокислотная последовательность прекурсорного белка. Участки структуры белка-предшественника, совпадающие с последовательностями, имеющимися в белке с м.м. 55 кДа, выделены серым цветом

При рассмотрении структуры типичного кальретикулина, выделенного из печени крысы, процент перекрывания его аминокислотных последовательностей с известными последовательностями 55 кДа белка также оказался достаточно большим (Рис.13).

1 mllsvplllg llglaaadpa iyfkeqfldg dawtnrwves khksdfgkfv

51 lssgkfygdq ekdkglqtsq darfyalsar fepfsnkgqt lvvqftvkhe

101 qnidcgggyv klfpggldqk dmhgdseyni mfgpdicgpg tkkvhvifny

151 kgknvlinkd irckddefth lytlivrpdn tyevkidnsq vesgsleddw

201 dflppkkikd pdaakpedwd erakiddptd skpedwdkpe hipdpdakkp

251 edwdeemdge weppviqnpe ykgewkprqi dnpdykgtwi hpeidnpeys

301 pdaniyayds favlgldlwq vksgtifdnf litndeayae efgnetwgvt

351 kaaekqmkdk qdeeqrlkee eedkkrkeee eaedkededd rdededeede

401 keedeedatg qakdel

Рисунок 13. Аминокислотная последовательность типичного кальретикулина (21-332 - кальретикулин, 1-17 - сигнальная последовательность, удаляемая протеолизом при созревании белка). Участки последовательности, общие с белком с м.м. 55 кДа, выделены серым цветом

Классический кальретикулин входит в состав семейства высококонсервативных белков с м.м. около 55 кДа, локализующихся как в саркоплазматическом, так и в эндоплазматическом ретикулуме клеток печени, скелетной и гладкой мускулатуры, сердечной мышцы [Fliegel et al., 1989]. Белки этого семейства связывают ионы кальция, цинка, других металлов, сахара, нуклеотидфосфаты, в частности, УДФ. Они также выступают в роли шаперонных белков в процессе фолдинга, участвуют в системе белковой машинерии, регуляции апоптоза, мейоза, экспорта белков из ядра клетки. Известны гомологи гена кальретикулина у мыши, крысы и человека. У крысы гомологичный ген кальретикулина локализован в 19 хромосоме. При этом ранее в нашей лаборатории было показано, что при окрашивании белков в геле после ДДС-ПААГ электрофореза по Шиффу, исследуемый белок с м.м. 55 кДа давал положительную реакцию, что говорит о способности его связывать сахара [неопубликованные данные]. Кроме того, определялось также и сродство белка-канала к кальцию с использованием 45Ca [неопубликованые данные]. Было показано, что исследуемый белок с м.м. 55 кДа проявляет достаточно большое сродство к этому иону. Эти результаты согласуются с данными по взаимодействию кальретикулина с сахарами и кальцием.

Причем, необходимо заметить, что большая часть перекрывающейся последовательности приходится на Р-домен кальрегулина, способного связывать нуклеотиды. Также, в перекрывающуюся последовательность включены высоконсервативные остатки триптофана, характерные для кальрегулинов в данных сайтах первичной последовательности, и стерически идентично расположенные в первичной аминокислотной последовательности кальрегулина консервативные антипараллельные бета-листы, формирующие Р-домен.

Следует особенно отметить тот факт, что в составе прекурсорного белка и кальретикулинов различных типов имеется характерная гидрофобная сигнальная последовательность из 17 аминокислотных остатков, MLLSVPLLLGLLGLAAA (1-17), посттрансляционно удаляемая протеолитическим расщеплением [Murthy et al., 1990] (Рис.16). Эта последовательность отсутствует в изучаемом нами белке с м.м. 55 кДа. Интересно также то, что N-концевая последовательность с 17 по 27 аминокислотный остаток DPAIYFKE кальретикулина совпадает с последовательностью N-концевого участка 55 кДа белка, структура которого была определена ранее в нашей лаборатории реакцией химической деградации по Эдману [неопубликованные данные] (Рис.16).

Кроме того, С-конец прекурсорного белка, как и всех кальретикулинов, содержит сигнальную последовательность KDEL, определяющую локализацию этих белков в ретикулюме [Schweizer et al., 1993], в то время как у изучаемого 55 кДа белка такой последовательности нет (Рис.15, 16), что, вероятно, свидетельствует о том, что белок с м.м. 55 кДа локализуется не в ретикулюме.

1 MLLSVPLLLG LLGLAAADPA IYFKEQFLDG DAWTNRWVES KHKSDFGKFV

51 LSSGKFYGDQ EKDKGLQTSQ DARFYALSAR FEPFSNKGQT LVVQFTVKHE

101 QNIDCGGGYV KLFPGGLDQK DMHGDSEYNI MFGPDICGPG TKKVHVIFNY

151 KGKNVLINKD IRCKDDEFTH LYTLIVRPDN TYEVKIDNSQ VESGSLEDDW

201 DFLPPKKIKD PDAAKPEDWD ERAKIDDPTD SKPEDWDKPE HIPDPDAKKP

251 EDWDEEMDGE WEPPVIQNPE YKGEWKPRQI DNPDYKGTWI HPEIDNPEYS

301 PDANIYAYDS FAVLGLDLWQ VKSGTIFDNF LITNDEAYAE EFGNETWGVT

351 KAAEKQMKDK QDEEQRLKEE EEDKKRKEEE EAEDKEDEDD RDEDEDEEDE

401 KEEDEEDATG QAKDEL

Рисунок 14. Последовательность прекурсорного белка. Сигнальная последовательность, характерная для кальретикулинов, выделена серым цветом, N-концевая последовательность, гомологичная таковой у исследуемого белка-канала с м.м. 55 кДа - жирным шрифтом, сигнальная последовательность KDEL, остутствующая в изучаемом белке - серым цветом и жирным шрифтом

Следует также отметить, что кальретикулины содержат ряд высоко консервативных последовательностей [Fliegel et al., 1989]. Согласно результатам MS-MALDI-TOF/TOF анализа, ряд гомологичных с белком предшественником участков цепи белка с м.м. 55 кДа являются высококонсервативными для белков семейства кальретикулинов.

Возможно, исследуемый нами белок, гомологичный кальрегулину, проходит альтернативные стадии пострансляционных модификаций и созревания при биосинтезе. Это, вероятно, позволяет ему встраиваться во внутреннюю мембрану митохондрий беспрепятственно и без значительных потерь энтропии и внутренней энергии при смене гидрофильной среды на гидрофобную. Не исключено также дополнительное стерическое и физико-химическое влияние на химические свойства и конформационную норму со стороны компонентов мембраны митохондрий. Учитывая все вышесказанное, на данном этапе исследования структуры митоКАТФ, можно утверждать лишь, что белок с м.м. 55 кДа является белком, обладающим высокой степенью структурной и функциональной гомологии с кальрегулином.

Учитывая все вышесказанное, на данном этапе исследования структуры митоКАТФ, можно утверждать лишь, что белок с м.м. 55 кДа является белком, обладающим высокой степенью структурной и функциональной гомологии с кальрегулином.

5.3 Ингибиторный анализ активности митоКАТФ канала с использованием антител, полученных на белок с м.м. 55 кДа

В нашей лаборатории были получены косвенные доказательства гетеромультимерного строения этого канала, а также данные о том, что белок с м.м. 55 кДа является канальной субъединицей митоКАТФ [Григорьев, 1999; Негода, 2004; Mironova et al., 2004]. В то же время, результаты исследования гомологичности структуры белка-канала с м.м. 55 кДа, выделенного из МХ печени крысы, показали высокий процент гомологии исследуемого белка с кальрегулином. Таким образом, возникла необходимость доказательства принадлежности белка с м.м. 55 кДа к системе митохондриального АТФ-зависимого транспорта калия.

Для прямого доказательства принадлежности каналообразующего белка с м.м 55 кДа к митохондриальной системе АТФ-ингибируемого транспорта К+, в работе на этот белок были получены поликлональные антитела (АТ) и проведен анализ их влияния на АТФ-зависимый транспорт калия в интактных МХ.

Предварительные данные по влиянию АТ к 55 кДа белку на транспорт К+ в МХ были получены в лаборатории ранее [Скарга и др., 1986]. Однако в о время, белок не был идентифицирован как АТФ-зависимый К+ канал и методы его очистки были несовершенны. Кроме того, не все использовавшиеся ранее модели отражали работу АТФ-зависимого митоходнриального калиевого кнала. Не было также проведено сравненительное исследование по влиянию АТ к 55 кДа белку на другие функции МХ.

5.3.1 Определение степени чистоты белка, используемого для иммунизации

Для получения поликлональных специфических антител на белок-канал необходимо было получить гомогенный белок с м.м. 55 кДа. Этот белок выделяли из МХ печени крысы методом водно-этанольной экстракции [Миронова и др., 1981; 1996(I)]. Дальнейшую очистку белка проводили методом ионообменной хроматографии с использованием ДЭАЭ-целлюлозы (п.п. 2 «Материалов и методов»). Каналообразующий белок элюировался с колонки 250 мМ KCl. Чистота данной фракции определялась ДДС-ПААГ электрофорезом [Laemmli, 1979] (Рис.5). Для обнаружения активной фракции, все фракции, элюированные с колонки ДЭАЭ-целлюлозы тестировали при встраивании в БЛМ (см. «Материалы и методы»). Далее активную фракцию (250 мМ KCl) диализовали против 5 мМ Трис буфера (pH 7.2) с добавлением 0.1% -меркаптоэтанола в течение ночи при 4С. Диализат повторно наносили на колонку ДЭАЭ-целлюлозы, аналогичную использовавшейся в первом случае. Фракции элюировали ступенчатым градиентом KCl. Все фракции тестировались на активность при встраивании в БЛМ. АТФ-ингибируемые К+-селективные каналы формировались, как правило, при встраивании белка, элюированного 250 мМ KCl.

Дополнительная очистка проводилась методом препаративного нативного электрофореза (п.п. 5.1.1. «Материалов и методов») в 10%-ом ПААГ. На конечной стадии очистки, исследуемый белок элюировали из геля, концентрировали методом обратного диализа на ПЭГ и проверяли на ДДС-ПААГ электрофорезе (Рис.17). Электрофоретическая подвижность белка соответствовала массе 55 кДа.

Рис. 15. Результат ДДС-ПААГ электрофореза фракции, полученной после нативного электрофореза и содержащей белок с м.м. 55 кДа. 1 - стандарт молекулярных масс, 2 - фракция митоКАТФ канала после нативного электрофореза

Полученным электрофоретически гомогенным белком с м.м. 55 кДа модифицировали искусственные бислойные мембраны. Было показано, что данный белок обладает селективной К+-транспортирующей активностью и ингибируется физиологическими концентрациями АТФ (Рис.18).

Рисунок 16. К+-транспортирующая АТФ-ингибируемая активность белка с м.м. 55 кДа, реконструированного в искусственную мембрану. Среда инкубации содержала: 20 мМ Трис, 100 мМ KCl, рН 7.2

Электрофоретически гомогенный АТФ-ингибируемый К+-транспортирующий белок с м.м. 55 кДа и замораживали и накапливали для иммунизации. При выделении вышеописанным методом из 100 г печени крыс получали 30-70 мкг очищенного белка. Иммунизацию кроликов проводили при накоплении 0.2-0.4 мг белка.

5.4 Иммунизация и определение титра полученных антител

Перед началом иммунизации отбирали 30-40 мл крови каждого животного для приготовления нормальной контрольной сыворотки. Для получения антител к АТФ-ингибируемому К+-транспортирующему белку с м.м. 55 кДа кроликов иммунизировали электрофоретически чистым белком. С целью устранения индивидуальных различий в получаемых анителах иммунизировали двух кроликов массой 2.6-2.8 кг.

Схема эксперимента была подобрана в соответствии с требованиями Декларации совета Европейского Союза 86/609/EEC и представлена в таблице 8. Инъекции делали подкожно в область лопаток в 3 подхода. Интервал между инъекциями 10-15 дней.

В ходе иммунизации кроликов по представленной выше схеме были получены антитела к белку с м.м. 55 кДа, выделенному из МХ печени крысы. Определение титра антител, полученных на белок-канал с м.м. 55 кДа проводили методом непрямого дот-анализа (см. «Материалы и методы»). Средние значения титра антител указаны в таблице 8.

Таблица 2. Схема иммунизации кроликов АТФ-зависимым К+-транспортирующим белком м.м. 55 кДа.

Номер животного

Кролик №1

Кролик №2

Номер иммунизации

1

2

3

1

2

3

Количество белка, мкг

114

70

30

100

114

38

Суммарное количество белка, мкг

214

252

Титр после трех иммунизаций

1:3200

1:1600

5.4.1 Определение специфичности полученных антител

Специфичность антител на белок с м.м. 55 кДа определяли методом Вестерн-блот. Для этого выделенный из МХ печени крысы и очищенный АТФ-чувствительный К+-транспортирующий белок с м.м. 55 кДа наносили на ДДС-ПААГ электрофорез с 10%-ым ПААГ гелем с нагрузкой на полосу 10 мкг. На другую полосу наносили 10 мкг тотальной белковой фракции МХ. Порядок нанесения образцов дублировался на том же геле. После электрофоретического разделения белков половина геля, содержащая оба образца и стандарт молекулярных масс, окрашивалась серебрением [Shevchenko et al., 1996]. Вторая половина использовалась для переноса на нитроцеллюлозную мембрану с последующей обработкой полученными антителами (п.п. 5.2.2. «Материалов и методов»). При этом исследуемую антисыворотку разводили 1:300, вторичные антитела - 1:500.

Рисунок 17. А. ДСН-электрофорез фракций

1 - очищенный АТФ-чувствительный К+-транспортирующий белок с м.м. 55 кДа, 2 - молекулярные стандарты массы белков, 3 - суммарный белок МХ. Б. Вестерн-блот анализ: 1 - очищенный АТФ-чувствительный К+-транспортирующий белок с м.м. 55 кДа, 2 - суммарный белок МХ.

Показано, что полученные в работе антитела специфически связываются только с белком с м.м. 55 кДа, и не вязываются ни с одним из массы белков, находящихся в МХ (Рис.19). Таким образом, в работе были получены специфические поликлональные антитела на белок с м.м. 55 кДа.

Этим же методом было установлено, что поликлональные антитела на исследуемый белок-канал, полученный из МХ печени крысы, не взаимодействует с той же концентрацией аналогичного белка с м.м. 55 кДа, выделенного тем же методом из МХ сердца крысы. Данный факт указывает на то, что исследуемый белок с м.м. 55 кДа тканеспецифичен.

5.4.2 Выделение иммуноглобулинов G (IgG) из антисыворотки и проведение ингибиторного анализа

Полученные антитела к АТФ-чувствительному К+-транспортирующему белку с м.м. 55 кДа, выделенному из МХ печени крысы, использовали в качестве ингибитора АТФ-зависимого транспорта ионов калия в МХ печени крысы. Для этого, полученные очищенные и концентрированные антитела (иммуноглобулины G (IgG)) кроликов (см. «Материалы и методы»). Контролем служили очищенные IgG сыворотки крови Интактных (неиммунизированных) кроликов. Кроме того, в качестве контроля использовались антитела к белку с м.м. 55 кДа, подвергнутые кипячению в течение 5 минут. Ранее было показано, что такая процедура ведет к потере белком активности. IgG контрольных животных получали тем же способом, что и IgG рабочей сыворотки. В ходе выделения и очистки IgG титр антител и сродство к белку-каналу с м.м. 55 кДа существенно не изменяется. Степень чистоты выделенных из сыворотки IgG определяли методом ДДС-ПААГ электрофореза [Laemmli, 1979] (см. «Материалы и методы»).

Очищенные фракции IgG, выделенные из иммунизированных и интактных животных, использовали для ингибирования АТФ-зависимого выхода ионов К+ из МХ в присутствии ДНФ, отражающего работу митоКАТФ, и энергозависимого входа ионов К+ в МХ. Все эксперименты проводились при термостатировании (26С) и постоянном перемешивании. После 1.5-2 минут преинкубации антител с митохондриями транспорт ионов К+ индуцировали ДНФ (при исследовании выхода К+ из МХ К+-селективным электродом) или субстратом дыхания (при определении энергозависимого входа К+ в МХ). Для повышения эффективности взаимодействия IgG с внутренней мембраной МХ создавались гипотонические условия. На рисунке 6 представлена концентрационная зависимость степени ингибирования выхода ионов К+ из МХ печени крысы в присутствии разобщителя (ДНФ). Ингибирующий эффект антител наблюдается только в случае добавления в среду инкубации МХ очищенных интактных IgG к АТФ-зависимому К+-транспортирующему белку с м.м. 55 кДа, выделенному из печени крысы. Степень ингибирования зависела от концентрации IgG и времени преинкубации.


Подобные документы

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.