Біосинтез антибіотика доксорубіцину

К-3

Турбоповітродувка

1

Сталь 12х18Н10Т

Турбоповітродувка ТВ-175-1,6, подача повітря 165 м3/хв.., кінцевий тиск 0,26МПа, потужність електродвигуна 320кВт

Т-4

Теплообмінник

1

Сталь

Кожухотрубний, горизонтальний ТКВ-16-МІ-0/20-21 гр.А, площа поверхні теплообміну 120м3, ГОСТ 15122-79

Р-5

Ресивер

1

Сталь 12Х18Н10Т

Вертикальний циліндричний з еліптичним днищем, Інд.ВЕ7-1-25-1,0; об'єм 25м3, роб.тиск 0,8МПа, діаметр 2200мм, висота 7330мм, запобіжний клапан

Ф-6

Фільтр тонкої очистки

1

Сталь 08х25Т

ФТОС-4000, вертикальний, циліндричний з еліптичною кришкою, 4 блока касет типу ФТОС-1000К, фільтрувальний матеріал - скловолокно з волокнами діаметром 6мкм, пило ємкість фільтра 450г/м2, діаметр 800мм, висота 1300мм

Ф -7

Фільтр індивідуальної очистки повітря

1

Сталь08х25Т

Вертикальний циліндричний з еліптичним днищем патронної конструкції ФТО-100м3/год, використовуються готові стандартні фільтрувальні патрони зі стійкою гідрофобною тканиною

С-12

Стерилізатор

1

Сталь

Вертикальний, з еліптичним днищем і кришкою, змійовиком ,об'ємом 3м3,діаметр 800мм

Д-9, 10, 13,17,19,

20,22,23,

25,26

Дозатор об'ємно-ваговий

10

Сталь

Шлюзовий дозатор( датчик, фіксатор об'єму встановлений на матеріалопроводі)

Р-11

Реактор для приготування емульсії піногасника

1

Сталь 312х18Н10Т

Чавун аналог С418

Вертикальний з еліптичним днищем і кришкою , об'єм 2м3, сорочка, висота 700мм, діаметр 400мм, лопатева мішалка , пот.5кВт, обладнаний оглядовим вікном та люком. Виробник завод дезхімобладнання, м. Пеyза

Р-15,

18,21

Реактор-змішувач

3

Сталь 312х18Н10Т

Чавун аналог С418

Вертикальний з еліптичним днищем і кришкою , об'єм 10м3, сорочка, висота 3500мм, діаметр 2000мм, лопатева мішалка , пот.20кВт, обладнаний оглядовим вікном та люком. Виробник завод дезхімобладнання, м. Пеyза

Д-28

Дозатор об'ємно-ваговий

1

Сталь

Ємкісний градуювальний дозатор, для дозування сипучих речовин, об'ємом 0,2м3

Р-24,27,

41

Реактор - змішувач

3

Сталь 12Х18Т

Вертикальний циліндричний з еліптичним днищем і кришкою, сорочка, об'єм 1м3, висота 350мм, діаметр 200мм, лопатева мішалка, пот. 5кВт

Н-34

Н-43

Насос відцентровий

2

Сталь

Хімічний центробіжний насос Х8/90-К-25, продуктивність 8м3/год, тиск 0,9МПа, ел.двигун А160М2, потужність 17кВт, Китайський насосний завод

Д-29,30,

31,38,

39,40,54

Дозатор об'ємно-ваговий

7

Сталь

Шлюзовий дозатор( датчик, фіксатор об'єму встановлений на матеріалопроводі)

Р-50

Біор

1

Хромнікелева сталь х 8 СrNіТі 1810 Аs

Вертикальний із сорочкою, барботером,з пропелерною мішалкою, об'єм 50л

Р-52

Посівний апарат

1

Хромнікелева сталь х 8 СrNіТі 1810 Аs

Вертикальний із сорочкою, барботером,з пропелерною мішалкою, частота обертання 270об/хв об'єм 0,5 м3

Н-35,44

Нагрівач

1

Сталь

Вертикальний циліндричний корпус з кришкою та соплом , теплоносій - пара гостра 5кгс/см2

В-36,44

Витримувач

2

Сталь

Змійовик , який складається з з 11 витків труби діаметром 89мм та довжиною 3,4м, об'ємом витримувача 170л

Т-37,46

Теплообмінник-охолоджувач

2

Сталь 312х18Н10Т

Чавун аналог С418

Теплообмінник тип « труба в трубі», діаметром труб 76 і 133мм і загальною поверхнею охолодженя 20м3

З-47,

51,53

Збірник

3

Хромнікелева сталь х 8 СrNіТі 1810 Аs

Вертикальний циліндричний, завантаження і розвантаження самопливом. Виробник Новоград-Волинський.

Ф-33,42

Фільтр

2

Сталь 312х18Н10Т

Фільтр у вигляді проволочної сітки з ячейками 0,8*0,8мм

Р-55

Виробничий ферментер

1

Хромонікелева сталь Х8CrNi18Ti10 AS

Вертикальний з еліптичним днищем і кришкою, 8-секційна сорочка, з лопатевою мішалкою, обладнаний оглядовим вікном та люком , об'єм 5 м3, висота 2812.5мм, внутр..діаметр 875мм, площа поверхні 20м3, змієвиків 5м3, електродвигун АНІ-456-614-120/180, заповнення - насосом , вигризка - передавлюванням. Виробник : Сумський машзавод.



РОЗДІЛ 7. ОПИС ТЕХНОЛОГІЧНОЇ СХЕМИ

ДР 1. Санітарна підготовка виробництва

Підготовка виробництва виконується за вимогами нормативних документів, в яких описуються правила виробництва та контроль якості продукції.

ДР 1.1. Підготовка персоналу до виробництва

Особи, що допускаються до виробництва повинні мати відповідну професійну підготовку і пройти інструктаж з безпеки праці та ознайомитись з інструкцією по техніці безпеки на виконувану роботу, а також інструктаж по санітарному мінімуму. Дані заходи з працівником проводяться у відділі охорони праці або спеціально призначеною особою на підприємстві. Персонал, що не пройшов інструктаж, не допускають до роботи.

ДР 1.1.1. Начання та інструктаж персоналу

Інструктаж та навчання проходить з працівником у відділі охорони праці або спеціально призначеною особою на підприємстві. Персонал, що не пройшов інструктаж, не допускають до роботи.

ДР 1.1.2. Підготовка спецодягу

Підготовку спеціального захисного одягу проводять у відповідності до вимог “Гігієнічні вимоги до персоналу і використання спеціального одягу”.

ДР 1.2. Приготування миючих та дезинфікуючих засобів

Всі мийні, дезінфікуючі розчини і суміші готує блок стерилізації, або співробітник, призначений начальником цеху, ділянки, підрозділу за наказом. Розчини готують в емальгованому посуді або в бутлях з товстого темного скла. Посуд, де зберігаються розчини, обов'язково повинен бути щільно прикритим кришкою або корком. Приготування розчинів проводиться у спеціальній кімнаті, що прилягає до санвузла. Бажано, щоб це була темна або напівтемна кімната, стіни та підлога її вистелені кахлями, токож є раковина для миття рук.

ДР 1.2.1. Приготування каустичної соди

Для отримання розчину каустичної соди потрібно 10 л води та 2,5 гк каустичної соди.

ДР 1.2.2. Приготування розчину дексоциду

Препарат дексоцид використовують для дезінфекції та ополіскування. Для приготування дексоциду небхідно розбавити концентрований препарат водою до потрібної концентрації. Для 5 % розчину беруть 40 г дексоциду та 750 мл води. Зберігати готовий розчин слід не більше 7 діб.

ДР 1.2.3. Підготовка розчину хлороциду

Для приготування хлороциду небхідно розбавити концентрований препарат водою до потрібної концентрації. Для 5 % розчину беруть 20 г хлороциду та 380 мл води.

Вода, що додається до хлороциду, повинна бути нагріта до температури 50--60 °С. Зберігати готовий розчин слід не більше 5 діб.

ДР 1.3. Підготовка виробничих приміщень

Прибирання і дезінфекцію виробничих приміщень проводять в спеціально призначених для цього гумових рукавичках, гумових чоботах і гумовому фартусі, при необхідності в респіраторі.

Стіни і стеля виробничих приміщень вкриті матеріалами з достатньою механічною стійкістю, не піддаються корозії, не токсичні, мають обмежену статичну електризацію, чистяться і миються миючими засобами з дезрозчинами. Підлога водонепроникна з гладкою поверхнею (без вибоїн та щілин), зручна для миття. Щороку виробничі приміщення піддають ремонтним роботам.

В якості миючих і дезінфікуючих засобів використовують розчин перекису водню з миючими засобами. Обробку приміщень проводять шляхом протирання поверхні цим розчином або, розпилюючи його за допомогою пристрою з турбулізаційними аерозольними насадками.

Вологе прибирання з дезінфекцією приміщень поділяють на щоденну та генеральну.

Підготовку виробничих приміщень проводять у відповідності до вимог СТП 00481212-03-01-2001 “Санітарна підготовка виробничих приміщень”, ТІ №Т-45 “Інструкція по підготовці до роботи і оброблення після технологічного процесу виробничих приміщень, обладнання і інвентаря” та Методичних рекомендацій, затверджених наказом МЗ України від 14.12.01 г №502.

Санітарна обробка приміщень - один з найважливіших заходів щодо забезпечення чистоти. Мета такої обробки - зведення до мінімуму механічних і мікробних забруднень. Дезінфекція поверхонь призводить, як правило, до зниження мікроорганізмів на 40-60% від вихідного змісту. 

ДР 1.3.1. Щоденне прибирання

Прибирання приміщень повинно проводитись 1 раз на зміну Використовуються розчин хлорного вапна.

ДР 1.3.1. Генеральне прибирання

Генеральне прибирання проводиться 1 раз на тиждень. Використовуються розчини хлорного вапна та розчин хлорациду.

ДР 1.4. Підготування обладнання до роботи

Підготовку обладнання та комунікацій проводять у відповідності з ТІ № Т-45 “Інструкція по підготовці до роботи і оброблення після технологічного процесу виробничих приміщень, обладнання і інвентаря” та Методичних рекомендацій, затверджених наказом МЗ України від 14.12.01 г №502.

ДР 1.4.1. Підготовка поміжних пристосувань

Вузли обладнання, що безпосередньо стикаються з виробничою сировиною, слід зняти, розібрати і ретельно вимити в розчині миючого засобу при температурі 70-80 °С.

По закінченні процесу вимикають насос і зливають залишки води з установки. Далі можна здійснити пропарювання апарату шляхом подачі пари з тиском 0,3-0,4 МПа і відведення конденсату в каналізацію. Після підготовчих заходів необхідно провести аналіз повітря всередині апарату за допомогою газоаналізаторів.

ДР 1.4.2. Підготовка ферментера

Обладнання обполіскують при температурі 20°С.

ДР 1.4.2.1. Обробка внутрішніх поверхонь

Спочатку промивають водою під тиском, щоб видалити залишки. Потім проводиться дезінфекція розчином каустичної соди при температурі 36 С°.

ДР 1.4.2.2. Перевірка герметичності та роботи апарату

Герметичність затворів гвинтів перевіряють парою. Апарат з прилеглими трубопроводами перед загрузкою середовища перевіряють на герметичність під дією повітряного тиску (0,15-0,20) МПа. Нещільність в фланцевих з'єднаннях, зварювальних швах знаходяться за допомогою мильної води. Остаточну перевірку герметичності апарату з прилеглими ділянками трубопроводів проводять галоїдним течешукачем під повітряним тиском (0,15-0,20) МПа і при температурі (78-81) °С. Знайдені пропуски усувають і проводять повторну перевірку.

Проводять пробний пуск апарата, при виникненні неполадок їх усувають.

ДР 1.4.2.3. Стерилізація ферментеру

Стерилізацію обладнання проводять гострою парою з тиском 0,2 МПа при температурі 125-130°С протягом однієї години. Після стерилізації обладнання утворений конденсат збирається і відводиться.

ДР 2. Підготовка стерильного технологічного повітря

Одним із важливих завдань є одержання великої кількості стерильного повітря, необхідного для аерації під час культивування, хоча інтенсивна аерація молочнокислого стрептокока не має позитивного впливу ні на ріст бактерії, ні на синтез антибіотику. Стерильне повітря також використовується для вентиляції ділянок цехів так званої стерильної зони, де в асептичних умовах здійснюють, наприклад, останні стадії очищення готового продукту.

ДР 2.1. Забір атмосферного повітря

Забір повітря з атмосфери проводять на висоті 30 м через жалюзійні решітки вертикальних шахт. На вході повітря очищують від механічних домішок на фільтрах типа ФР-5 з нетканинним обґємним матеріалом або типу ФС масляних самоочищувачів.

В нагнітачах повітря стискається до тиску (0,23±0,01) МПа і по повітропроводу надходить в головні фільтри для грубого очищення.

При роботі на повітродувках, повітря стискається до тиску (0,08±0,05) МПа і надходить в головні фільтри.

ДР 2.2. Попередня очистка повітря

В якості фільтруючого матеріалу використовують скловолокно. Фільтр представляє собою циліндричний сосуд із специфічним днищем та кришкою, що знімається. Всередині фільтра розташовані дві решітки, між якими поміщають фільтруючий матеріал. Для набивки головних фільтрів використовують нитки скляного однонаправленого волокна. Заміну фільтруючого матеріалу виконують не рідше 1 раз в рік. При заміні фільтруючого матеріалу виконують подачу повітря через попередній фільтр, надлишковий тиск в ньому знижають до нуля, знімають кришку і решітку та дістають відпрацьований фільтруючий матеріал. Очищають від залишків фільтруючого матеріалу та іржі і заповнюють новим фільтруючим матеріалом, рівномірно його ущільнюючи. Фільтр забезпечує очистку повітря на 80%.

ДР 2.3. Стадія компресування повітря

Проводиться під тиском 0,35-0,5 МПа, при високих температурах.

ДР 2.4. Регуляція термодинамічних показників повітря

Для стиснення і нагнітання повітря використовують турбокомпресори, в яких стиск повітря відбувається під дією відцентрової сили. Стиснення повітря супроводжується його нагріванням до 180оС. Тому після компресорів повітря поступає в холодильник, щоб видалити з повітря зайву вологу. Температуру знижують до 25-40єС холодною водою. При цьому вологість повітря становить W=60%.

ДР 2.5. Очистка повітря фільтрах тонкої очистки

Повітря надходить у головний фільтр. Всередині нього розташовані сітки, між якими укладені фільтруючий матеріал - скловолокно ЦФД. Стерилізується фільтр паром під тиском 0,2 МПа при 133°С протягом 3 годин. Перебивку головного фільтра ведуть 1 раз на 2 - 3 місяці. Ступінь очищення становить 90%.

ДР 2.6. Очистка повітря в індивідуальних фільтрах

Перед подачею повітря в апарат воно проходить очищення в фільтрах індивідуальної очистки. Ступінь очищення становить 90,99%.

ДР 3. Приготування поживного середовища

Для вирощування штаму S. peucetius ATCC 29050 з метою синтезу доксорубіцину використовується середовище наступного складу, г/л:

Декстроза	60
Пивні дріжджі	25
CaCO3	2
КН2РО4	1
NaCl	2
MgSО4	0,1
FeSО4 7H2О	0,01
ZnSО4 7H2О	0,01

Композиція 1. декстроза, пивні дріжджі (режим стерилізації 112 °С, 30 хв).

Композиція 2. NaCl, КН2РО4, MgSО4, FeSО4 7H2О, ZnSО4 7H2О (режим стерилізації 131 °С, 50 хв).

Композиція 3. CaCO3 (режим стерилізації 131 °С, 50 хв).

ДР 3.1. Приготування поживного середовища для колб

Об`єм композиції для колб становить 250 мл. Отже розрахуємо необхідну кількість компонентів та води, що необхідні для приготування заданої кількості поживного середовища.

Розрахунок кількості компонентів для 0,25 л поживного середовища

Склад поживного середовища, г/л	Компо-зиція	Вміст компонента на 0,25 л середовища, г	Загальна кількість компонентів, г	Кількість води, мл
Декстроза	60	1	15	21,25	127
Пивні дріжджі	25		6,25
КН2РО4	1	2	0,25	0,78	50
NaCl	2		0,5
MgSО4	0,1		0,025
FeSО4 7H2О	0,01		0,0025
ZnSО4 7H2О	0,01		0,0025
CaCO3	2	3	0,5	0,5	50

ДР 3.1.1. Підготовка композиції 1

Для приготування розчину декстрози та пивних дріжджів на технічних вагах у мірному стаканчику об'ємом 250 мл зважують 15 г декстрози, 6,25 г пивних дріжджів та додають питну воду (температура 50 0С) об'ємом 127 мл. Розчин перемішують та переносять в стерильну колбу об'ємом 500 мл. Колбу закривають ватно-марлевою пробкою і стерилізують в автоклаві при температурі 1120С протягом 30 хв.

ДР 3.1.2. Підготовка композиції 2

Для приготування мінеральних солей зважують на електронних вагах , г: NaCl - 0,5, КН2РО4 - 0,25, MgSО4 - 0,025, FeSО4 7H2О - 0,0025, ZnSО4 7H2О - 0,0025. Наважки переносять в стерильну колбу об'ємом 250 мл та додають питну воду (температура 500С) об'ємом 50 мл. Інтенсивно перемішують. Колбу закривають ватно-марлевою пробкою і стерилізують в автоклаві при температурі 1310С протягом 50 хв.

ДР 3.1.3. Підготовка композиції 3

Для приготування суспензії карбонату кальцію зважують на електронних вагах 0,5 г CaCO3. Наважку переносять в стерильну колбу об'ємом 250 мл та додають питну воду (температура 500С) об'ємом 50 мл. Інтенсивно перемішують. Колбу закривають ватно-марлевою пробкою і стерилізують в автоклаві при температурі 1310С протягом 50 хв.

ДР 3.1.4. Змішування композицій

Після стерилізації композиції в асептичних умовах (при полум'ї пальника) зливають в колбу об'ємом 500 мл де відбувалась стерилізація.

ДР 3.2. Приготування поживного середовища для вирощування на колбах

Об`єм композиції для колб становить 2,5 л. Отже розрахуємо необхідну кількість компонентів та води, що необхідні для приготування заданої кількості поживного середовища. Слід врахувати 0,25 л посівного матеріалу, одержаного на попередній стадії.

Розрахунок кількості компонентів для 2,5 л поживного середовища

Склад поживного середовища, г/л	Компо-зиція	Вміст компонента на 2,5 л середовища, г	Загальна кількість компонентів, г	Кількість води, л
Декстроза	60	1	150	212,5	1,27
Пивні дріжджі	25		62,5
КН2РО4	1	2	2,5	7,8	0,5
NaCl	2		5
MgSО4	0,1		0,25
FeSО4 7H2О	0,01		0,025
ZnSО4 7H2О	0,01		0,025
CaCO3	2	3	5	5	0,5

ДР 3.2.1. Підготовка композиції 1

Для приготування розчину декстрози та пивних дріжджів на технічних вагах у мірному стаканчику об'ємом 250 мл зважують 150 г декстрози, 62,5 г пивних дріжджів та додають питну воду (температура 50 0С) об'ємом 1,27 мл. Розчин перемішують та переносять в стерильну колбу об'ємом 2000 мл. Колбу закривають ватно-марлевою пробкою і стерилізують в автоклаві при температурі 1120С протягом 30 хв.

ДР 3.2.2. Підготовка композиції 2

Для приготування мінеральних солей зважують на електронних вагах , г: NaCl - 5, КН2РО4 - 2,5, MgSО4 - 0,25, FeSО4 7H2О - 0,025, ZnSО4 7H2О - 0,025. Наважки переносять в стерильну колбу об'ємом 1000 мл та додають питну воду (температура 500С) об'ємом 500 мл. Інтенсивно перемішують. Колбу закривають ватно-марлевою пробкою і стерилізують в автоклаві при температурі 1310С протягом 50 хв.

ДР 3.2.3. Підготовка композиції 3

Для приготування суспензії карбонату кальцію зважують на електронних вагах 5 г CaCO3. Наважку переносять в стерильну колбу об'ємом 1000 мл та додають питну воду (температура 500С) об'ємом 500 мл. Інтенсивно перемішують. Колбу закривають ватно-марлевою пробкою і стерилізують в автоклаві при температурі 1310С протягом 50 хв.

ДР 3.1.4. Змішування композицій

Після стерилізації композиції в асептичних умовах (при полум'ї пальника) зливають в простерилізовану колбу.

ДР 3.3. Приготування поживного середовища для інокулятору

Об`єм композиції для інокулятору становить 25 л. Отже розрахуємо необхідну кількість компонентів та води, що необхідні для приготування заданої кількості поживного середовища. Слід врахувати 2,5 л посівного матеріалу, одержаного на попередній стадії.

Розрахунок кількості компонентів для 25 л поживного середовища

Склад поживного середовища, г/л	Компо-зиція	Вміст компонента на 25 л середовища, г	Загальна кількість компонентів, г	Кількість води, л
Декстроза	60	1	1500	2125	16,8
Пивні дріжджі	25		625
КН2РО4	1	2	25	78	0,5
NaCl	2		50
MgSО4	0,1		2,5
FeSО4 7H2О	0,01		0,25
ZnSО4 7H2О	0,01		0,25
CaCO3	2	3	50	50	0,5

ДР 3.3.1. Приготування композиції 1

Для приготування розчину композиції на технічних вагах у металевій ємності об'ємом 10 л зважують 1500 г декстрози, 625 г пивних дріжджів та додають 16,8 л питної води (температура 50 0С). Компоненти розчиняють перемішуванням. Розчин компонентів переносять в стерилізатор ємкісного типу об'ємом 30 л. Стерилізація відбувається подачею пари в апарат. Надлишковий тиск в апараті 0,05 МПа, температура 1120С. Тривалість стерилізації становить 30 хв. Об'єм конденсату становить 2,38 л. Стерильний розчин компонентів передають в інокулятор.

ДР 3.3.2. Приготування композиції 2

Для приготування мінеральних солей зважують на електронних вагах , г: NaCl - 50, КН2РО4 - 25, MgSО4 - 2,5, FeSО4 7H2О - 0,25, ZnSО4 7H2О - 0,25. Наважки переносять в стерильну колбу об'ємом 1000 мл та додають питну воду (температура 500С) об'ємом 500 мл. Інтенсивно перемішують. Колбу закривають ватно-марлевою пробкою і стерилізують в автоклаві при температурі 1310С протягом 50 хв.

Р3.3.3. Підготовка композиції 3

Для приготування суспензії карбонату кальцію зважують на електронних вагах 50 г CaCO3. Наважку переносять в стерильну колбу об'ємом 1000 мл та додають питну воду (температура 500С) об'ємом 500 мл. Інтенсивно перемішують. Колбу закривають ватно-марлевою пробкою і стерилізують в автоклаві при температурі 1310С протягом 50 хв.

ДР 3.4. Приготування поживного середовища для посівного апарату

Об`єм композиції для посівного апарату становить 250 л. Отже розрахуємо необхідну кількість компонентів та води, що необхідні для приготування заданої кількості поживного середовища. Слід врахувати 25 л посівного матеріалу, одержаного на попередній стадії.

Розрахунок кількості компонентів для 250 л поживного середовища

Склад поживного середовища, г/л	Компо-зиція	Вміст компонента на 250 л середовища, г	Загальна кількість компонентів, г	Кількість води, л
Декстроза	60	1	15000	21250	168
Пивні дріжджі	25		6250
КН2РО4	1	2	250	780	4,43
NaCl	2		500
MgSО4	0,1		25
FeSО4 7H2О	0,01		2,5
ZnSО4 7H2О	0,01		2,5
CaCO3	2	3	500	500	4,5

ДР 3.4.1. Приготування композиції 1

Для приготування розчину композиції на технічних вагах у металевій ємності, об'ємом 200 л зважують 15000 г декстрози, 6250 г пивних дріжджів та додають 168 л питної води (температура 50 0С). Компоненти розчиняють перемішуванням. Розчин компонентів переносять в стерилізатор ємкісного типу об'ємом 300 л. Стерилізація відбувається подачею пари в апарат. Надлишковий тиск в апараті 0,05 МПа, температура 1120С. Тривалість стерилізації становить 30 хв. Об'єм конденсату становить 23,8 л. Стерильний розчин компонентів передають в інокулятор.

ДР 3.4.2. Приготування композиції 2

Для приготування розчину мінеральних солей на технічних вагах, у металевій ємності об'ємом 10 л зважують, г: NaCl - 500, КН2РО4 - 250, MgSО4 - 25, FeSО4 7H2О - 2,5, ZnSО4 7H2О - 2,5 та додають 4,43 л питної води (температура 50 0С). Компоненти розчиняють перемішуванням. Розчин компонентів переносять в інокулятор об'ємом 500 л. Отриманий розчин стерилізують подачею пари в апарат при 0,15 МПа та температурі 1310С протягом 50 хв. Об'єм конденсату становить 0,57 л.

ДР 3.4.3. Приготування композиції 2

Для приготування розчину мінеральних солей на технічних вагах, у металевій ємності об'ємом 10 л зважують 500 г CaCO3 та додають 4,5 л питної води (температура 50 0С). Ретельно перемішують. Отриману суспензію стерилізують в стерилізаторі ємкісного типу подачею пари в апарат при 0,15 МПа та температурі 1310С протягом 50 хв. Об'єм конденсату становить 0,55 л.

ДР 3.5. Приготування поживного середовища для виробничого ферментеру

Об`єм композиції для посівного апарату становить 2500 л. Отже розрахуємо необхідну кількість компонентів та води, що необхідні для приготування заданої кількості поживного середовища. Слід врахувати 250 л посівного матеріалу, одержаного на попередній стадії.

Розрахунок кількості компонентів для 2500 л поживного середовища

Склад поживного середовища, г/л	Компо-зиція	Вміст компонента на 2500 л середовища, г	Загальна кількість компонентів, г	Кількість води, л
Декстроза	60	1	150000	212500	1680
Пивні дріжджі	25		62500
КН2РО4	1	2	2500	7800	44,3
NaCl	2		5000
MgSО4	0,1		250
FeSО4 7H2О	0,01		25
ZnSО4 7H2О	0,01		25
CaCO3	2	3	5000	5000	45

ДР 3.4.1. Приготування композиції 1

Для приготування розчину композиції за допомогою об'ємно-вагового дозатора у металевій ємності, об'ємом 1000 л зважують 150000 г декстрози, 62500 г пивних дріжджів та додають 1680 л питної води (температура 50 0С). Компоненти розчиняють перемішуванням. Розчин компонентів переносять в стерилізатор ємкісного типу об'ємом 3000 л. Стерилізація відбувається подачею пари в апарат. Надлишковий тиск в апараті 0,05 МПа, температура 1120С. Тривалість стерилізації становить 30 хв. Об'єм конденсату становить 238 л. Стерильний розчин компонентів передають в інокулятор.

ДР 3.5.2. Приготування композиції 2

Для приготування розчину мінеральних солей на технічних вагах, у металевій ємності об'ємом 10 л зважують, г: NaCl - 500, КН2РО4 - 250, MgSО4 - 25, FeSО4 7H2О - 2,5, ZnSО4 7H2О - 2,5 та додають 44,3 л питної води (температура 50 0С). Компоненти розчиняють перемішуванням. Розчин компонентів переносять в інокулятор об'ємом 500 л. Отриманий розчин стерилізують подачею пари в апарат при 0,15 МПа та температурі 1310С протягом 50 хв. Об'єм конденсату становить 5,7 л.

ДР 3.5.3. Приготування композиції 2

Для приготування розчину мінеральних солей на технічних вагах, у металевій ємності об'ємом 10 л зважують 5000 г CaCO3 та додають 45 л питної води (температура 50 0С). Ретельно перемішують. Отриману суспензію стерилізують в стерилізаторі ємкісного типу подачею пари в апарат при 0,15 МПа та температурі 1310С протягом 50 хв. Об'єм конденсату становить 5,5 л.

ДР 4. Підготовка посівного матеріалу

Посівний матеріал готують глибинним способом.

ДР 4.1. Приготування посівного матеріалу в колбах на качалках 1

У 2 колби місткістю 750 см3 наливають по 125 мл стерильного поживного середовища та в стерильних умовах (при полум'ї пальника) здійснюють його засів. Культуру вносять в поживне середовище з розрахунку - одна пробірка на одну колбу. Колби ставлять на качалки з частотою обертання 120 об/хв, при температурі 28 °С та здійснюють культивування протягом 7 діб. Обов'язковою стадією є мікробіологічний контроль сторонньої мікрофлори.

ДР 4.2. Приготування посівного матеріалу в колбах на качалці 2

Даний етап проводять у колбах для одержання 2,5 л інокуляту. Після підготовки поживного середовища подається посівний матеріал з попередньої стадії. Подача посівного матеріалу в колби здійснюється в стерильних умовах (при полум'ї пальника). Приготування посівного матеріалу проводиться протягом 80 год при температурі 28 °С, рН 7,2 при постійному перемішуванні. Обов'язковою стадією є мікробіологічний контроль сторонньої мікрофлори.

ТП 4.3. Приготування посівного матеріалу в інокуляторі

Для одержання 25 л інокуляту, стерильне поживне середовище у попередньо простерилізованому інокуляторі місткістю 0,05 м3 засіваємо через трубу перетискування. Культивування проводиться протягом 80 год при температурі 28°С, рН = 7,2, постійному перемішуванні та аерації. Обов'язковою стадією є мікробіологічний контроль сторонньої мікрофлори.

ТП 4.4. Приготування посівного матеріалу в посівному апараті

Культивування проводять у посівному апараті загальним об'ємом 0,5 м3 для одержання 0,25 м3 інокуляту. Поживне середовище засівають через трубу перетискування, додають посівний матеріал з попередньої стадії. Культивування проводять протягом 80 год при температурі 28 °С, рН 7,2, постійному перемішуванні та аерації. Обов'язковою стадією є мікробіологічний контроль сторонньої мікрофлори.

ТП 5. Біосинтез

ТП. 5.1. Виробниче культивування

У попередньо простерилізований ферментер об'ємом 5 м3 подають стерильне поживне середовище. Подача посівного матеріалу в ферментер здійснюється через трубу перетискування. Піногасник буде подаватися дозовано, по сигналу датчика піни з реактора.

Культивування проводять протягом 148 год при температурі 28 °С, рН 7,2 при постійному перемішуванні та аерації.. Відпрацьоване повітря йде на знешкодження відходів. Обов'язковою стадією є мікробіологічний контроль сторонньої мікрофлори.



РОЗДІЛ 8. КОНТРОЛЬ ВИРОБНИЦТВА

8.1 Карта постадійного контролю

Номер контрольної точки та назва стадії	Об'єкт контролю і показник, що визначається	Методи контролю	Періодичність перевірки та порядок відбору проб	Нормативна характеристика показника, що визначається
К1.2.1 Технологічний контроль приготування розчину Хлороциду	Концентрація розчину	Фізичні методи визначення концентра- ції	Після приготування розчинів	С = 3 % ф = 4 хв
К1.2.2 Технологічний контроль приготування розчину Дексоциду	Концентрація розчину	Фізичні методи визначення концентра-ції.	Після приготування розчинів.	С = 0,3 %
К1.2.3 Технологічний контроль приготування розчину каустичної соди	Концентрація розчину	Фізичні методи визначення концентра-ції.	Після приготування розчинів.	С = 2 % t = 26 0С ф = 5 хв
К1.3.2 Технологічний контроль щоденного прибирання	Концентрація мікроорганіз-мів	Мікробіологічний метод, висіви на чашки Петрі	Після щоденного прибирання	КУО < 400
К1.3.2 Технологічний контроль генерального прибирання	Концентрація мікроорганіз-мів	Мікробіологічний метод, висіви на чашки Петрі	Після генеральногоприбирання	КУО < 200
К1.4.1 Технологічний контроль миття обладнань та комунікацій	Температура та час	Термометр технічний, годинник	Під час проведення миття	t= 70 oC ф = 15 хв
К1.4.2 Технологічний контроль ополіскування обладнань і комунікацій	Температура	Термометр технічний,	Під час проведення ополісківання	t = 20 oC
К1.4.3 Технологічний контроль герметичності обладнання	Тиск	Датчик	Після миття та ополіс-кувавння обладнання	Р = 0,5 МПа ф = 30 хв
К1.4.4 Технологічний контроль стерилізації обладнання та комунікацій	Режим стерилізації вузлів обладнання. Тиск. Температура.	Манометр технічний Термометр	Температура та тиск визначаються безперервнопід час виробничогопроцесу.	P = 0,2 МПа ф = 20 хв t = 140 oC
К2.1. Технологічний контроль очищення повітря від пилу та механічних часток	Ступінь чистоти	Часточки бруду; манометр	Пезперервно при подачі повітря	Е = 80 %
К2.3. Технологічний контроль стиснення повітря	Тиск, температура	Часточки бруду; манометр	Пезперервно при подачі повітря	Р = 0,35 МПа t = 120 oC
К2.4.Технологічний контроль при стабілізації термодинамічних показників повітря	Температура, тиск, вологість	Термометр, барометр, вологомір	Безпосередньо під час нагрівання	t = 60 ?С, Р = 0,35 МПа W = 60 %.
К2.5. Технологічний та мікробіологічний контроль стерильності повітря в головному фільтрі	Повітря, вміст мікроорганізмів та часток	Мікробна контрміна-ція (проба повітря КУО/м3) Седиментаційний (седи-ментація на пластинку КУО/м3)	Під час кожної зміни, під час виробничого біосинтезу	Не повинно бути життєздатних мікроорганізмів, та макси-мально допустиме число часток в 1м3 повітря 200. Е = 95%
К2.6. Технологічний і мікробіологічний контроль повітря після очищення в індивідуальному фільтрі	Ступінь чистоти	Часточки бруду; манометр	Пезперервно при подачі повітря	Е = 99,999 % КУО < 1
К3.1. Технологічний контроль стерилізації піногасника	Концентрація компонентів Температура Ча	Термометр технічний Годинник	Безперервно під час вирощування посівного матеріалу в ферментері	ф = 30 хв t= 131 °С КУО < 1
К4.1. Технологічний контроль при приготуванні соляної кислоти	Концентрація соляної кислоти	Фізико-хімічний метод	Після приготування розчину	С = 6 %
К4.2. Технологічний контроль приготування розчину гідроксиду натрію	Концентрація гідроксиду натрію	Фізико-хімічний метод	Після приготування емульсії	С = 10 %
К5.1.1.; К5.2.1. К5.3.1.; К5.4.1. К5.5.1.; К5.6.1. Мікробіологічний та технологічний контроль приготування та стерилізації композиції А	Режим стерилізації розчину Температура Час Мікробна контамінація	Технічний термометр годинник чашки Петрі	Температура визначається безперервно під час стерилізації. Автоматичний регулятор температури Мікробіологічний метод, розведення та висів на МПА	t = 112?С ф = 30 хв КУО < 1
К5.1.2.; К5.2.2. К5.3.2.; К5.4.2. К5.5.2.; К5.6.2. Мікробіологічний та технологічний контроль приготування та стерилізації композиції Б	Режим стерилізації розчину солей Температура Час Мікробна контамінація	Технічний термометр годинник чашки Петрі	Температура визначається безперервно під час стерилізації. Автоматичний регулятор температури Мікробіологічний метод, розведення та висів на МПА	t = 131?С ф = 40 хв КУО < 1
К6.1. Технологічний та мікробіоло-гічний контроль вирощування посівного матеріалу в колбах на качалці	Температура Час рН Кількість обертів	Термометр технічний рН-метр Годинник	Під час вирощування посівного матеріалу в колбах	t = 30 °С pH = 7,2 ф = 24 год w = 280 об/хв. Х = 4,5 г/л КУО ст. м. < 1
К6.2. Технологічний та мікробіоло-гічний контроль вирощування посівного матеріалу в І інокуляторі.	Температура Час рН Концентрація біомаси	рН-метр, Термометр Годинник	Під час вирощування посівного матеріалу в інокуляторі	рН =7,2, ф = 24 год, t = 30 ?С Х = 4,5 г/л КУО ст. м. < 1
К6.3. Технологічний та мікробіоло-гічний контроль вирощування посівного матеріалу в ІІ інокуляторі.	Температура Час рН Концентрація біомаси	рН-метр, Термометр Годинник	Під час вирощування посівного матеріалу в інокуляторі	рН =7,2, ф = 24 год, t = 30 ?С Х = 4,5 г/л КУО ст. м. < 1
К6.4. Технологічний та мікробіоло-гічний конт-роль вирощу-вання посівно-го матеріалу в ІІІ інокуляторі	Температура Час рН Концентрація біомаси	рН-метр, Термометр Годинник	Під час вирощування посівного матеріалу в інокуляторі	рН =7,2, ф = 24 год, t = 30 ?С Х = 4,5 г/л КУО ст. м. < 1
К6.5. Технологічний та мікробіоло-гічний конт-роль вирощу-вання посівно-го матеріалу в посівному апараті	Температура Час рН Концентрація біомаси	рН-метр, Термометр Годинник	Під час вирощування посівного матеріалу в посівному апараті	рН =7,2, ф = 24 год, t = 30 ?С Х = 4,5 г/л КУО ст. м. < 1
К7.1., К7.2., К7.3., Технологічний та мікробіоло-гічний контроль при виробничому культивуванні.	Температура Час рН Концентрація біомаси	рН-метр, Термометр Годинник	Під час вирощування посівного матеріалу в ферментері	рН =7,2, ф = 72 год, t = 30 ?С Х = 6 г/л КУО ст. м. < 1

8.2 Мікробіологічний контроль

Визначення концентрації біомаси

Концентрацію біомаси визначаємо за оптичною густиною клітинної суспензії із наступним перерахунком на абсолютно суху біомасу у відповідності з калібрувальним графіком.

Культуральна рідина розводиться дистильованою водою у співвідношенні 1:9. Суміш збовтується, потім вимірюється оптична густина (при 540 нм), отримані дані перераховують за калібрувальним графіком [3].

Визначення концентрації цільового продукту

Концентрацію цільової речовини визначають методом обернено-фазової рідинної хроматографії високого тиску.

Використовується колонка (4,6 х 250 мм, 5 мкм розмір часточок) зі швидкістю потоку 0,385 мл/хв. Рухома фаза А водний 0,2 % розчин трифтороцтової кислоти, а рухома фаза В - 0,078% розчин три хлороцтової кислоти в ацетонітрилі. Елюцію проводять за лінійним градієнтом від 20 до 60% фази В по фазі на 33 хв. Контролюють за допомогою діодного множинного детектора, встановленого на 488 нм. Доксорубіцин концентрацією 10 мкг/мл розчинений в метанолі використовують в якості стандарту для визначення кількості цього метаболіту в ізольованих культурах [27].

Визначення концентрації джерела вуглецю

Суть методу визначення концентрації джерела вуглецю полягає в утворенні Cu(OH)2, при змішуванні робочих розчинів Фелінга І та Фелінга ІІ, який легко відновлюється до вільної міді альдегідної групи глюкози. Мідь, яка виділяється, відновлює KI до вільного йоду, який відтитровують тіосульфатом натрію. Як індикатор використовується крохмаль.

Для культивування S. peucetius використовується поживне середовище джерелом вуглецю в якому є декстроза. Перед початком висначення декстроза гідролізується за допомогою 5 % розчину соляної кислоти 30 хв, при температурі 40 °С. По закінченню гідролізу суміш нейтралізують розчином гідроокису натрію до рН 7,0.

Для визначення глюкози, в колбу вноситься 5 - 9 мл розчину, що досліджується і доводиться дистильованою водою до загального об'єму 10 мл.

Додають по 10 мл розчину Фелінга І і Фелінга ІІ. Колбу ставлять на нагрівник та кип'ятять 2 хвилини. Після охолодження додають 15 - 20 мл 20 % сірчаної кислоти і 3 г йодистого калію. Виділений йод титрують 0,1 н розчином тіосульфату. Коли розчин йоду починає світлішати, додають 2 - 3 краплини крохмалю і продовжують титрувати до зникнення синього забарвлення і виділення синього осаду. Кількість міді, яка пішла на реакцію з глюкозою, визначають за формулою:

Сu = ((a ? b) Ч k Ч 6,36) / C, де

а - кількість 0,1 н розчину тіосульфату, яка пішла на титрування досліджуваного розчину, мл;

b - кількість 0,1 н розчину тіосульфату, яка пішла на титрування контрольного розчину, мл;

k - поправочний коефіцієнт, k = 1;

6,36 - кількість мл Cu, яка відповідає 1 мл 0,1 н тіосульфату;

С - кількість досліджуваного розчину, яка пішла на титр, мл.

Визначення азоту амінних груп методом формольного титрування

Методи кількісного визначення амінокислот досить різноманітні і чисельні. У деяких випадках необхідно визначити сумарну кількість усіх амінокислот у гідролізаті білків, або в екстрактах з біологічного матеріалу.

Один із таких методів, заснований на визначенні азоту амінних груп, був запропонований Сьоренсеном.

За зміною вмісту амінного азоту можна судити про швидкість гідролізу білка, дії протеолітичних ферментів, швидкість перетворення білків та амінокислот у тканинах організму.

Під час гідролізу білка внаслідок розриву пептидних зв'язків у розчині відбувається збільшення вільних аміно- і карбоксильних груп. Амінокислоти у водних розчинах утворюють внутрішньо молекулярні солі, тому без попереднього блокування аміногруп безпосередньо титрувати лугом карбоксильні групи неможливо. 

Принцип методу грунтується на здатності формальдегіду зв'язувати вільні аміногрупи з утворенням метиленових похідних амінокислот. Аміногрупи при цьому втрачають основні властивості, а вільні карбоксильні групи відтитровують розчином лугу.

Існує кілька модифікацій методу формольного титрування, в основі яких лежать наведені реакції.

Матеріали та реактиви: 1. 0,25%-й розчин гліцину або гідролізат білка; 2. 0,1%-спиртовий розчин фенолфталеїну; 3. 0,1 н. розчин гідроксиду натрію; 4. Формольна суміш (до 6 мл 20%-го розчину формальдегіду додають краплину фенолфталеїну і краплинами 0,1 н. розчин гідроксиду натрію до почервоніння рідини. Суміш готують перед початком роботи).

Хід роботи. У колбу на 25 мл наливають 3 мл 0,25%-го розчину амінокислот (наприклад, гліцину) або гідролізату білка; додають краплину 0,1%-го спиртового розчину фенолфталеїну і краплинами 0,1 н. розчин їдкого натру до почервоніння рідини. У нейтралізований таким чином гліцин доливають 2 мл формольної суміші. При цьому червоне забарвлення розчину зникає. Далі титрують 0,1 н. розчином гідроксиду натрію до появи червоного забарвлення.

Мікробіологічний контроль

В першу чергу, перевірка чистоти культуральної рідини проводиться з використанням методу мікроскопіювання, результати методу будуть позитивними, якщо виявленими будуть лише колонії S. peucetius. Проте не завжди вдається отримати точні результати за даним аналізом, оскільки деякі мікроорганізми мають дуже малі розміри. Тому наступною стадією є виділення ізольованих колоній на чашках Петрі з м'ясо-пептонним агаром (МПА ? для бактерій) та сусло-агаром (СА ? для грибів і дріжджів).

Частота перевірки стерильності культуральної рідини приблизно кожні 5 години. Після інкубації посівів на середовищах МПА не повинен бути виявлений ріст контамінуючої мікрофлори [2].



ЛІТЕРАТУРА

Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии. - Москва, «Химия» - «Колос», 2004 г. - 296 с.

Буценко Л. М., Пенчук Ю.М., Пирог Т.П. Технології мікробного синтезу лікарських засобів: Навч. посіб. - К.: НУХТ, 2010. - 323c.

Валагурова Е. В., Козырицкая В.Е. Актиномицеты рода Streptomyces. Описание видов, их идентификация. - К.: Наукова думка, 2003. - 647c.

Гордєєва Ю. Л., Івашкін Ю. А., Гордєєв Л. С. Алгоритми розрахунку показників процесу мікробіологічного синтезу в періодичних умовах культивування // Вісник Астрахан. держ. техн. ун-та. Сер: Управління, обчислювальна техніка та інформатика. - 2011. - № 2. - С. 7-14.

Дубицька Л. П., Федоренко В.О. Характеристика мутантів Streptomyces peucetius subsp.caesius ATCC 27952, cтійких до антрациклінових антибіотиків // Мікробіол. журн. - 2001. - С. 53-61.

Дубицька Л.П., Федоренко В.О. Характеристика мутантів Streptomyces peucetius subsp.caesius ATCC27952-2, cтійких до хлорамфеніколу // Вісн. Львів. ун-ту. - 2002. - С.105-113.

Дудниченко А.С. Новые возможности в лечении рака // Провизор.-- 2000. - C 32 - 39.

Егоров Н.С. Биотехнология: проблемы и перспективы. - М.: Высшая школа, 1997. - 208 c.

Коломбо А. Л, Хатчинсон. Генная инженерия доксорубицина производства в Streptomyces peucetius // Microbiol. Biotechnol. J. - 1999. - P. 29 - 41.

Леонтьева О. В. Взаимодействие новых полусинтетических производных антрациклиновых антибиотиков с чувствительными и резистентными опухолевыми клетками in vitro. Автореф. дис. кандидат биологич. наук. - Москва, 1995. - C. 44 - 50.

Малежик І. Процеси та апарати харчових виробництв. - К.: НУХТ, 2003. - с. 400.

Мацелюх А. Б. Стрептоміцети - продуценти антибіотиків // Мікробіол. журнал. - 2003. - 214 с.

Никитин А. В. Антибиотики и макроорганизм// Антибиотики и химиотерапия. -- 2000. -- № 12. -- С. 31-36.

Новіков В., Сидоров Ю., Швед О. Тенденції розвитку комерційної біотехнології. // Вісн. НАН України. - 2008. - 459 c.

Пат. 2205222 USA, МПК 7 C12P19/56. Способ получения доксорубицина и средства для его осуществления / Бреме Умберто // заявл. 20.05.1999. опубл. 27.05.2003.

Пирог Т.П., Ігнатова О.А. Загальна біотехнологія. - К.: НУХТ, 2009. - 314 с.

Федоренко В.О.; НАН України. Ін-т клітин. біології та генет. інженерії. Автореф. дис... д-ра біол. наук: 03.00.15-- К., 2004. -- 32 с.

Donadio S., Maffioli S., Monciardini P. Antibiotic discovery in the 21st century: current trends and future perspectives // J. Antibiotics. - 2010. - P. 2 - 15.

Ducep J., Farge D., Ponsinet G. Daunorubicin derivatives. USA, 2001

Hyung-Moo J., Marimuthu J., Sang-Uong Kim et al. Biosynthesis, biotechnological production and application of teicoplanin: current state and perspectives // Appl. Microbiol. Biotechnol, - 2009. - P. 16 - 30.

Kiviharju   С., Leisola М. і Eerikаinen T. Optimization of Streptomyces peucetius var. caesius N47 cultivation and е-rhodomycinone production using experimental designs and response surface methods // J. of Ind. Microbiol. and Biotechnol. - 2004. - P. 24 - 28.

Makitrynskyy R., Rebets Y., Ostash B. et al. Genetics factors that influence moenomycin production in Streptomycetes // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. - 2010. - P. 46 - 49.

Malla Sailesh Self-resistance mechanism in Streptomyces peucetius: overexpression of drrA, drrB and drrC for doxorubicin enhancement // Microbiol. Research http://www.sciencedirect.com/science/journal/13891723 - 2009. - P. 259-267.

Mayra K. M. Antibiotics produced by Streptomyces // Braz. journal of infectious. - 2012. - P. 12 - 21.

Ranjan P., Padmanabhan S., Sankara N.. Regulation of Daunorubicin production in Streptomyces peucetius // J. of Bacteriol. - 2010. - Р. 30 - 38.

Scotti C.,  Hutchinson C. Enhanced antibiotic production by manipulation of the Streptomyces peucetius dnrH and dnmT genes involved in doxorubicin (adriamycin) biosynthesis // J. Bacteriol. - 1996. - Р. 48 - 56.

Enhancement of doxorubicin production by expression of structural sugar biosynthesis and glycosyltransferase genes in S. peucetius [електронний ресурс] www.science direct.com /science / article / pii /S1389172309001406

Adriamycin, 14-hydroxydaimomycin, a new antitumor antibiotic from S. рeucetius var. Caesius [електронний ресурс] www.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ bit.260110607/abstract

Размещено на Allbest.ru