Загальна біотехнологія

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Вступ

Дисципліна «Загальна біотехнологія» є дисципліною бакалаврської підготовки фахівців-біотехнологів, належить до циклу професійної і практичної підготовки, що призначена надати базові знання з технологічного втілення процесів біосинтезу та отримання цінних речовин з використанням мікроорганізмів і інших біологічних об'єктів.

Дана дисципліна є однією з найбільш визначальних у підготовці майбутнього біотехнолога, що допомагає інтегрувати знання, отримані при вивченні таких дисциплін як «Загальна мікробіологія і вірусологія», «Біологія клітини», «Загальна біохімія», «Процеси та апарати біотехнологічних виробництв» і втілити їх у практичній діяльності.

Предметом навчальної дисципліни «Загальна біотехнологія» є вивчення технологій виробництва біологічно-активних речовин або мікробних мас за допомогою біологічних агентів із застосуванням наукових та інженерних методів, опанування основ кінетики фізіологічних перетворень, вивчення методів моделювання клітинних популяцій. У рамках дисципліни розглядаються базові технології, які застосовуються у різноманітних напрямках біотехнології та медицини.

Метою дисципліни є вивчення умов і особливостей культивування біологічних агентів (БА) - продуцентів біологічно-активних речовин (БАР), процесів біосинтезу цільового продукту, методів керування процесами біосинтезу, способів і прийомів промислової реалізації біотехнологічного процесу, а також ознайомлення студентів із принципами розробки біотехнології.

культивування біологічна активна речовина

Лабораторна робота №1

Тема: Оптимізація складу живильних середовищ для культивування промислових штамів - продуцентів біологічно активних речовин.

Мета: Оптимізація якісного і кількісного складу середовища для зростання дріжджів роду Saccharomyces.

Матеріали, реактиви та обладнання: чиста (або накопичувальна) культура Saccharomyces cerevisiae, глюкоза, пептон, сульфат амонію, сахароза, мальтоза, лактоза, агар, МПА, пивне сусло, чашки Петрі, піпетки на 1-2 мл, бактеріологічна петля, тонке предметне та покривне скло, спиртівка (брикети сухого пального), кювета з містком для фіксованих препаратів, розчини метиленового синього (1:40), фуксину основного, генціанвіолету, імерсійне масло, бензин, серветки, фільтрувальний папір, дезінфікуючий розчин, дистильована вода.

Оптимізація біологічного процесу зводиться до експериментального визначення умов, за яких вихід процесу (накопичення біомаси або якого-небудь продукту життєдіяльності) досягає максимального значення. Умови протікання процесу визначаються комплексом чинників, від яких залежить його вихід.

При оптимізації процесу культивування мікроорганізму покращують склад живильного середовища і умови культивування мікроорганізмів: температуру, рН, перемішування, освітлення, аерацію та ін.

Оптимізацію можна проводити за усією сукупністю чинників, що впливають на вихід процесу за допомогою математичного планування експерименту. Це достатньо трудомістке дослідження. На практиці часто доводиться стикатися з більш вузьким завданням підбору оптимального складу середовищ за заданих умов культивування, тобто при постійному рівні решти чинників. З фізіологічних відомостей можна вивести загальну форму залежності врожаю культури від концентрацій кожного окремого компонента середовища. Вид цієї залежності надано на рисунку.



Відрізок АВ відповідає області концентрацій, що лімітують урожай культури («лімітуюча область»); відрізок ВС - області, в межах якої зміна концентрації даного компонента не викликає помітної зміни урожаю («стаціонарна область»); відрізок CD - області, в якій зростання культури пригнічується надмірною концентрацією компонента («інгібіруюча область»). Для різних компонентів загальний вид залежності буде зберігатися, але набуває індивідуальних особливостей, що виражаються в різному нахилі і кривизні ділянок АВ і CD, протяжності ділянки ВС. Розглянутий вид залежності визначає вплив одного чинника на врожай культури. Проте при складанні середовищ, що є сукупністю багатьох компонентів, потрібно враховувати ефект їх сумісного впливу на величину врожаю. Вибір критерію оптимізації визначається конкретними вимогами завдання. Величина критерію оптимізації, тобто «вихід процесу» може бути виражений різними одиницями (оптичною щільністю суспензії, числом клітин, сухою масою і т.д.). В усякому разі, критерій оптимізації повинен бути безперервною чисельною величиною в усьому інтервалі існування біологічної системи, виміряти яку дослідник може за допомогою наявних у його розпорядженні засобів (приладів). Важливим моментом є вибір тривалості досліджуваного процесу, оскільки вона впливає на вихід процесу. Проте, оскільки максимальна біомаса для екстенсивної культури накопичується в стаціонарну фазу, для якої характерна відсутність зміни біомаси в часі, представляється можливим заздалегідь призначити час досліду, відповідний цій фазі. Практичне вирішення даної задачі полегшується тим, що тривалість стаціонарної фази для більшості відомих культур мікроорганізмів порівняно велика.

При підборі середовища для культури, що оптимізується, необхідно вибрати найбільш відповідні форми хімічних сполук, в яких присутні, перш за все, біогенні елементи (С, N, P, S), а також макро- і мікроелементи. Особливо важко це зробити по відношенню до азоту (що використовується у вигляді NO₃, NH₄⁺, R-NH₂, NO₂, N₂ і т.д.) і вуглецю (хімічна форма якого визначає фізіологічний тип живлення мікроорганізмів, - авто - або гетеротрофія). Як відомо, багато організмів здатні використовувати велике число хімічно різнорідних джерел вуглецю та азоту, причому частина з них залучається до процесів метаболізму одночасно і незалежно один від одного. Це дає підставу іноді включати до складу середовища декілька різних сполук вуглецю.

Таким чином, першим етапом вибору оптимального складу середовища являється якісний відбір необхідних для даної культури хімічних форм біогенних елементів. Вирішення цієї задачі може бути значно полегшено наявністю апріорних відомостей про культуру, що вивчається. В основу складу середовища, що оптимізується, може покладатися раніше відомий для цієї культури склад середовища, до якого повинні бути додані речовини, що надають позитивний ефект на зростання культури.

Наступним етапом є кількісна оцінка впливу відібраних компонентів на врожай досліджуваної культури. З числа компонентів середовища виділяють тільки ті, зміна концентрацій яких найсильніше позначається на врожаї, що дозволяє провести ранжування компонентів відповідно до міри їх впливу на врожай культури.

Хлібопекарські дріжджі роду Saccharomyces cerevisiae являють собою біомасу дріжджових клітин, що містять багатий комплекс біологічно активних речовин та володіють ферментативною активністю, яка забезпечує інтенсивне зброджування цукрів борошна і розпушування тіста. Дріжджі багаті вітамінами (рибофлавін, ергостерин, пантотенова, нікотинова та фолієва кислоти) і тому являються цінним продуктом для вітамінізації хлібобулочних виробів. У зв'язку з цим, хлібопекарські дріжджі роду Saccharomyces cerevisiae було обрано об'єктом дослідження для оптимізації складу поживних середовищ для культивування промислових штамів - продуцентів біологічно активних речовин.

Дріжджі - це одноядерні клітини (відносно мікроорганізмів мають великі розміри) еукаріотичної будови, відносяться до сімейства грибів (мікроскопічні), але не мають здатності утворювати гіфи, характеризуються хемогетеротрофним типом живлення, являються факультативними анаеробами та мезофільними організмами, розмножуються брунькуванням або діленням.

Дріжджі не зброджують полісахариди (крохмаль, клітковину), тому для їх культивування треба застосовувати моносахариди або проводити попередню обробку сировини (зазвичай рослинної) амілолітичними та іншими ферментами для оцукрювання полісахаридів живильного середовища до простих моносахаридів - глюкози. Оптимальним середовищем для культивування дріжджів є середовище Сабуро - живильне середовище для грибів: складається з 2%-го агарового гелю, 1%-го пептону, 4%-ї мальтози, рН 6,5-7. Стерилізують дане середовище протягом 15 хв при 120°С. Для зберігання грибів застосовують «середовище зберігання», аналогічного складу, але без додавання вуглеводу.

Порядок виконання роботи

Робота проводиться за трьома етапами.

На першому занятті:

1. Для з'ясування здатності культури дріжджів розвиватися на середовищах з різними цукрами приготувати 200 мл середовища наступного складу (г/100 мл): пептон - 0,2; КН₂РО₄ - 0,25, вода водопровідна. Розлити середовище в 5 колб по 60 мл у кожну. У 1-у колбу додати глюкозу, у 2-у - лактозу, у 3-у - мальтозу, у 4-у - сахарозу. Цукри додавати в концентрації 2%. Середовище в 5-ій колбі - контрольне, тобто не містить джерела вуглецю. Всі приготовані середовища розлити по 20 мл у 10 мікробіологічних пробірок (по 2 пробірки на кожен варіант). Заздалегідь у кожну пробірку внести поплавець запаяним кінцем догори. Поплавець повинен бути цілком заповнений середовищем. Пробірки з середовищами віддати на стерилізацію при 0,5 атм.

2. Приготувати середовище для з'ясування аерації на зростання дріжджів. Для цього в дві однакові високі вузькі пробірки і дві однакові конічні колби налити один і той же об'єм пивного сусла (8°Б) або середовища Сабуро. Шар живильного середовища в колбах повинен бути не більше 1 см, що забезпечить вільний доступ кисню, тоді як шар рідини в пробірках повинен бути якомога вище, щоб ускладнити доступ кисню. Середовища в колбах і пробірках віддати на стерилізацію при 0,5 атм.

Готуємо 140 мл середовища (сахароза / глюкоза - 5%, пептон - 1%, КН₂РО₄ - 0,05%). 40 мл середовища використовуємо для дослідження аерації (по 10 мл у кожну з 2-х пробірок та по 10 мл у кожну з 2-х колб). 100 мл середовища (для ЛР №2) розливаємо на 2 колби: 60 мл середовища залишаємо рідким, до 40 мл додаємо 2-2,5% агару і віддаємо на стерилізацію при 1 атм. Для дослідження стерильності (ЛР №2) із застосуванням бактеріальної культури треба застосовувати МПБ (60 мл) та МПА (40 мл).

3. З метою оптимізації середовища за концентрацією вуглеводу приготувати 40 мл живильного середовища, що містить 1% пептону. Розлити середовище в 2 колби по 20 мл у кожну. У першу колбу внести 1% глюкози (сахарози), у другу - 10%. Розлити по 10 мл у 4 мікробіологічні пробірки і віддати на стерилізації при 0,5 атм. (див табл. 1). Дані про культивування дріжджів із застосуванням 5% глюкози взяти з пункту 2 - дослідження впливу аерації (у пробірках).

4. Приготувати і віддати на стерилізацію 20 мл живильного середовища із 5% глюкозою (розлиті по 10 мл у 2 пробірки), але без пептону. Як джерело азотного живлення використовувати сульфат амонію у концентрації 0,5%. Результати порівняти із пунктом 2 - дослідження впливу аерації (у пробірках) при застосуванні 5% глюкози та 1% пептону.

5. Розлити водопровідну воду у 10 пробірок по 10 мл і віддати на стерилізацію при 1 атм.

6. Підготувати до стерилізації 5 піпеток на 1-2 мл.

7. Підготувати до стерилізації 4 чашок Петрі (для ЛР №2).

На другому занятті:

1. Приготувати суспензію чистої культури дріжджів у стерильній водопровідній воді (провести мікроскопію, оцінити чистоту і фізіологічний стан дріжджів).

2. Поставити досліди для з'ясування впливу аерації на зростання культури дріжджів і виявлення їх здатності використовувати цукор і джерела азоту. Засіяти живильні середовища в пробірках і колбах однаковою кількістю (2-3 краплі) приготованої суспензії. Поставити на культивування в термостат, через добу помістити в холодильник до наступного заняття.

На третьому занятті:

1. Порівняти розвиток дріжджів у різних умовах аерації. Вивчити морфологічні особливості дріжджів, звернути увагу на спосіб розмноження, провести мікроскопічні дослідження на наявність глікогену і волютину. Приготувати тимчасовий препарат «роздавлена крапля», із використанням метиленового синього (1:40) для визначення співвідношення мертвих і живих клітин. Зростання культури оцінити нефелометрично (див. МУ №980).

2. Дослідити інтенсивність зростання дріжджів на різних варіантах середовищ залежно від концентрації основного субстрату, що вміщує вуглевод (вуглевод) і джерела азотного живлення. Для цього зробити підрахунок клітин у камері Горяєва (див. МУ №1016). Аналогічно, приготувати мікроскопічні препарати та проаналізувати фізіологічний стан дріжджів після культивування на дослідних середовищах. Результати дослідження (у відносних одиницях) занести в таблицю 1. Оформити роботу, зробити висновки.

Таблиця 1

№ середовища	Компоненти живильного середовища	Інтенсивність зростання
	Вуглевод (глюкоза або сахароза)	Джерело азотного живлення
		Пептон	Сульфат амонію
1 2 3	1 5 10	1 1 1	- - -
4	5	-	0,5

Контрольні питання:

1. Що розуміють під поняттям «оптимізація умов культивування мікроорганізмів»?

2. «Живильне середовище» - це…?

3. Наведіть класифікацію живильних середовищ за фізичним станом, хімічним складом та призначенням.

4. За якими елементами проводиться оптимізація складу живильних середовищ під час культивування мікроорганізмів?

5. Від чого залежить вибір сировини, що використовується для приготування живильних середовищ?

6. Назвіть та коротко охарактеризуйте фази зростання мікроорганізмів при періодичному культивуванні.

7. За типом вуглецевого живлення мікроорганізми поділяються на…?

8. За відношенням до температури мікроорганізми поділяються на…?

9. За споживанням кисню мікроорганізми поділяються на…?

10. Перелічити оптимальні умови культивування хлібопекарських дріжджів роду Saccharomyces cerevisiae?

Лабораторна робота №2

Тема: Асептика в біотехнологічній промисловості. Мікробіологічний контроль ефективності різних методів стерилізації.

Мета: Вивчити антибактеріальну дію фізичних, хімічних і механічних способів стерилізації.

Матеріали, реактиви та обладнання: чиста культура Saccharomyces cerevisiae, МПА, СА, середовище Сабуро, чашки Петрі, пробірки мікробіологічні, піпетки на 1-2 мл, бактеріологічна петля, тонкі предметні стекла, покривні стекла, спиртівка (брикети сухого пального), кювета з містком для фіксованих препаратів, розчини метиленового синього (1:40), фуксину основного, генцианвіолету, імерсійне масло, бензин, серветки, фільтрувальний папір, дезінфікуючий розчин, дистильована вода, МБР, МБІ, електроплитка.

Біотехнологічні процеси, як правило, проводять в асептичних умовах, хоча можуть бути виключення для деяких з них. Наприклад, при культивуванні окремих еукаріот (дріжджі) у негерметизованих ферментаторах (нестерильний процес) відбувається помітне зниження рН середовища, де домінуюче положення дріжджів не змінюється при потраплянні контамінуючих бактерій (від лат. contaminatio - забруднення, зараження) - вони не можуть скласти конкуренції основному вигляду.

Асептика (від греч. а - не, немає, sepsis - гниття) - це комплекс заходів, що спрямовано на запобігання потрапляння до середовища (об'єкта) сторонніх мікроорганізмів, включно хвороботворні. Отже, асептика в біологічній технології і, наприклад, в хірургії - це не одне і те ж поняття. У першому випадку припускають використання якого-небудь біооб'єкта (зокрема - мікроба) і повне виключення попадання інших мікроорганізмів, що є забруднювачами. У другому випадку прагнуть виключити будь-яку можливість потрапляння патогенних мікробів і мікробів-контамінатів на операційне поле або у рану.

Кожен з матеріальних потоків у біотехнологічних процесах - потенційне джерело мікробів-контамінатів. Джерелом сторонніх мікроорганізмів у біотехнологічних процесах являються сировина (компоненти живильного середовища), обладнання, вода, повітря та самі працівники.

Асептика може включати вологе прибирання приміщень, обробку їх ультрафіолетовими променями, антисептичними засобами, використання стерильних інструментів, середовищ, технологічного одягу, подачу стерильного повітря (столи з ламінарним потоком стерильного повітря в боксових приміщеннях, надходження у ферментатор стерильного повітря через барботер - від франц. barbotage - перемішування) та ін. Отже комплекс засобів, що забезпечує асептику біотехнологічних процесів, включає: механічний, фізичний і хімічний захист біооб'єкта і місця його існування, а при необхідності - і кінцевий продукт. До механічного захисту належать: видалення механічних домішок, наприклад, з повітря, культиваторів, герметизація устаткування, ізоляція вузлів і з'єднань; до фізичної - обробка повітря і поверхонь приладів і апаратів ультрафіолетовими променями, кип'ятіння, стерилізація парою під тиском, обробка ультразвуком; до хімічної - обробка поверхонь хімічними антисептиками.

У виробничих умовах джерелами мікробів-контамінатів можуть бути ґрунт, вода, навколишнє повітря, люди. З ґрунту в сферу біотехнологічних процесів потрапляють спороутворюючі палички-бацили, конідії грибів, актиноміцети; ці ж мікроорганізми з пилом можуть потрапити у повітря, завдяки якому вони здатні проникнути у середовище вирощування біооб'єкта або у кінцевий продукт виробництва.

Якісний склад і розміри часток у повітряному пилу коливаються в широких межах. У виробничих приміщеннях це залежить від конструкційних особливостей будівлі, рози вітрів, географічної зони розташування міста і підприємства, наявності або відсутності потоків автомобільного та іншого транспорту, кількості безпосередньо зайнятих у технологічному процесі людей, характеру і локалізації складських приміщень і так далі.

Пил, що утворюється, та крапельки вологи у повітрі, як правило, містять на своїй поверхні шар адсорбованого повітря і більшу або меншу кількість мікроорганізмів. Газова оболонка запобігає змочуванню часток. Такі частки є дисперсною фазою аерозолю, стійкість якого залежить від розмірів (величини) часток, їх електричного заряду і поверхневої енергії.

З водою у сферу технологічного процесу можуть потрапляти грамнегативні бактерії з групи ентеробактерій, псевдомонад і деяких інших. У природних відкритих водоймищах виявляються целюлозоруйнуючі, нітрифікуючі і денітрифікуючі бактерії, ціанобактерії, амоніфікатори, залізобактерії і багато інших. Лише вода артезіанських колодязів, глибоких свердловин і джерел відрізняється високою чистотою. Слід пам'ятати, що чим більше вода забруднена органічними речовинами, тим більше в ній міститься мікробів. З урахуванням всіх характеристик необхідно здійснювати підготовку води для використання її в біологічній технології.

Люди, зайняті в біотехнологічному виробництві, також можуть бути джерелом контамінуючої мікрофлори - грамнегативних бактерій, коків, мікоплазм, вірусів і ін. Тільки на поверхні шкіри може зосереджуватися до 10¹⁰ мікробних клітин. Найбільш забрудненими є руки, ступні, лікті, шия, груди, промежина, пахові області. Різноманітна і численна мікрофлора ротової порожнини: бактерійні і кокові форми, вібріони, спірили і спірохети, нокардії, дифтероїди, протозойні організми, аспорогенні дріжджі роду Candida, мікоплазми, віруси та ін. При розмові, кашлі, чханні мікроби у великому числі потрапляють у повітря. Встановлено, що здорова людина за одне чхання виділяє до 20000 мікробних клітин, здатних розповсюджуватися по горизонталі, в середньому, до 1,5 м. Крапельки носового слизу, слини і мокроти, підсихаючи, утворюють частинки, покриті білковою або глікопротеїновою оболонкою, що містять і мікробні клітини. У таких частинках мікроорганізми тривало зберігаються і можуть бути причиною нестерильності матеріалів (об'єктів) на яких-небудь технологічних операціях.

Джерелом мікробів-забруднювачів можуть бути деякі компоненти живильних середовищ, наприклад, кукурудзяний екстракт (фаги, дріжджі та ін.). Рослинні віруси часто виявляються в культурах калусних тканин та у культурах клітин тваринних тканин і клітин людини, так як вони являються сприятливими середовищами для контамінаційної мікрофлори.

Мікроби-контамінанти не тільки можуть подавляти розвиток і функції біооб'єкта через конкуренцію, але і дезорганізовувати яку-небудь тканину - середовище вирощування; більш того, деякі з них здатні продукувати токсичні речовини, які можуть потрапити в цільовий продукт (так само як і самі мікроби-забруднювачі).

Захист біотехнологічних процесів від мікробів-контамінантів ефективно здійснюється за допомогою різних фільтрів. Останнім часом широкого розповсюдження набула мембранна фільтрація в цілях отримання стерильних повітря і різних рідин (різновид холодної стерилізації). Більш того, мембрани знайшли застосування в рДНК-біотехнології, в дисперсійному та інших аналізах біомолекул. Багато термолабільних речовин стерилізують такими ж способами.

У біологічній технології, незалежно від умов проведення процесів, широко використовують стерильне повітря, що подається: у ферментатори для аеробних організмів (клітин, клітинних систем); у спеціальні приміщення у вигляді ламінарних потоків для асептичного приготування лікарських засобів, у бокси та операційні аварії, в розпилювальні сушарки для висушування деяких речовин, у шлюзи між (перед) асептичними блоками. Стерилізуюча мембранна фільтрація тут виявляється найбільш прийнятною.

Промисловий випуск мембранних фільтрів був початий з кінця 40-х років поточного сторіччя. Згідно з Р.Е. Кестінгому (1971) найбільш поширеними процесами фільтрації є звичайна фільтрація (її можна назвати макрофільтрацією), мікрофільтрація, ультрафільтрація, діаліз (зворотний осмос). Для макрофільтрації застосовують зазвичай паперові або скляні фільтри. При цьому відокремлюють частинки, розміри яких знаходяться в межах від 1 до 10³ мкм. Для інших типів фільтрації використовують нітроцелюлозу, ацетилцелюлозні, полівінільні, поліамідні, фторвуглеводневі мембрани товщиною менше 0,1 мкм із високим ступенем пористості і з діаметром пори у межах від 10⁴ до 10 мкм. У випадках мікрофільтрації відокремлюють частинки розмірами 2Ч10²-10 мкм, у випадках ультрафільтрації розміри макромолекул, що відділяються при цьому, знаходяться приблизно у межах від 0,001 до 0,02 мкм, а їх молекулярні маси відповідають 1-1000 кДа.

При діалізі через мембрани відокремлюють невеликі молекули, що співставляються за розміром з молекулами розчинника (10^-3 мкм і менше або до 1 нм). Тут речовини розділяються унаслідок різних швидкостей дифузії через мембрану. Розчини, що підлягають стерилізації фільтруванням, повинні зберігатися перед розливом і при подальшому розливі в асептичних умовах. При цьому час між початком приготування розчину і його стерилізацією фільтруванням повинен бути якомога менше.

Будь-який фільтр, що використовується для стерилізуючої фільтрації, не винен якісно і кількісно змінювати кінцевий продукт (у тому числі й антибіотичну активність культуральних рідин після їх стерилізуючої фільтрації через батареї фарфорових свічок).

Повітря, що подається у ферментатори, повинне бути чистим і стерильним. У цих випадках ще використовують і інші матеріали, що фільтрують, якими заповнюються загальні та індивідуальні (для кожного ферментатора) фільтри, наприклад, з перхлорвінілу (у фільтрах Петрянова - ФП), скловати та ін. Профільтроване повітря стискується у компресорах, охолоджується в теплообміннику, надходить у ресивер (від англ. гесiеvег - ємкість), що знімає пульсації повітря, з якого через бризкоуловлювач проходить загальний і індивідуальний фільтри, і лише після цього надходить через барботер в культуральну рідину.

Живильне середовище перед засівом біооб'єктом також повинно бути стерильним. У таких випадках застосовують теплову стерилізацію, піклуючись при цьому про збереження стабільності інгредієнтів середовища. У мікробній біотехнології зазвичай використовують методи періодичної і безперервної стерилізації. Першу з них здійснюють в апаратах малої ємності безпосередньо у ферментаторах глухою або гострою парою під тиском протягом 30-40 хв при температурі 134°С (2,02650Ч10⁵ Па) після видалення повітря з апарата при нагріві до 100°С. Потім середовище охолоджують водою через змійовик або сорочку апарата і засівають тим або іншим біооб'єктом.

Метод безперервної стерилізації заснований на тому, що концентрат живильного середовища подають насосом через систему конструкцій, що включає нагрівач, витримувач (власне стерилізатор) і теплообмінник (охолоджувач, в якому охолоджування середовища відбувається до температури, оптимальної для культивування клітин).

Названі вище методи знезараження відносять до найбільш поширених, проте, враховуючи необхідність стерилізації досить широкого асортименту різних матеріалів, доводиться вдаватися і до інших способів. Цим підтверджується те положення, що універсальних методів стерилізації не існує.

Порядок виконання роботи

Робота проводиться за трьома етапами.

І. На першому занятті приготувати живильне середовище для проведення експерименту: (підготовка може відбуватися на першому занятті лабораторної роботи №1).

1. МПА для роботи із бактеріальною культурою, наприклад Bacillus subtilis.

2. Приготувати 100 мл середовища Сабуро для роботи з грибною культурою, наприклад дріжджі роду Saccharomyces (%) 100 мл: сахароза (глюкоза) - 4

пептон - 1

КН₂РО₄ - 0,05.

Для глибинного культивування 60 мл живильного середовища залишити рідким, для поверхневого культивування до 40 мл додати 2-2,5% агар-агару.

3. Приготувати посуд до стерилізації:

- великі пробірки - 5 шт.;

- чашки Петрі - 4 шт.

Живильне середовище розлити в пробірки і віддати на стерилізацію.

ІІ. На другому занятті провести засів рідкого та агаризованого (попередньо розплавленого) живильного середовища Сабуро культурою мікроорганізмів Saccharomyces cerevisiae (або МПА будь-якою іншою бактерійною культурою). Після цього середовище простерилізувати різними методами.

1. Вивчення антибактеріальної дії високих температур.

У чотири пробірки з живильним середовищем помістити по 2 краплі суспензії досліджуваного мікроорганізму. Першу пробірку піддати автоклавуванню, другу - кип'ятінню протягом 20 хв (100°С), третю витримати у сухожаровій шафі протягом 20 хв (60°С), четверту (контроль) ніякій дії не піддавати. Посіви витримати в термостаті при 28°С протягом 4-7 діб.

2. Вивчення антибактеріальної дії УФ-променів

Суспензію досліджуваного мікроорганізму помістити на стерильне годинникове скло та опромінити лампою БУВ-30 протягом 15 хвилин на відстані 10-20 см від центру лампи. Опромінену і неопромінену (контроль) суспензії засіяти в живильне середовище та інкубувати в термостаті при сприятливій температурі.

3. Визначення антимікробної дії антисептичних речовин

До суспензії досліджуваного мікроорганізму додати невелику кількість антисептичної речовини: фенолу (5%), лізолу (5%), хлорного вапна (10%), етилового спирту (70%), оцтової кислоти. Потім цим мікроорганізмом засіяти живильне середовище. Як контроль використовувати необроблену культуру. Посіви витримати в термостаті.

Диски із фільтрувального паперу змочити розчинами досліджуваних речовин і помістити на поверхню живильного агаризованого середовища в чашки Петрі, засіяні газоном тест-культурою. Чашки інкубувати в термостаті.

Всі досліди провести в декількох (2-3) повторностях.

ІІІ. На третьому занятті проаналізувати отримані результати.

Інтенсивність зростання та облік мікроорганізмів провести кількісно (під мікроскопом у камері Горяєва або нефелометрично).

Про антибактеріальну дію антисептичних речовин, при дослідженні на щільному живильному середовищі, судять по зонах затримки зростання мікроорганізму навколо дисків.

Всі дані занести у таблицю 2 і зробити висновки.

Таблиця 2

№ п/п	Стерилізуючий фактор	Інтенсивність зростання мікроорганізмів

Контрольні питання:

1. Що таке асептика?

2. Що таке дезінфекція?

3. Що таке антисептика?

4. Наведіть джерела інфекції під час виробництва біотехнологічного продукту?

5. Наведіть методи стерилізації поживних середовищ.

6. Наведіть методи стерилізації за принципом дії.

7. Перелічить методи стерилізації спрямовані на створення умов для відмирання мікрофлори.

8. Наведіть приклади фізичних методів стерилізації.

9. Наведіть приклади хімічних методів стерилізації.

10. Наведіть приклади механічних методів стерилізації.

11. Поясніть методику механічного фільтрування та можливості її застосування.

Лабораторна робота №3

Тема: Отримання засівного матеріалу для поверхневого і глибинного культивування промислових мікроорганізмів.

Мета: Вивчити способи отримання засівного матеріалу в промисловості та отримати засівний матеріал промислового мікроорганізму.

Матеріали, реактиви та обладнання: чисті культури Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis, середовище Сабуро, МПА, сусло-агар, фізіологічний розчин, стерильна вода, стерильний посуд (піпетки, чашки Петрі, пробірки), бактеріологічна петля, тонкі предметні скельця, покривні скельця, спиртівка (брикети сухого пального), кювета з містком для фіксованих препаратів, розчини фарбників, імерсійне масло, бензин, серветки, фільтрувальний папір, дезінфікуючий розчин, дистильована вода.

Будь-який біотехнологічний процес починається з підготовки біооб'єкта. Біооб'єкт, або промисловий штам в ідеалі повинен задовольняти наступним основним вимогам:

- стабільність структурно-морфологічних ознак і фізіологічної активності при тривалих зберіганнях і експлуатації у виробництві;

- підвищені швидкості росту і біосинтезу цільового (-их) продукту (-ів) у лабораторних і виробничих умовах;

- достатньо широкий діапазон стійкості до дії несприятливих зовнішніх чинників (коливання температури, рН, аерація, перемішування, в'язкість середовища);

- помірна вимогливість до обмеженого числа джерел живлення; чим ширший набір джерел вуглецю, азоту та інших елементів може використовувати виробничий штам, тим легше його культивувати і з більшою економічною вигодою.

Насправді кожен штам має свої особливості і не за всіма показниками відповідає вимогам, що висуваються для промислових робочих штамів.

Штами промислових мікроорганізмів на біотехнологічні виробництва надходять, в основному, в ампулах або у флаконах, де вони законсервовані у вигляді чистих культур. Штами міцеліальних грибів - на скошеному агаризованому живильному середовищу в мікробіологічних пробірках (під шаром мінеральної олії або без нього). Кожна культура має паспорт з описом живильних середовищ, морфологічних, фізіологічних і інших характеристик, умов для їх підтримки, вирощування і терміну зберігання. Режим зберігання культур припускає охолоджування, заморожування або зневоднення; у всіх випадках повинен бути різко скорочений або повністю припинений клітинний обмін речовин.

Культури мікроорганізмів зберігають:

- на косому агарі при температурі мінус 1-5°С або плюс 1-5°С;

- замороженими при температурі нижче мінус 20°С (неприпустимо повторне відтавання і заморожування);

- ліофілізованими в ампулах, що зберігаються протягом декількох років.

Більшість культур клітин ссавців, у тому числі і клітин людини, вдається зберігати невизначено довгий час замороженими в спеціальному середовищі при температурі мінус 180°С.

Через певний час, специфічний, для кожного виду мікроорганізмів і виду зберігання, культуру пересівають.

Перед початком технологічного процесу культуру, що зберігається в умовах, близьких до анабіозу, оживляють додаванням стерильного рідкого живильного середовища з подальшим висівом на тверде живильне середовище. Переконавшись у достовірності і чистоті культури, її розмножують у стерильних умовах при оптимальному складі живильного середовища і режимі вирощування, методом проліферації. Для цього поступово збільшують об'єм культури, поступово збільшуючи об'єм живильного середовища. У промисловості засівний матеріал, зазвичай, отримують глибинним способом у спеціальних апаратах - інокуляторах.

Засівний матеріал повинен володіти:

- високою життєздатністю;

- бути абсолютно стерильним;

- володіти високою біохімічною активністю.

Засівну культуру продуценту отримують глибинним та поверхневим способами (Рисунки 1-3). Під час виробництва пробіотику «Біоспорин» (продуцент Bacillus subtilis), лимонної кислоти (продуцент Aspergillus niger), вирощування їстівних шапинкових грибів та ін. засівний матеріал одержують не глибинним способам на рідких живильних середовищах, а поверхневим способом. На рисунку 3 зображена схема отримання засівної культури мікроорганізмів - продуцентів біологічно-активних речовин (ферментів, органічних кислот, антибіотиків, пробіотиків тощо). Отримання засівної виробничої культури проводиться у декілька етапів: 1) оновлення початкової культури на агаризованому середовищі; 2) отримання маточної культури; 3) отримання засівної культури (рисунок 4).

Загальна схема отримання промислового засівного матеріалу глибинним способом наступна (див. рис. 1, 2):

Вихідна культура (5 - 10 мл)

Колба на качалці (200 - 1000 мл)

Ферментер для засівного матеріалу - інокулятор (10 - 100 л)

Промисловий ферментер (1000 л і більше)

Під час глибинного культивування (див. рис. 2) початковий продуцент з пробірки 1 пересівають на матраци 2 з великою кількістю агаризованого середовища. З матраців культуру змивають стерильною водою та у вигляді суспензії використовують для засіву колб 3. Частіше засів роблять відразу з пробірки у колби. Колби закріплюють на гойдалці 4, яка струшує рідину у колбах і сприяє розчиненню кисню в середовищі, що забезпечує нормальні умови життєдіяльності мікроорганізмів. Готову культуру з колб збирають в одну ємність при дотриманні правил асептики і переносять в малий інокулятор 5 із стерильним охолодженим середовищем. Засів роблять у полум'ї факела, через засівний патрубок інокулятора. У малий інокулятор через індивідуальний фільтр 6 подається стерильне повітря. Підготовку, стерилізацію та охолоджування живильного середовища проводять у малому інокуляторі. Піногасник стерилізують та охолоджують у спеціальній ємності і подають у малий інокулятор за мірою потреби. Для великого інокулятора 7 середовище готують, як правило, в спеціальних апаратах, потім його стерилізують, охолоджують приблизно до 30-40°С і подають у стерильний охолоджений до 60-70°С великий інокулятор, вирівнюють температуру середовища до оптимальної для вирощуваного продукту. Після цієї операції готову культуру з малого інокулятора передавлюють стерильним повітрям у великий інокулятор на свіже живильне середовище. Культивування на всіх стадіях ведеться при оптимальній температурі та аеруванні.

Міцеліальні гриби вирощують для отримання їстівного білка та як джерело біологічно-активних речовин: ферменти, амінокислоти, органічні кислоти, антибіотики тощо. Мікроскопічний гриб Aspergillus niger являється продуцентом лимонної кислоти, а вищий їстівний гриб Pleurotus ostreatus являється джерелом екологічно чистого білка харчового та кормового призначення.

Одержання засівної культури міцелію вищого їстівного грибу Pleurotus ostreatus поверхневим способом (рис. 4)

Зазвичай, для отримання засівної культури міцелію застосовують зерно злакових культур. Зерно миють, варять, підсушують і вносять мінеральні добавки для регулювання рН. Підготовлене зерно засипають на 2/3 у ємності, зазвичай це 1-3-литрові банки, які закривають і стерилізують автоклавуванням (1,5 години при 1-1,5 атм. та 120єС). Стерильне зерно охолоджують і засівають чистою культурою міцелію (одержану з музейних культур) з пробірок, що знаходиться на агаризованому середовищі. Засіяні банки з міцелієм витримують в інкубаційній камері (22-25єС у приміщенні, вологість повітря 60%). За 3-4 тижні субстрат заростає білим пухким міцелієм. Зрілий засівний міцелій готовий до інокуляції підготовлених субстратних блоків. Засівний міцелій може зберігатися за низьких температур (2-5єС) або у замороженому стані із застосуванням рідкого азоту (до мінус 196єС). Далі засівний міцелій вносять у твердий субстрат (соняшникове лушпиння, солома та інші) для поверхневого вирощування у мішках. Гливу вирощують для отримання їстівних плодових тіл.

Одержання засівної культури міцелію мікроскопічного гриба Aspergillus niger поверхневим способом (Грачева, 1982)

Оновлення культури. Музейну культуру з колекційної пробірки пересаджують у біологічні пробірки (діаметр 18 мм) із свіжим поживним середовищем «сусло-агар» (5-6% пивне сусло та 1,5-2% агару), що скошено. Засіяні пробірки витримують у термостаті при 30єС протягом 3-4 діб. Зростання гриба закінчується інтенсивним спороутворенням.

Отримання засівної культури. У конічні колби ємністю 250 см³ поміщають 15-20 г. пшеничних висівок із вологістю 45%, закривають ватяними пробками і папером. Колби із висівками автоклавують 1 годину при 120єС. Після охолодження висівок у колбах після автоклавування до 30-40єС їх засівають у стерильних умовах суспензією спор мікроскопічного гриба. Суспензію отримують змиванням стерильною водою (1 см³ на одну скошену пробірку) спор із косяка з оновленою культурою. Засіяні колби ставлять до термостату на 2-3 доби при 30єС. За цей час міцелій гриба щільно пронизує субстрат із конідіями жовто-зеленого забарвлення. Даний матеріал являється засівною культурою для подальшої пересадки на тверде живильне середовище у кювети для вирощування поверхневим способом.

Одержання засівної культури міцелію мікроскопічного гриба Aspergillus niger глибинним способом (Фараджева, 2002)

Із спор гриба, ліофілізовано висушених, готують суспензію: 3 г сухих спор замочують у 2-3 дм³ мелясного розчину (відхід цукрового виробництва) і витримують при 32єС у термостаті протягом 5-6 годин (оновлення культури). Отриману суспензію засівають у посівний ферментер (малий інокулятор) із аерацією та перемішуванням. Постійно темпорально проводять аналіз на стерильність. Міцелій спливає на поверхню, знизу залишається прозорий розчин. Міцелій пластівцеподібний, дифузний із світлими тонкими гіфами являється засівною культурою і придатний до подальшого засівання у промисловий ферментер.

Порядок виконання роботи

1. Ознайомитися з промисловими музейними штамами мікроорганізмів і з паспортами до них.

2. Зарисувати форми зберігання промислових мікроорганізмів: Pleurotus ostreatus, Bacillus subtilis, Blakeslea trispora та ін., вказати способи їх зберігання.

3. Зобразити блок-схеми отримання засівного матеріалу продуцентів біологічно-активних речовин: вищого їстівного гриба Pleurotus ostreatus та мікроскопічного гриба Aspergillus niger поверхневим способом.

4. Розглянути та зарисувати апаратурно-технологічні схеми одержання засівного матеріалу промислових продуцентів глибинним та поверхневим способами.

5. Перевірити якість робочої культури Saccharomyces cerevisiae, що виросла на агаризованому живильному середовищі у пробірках. Визначити морфологію клітин, процентний вміст мертвих клітин, що брунькуються, наявність інфекції.

6. Провести посів на рідке живильне середовище в коливальні колби.

7. Результати оформити. Зробити висновки.

Контрольні питання:

1. Чиста культура - це…?

2. Накопичувальна культура - це…?

3. Наведіть способи одержання засівної культури продуцентів біологічно-активних речовин.

4. Наведіть технологічні стадії одержання засівної культури промислового продуцента.

5. У якому вигляді і за яких умов зберігаються промислові культури продуцентів?

6. Які вимоги висуваються до промислових штамів у біотехнологічному виробництві?

7. Які вимоги висуваються до промислової засівної культури у біотехнологічному виробництві?

8. У яких апаратах відбувається процес одержання засівної культури?

9. Як називається метод поступового нарощування об'ємів засівної культури?

10. Наведіть особливості мікроорганізмів, які сприяють широкому застосуванню мікроорганізмів як біооб'єктів у промисловості для одержання багатьох біотехнологічних продуктів?

11. Що передбачає стадія підготовки біооб'єкта?

Лабораторна робота №4

Тема: Поверхневе та глибинне культивування промислових мікроорганізмів.

Мета: Вивчення способів культивування мікроорганізмів. Здійснення поверхневого та глибинного культивування.

Матеріали та обладнання: стерильна водопровідна вода, стерильні чашки Петрі з агаризованим живильним середовищем, конічні колби з рідким живильним середовищем, чиста культура промислових мікроорганізмів, стерильні піпетки (1, 2, 5 мл), мікробіологічна петля, спиртівка, мікроскоп, технологічні схеми поверхневого та глибинного культивування промислових мікроорганізмів.

Культивування мікроорганізмів у промисловості здійснюють поверхневим або глибинним способами. Поверхневим способом вирощують тільки аеробні мікроорганізми на поверхні твердого або сипучого живильного середовища. Глибинним методом вирощують мікроорганізми в рідкому живильному середовищі, цей метод застосовується як для вирощування аеробних, так і анаеробних мікроорганізмів.

Поверхневе культивування мікроорганізмів

Процес культивування продуцента починається з моменту засіву охолодженого стерильного живильного середовища посівним матеріалом. Засів середовища при періодичній стерилізації зазвичай проводиться безпосередньо в стерилізаторі в охолоджене середовище при постійному перемішуванні. При безперервній стерилізації середовище засівають у відсіку стерилізатора, де воно охолоджується, потім засіяне середовище передають у цех вирощування.

Поверхневе культивування мікроорганізмів може проводитися різними способами. Традиційним є кюветний спосіб, який, на жаль, вимагає застосування важкої ручної праці і величезних виробничих площ. Новішим методом є вирощування продуцентів у механізованих установках.

Кюветний спосіб вирощування. Елементарним місцем для вирощування є кювета - ємність чотирикутної форми площею 0,25-0,50 м² і висотою 2-50 мм. Вона виготовляється з листа металу з перфорованим дном і рідше - з суцільного листа. Кювети бувають відкриті і з кришками. Найбільшого поширення набули відкриті кювети з оцинкованого заліза з перфорованим днищем. Перфорація виконується у вигляді довгастих вузьких щілин завдовжки 20 мм і шириною 1,5-2 мм, розташованих або в шаховому порядку, або підряд із зазором між отворами 3 - 5 мм і відстанню між рядами 10 мм.

Стерильні кювети заповнюють зволоженим та засіяним продуцентом живильним середовищем шаром 2-2,5 см і транспортують у зрощувальні камери, де кювети розташовуються на багатоярусних рухомих етажерках або стаціонарних стелажах з відстанню між ярусами 10-11 см. Зазвичай у стелажах і етажерках влаштовано 17-18 ярусів при загальній висоті не більше 2 м. Це пов'язане з тим, що кювети з середовищем завантажуються на стелажі уручну робітником, що стоїть на підлозі. Перша кювета встановлюється на висоті 20-25 см від підлоги. Етажерки і стелажі повинні виконуватися з металу з антикорозійним покриттям. Перед завантаженням кювет камеру миють і дезінфікують формаліном, який потім видаляється з камери при аерації та обробці аміаком. Камери бувають різного типу і форми. Вони можуть використовуватися з максимальним заповненням простору і мати висоту 2,2 м, або з вільнішим заповненням, коли висота стель може бути 3 м і більше. Камера може заповнюватися кюветами суцільно, наприклад, на пересувних стелажах-етажерках або кювети можуть розташовуватися на стаціонарних стелажах, коли між стелажами передбачається вільний прохід. Найчастіше камера має форму довгого вузького коридору з дверима в торцях. Безпосередньо над камерою розташовується відділення кондиціонування та очищення повітря.

Камери всіх типів працюють за наступним графіком: завантаження; культивування (зазвичай складає від 20 до 72 год); підсушування культури на кюветах сухим, підігрітим до 40-45°С повітрям протягом 3-4 год; вивантаження; прибирання і миття камери; обробка формаліном, аміаком і парою (3 год) і провітрювання камери (близько 3 год). Повний технологічний цикл в камері з урахуванням тривалості зростання продуцента зазвичай складає від 36 до 90 год і залежить від виду продуцента.

Зрощувальні камери розташовують так, щоб у них можна було вести вирощування культури з дотриманням всіх правил асептики. Кожна камера має два виходи. З одного боку камера сполучена із стерильним коридором, з якого в камери завантажують кювети з тільки що засіяним середовищем, а з іншою примикає до розвантажувального коридора, по якому з камер транспортують кювети з готовою культурою. Використання кювет у виробництві пов'язане з витратою великої кількості ручної праці, оскільки майже всі операції на стадії культивування виконуються вручну. І хоча отримання культури продуцента технологічно порівняно просте, її собівартість достатньо висока.

Вирощування в механізованих установках. Основна складність при створенні механізованих ліній полягає в тому, що шар живильного середовища повинен добре аеруватися, не спресовуватися і не підсушуватися. Механізована установка повинна бути влаштована так, щоб можна було без зупинки лінії у разі виникнення інфекції провести стерилізацію і негайне вивантаження зараженого середовища. Механізовані установки розробляються і реалізуються на практиці у ряді країн світу: США, Японії, Франції, Чехії, Германії, Росії, країнах СНД та ін.

Найбільш відомими є механізовані установки Андеркофлера, Джеффріса і Хрістенсена. В установці Джеффріса здійснюється механізоване завантаження засіяного середовища в кювети, які переміщаються по транспортеру і за допомогою спеціального пристрою передаються на підвісну етажерку. Завантажена етажерка по монорельсі входить у зрощувальний коридор, де створюються необхідні умови, і з швидкістю, залежно від тривалості культивування продуцента, переміщається до іншого кінця коридора. Готова культура при виході із зрощувального коридора автоматично розвантажується, і цикл повторюється.

В установці Хрістенсена процес вирощування здійснюється на безперервно рухомій стрічці скребкового транспортера і процес накопичення ферментів у культурі завершується у зрощувальній камері барабанного типу. Продуктивність цих установок - 1,6 т/добу. Але ці установки мають істотний недолік: у разі інфікування необхідні повна зупинка процесу і стерилізація всієї лінії.

Механізована установка Андеркофлера періодичної дії має продуктивність - до 10 т/добу.

Достатньо надійною є механізована установка Чехії для вирощування поверхневої культури продуктивністю 0,4 т/добу. Ця установка є камерою, в якій розміщений багатоярусний ланцюговий транспортер з підвішеними до нього лотками. При русі транспортера лотки заповнюються до тих пір, поки перший заповнений лоток не дійде до останньої позиції нижньої стрічки транспортера. Потім камера підключається до кондиціонера, рух транспортера припиняється до кінця культивування. Коли зростання закінчене, включають транспортер, лотки по черзі перекидаються, культура потрапляє в бункер. Після розвантаження камера і лотки миються, стерилізуються, і цикл повторюється. Ця установка має невелику продуктивність, але дуже надійна в експлуатації.

У наш час реальною установкою, здатною працювати в умовах виробництва, є механізована лінія з вертикально розташованими кюветами, створена у ВНДІФС і ВНДІ біотехніка за ідеєю А.В. Соловйова.

Принципова схема установки продуктивністю 1,5 т/добу для вирощування культури у вертикальних кюветах дана на рисунку 5а. Простерилізовані засіяні висівки за допомогою спеціального розподільного пристрою завантажуються на вібраційному столі в зрощувальну камеру і по рейковому шляху подаються в зрощувальне відділення. На спеціальних візках траверсів зрощувальні камери підводяться до повітряних дифузорів. Останні підключені до кондиціонерів, які можуть подавати повітря до зростаючої культури по різних режимах залежно від фази зростання культури. Аерація культури здійснюється через вертикальні канали, що знаходяться між кюветами, через перфоровані стінки кювет. Повітря переміщається уздовж кювет. Кондиціонери працюють з рециркуляцією повітря, підсос свіжого повітря складає 10%. Викид в атмосферу відпрацьованого повітря також 10%. Відпрацьоване повітря перед видаленням очищається від мікрофлори і пилу. Культура в зрощувальній камері практично не підсихає, навіть спостерігається її додаткове зволоження вологою, що виділяється мікроорганізмами в процесі зростання. Схематично зрощувальна камера є ящиком прямокутної форми з алюмінієвого сплаву (рис. 5б). Перфоровані перегородки з круглими отворами діаметром 3 мм і кроком 40 мм утворюють усередині ящика вертикальні кювети. Просвіти між кюветами виконують роль повітряних щілинних каналів. Кювети можуть відкриватися знизу і зверху (рис. 5в).

Звільнена від культури зрощувальна камера по рейковому шляху подається в мийну камеру, забезпечену форсунками, що подають могутні струмені води. Зрощувальна камера миється і потім стерилізується в спеціальній стерилізаційній камері. Чиста простерилізована зрощувальна камера подається в стерилізаційне відділення на вібраційний завантажувальний стіл, і цикл повторюється. Місткість кожної камери складає 500 кг за сухими висівками.

Переваги цієї установки полягають у повній механізації процесу вирощування, в ізолюванні зрощувальних камер, що у разі потреби дозволяє ізолювати осередок інфекції і провести повну послідовну стерилізацію всіх камер, чого не можна зробити в установках, які безперервно діють.

Представляє практичний інтерес установка колонного типу конструкції ВНДІ біотехніка, призначена для вирощування мікроскопічних грибів у товстому шарі (рис. 6). Складність вирощування в товстому шарі пов'язана з тим, що відбувається перегрів внутрішніх шарів у результаті інтенсивного тепловиділення, і аерація культури сильно ускладнена. При вирощуванні культур у закритому герметичному апараті рух газу відбувається не уздовж поверхні шару середовища, а розповсюджується на весь об'єм. Виникає режим об'ємної аерації, здатний забезпечити конвективний і дифузійний тепломасообмін по всій висоті шару зростаючої культури, що дозволяє в 10 і більше разів збільшувати висоту шаруючого середовища (до 300 мм).

Апаратом є вертикальний циліндр, розділений на секції перфорованими пластинами, укріпленими консольно на поворотних осях. У середині апарата розташовані перемішуючі пристрої для періодичного перемішування, що забезпечують рівномірність висоти шару і що виключають утворення застійних зон середовища усередині кожної секції. Таким чином, в шарі підтримується задане розподілення повітря. Верхня частина апарата герметично сполучена із стерилізатором. Стерильне повітря для аерації надходить у кожну секцію під перфоровані пластини із заданою температурою та об'ємом і перед виходом в атмосферу піддається бактеріальному очищенню.