Метод PCR Real Time в диагностике мутаций EGFR

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство образования и науки российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Кубанский государственный университет»

Кафедра биохимии и физиологии

Выпускная квалификационная работа Бакалавра

метод PCR real time в диагностике мутаций EGFR

Работу выполнил Л.А. Кондратова

Научный руководитель М.Л. Золотавина

Краснодар 2013

Реферат

Исследование выполнено на базе генетической лаборатории Краснодарского онкологического диспансера №1, период с 26.06.2012 по 26.05.2013г.

Цель работы: оценка возможностей использования генетических маркеров опухолевой ткани при раке легких.

Объект исследования - опухолевая ткань больных раком легких, представленная гистологическими блоками эпителиальной ткани легких.

Методом в данной работе служила полимеразная цепная реакция в режиме реального времени. Этот метод служит для выявления мутаций в ДНК материале.

В результате данного исследования было выявлено наличие мутаций у 29,4% больных раком легких, а так же были выявлены некоторые закономерности в возникновении мутаций в гене EGFR.

Содержание

Введение

1. Аналитический обзор

1.1 Мутации и их роль. Классификация. Причины возникновения

1.1.1 Активирующие мутации в гене EGFR

1.2 Проблемы диагностики рака легких

1.2.1 Метод PCR Real Time

1.2.2 Зависимость выбора тактики лечения от мутаций

2. Материал и методы

2.1 Материал исследования

2.2 Методы исследования

2.2.1 Выделение и оценка количества ДНК

2.2.2 Количественная PCR в реальном времени с использованием технологии ARMS и Scorpions

2.3 Методы статистической обработки данных

3. Метод PCR Real Time в диагностике мутаций EGFR

Заключение

Библиографический список

Приложение

Обозначения и сокращения

РЛ - рак легких

ПЦР, PCR - полимеразная цепная реакция

ТК - тирозин киназы

Введение

В настоящее время лабораторная диагностика занимает важное место в пропедевтике заболеваний. Большинство анализов биохимических показателей крови и других биологических жидкостей, несомненно, очень популярны сегодня и не без основания: они могут характеризовать как состояние всего организма, так и отдельных органов. Но, к сожалению, они не дают быстрого, точного и достаточно информативного ответа в ряде случаев.

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени ? это метод диагностики, который позволяет проверить генетический материал, экстрагированный из исследуемого клинического образца, на наличие в его составе участка чужеродной или измененной генетической информации. Кроме того, этот метод используется для получения копий непротяженных участков ДНК, специфичных для каждого генетически обусловленного признака. Исследование образцов ткани, содержащих опухоль, проводят при помощи метод PCR в реальном времени. Порог чувствительности данного метода, при использовании нами набора Therascreen всего пять процентов мутантных клеток.

Ученые-практики все чаще отмечают возрастающее количество онкологических заболеваний. В ряде опухолей обнаруживаются аномальные рецепторы эпидермального фактора роста, что обусловлено наличием активирующих мутаций в соответствующем гене.

Во всех странах мира отмечается резкое повышение частоты заболевания раком легкого. Из редкого заболевания, которым считался в прошлом столетии, рак легких превратился в одну из наиболее частых причин смерти онкологически больных людей. Ежегодно в Российской Федерации заболевают раком более 63000 человек, в том числе свыше 53000 мужчин. Более 20000, или 34,2%, выявляются в IV стадии заболевания. Несмотря на то, что уровень смертности от рака легкого в ряде стран снизился в последнее десятилетие, общее количество умерших от этого заболевания может сравниться с совокупным числом погибших от рака толстой кишки, поджелудочной и предстательной железы [Мерабишвили, Дятченко, 2000].

Уже в середине 90-х годов прошлого века стало очевидно, что химиотерапия на основе препаратов платины достигла «плато» своей эффективности. Одним из путей улучшения результатов терапии злокачественных новообразований является индивидуализация тактики лечения этих больных: с помощью определения генов-мишеней в опухолевой ткани. Наиболее изученной группой таких мишеней является семейство ростовых факторов рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) [Имянитов, 2010].

Индивидуализация тактики лечения больных заключается в применении таргетных препаратов, подавляющих активность фермента эпидермального фактора роста. Эти препараты являются низкомолекулярными ингибиторами тирозинкиназ, которые блокируют АТФ-связывающий внутриклеточный домен EGFR и тем самым сигналы поступающие от этого рецептора не принимаются.

Цель исследования: оценка возможностей использования генетических маркеров опухолевой ткани при раке легких.

В связи с целью были поставлены следующие задачи:

1. Определить частоту возникновения мутаций в гене EGFR.

2. Определить наиболее распространенный гистологический тип рака легкого при выявлении мутаций в гене EGFR.

3. Проследить влияние вдыхаемого табачного дыма на возникновения мутаций.

4. Выявить зависимость возникновения мутаций в соответствии с половой принадлежностью.

1. Аналитический обзор

1.1 Мутации и их роль. Классификация. Причины возникновения

Наследственные признаки живых организмов не являются неизменными, так как ни один механизм деления и созревания половых клеток не застрахован от ошибки, а ошибки приводят к генетическим изменениям - мутациям [mygenom.ru].

Способность мутировать - это универсальное свойство всех форм жизни от вирусов и микроорганизмов до высших растений, животных и человека. Различают два вида мутации:

1. Мутации, возникающие в половых клетках или спорах (генеративные мутации), передаются по наследству.

2. Мутации, возникающие в соматических клетках, приводят к генетическому мозаицизму, т.е. часть организма состоит из мутантных клеток, другая - из немутантных. В этих случаях мутации могут наследоваться только при вегетативном размножении с участием мутантных соматических частей организма (почек, черенков, клубней и т.п.), такие мутации могут вызывать опухолевые процессы [Жученко, 2004].

По характеру изменения генетического аппарата мутации делят на три типа:

1. Геномные мутации заключаются в изменении числа хромосом в клетках организма.

2. Хромосомные мутации. К таким мутациям относят: инверсии - участок хромосомы перевернут на 180°, так что содержащиеся в нем гены расположены в обратном порядке по сравнению с нормальным; транслокации - обмен участками двух или более негомологичных хромосом; делеции - выпадение значительного участка хромосомы; нехватки - выпадение небольшого участка хромосомы; дупликации - удвоение участка хромосомы; фрагментации - разрыв хромосомы на две части или более;

3. Генные мутации представляют собой стойкие изменения химического строения отдельных генов и, как правило, не отражаются на наблюдаемой в микроскоп морфологии хромосом [Фогель, Мотульски, 1990].

Мутацию в организме человека вызывают радиационные факторы, химические и биологические, то есть состояние окружающей среды. В зависимости от силы воздействия фактора, происходят изменения на различных уровнях организации человека (генный, клеточный и т. д.). Последствиями мутаций являются: увеличение разнообразия наследственных признаков человека, а также рост врожденных пороков, ускорение процессов старения, появление большого количества волос на теле. Человек в течение своей жизни может подвергается нескольким мутациям[www. primeinfo.net.ru].

Большинство случаев злокачественных опухолей развиваются вследствие целой серии генетических мутаций, которые происходят на протяжении жизни отдельного человека. Такие мутации называют "приобретенными", так как они не являются врожденными. Большинство приобретенных мутаций вызываются факторами окружающей среды, такими как воздействие токсинов или вызывающих рак агентов. Развивающийся в этих случаях рак носит название "спорадического". Некоторые люди могут нести в своих клетках более высокое количество врожденных мутаций, чем другие и даже в равных условиях окружающей среды, при воздействии одинакового количества токсинов, некоторые люди имеют более высокий риск развития рака [Чудов, 2002].

1.1.1 Активирующие мутации в гене EGFR

Рецептор EGF (EGFR) является продуктом одного из онкогенов семейства erb ? c-erbB1, часто называемом по аналогии с названием кодируемого белка ? геном EGFR. Рецептор имеет молекулярную массу 170 kD и состоит из длинного внеклеточного домена с двумя богатыми цистеином областями, трансмембранного домена и внутриклеточного домена, обладающего тирозинкиназной активностью. Эта активность рецептора EGF важна для осуществления большинства его функций, включая изменение подвижности клеток и инициацию синтеза ДНК. Число рецепторов EGF варьирует от одного клеточного типа к другому. Наибольшее число рецепторов выявлено в эмбриональной ткани и пролиферирующих клетках эпителия [Давыдов, Полоницкий 2003].

В ряде опухолей обнаруживаются аномальные рецепторы эпидермального фактора роста, что обусловлено наличием активирующих мутаций в соответствующем гене. Такие мутации приводят к стабилизации диммерного состояния рецепторов, в результате которой они постоянно находятся в активированном состоянии, независимо от связывания с лигандом. В результате рост опухолевых клеток, несущих мутацию гена EGFR, в большей степени зависит от передачи сигнала по внутриклеточному сигнальному пути, активируемому EGF, чем рост клеток, не имеющих подобных отклонений [cancergenom.ru].

При связывании рецептора с лигандом происходит активация EGFR ? диммеризация и аутофосфориллирование рецепторов, что индуцирует активацию нескольких сигнальных путей (а именно последовательное фосфориллирование сигнальных внутриклеточных киназ). Известно, что при активации EGFR запускаются внутриклеточные сигнальные каскады, приводящие к повышению пролиферации малигнизированных клеток; росту опухоли; стимуляции процессов инвазии, патологического ангиогенеза и метастазирования [www. humbio.ru/humbio/cytology/002fde31.htm].

Важно понимать, что под мутациями гена EGFR подразумеваются изменения в самой последовательности ДНК, а не изменения уровня экспрессии белка EGFR и количества копий гена EGFR.

Спектр мутаций, выявляемых на сегодняшний день в гене EGFR стандартными методами, и имеющих практическую значимость, ограничивается точечными заменами, делециями и инсерциями в участке ДНК, кодирующем тирозинкиназный домен рецептора. Опухоли, несущие подобные мутированные гены хорошо отвечают на воздействие низкомолекулярных ингибиторов тирозинкиназного домена EGFR.

Отдельно следует отметить, что генетические изменения в метастатических очагах опухоли не всегда аналогичны изменениям в первичном очаге, то есть отсутствие мутаций в клетках первичной опухоли не гарантирует, что их также не будем и в клетках метастазов. Также, важно помнить, что проведенное лечение может менять генотип опухолевых клеток [Конверсия неоперабельной стадии рака легкого … 2010; Рагулин, 2012; Тюлядин, 2003].

Таким образом, при диагностировании рака легких важно исследовать ДНК опухоли, чтобы установить этиологию развития заболевания и назначить соответствующее лечение.

1.2 Проблемы диагностики рака легких

генетический опухолевый мутация рак

В настоящее время в России заболевают раком легкого свыше 63000 человек, в том числе 53000 мужчин. Умирает ежегодно от РЛ свыше 60000 человек, что составляет более 20% от всех умерших от злокачественных новообразований. Практически у 2/3 первично выявленных больных диагностируется РЛ III и IV стадий. В течение первого года умирают 80%, лишь около 10% больных имеют шанс прожить более пяти лет, а при мелкоклеточном раке этот показатель составляет лишь 1,3%. РЛ имеет наихудший прогноз среди всех раковых заболеваний [www.pmarchive.ru]. Успехи хирургического лечения рака легких тесно связаны с проблемой его ранней диагностики.

Большое число больных, выявленных в III и IV стадиях заболевания РЛ, и низкая пятилетняя выживаемость после радикальных операций свидетельствуют о том, что применяемые методы диагностики этой болезни еще недостаточно эффективны. Важность ранней диагностики подтверждается данными пятилетней выживаемости после радикальных операций. Так, этот показатель при первой стадии -- 63,5%, при второй -- 43,5% и при третьей -- 22,9% (у разных авторов эти цифры разные, здесь приведены средние показатели) [Власов, Барышников, Ионова 2005].

Низкий показатель пятилетней выживаемости после радикальных операций даже при первой стадии свидетельствует о наличии у ряда больных метастазов, выявление которых на современном этапе развития науки вызывает большие трудности. Соответственно больным определяется неправильная стадия болезни и назначается неадекватное лечение. Сложность проблемы состоит еще и в том, что надежных методов ранней диагностики РЛ в настоящее время нет. Наиболее эффективным методом является рентгено-эндоскопическое исследование.

Главной причиной запущенности рака легкого является поздняя диагностика, в основе которой лежат плохое знание его клинико-рентгенологических проявлений и несоблюдение правильной диагностической технологии.

Понятие ранней диагностики весьма относительно. Многочисленные исследования по изучению темпов роста рака, проведенные путем вычисления среднего времени удвоения объема опухоли, показали, что среднее время удвоения объема плоскоклеточного рака составляет около 120-140 дней. Опухоль возникает из одной злокачественной клетки, следовательно для того чтобы образовался опухолевый узел диаметром один см, когда его можно выявить на рентгенограммах, необходимо 30 периодов удвоения, то есть около 10 лет. В корне легкого прямые признаки узлового образования можно выявить только в том случае, если оно достигает диаметра два см. Когда диаметр опухоли удваивается, ее объем увеличивается в восемь раз. А для этого необходимо еще три периода удвоения. Все это говорит о том, что прямые признаки центрального рака могут быть выявлены на целый год позже по сравнению с периферическим раком. Положение в какой-то степени облегчается тем, что больные с центральным раком довольно рано предъявляют клинические симптомы, которые дают основание искать их причину.

Анализ причин ошибочной диагностики РЛ показывает, что наряду со сходством рентгенологической картины в ее основе лежит переоценка фактора локализации процесса. От 12,7% до 50% пациентов с нераспознанным РЛ на различных этапах заболевания подвергаются необоснованному лечению по поводу ошибочного диагноза туберкулеза [www.pmarchive.ru].

Среди дополнительных методов диагностики важную роль играет бронхоскопия. В некоторых случаях она позволяет увидеть карциному, выступающую в просвет бронхов, инфильтрированные стенки бронхов или их сдавливание.

Для подтверждения диагноза может быть использовано морфологическое исследование, в процессе которого изучают мокроту, бронхиальные мазки и смывы пациента на присутствие клеток рака. Если у врача есть подозрение на метастазы в лимфоузлах, может быть использована медиастиноскопия.

Медиастиноскопия, проводится под общим наркозом и ее цель через небольшой разрез на шее получить образец ткани лимфоузла, который в последствии исследуется на наличие раковых клеток.

Среди дополнительных методов так же следует отметить исследование крови. Само по себе исследование крови не может подтвердить или опровергнуть рак легких, однако наличие информации об уровне гемоглобина и СОЭ может помочь в уточнении диагноза, а онкомаркеры (специальные показатели крови, повышающиеся при наличии злокачественной опухоли в организме) имеют важное значение при контроле лечебного процесса [Актуальные вопросы комбинированного лечения рака легкого, 2012]. Таким образом, существующие методы диагностики рака легких несовершенны и не всегда точно диагностируют само заболевание, не говоря уже о его гистологическом типе.

1.2.1 Метод PCR Real Time

Среди большого многообразия гибридизационных методов анализа ДНК, метод PCR наиболее широко используется в клинической лабораторной диагностике [Батурина, Бреннер, Суслякова, 2008].

Принцип метода PCR был разработан Кэри Мюллисом (фирма “Cetus”, США) в 1983г. и в настоящее время широко используется как для научных исследований, так и для диагностики в практическом здравоохранении и службе Госсанэпиднадзора (генотипирование, диагностика инфекционных заболеваний).

В основе метода PCR лежит природный процесс ? комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК.

Естественная репликация ДНК включает в себя несколько стадий:

1) Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, расхождение нитей ДНК);

2) Образование коротких двухцепочечных участков ДНК (затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК);

3) Синтез новой цепи ДНК (комплементарное достраивание обеих нитей).

Данный процесс можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генодиагностики для выявления возбудителей инфекционных заболеваний.

Открытие термостабильной ДНК-полимеразы (Taq-полимеразы) из термофильных бактерий Thermis aquaticus , оптимум работы которой находится в области от минус 70°С до минус 72°С, позволило сделать процесс репликации ДНК циклическим и использовать его для работы in vitro. Создание программируемых термостатов (амплификаторов), которые по заданной программе осуществляют циклическую смену температур, создало предпосылки для широкого внедрения метода PCR в практику лабораторной клинической диагностики. При многократном повторении циклов синтеза происходит экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента ДНК, что позволяет из небольшого количества анализируемого материала, который может содержать единичные клетки микроорганизмов получить достаточное количество ДНК копий для идентификации их методом электрофореза [Глик, Пастернак, 2002].

Таким образом, PCR представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка ДНК катализируемое ферментом ДНК- полимеразой.

Принципиальной особенностью ПЦР в реальном времени является возможность детекции накопления продуктов амплификации непосредственно во время проведения амплификации. Так как кинетика накопления ампликонов напрямую зависит от числа копий исследуемой матрицы, это позволяет проводить количественные измерения ДНК и РНК инфекционных агентов. Полученная информация может быть использована для проведения мониторинга эффективности проводимой терапии, оценки клинического прогноза.

В отличие от других методов количественного определения ДНК матрицы в пробе, ПЦР в реальном времени не требует дополнительных манипуляций, связанных с раститровкой ДНК исследуемой пробы или полученных в ходе ПЦР ампликонов, которые усложняют постановку анализа и могут приводить к появлению ложноположительных результатов.

Часто ПЦР в реальном времени комбинируют с ОТ-ПЦР (обратная транскрипция) для измерения малых количеств мРНК, что позволяет исследователю получать количественную информацию о содержании данной мРНК в клетке и, соответственно, позволяет судить об уровне экспрессии данного гена в отдельной клетке или ткани [Новейшие технологии в генодиагностике: ... , 2008].

1.2.2 Зависимость выбора тактики лечения от мутаций

В настоящее время повышенное внимание обращено на диагностику не самого заболевания, но его происхождения и причины возникновения.

Концепция «мишени» была сформулирована в начале прошлого века немецким учёным Паулем Эрлихом (Paul Ehrlich) и изначально предназначалась для координации исследований, направленных на изобретение антибактериальных препаратов. Мишень - это фермент (либо другая биологическая молекула, органелла, физиологическая особенность и т.д.), который присутствует в патогенном микроорганизме и необходим для жизнеспособности последнего, но при этом отсутствует в организме пациента [Моисеенко, Проценко, 2010].

Таким образом, лекарственные препараты, обладающие способностью специфически ингибировать молекулы-мишени, должны характеризоваться исключительно широким терапевтическим индексом, а именно демонстрировать высокую антибактериальную активность при минимуме побочных эффектов. Подобный принцип лежит в основе действия «классических» противомикробных средств - антибиотиков, сульфаниламидов и т.д. Главная проблема заключается в том, что биохимические отличия между бактерией и человеком неизмеримо выше, чем отличия между трансформированными и исходными клетками. Именно поэтому концепция «мишени» для «средства против рака» длительное время оставалась лозунгом, не имеющим предпосылок для реализации. Появление лекарств нового поколения - так называемых таргетных противоопухолевых препаратов - стало возможным лишь в конце ХХ века, благодаря бурному прогрессу молекулярной онкологии.

Препараты (Гефитиниб) и (Эрлотиниб) являются ингибиторами TK EGFR и применяются в современной таргетной терапии немелкоклеточного РЛ. Чувствительность опухоли к ингибиторам TK EGFR коррелирует с наличием активирующих мутаций в гене EGFR, которые наблюдаются примерно в 10% немелкоклеточного РЛ. Подавляющее большинство активирующих мутаций в гене EGFR (примерно 90%) ? это микроделеции, захватывающие 746-750 кодоны (45-50%), или точечная мутация, приводящая к замещению нуклеотидного основания в 858 кодоне приводящая к замене лейцина на аргинин (35-40%). При лечении ингибиторами TK EGFR улучшение состояния наблюдается у 80% пациентов с мутациями. У отдельных пациентов с мутациями EGFR положительный эффект очень сильный и длительный. По рекомендациям Европейского Общества Медицинских Онкологов (ESMO) и Американского Общества Клинической Онкологии (ASCO) наличие активирующих мутаций в EGFR является показанием к применению ингибиторов TK EGFR.После связывания фактора роста (или лиганда) происходит димеризация рецептора и активация плазматической части рецептора, представленной тирозинкиназой Ц. Лигандами для EGFR являются эпидермальный фактор роста (EGF) и трансформирующий фактор роста. Сигналы, передаваемые при активации EGFR определяют пролиферативную активность клетки, способность к дифференцировке, инвазию и метастазирование, индукцию ангиогенеза и т. д. Существуют неопровержимые свидетельства о вовлеченности EGFR в опухолевую трансформацию эпителия бронхов. Выключение EGFR в экспериментальных моделях приводит к торможению опухолевой пролиферации [Баранов, 2000; Гуторов, Борисова, 2012; Применение Ирессы (гефинитиба) ... , 2010].

Таким образом, наличие экспрессии рецепторов семейства EGFR на поверхности опухолевых клеток немелкоклеточный РЛ, и участие в регуляции важнейших свойств опухолевой клетки делает их перспективными мишенями для разработки противоопухолевой терапии.

2. Материал и методы

2.1 Материал исследования

Исследование проводилось на базе генетической лаборатории Краснодарского Клинического онкологического диспансера №1 в период с 26.06.2012 по 26.05.2013г.

Материалом исследования служила ДНК, выделенная из гистологических блоков - срезов опухолевой ткани легких, заключенной в парафин. Эти срезы опухолевой ткани были взяты у больных раком легких на различных стадиях развития заболевания.

В работе представлены результаты анализов 169 больных с диагнозом «рак легких». Всю выборку больных мы разделили на несколько групп: курящие мужчины, некурящие мужчины и некурящие женщины. Исходя из этого, мы сравнили больных с диагнозом «рак легких» по двум основным признакам: половой принадлежности и статусу курения. Группы составлялись таким образом, чтобы было исключено влияния этих двух признаков одновременно. В данное исследование включались больные, проживающие на территории южного федерального округа.

В своем исследовании мы не обращали внимания на возраст больных и стадию развития заболевания.

2.2 Методы исследования

2.2.1 Выделение и оценка количества ДНК

Перед тем как проводили анализ PCR Real Time, было обработать ткань на преаналитическом этапе.

Первая часть преаналитического этапа проводилась в патоморфологической лаборатории, итогом которой становилось получение в генетическую лабораторию пробирок, где находился соскоб пораженной ткани легких с максимальным содержанием опухолевых клеток.

Затем, мы выделяли ДНК из полученной ткани. Выделение ДНК происходит при помощи набора QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (компания QIAGEN). Этот набор оптимизирован для выделения и очистки ДНК из срезов тканей, заключенных в парафин.

Процедура выделения ДНК из тканей, заключенных в парафин, состоит из шести этапов. В первую очередь необходимо удалить парафин - его растворяют в ксилоле и удаляют. Чтобы избавится от ксилола добавляли 96% этанол. Далее, образец лизируют в денатурирующих условиях в комплексе с протеиназой К. Инкубация при высокой температуре после переваривания протеиназой К частично удаляет вызванные формалином сшивки ДНК, что улучшает выход и качество получаемой ДНК. Следующий этап - это связывание: ДНК связывается с мембраной, а примеси проходят сквозь мембрану и затем, остаточные примеси удаляют отмывкой. Последний этап - это элюция - с мембраны элюируют чистую концентрированную ДНК.

После этого проверяли выделенную ДНК на пригодность к проведению анализа PCR Real Time. Для этого использовали тот же набор, что и при проведении анализа на мутацию в гене EGFR, только брался один контрольный тест. Для этой цели набор содержал дополнительную реакционную смесь. Эта процедура позволяла выбрать оптимальное разведение ДНК и исключала образцы ДНК с низким содержанием ДНК или образцы вообще не пригодные для амплификации ДНК.

2.2.2 Количественная PCR Real Time с использованием технологии ARMS и Scorions

После всех этих процессов, можно проводить анализ PCR Real Time при помощи набора TheraScreen: EGFR29 Mutation Kit. Эта чувствительная и специфичная методика обнаружения мутаций на фоне геномной ДНК дикого типа в гене EGFR разработана на основе сочетания технологий ARMS и Scorpion.

При помощи ARMS происходит аллель-специфичная амплификация. Особенностью ARMS является то, что можно селективно амплифицировать специфические мутантные последовательности даже в тех образцах, где большинство последовательностей не имеет мутаций.

Scorpions - это бифункциональные молекулы, состоящие из PCR-праймера, ковалентно связанного с зондом. Флюорофор в зонде взаимодействует с гасителем, который подавляет флюоресценцию. Во время PCR, когда зонд связывается с ампликоном, флюорофор и гаситель становится пространственно разделенными.

Проведение PCR анализа заключает в себя ряд действий. Во-первых, необходимо приготовить реакционную смесь. Все реагенты должны храниться в холодильнике при температуре от минус 18°С до минус 20°С. Количество приготовленных смесей должно немного превышать суммарное количество растворов по реакциям, дабы включить в себя все потери при постановке PCR анализа.

Далее, раскапываем реакционные смеси в соответствующие лунки. Это необходимо делать в специальном месте, и обязательно в перчатках, чтобы избежать контаминации с чужеродной ДНК. Так же необходимо ввести положительный и отрицательный контроль, что позволит не ошибиться в правильности проведения анализа.

Лунки или пробирки должны быть плотно закрыты крышками или пленкой, чтобы избежать испарения, так как любая потеря объема в следствии испарения в процессе PCR значительно повлияет на данные. И последнее, необходимо провести анализ PCR в реальном времени при определенных параметрах цикла.

При использовании любого метода фактор погрешности имеет место быть, в данном методе с целью исключения погрешности уровень флуоресценции читают не с нулевой отметки, а выставляют с учетом уровня фона. Количество циклов PCR, при которых кривая флуоресценции пересекает заданный уровень фона называется Ct. Для каждого препарата ДНК определяют разведение, которое дает величину Ct наиболее близкую к ДНК контролю. По величине Ct в контрольной PCR определяют пригодность индивидуальных образцов для теста на мутацию L858R.

Положительный стандарт применяется для контроля специфичности и чувствительности теста. В положительном стандарте содержится смесь фрагментов ДНК EGFR с мутацией EGFR L858R и геномной ДНК человека без мутации в гене EGFR в соотношении один к 20. Положительный стандарт тестируют аллель-специфичной PCR вместе с неизвестными образцами. Отрицательный контроль необходим для выставления уровня фона, там нет ДНК вообще - вместо нее обычно содержится вода, так же входящая в набор реагентов. Она не должна давать флуоресценцию и таким образом мы можем судить о чувствительности и сроке годности реагентов.

Результаты PCR представляют в виде разницы dCt = Ctмут - Ctконтр, где Ctмут - это среднее Ct препарата ДНК в PCR специфичной к мутации L858R, Ctконтр - это среднее Ct препарата ДНК в контрольной PCR. И таким образом, образец является положительным (содержащим мутацию) если dCt образца равно или меньше dCt положительного стандарта. Образец является отрицательным (без мутации или содержание мутации менее 5%) если dCt образца больше dCt стандарта.

2.3 Статистическая обработка

Данные статистически обрабатывались несколькими методами, чтобы подтвердить достоверность полученных результатов.

Все подсчеты проводились в программе Microsoft Office Excel. Для подсчета достоверности были использованы точечная оценка данных и доверительные интервалы. Для доказательства различия групп были использованы критерий ч² и «точный критерий Фишера». Для оценки достоверности использовали относительный риск.

3. Метод PCR Real Time в диагностике мутаций EGFR

В современной клинической молекулярной диагностике перспективным методом исследования ДНК по праву считается PCR RT [Подольская, 2002], так как позволяет определить мутации в генетическом материале больных раком легких. Критическое количество мутационных клеток, которое можем определить в ткани в нашем случае - один процент [www.biolinklab.ru].

Активация онкогена EGFR сопровождается появлением у клетки-мишени множественных характеристик злокачественного фенотипа. Всего в гене EGFR найдено 29 мутаций, которые представлены в таблице в приложении А. Из этой таблицы можно заметить, что ни одна из мутаций не приводит к сдвигу рамки считывания, но все они при замене или вставке нуклеотидов приводят к тому, что одна аминокислота в белке заменяется на другую. Это приводит к стабилизации диммерного состояния белка, и как следствие происходит активация сигнального пути без связывания белка с рецептором [Иванцов, 2011].

Нами в процессе работы было исследовано ДНК 169 пациентов на наличие мутаций в гене EGFR. Всего было выявлено 50 мутаций, что составляет 29, 4% от общего числа (рисунок 1).



Рисунок 1 - Количество выявленных мутаций среди больных раком легких

Таким образом, причиной возникновения заболевания ракам легких на одну треть являлась мутация в гене EGFR.

Следующим шагом нашего исследования стало определение частоты возникновения рака легких по причине мутации в гене EGFR в трех субъектах Южного Федерального округа.

Таблица 1 - Возникновение мутации в гене EGFR у больных раком легких в Ростовской и Волгоградской областях и в Краснодарском крае

Регион	Мутация есть	Мутация отсутствует
Волгоградская область (n=27)	10 (36,7%)	17 (62,7%)
Краснодарский край (n=83)	27 (32,5%)	56 (67,5%)
Ростовская область (n=36)	9 (24,8%)	27 (74,8%)

Из таблицы 1 мы можем проследить тенденцию к увеличению возникновения мутаций в гене EGFR больных, проживающих в Ростовской области - 24,8%, 32,5% - в Краснодарском крае и 36,7% - в Волгоградской области. Исходя из цели нашего исследования, мы оценивали возможность использования мутаций в гене EGFR как генетических маркеров при раке легких. Для этого мы сравнили группы больных раком легких, чтобы выявить, в каких случаях риск возникновения заболевания выше.

Следуя задачам нашего исследования, мы определили при каком типе рака легкого наиболее часто выявляется мутация в гене EGFR. В нашей выборке было представлено пять типов рака легкого. В таблице 2 представлены данные, указывающее количество больных, у которых выявлена мутация в гене EGFR с учетом гистологического типа рака легких.

Таблица 2 - Гистологические типы рака легких, представленные в нашей выборке

Гистологический тип	Мутация выявлена	Мутация отсутствует
Аденокарцинома	50	101
Слизистая аденокарцинома	0	2
Железисто-плоскоклеточный рак	0	2
Крупноклеточный	0	1
Плоскоклеточный	0	11
Другой	0	1

Из таблицы 2 видно, что все больные, у которых выявлена была мутация в гене EGFR, имели тип рака легкого «аденокарцинома», поэтому мы сравнили возникновение мутаций только у больных аденокарциномой.

Ниже представлены данные о влиянии табачной зависимости на возникновения мутаций в гене EGFR. В таблице 3 представлены данные, показывающие количество курящих и некурящих мужчин и женщин.

Таблица 3 - Количество больных раком легкого имеющих никотиновую зависимость

Пол	Курит/курил ранее	Не курит
Женский	5 (6,02%)	78 (93,98%)
Мужской	51 (66,23%)	26 (33,77%)

В таблицы 3 отмечено, что курящих мужчин намного больше, чем женщин. На сегодняшний день, по мнению ученых, курение является самой распространенной причиной возникновения рака легких [Мерабишвили, Дятченко, 2000]. Поэтому, мы решили сравнить данные возникновения мутации среди курящих и некурящих людей, но чтобы исключить влияние пола, было решено взять группы, состоящие только из мужчин. Данные таблицы 4 показывают, что точечная оценка данных говорит нам о том, что риск возникновения мутаций в гене EGFR у людей, не испытывающих пагубного влияния табачного дыма в 4,88 раза больше, чем у людей не подверженных данному риску.

Таблица 4 - Частота активирующих соматических мутаций в гене EGFR в зависимости от курения

Статус курения	Мутация выявлена	Мутация отсутствует
Не курит	5 (23,81%)	14 (76,19%)
Курит/курил ранее	2 (4,88%)	39 (95,12%)

Ниже представлены данные отображающие таблицу 4 в графическом виде.

Рисунок 2 - Влияние табачной зависимости на возникновение активирующих соматических мутаций в гене EGFR с учетом доверительных интервалов

Эти данные были статистически подсчитаны с помощью «точного теста Фишера» и выявили, что риск возникновения мутаций у некурящих выше с вероятностью р>0,028. Причины повышенного риска возникновения мутаций в гене EGFR именно при отсутствии курения являются не до конца изученными. Возможно, это связано с тем, что присутствующие в сигаретах канцерогены никак не влияют на возникновения мутаций в гене EGFR.

Таким образом, при анализе влияния табачного дыма нами было выявлено четыре типа людей, больных раком легких среди мужчин: курящие с мутацией в гене EGFR, курящие без мутации, некурящие с мутацией и некурящие без мутации в гене EGFR. Их общее количество было принято за 100%. Из таблицы 5 следует, что самую обширную группу занимают мужчины, больные раком легких, но у которых не было обнаружено мутаций в гене EGFR. Это свидетельствует о том, что влияние табачного дыма на возникновение мутации в гене EGFR не доказано, что подтверждает и низкий уровень возникновения активирующих соматических мутаций в гене EGFR в группе курящих мужчин.

Таблица 5 - Зависимость возникновения мутаций в гене EGFR у мужчин, с диагнозом «рак легких»

n=60 100%	Группа	Количество, человек	Процент, %
	Курящие с мутацией	2	3,3
	Курящие без мутации	39	65,0
	Некурящие с мутацией	5	8,3
	Некурящие без мутации	14	23,3

Второй фактор, рассмотренный нами в данной работе - это влияние половой принадлежности на возникновение активирующих соматических мутаций в гене EGFR. Данные были рассчитаны строго по отдельному критерию половой принадлежности, и в таблице 6 представлены данные только некурящих людей.

Таблица 6 - Частота активирующих соматических мутаций в гене EGFR в зависимости от половой принадлежности пациентов

Пол	Мутация выявлена	Мутация отсутствует
Женский	38 (52,78%)	34 (47,22%)
Мужской	5 (23,81%)	14 (76,19%)

На рисунке 3 представлены эти же данные, но в виде диаграммы.

Рисунок 3 - Частота возникновения мутаций в гене EGFR в зависимости от половой принадлежности больных раком легких с учетом доверительных интервалов

«Точный тест Фишера» показал, что выборки статистически отличаются на уровне p>0,034.

Следует заметить, что возникновение мутаций у женщин наблюдается в два раза выше, чем у мужчин.

При исследовании влияния полового признака на возникновение мутации в гене EGFR нами так же было выделено четыре типа больных раком легких среди некурящих: женщины с мутацией в гене EGFR, женщины без мутации, мужчины с мутацией и мужчины без мутации в гене EGFR.

Таблица 7 - Частота возникновения мутаций в гене EGFR у больных раком легкого в зависимости от половой принадлежности.

n=91 100%	Группы	Количество, человек	Процент, %
	Женщины с мутацией	38	41,6
	Женщины без мутации	34	37,4
	Мужчины с мутацией	5	5,5
	Мужчины без мутации	14	15,4

В ходе исследования был проведен анализ ДНК методом PCR Real Time у 169 больных с диагнозом «рак легких» различного гистологического типа. Установлены закономерности возникновения мутации EGFR.

Во-первых, нами проанализировано при каком гистологическом типе рака легкого чаще всего встречаются мутации в гене EGFR. Оказалось, что выявленные мутации в гене EGFR обнаружены у больных аденокарциномой.

Во-вторых, нами было выяснено, что мутации могут возникать у некурящих людей. Некоторые случаи возникновения мутаций имели место, если пациент курил ранее, но не выявлено мутаций в гене EGFR у курящих людей. Но, при дальнейшем анализе данных факт прямой зависимости вдыхаемого табачного дыма на возникновение мутаций в гене EGFR не подтвержден.

В-третьих, нами было изучено влияние половой принадлежности на возникновение мутаций в гене EGFR. По нашим данным достоверно различие в том, что у женщин частота возникновения мутаций в гене EGFR в 2 раза выше, чем у мужчин. Причиной этому могут служить некоторые особенности женского организма.

Таким образом, использование мутаций в гене EGFR как маркер опухолевой ткани действительно позволяет оценить мутационный статус опухоли на раннем этапе ее формирования.

Заключение

Рак легкого отличается высокой частотой рецидивов и генерализации процесса, даже в случае если лечение начато достаточно рано. Однако существует проблема ранней диагностики рака легкого: зачастую больные попадают к врачу с запущенным распространенным раком, часто с метастазами. Все это обусловливает необходимость прогнозирования течения заболевания и разработки стратегии лечения рака легкого на основе более глубокого изучения процессов канцерогенеза и молекулярно-генетических особенностей конкретных опухолей.

Подходы к лечению опухоли легкого и его результативность в значительной степени зависят от морфологических и генотипических особенностей рака. То есть лечение должно быть адресное, и зависит оно от причин возникновения рака легких.

Проведенное нами исследование позволило оценить возможность использования мутации в гене EGFR как генетический маркер и сделать несколько выводов:

1. Проведенный анализ PCR на наличие активирующих мутаций в гене EGFR показал, что мутации обнаруживаются в 29,4% случаев.

2. Мутации в гене EGFR были обнаружены при гистологическом типе «аденокарцинома».

3. Влияние табачного дыма на возникновение рака легких не доказано, хотя и у курящих людей относительный риск возникновения мутаций в 6,964 больше.

4. Так же нами было выявлено, что у женщин в 3,129 больший относительный риск возникновения мутаций в гене EGFR.

Таким образом, метод PCR Real Time является перспективным методом в диагностике мутаций EGFR у больных раком легких.

Библиографический список

1. Актуальные вопросы комбинированного лечения рака легкого / Барчук А. С. [и др.] // Вопросы онкологии. 2012. №2. С. 253-259.

2. Баранов В.С. Молекулярная медицина: молекулярная диагностика, превентивная медицина и генная терапия // Молекулярная биология. 2000. Т. 34, №4. С.19-22.

3. Батурина O.A., Бреннер Е.В., Суслякова O.A. Определение нуклеотидных последовательностей ? перспективный метод диагностики наследственных заболеваний // Сборник трудов конференции «Фундаментальные науки - медицине», Новосибирск. - 2-5 сентября 2008. - С. 76-80.

5. Власов П.В., Барышников А.С., Ионова В. Г. Клинико-рентгенологическая диагностика рака легкого // Медицинская газета. 2005. №17. С.15-18.

6. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М., 2002. 589 с.

7. Гуторов С.Л., Борисова Е.И. Поддерживающая терапия немелкоклеточного рака легкого // Современная онкология. 2012. №3. С.14-19.

8. Давыдов М. И., Полоцкий Б. Е. Детекция молекулярных нарушений, характерных для рака легкого. Возможности использования в клинической практике // Онкология. 2003. №5. С. 44-47.

9. Демин А.С. Мутации человека. // Наука. 2009. №9. С. 35-37.

10. Жучеко А.А. Генетика. М., 2004. 240 с.

11. Иванцов А.О. Морфологические и иммуногистохимические особенности опухолей человека с мутацией рецептора эпидермального фактора роста: автореф. дис. на соискание ученой степени канд. мед. наук. Спб, 2011. 32 с.

12. Имянитов В.Н. Общие представления о таргетной терапии // Онкология. 2010. №3. С. 123-130.

13. Левченко Е.В., Моисеенко В.М., Мацко Д.Е. Конверсия неоперабельной стадии рака легкого в операбельную у EGFR-позитивных пациентов на фоне лечения гефитинибом: два клинических случая // Современная онкология. 2010. №2. С.88-92.

14. Мерабишвили В.М., Дятченко О.Т. Статистика рака легкого (заболеваемость, смертность, выживаемость)// Онкология. 2000. №3. С. 3-5.

15. Моисеенко В. М., Проценко С.А. Эффективность гефинитиба (Ирессы) в первой линии терапии // Вопросы онкологии. 2010. №1. С. 20-23.

16. Новейшие технологии в генодиагностике: полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR) / А.Н. Екимов [и др.] // Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Министерства Здравоохранения Российской Федерации. 2008.

17. Подольская С.В. Методы молекулярной генетики в современной медицине //Журнал практического врача. 2002. №5. С. 48-50.

18. Применение Ирессы (гефитиниба) в качестве терапии первой линии для лечения неоперабельных аденокарцином легкого, содержащих мутацию в гене EGFR / В.М. Моисеенко [и др.] // Современная онкология. 2010. №1. С.33-37.

19. Рагулин Ю.А. Таргетные препараты и лучевая терапия в лечении местнораспространенного рака легкого // Современная онкология. 2012. №2. С. 156-160.

20. Тюляндин С. А. Перспективные подходы лекарственной терапии немелкоклеточного рака легкого // Онкология. 2003. №5. С. 27-31.

21. Чудов С.В. Устойчивость видов и популяционная генетика хромосомного видообразования: Монография. М., 2002. 97с.

22. Фогель Ф., Мотульски А. Генетика человека: в 3-х т. Т. 2: Генетика человека. Пер с англ. М., 1990. 378 с.

23. Потанин А.В., Потанин В.П. Ранняя диагностика рака легкого (обзор по материалам электронных средств массовой информации) // PMARCHIVE.RU. Режим доступа: http://pmarchive.ru/rannyaya-diagnostika-raka-legkogo-obzor-po-materialam-elektronnyx-sredstv-massovoj-informacii/ (дата обращения 18.05.2013)

24. Роль рецептора EGFR и мутаций гена EGFR в патогенезе рака легкого // CANCERGENOME.RU. Режим доступа: http: //www.cancergenome.ru/page39 (дата обращения 20.11.2012)

25. Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) // HUMBIO.RU. Режим доступа: http://humbio.ru/humbio/cytology/002fde31.htm (дата обращения 20.11.2012)

26. Набор Real-Time-EGFR-L858R. Набор реагентов для выявления мутации L858R в гене EGFR методом ПЦР в режиме реального времени // BIOLINKLAB.RU. Режим доступа: http: //www.biolinklab.ru/system/files/manuals/real-timepcregfrl858r.pdf?download=1 (дата обращения 28.11.2012)

27. Тарантул В. З. Геном человека: Энциклопедия, написанная четырьмя буквами // MYGENOME.RU. Режим доступа: http: //mygenome.ru/articles/89/ (дата обращения 28.11.2012)

28. Человек продолжает прогрессивно мутировать // PRIMEINFO.NET.RU. Режим доступа: http:// primeinfo.net.ru/ news1908.html?submit (дата обращения 5.12.2012)

Приложение

Характеристика соматических мутаций в гене EGFR

мутация	экзон	замена оснований
T790M	20	2369C>T
L858R	21	2573T>G
L861Q	21	2582T>A
S788I	20	2303G>T
G719A	18	2156G>C
G719S	18	2155G>A
G719C	18	2155G>T
Инсерции	20	2307_2308ins9
		2319_2320insCAC
		2310_2311insGGT
Делеции	19	2235_2249del15
		2235_2252>AAT
		2236_2253del18
		2237_2251del15
		2237_2254del18
		2237_2255>T
		2236_2250del15
		2238_2255del18
		2238_2248>GC
		2238_2252>GCA
		2239_2247del9
		2239_2253del15
		2239_2256del18
		2239_2248TTAAGAGAAG>T
		2239_2258>CA
		2240_2251del12
		2240_2257del18
		2240_2254del15
		2239_2251>C

Размещено на Allbest.ru