Лабораторная диагностика интенсивности перекисного окисления липидов
Исследование ферментативных и неферментативных путей образования активных форм кислорода. Механизмы их повреждающего воздействия на живые клетки, в частности, инициация свободнорадикального перекисного окисления липидов. Антиоксидантная защита организма.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | курсовая работа |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 11.01.2017 |
| Размер файла | 65,0 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
О2 + R-H>Rя + НО2
О2 + R-H>Rя + НО2
ОНя + R-H > Rя +Н2О
На следующей стадии радикал быстро взаимодействует с кислородом, который выступает в качестве акцептора электронов. В результате происходит образование пероксирадикала (RO2), который атакует ненасыщенные липиды. Возникновение в результате этой реакции органических перекисей и нового радикала (R) способствует продолжению окислительных реакций, приобретающих цепной характер:
R + О2 > RO2;
RO2 + RH > ROOH + R
Органические перекиси (ROOH) включаются в процесс генерации радикалов, в присутствии металлов переменной валентности (меди, кобальта, марганца, железа) происходит образование реакционного алкоксильного радикала:
ROOH + Me n+>RO + ОН ? + Me (n+1)-
Часть образующихся органических радикалов взаимодействует друг с другом, при этом происходит образование неактивных молекул, что обрывает ход реакций свободнорадикального окисления:
R + R > RR;
RO2 + R > ROOR
Гидроперекиси липидов способны подвергаться нерадикальным - окислительным превращениям, что приводит к образованию первичных (диеновые коньюгаты, диальдегиды), промежуточных (основания Шиффа) и конечных продуктов ПОЛ, а также спиртов, кетонов и альдегидов. Обрыв цепных реакций перекисного окисления возможен при взаимодействии радикалов со специализированными ферментными системами, а также с рядом низкомолекулярных веществ, совокупно формирующих биохимический компонент антиоксидантной системы организма [12]
Избыточная активация ПОЛ может возникать как следствие резких изменений кислородного режима клетки. При этом гипероксия является причиной временного усиления процессов ПОЛ, а стойкая гипоксия ведет к лавинообразному накоплению токсичных продуктов перекисного окисления. Чрезмерная интенсивность реакций ПОЛ развивается под действием внешних воздействий, к которым можно отнести ионизирующее и ультрафиолетовое облучение, а также ряд химических веществ, относящихся к прооксидантам. Продукция АФК и, соответственно, интенсивность процессов ПОЛ в клетках резко возрастают как неспецифическая реакция при действии на организм различных стрессорных факторов химической, физической и биологической природы. В конечном итоге все эти воздействия могут приводить к напряжению и последующей декомпенсации механизмов антиоксидантной защиты организма и развитию окислительного стресса, проявляющегося на клеточном, тканевом и организменном уровнях. Типовые патологические процессы, такие как гипоксия и воспаление, свойственные и развивающиеся при большинстве соматических и инфекционных заболеваний, тяжелых травмах и ранениях, всегда сопровождаются избыточным образованием АФК и продуктов ПОЛ [13]
Длительная активация процессов ПОЛ сопровождается развитием синдрома липидной пероксидации. При чрезмерной активации ПОЛ, когда, значительная часть мембранных фосфолипидов подвергается окислительной деградации, липидная фаза мембран становится более ригидной. Это ограничивает конформационную подвижность полипептидной цепи, вследствие чего снижается функциональная активность ферментов, рецепторов и каналообразующих белков, встроенных в мембраны, что в свою очередь препятствует удалению Са+2 из саркоплазмы и обеспечивает повреждающее действие кальция на клеточные органеллы. К настоящему времени доказана способность метаболитов ПОЛ ингибировать К+/Na+-АТФазу плазматической мембраны, вызывать цитолиз гепатоцитов с развитием ферментемии. Продукты ПОЛ нарушают нормальное функционирование кальциевых каналов L-типа, что сопровождается электролитными нарушениями в клетках миокарда. Их избыток приводит к сдвигу метаболизма арахидоновой кислоты, в результате чего одно из образующихся соединений (15-гидроарахидоновая кислота) снижает в-адренергическую стимуляцию за счет угнетения этого типа адренорецепторов. Продукты этих реакций повреждают мембраны эритроцитов, окислят альбумин сыворотки, нарушают синтез нуклеиновых кислот в клетках.
Активированные формы кислорода и продукты ПОЛ повреждают гиалуроновую кислоту, протеогликаны, коллаген, иммуноглобулины. Некомпенсированная антиоксидантной системой генерация активированных форм кислорода может вызвать повреждающее действие на эндотелий и базальную мембрану сосудов непосредственно или опосредованно через инактивацию антиоксидантных систем. Морфологически выявляемые гранулы липофусцина, состоящие из отложений нерастворимых липоперекисей и белков, являются продуктами ПОЛ.
АФК и продукты ПОЛ способствует избыточной выработке и высвобождению ряда провоспалительных цитокинов (фактора некроза опухолей, интерлейкина-1, интерлейкина-6) и медиаторов воспаления (гистамина, брадикинина, серотонина), производных арахидоновой кислоты -- лейкотриенов, простагландинов и тромбоксанов. Избыточная выработка АФК и продуктов ПОЛ обусловливает резкую активацию системы комплемента по альтернативному пути с высвобождением анафилатоксина [14].
2.1 Участие АФК и продуктов ПОЛ в патогенезе заболеваний человека
Для большинства или почти всех патологичгских состояний, течение которых сопровождается участием АФК, присуще так называемое состояние окислительного стресса, характеризующееся интенсификацией продукции этих субстанций. Следует отметить, что состояние окислительного стресса является характерным не только для заболеваний, но имеет место и при физиологическихсостояниях, близких к экстремальным - интенсивных физических и психоэмоциональных нагрузках, переутомлении, а также при старении организма. Существует «свободнорадикальная теория старения», ее создатель Д. Хармен, впервые изложивший основные положения теории в 1955 г. Теория Хармана базируется на системе аргументаций, связанной со способностью свободных радикалов неспецифически повреждать такие макромолекулы, как ДНК, липиды и белки, а процесс старения связывается с накоплением таких повреждений в организме. В рамках этой теории находит объяснение не только старение ррганизма, но и широкий круг связанных со старением патологических процессов: сердечнососудистые заболевания, возрастные дисфункции мозга, иммунодепрессия, канцерогенез и другие виды патологии.
При всех заболеваниях, где в качестве обязательного компонента присутствует воспалительная реакция, ведущую роль в повреждении клеток и тканей организма выполняют АФК, продуцируемые лейкоцитами, главном образом, нертрофилами. Хотя наиболее разрушительные формы АФК, генерируемые миелопероксидазой, действуют в фаголизосомах лейкоцита, однако в очаге воспаления нейтрофилы способны секретировать этот фермент и во внеклеточное пространство. Уничтожение инфекционного агента при развитии воспалительного процесса может обеспечиваться и ценой попутного повреждения собственных тканей в очаге воспаления, при этом кислородзависимое повреждение тканей носит как прямой, так и опосредованный характер. Последний реализуется при воздействии АФК на регуляторные и эффекторные молекулы, например, на протеиназы и ингибиторы протеиназ. АФК могут прямо активировать латентные формы коллагеназы секретируемые нейтрофилами, а также инактивировать универсальный ингибитор протеиназ -- б2-макроглобулин и специфический ингибитор сериновых протеиназ -- бэ-антитрипсин. АФК, генерируемые внутриклеточно, а также проникающие внутрь через клеточную мембрану, являются пусковыми факторами индукции апоптоза.
Свободнорадикальный механизм повреждения плазматических, митохондриальных и ядерных мембран, ядерного и митохондриального генома, липопротеинов крови приводит к повреждению сосудов и гистогематических барьеров, что играет важнейшую, нередко решающую роль в патогенезе наиболее распространенных заболеваний воспалительной, токсической и аутоиммунной природы.
Патогенетическая роль АФК выявлена к настоящему времени приблизительно для сотни заболеваний человека. Это имеет место при сердечно-сосудистой патологии -- ишемической болезни сердца, инфаркте миокарда, острой артериальной непроходимости сегмента конечности, ишемических и реперфузионных поражениях почек, головного мозга и других тканей, в развитии катаракты и атеросклероза. Показано, что формирование атеросклеротических бляшек в интиме сосудов происходит при активном участии свободных радикалов, взаимодействующих с полиненасыщенными жирными кислотами. В основе патогенеза системной красной волчанки лежит повышенная чувствительность нуклеиновых кислот (в частности, ядерного ДНК) к повреждающему действию свободных радикалов. Предрасполагающим фактором заболевания является диета с избыточным количеством полиненасыщенных жирных кислот.
АФК играют важную роль при бронхолегочной патологии, как при острых, так и при хронических заболеваниях (например, эмфиземе, астме и хроническом бронхите). Чрезвычайно важное значение свободные радикалы имеют в патогенезе респираторного дистресс-синдрома. Именно АФК, вырабатываемые нейтрофилами крови, отводится ведущая роль в повреждении эндотелиально-альвеолярного барьера, развитии интерстициального отека и развернутой клиники этого синдрома. Чрезмерная и длительная стимуляция ферментных систем, отвечающих за генерацию активных радикалов фагоцитов, лежит в основе механизмов формирования профессиональной пылевой болезни и таких ее осложнений, как системный коллагеноз и злокачественное перерождение клеточных элементов легких и плевры. Многолетнее ретроспективное исследование, проведенное в 23 странах под эгидой ВОЗ, выявило прямую зависимость частоты развития некоторых видов злокачественных новообразований легких, молочной железы, яичников и прямой кишки от количества потребляемых животных жиров и интенсивности процессов ПОЛ в организме [10].
Многочисленные исследования свидетельствуют, что процессы свободнорадикального окисления лежат в основе патогенеза многих хронических заболеваний печени, причем избыточное образование АФК и продуктов ПОЛ проявляется на самых ранних стадиях процесса. Гепатотоксическое действие радикалов кислорода проявляется на мембранах клеток, являющихся основным местом синтеза супероксиданион-радикала. Усиление продукции АФК в результате индукции ксантиноксидазы интерфероном происходит даже при вирусном поражении. Радикалы кислорода повреждают мембранный аппарат гепатоцита, разрушают липидный слой его мембран, а также повреждают белки -- ферменты монооксигеназной системы. Тяжесть течения и прогноз развития хронического заболевания печени тесно связаны с функциональным состоянием антиоксидантной системы гепатоцитов.
Избыточная активация ПОЛ является причиной возникновения и прогрессирования гипертонической болезни. Установлено, что под влиянием АФК и продуктов ПОЛ нарушаются проницаемость клеточных мембран и активность Na+/K+-АТФазы, что приводит к накоплению в клетках ионизированного кальция. Кроме этого, вторичные продукты ПОЛ способны прямо воздействовать на тонус артериальных сосудов. Кроме сосудосуживающего действия, радикалы кислорода активируют работу фибробластов соединительной ткани, в результате чего развивается артериокапиллярный фиброз, т. е. необратимые изменения сосудов. Окислительный стресс практически всегда развивается при инфекционных заболеваниях. Избыточное образование свободных радикалов кислорода является одним из ведущих механизмов в патогенезе гриппа. Генерирование АФК определяет мутагенез и протеолитическую активность вируса гриппа, цитопатический эффект вирусной инфекции, деструкцию капиллярной сети и стенок капилляров, развитие сливных пневмоний и отека легких.
Токсическое повреждение нейронов АФК, продуктами ПОЛ и окислительный стресс рассматриваются в качестве ведущего механизма при нейродегенеративных заболеваниях. Одной из причин развития рассеянного склероза могут быть митохондриальные нарушения, сопровождающиеся избыточной продукцией АФК. Активный кислород при рассеянном склерозе обладает непосредственно поражающим действием на ЦНС и является причинным фактором развития заболевания. Окислительное повреждение приводит к гибели нервных и глиальных клеток, что проявляется демиелинизацией и образованием очагов глиоза в ЦНС. В 37% случаев у людей с болезнью Паркинсона наблюдается дефектность первого комплекса дыхательной цепи в клетках черной субстанции. Постепенная кумуляция метаболитов кислорода, продуктов ПОЛ, металлопротеинов и развитие окислительного стресса в различных отделах ЦНС имеют особое значение при болезни Альцгеймера и хорее Гентингтона. Процессы накопления липофусцина в клетках ЦНС при этих состояниях соотносятся с уровнем антиоксидантных энзимов в мозговой ткани.
АФК и продукты ПОЛ оказывают прямое деструктивное действие на внутренние органы и приводят к развитию полиорганной недостаточности после тяжелых травм и обширных ожогов. Радиолиз воды, образование свободных радикалов кислорода и разнообразных метаболитов ПОЛ лежат в основе патогенеза острых и хронических радиационных поражений и человека [6].
2.2 Диагностика процессов перекисного окисления
Четких клинических признаков избыточной активации свободнорадикального окисления в организме человека нет. Развитие окислительного стресса у пациента сопровождается:
* признаками дыхательной недостаточности и недостаточности
кровообращения (чаще имеет место гипердинамический тип кровообращения);
психомоторным возбуждением;
повышением температуры более 37,5° С;
выраженной болевой реакцией.
Лабораторными признаками окислительного стресса авторы считают:
* повышение количества лейкоцитов в крови (> 10 тыс.) без палочкоядерного сдвига в ближайшее время после травмы (10-12 ч.);
* увеличение содержания в крови аланиновой и аспарагиновой трансаминаз;
* снижение содержания и активности супероксиддисмутазы, каталазы и глютатионпероксидазы крови;
повышение концентрации глюкозы плазмы крови > 7,0 ммоль/л;
некомпенсированный метаболический ацидоз (рН < 7,2);
* повышение содержания в крови АФК и продуктов ПОЛ(диеновых конъюгатов, оснований Шиффа, малонового диальдегида).
Для лабораторной диагностики выраженности окислительного стресса и определении показания для использования препаратов с антиоксидантными свойствами целесообразно оценивать состояние антиоксидантной системы, а также интенсивности свободнорадикальных реакций (процессов ПОЛ) в организме пациента. Оценка состояния антиоксидантной системы обычно включает в себя определение активности основных ферментных АО (активность СОД, каталазы и глутатионпероксидазы эритроцитов), а также содержание аскорбиновой кислоты, токоферола и селена в крови. Инструментальная оценка выраженности свободнорадикальных реакций предусматривает определение в пробах крови или тканей продуктов реакций перекисного окисления, к которым относят диеновые конъюгаты, малоновый диальдегид, основания Шиффа и активные формы кислорода. Совокупность этих показателей позволяет оценивать как состояние основных звеньев АО-системы организма, т. е. ее способность предотвращать избыточный ход реакций свободнорадикальной природы, так и фактическую интенсивность реакций ПОЛ и синтеза АФК. Исходя из этого, данные тесты могут рассматриваться в качестве лабораторных критериев диагностики окислительного стресса.
Лабораторная диагностика интенсивности ПОЛ необходима для суждения об АО-активности того или иного препарата, так как на основании клинических признаков невозможно адекватно оценить деиствие АО-препарата. Отметим, что использование только одного из указанных выше тестов не дает полной информации. Динамика показателей интенсивности свободнорадикальных реакций и содержание АО в организме порой имеют противоположную направленность. В ряде случаев колебания содержания продуктов свободнорадикальных реакций не сопровождаются изменением уровней активных форм кислорода, и наоборот. Резкая интенсификация свободнорадикальных реакций и накопление продуктов этих реакций в крови может не приводить к изменению содержания и активности основных компонентов АО-системы. Для достоверной и адекватной клинической интерпретации получаемых результатов принципиальное значение имеет не только абсолютная величина показателей, а их динамика на фоне проведения лечебных мероприятий.
Лабораторные критерии диагностики окислительного стресса
|
Оценка состояния антиоксидантной системы пациента |
Определение интенсивности свободнорадикальных реакций |
|
|
Содержание и активность антиоксидантных ферментов в эритроцитах или других, доступных для изучения клетках: * Супероксиддисмутазы * Каталазы * Глютатионпероксидазы |
Содержание в плазме (сывортке) крови первичных, вторичных и промежуточных продуктов перекисного окисления липидов: * Диеновых коньюгат * Малонового диальдегида * Оснований Шиффа |
|
|
Содержание в крови низкомолекулярных антиоксидантов: * Аскорбиновой кислоты * Токоферола * Селена |
Содержание в крови активных (радикальных) форм кислорода: * Супероксиданион-радикала * Синглетного кислорода * Общий уровень радикалов |
Каждый из предложенных показателей имеет свои достоинства и недостатки. Основными требованиями, предъявляемыми к лабораторным методам, являются точность, простота выполнения и хорошая воспроизводимость. Желательными являются простота подготовки проб к исследованию и возможность их хранения, что позволяет не проводить все тесты ex tempore. Наиболее широко распространенный в экспериментальных исследованиях и клинической практике метод определения малонового диальдегида в реакции с тиобарбитуровой кислотой не является точным показателем, отражающим течение процессов ПОЛ, так как в ходе реакции тиобарбитуровая кислота взаимодействует с веществами нелипидной природы, имеющими в своем составе кето-группу, например, с глюкозой. Взаимодействие же тиобарбитуровой кислоты с малоновым диальдегидом, исходно содержащимся в липидных системах, в количественном отношении играет незначительную роль. Тем не менее на протяжении почти тридцати лет метод является наиболее употребимым большинством исследователей при изучении процессов ПОЛ в различных биологических системах. К его достоинствам можно отнести простоту и относительную быстроту выполнения, а также хорошую воспроизводимость результатов. Другими распространенными методами оценки интенсивности реакций ПОЛ является определение уровня первичных и промежуточных продуктов этих реакций, т. е. диеновых конъюгатов и оснований Шиффа. Методы точны и относительно просты для воспроизведения. К их недостаткам относится невозможность хранения отобранных проб, поэтому исследования должны проводиться сразу или в пределах получаса после их отбора. Более точным и адекватным показателем интенсивности и выраженности свободнорадикальных реакций и, соответственно, состояния анти-оксидантной системы организма, является определение АФК -- основных предшественников реакций ПОЛ; быстрое и точное измерение уровня которых в цельной крови осуществляется люминесцентным методом. В зависимости от вида используемого люминофора (люминол, люцигенин и т. д.) возможно определение как отдельных видов АФК, так и их общее количество. Метод отличается быстротой выполнения, его можно рекомендовать для экспресс-диагностики. Методика позволяет хранить пробы гепаринизированной крови для исследования до 12 ч при температуре +4?С, т. е в обычном бытовом холодильнике.
Основные показатели, характеризующие оксидантно-антиоксидантную систему.
1. Интенсивность ПОЛ -- оценивается по концентрации в крови и других биологических жидкостях промежуточных и конечных продуктов реакции.
Малоновый диальдегид (МДА) -- конечный продукт ПОЛ.
Нормальная концентрация в крови -- 2,5-6,0 мкМ/л. Зависит от метода определения, поэтому в каждой лаборатории имеется собственный референтный интервал.
Увеличение концентрации -- свидетельство усиленного ПОЛ и срыва антиоксидантной защиты.
* Определение малонового диальдегида в крови флуориметрическим методом (Федорова Т. Н., Коряцива Т. С, Ларский Э. Г.)
Принцип метода: тиобарбитуровая кислота (ТБК) в кислой среде взаимодействует с низкомолекулярными диальдегидами (главным образом с малоновым) с образованием окрашенного в розовый цвет комплекса.
Нормативные величины: 3,7±0,12 ед.
* Модификация определения продуктов перекисного окисления липидов в реакции с тиобарбитуровой кислотой (Коробейников Э. Н.)
Принцип метода: при нагревании в кислой среде часть продуктов ПОЛ, относящихся к классу гидроперекисей, разлагается с образованием малонового диальдегида, взаимодействие молекулы которого с двумя молекулами тиобарбитуровой кислоты приводит к формированию окрашенного комплекса.
Нормативные величины: 3,69±0,14нмоль/л.
* Определение перекисей липидов в реакции с тиобарбитуровой кислотой (Гаврилов В. Б., Гаврилова А. Р., Мажуль Л. М.)
Принцип метода: тиобарбитуровая кислота реагирует с малоновым диальдегидом, который образуется при переокислении ненасыщенных жирных кислот, имеющих 2-3 диеновые связи, с образованием розового продукта, имеющего максимальное поглощение при 535 нм.
Нормативные величины: 100-120 нмоль/л.
* Определение диеновых коньюгатов в плазме крови по УФ-поглощению
гептановых и изопропанольных экстрактов (Гаврилов В. Б.,
Гаврилова А. Р., Хмара Н. Ф.)
Принцип метода: метод основан на измерении интенсивности поглощения в области 223- 234 нм, обусловленной конъюгированными диеновыми структурами (предварительно экстрагированными из плазмы), возникающими при образовании гидроперекисей полиненасыщенных жирных кислот.
* Спектрофотометрическое определение содержания ацилгидроперекисей (диеновых конъюгатов) в плазме (сыворотке) крови.
Принцип метода основывается на установлении содержания первичных продуктов ПОЛ в крови по поглощению липидным экстрактом монохроматического светового потока в ультрафиолетовой области спектра (233 нм)[15].
2. Витамины с антиоксидантными свойствами.
Витамин А (ретинол) -- жирорастворимый витамин, содержащийся в животных продуктах в форме А, и А2, в растениях в форме провитамина -- каротина, наиболее активным среди которых является бета-каротин.
Нормальная концентрация в сыворотке -- 1,05-2,27 мкМ/л или 300-650 мкг/л.
Недостаточность витамина А, которая может возникать не только при дефиците ретинола или каротина в пище, но и из-за нарушения их всасывания при заболеваниях кишечника, а также при малом количестве жира и белка в пище, способствует усилению ПОЛ. В большей степени страдает эпителий различных органов и глаза (замедление восстановления зрительного пурпура -- родопсина). Это проявляется повышенной восприимчивостью к бронхолегочным заболеваниям, инфекциям мочевыводящих путей, слизистой оболочки глаз, кожи, снижением остроты зрения в темноте («куриная слепота»).
Витамин Е (токоферолы) -- группа веществ, среди которых наибольшей активностью обладает альфа-токоферол. Жирорастворимый витамин, действует сопряженно с витамином А. В сыворотке крови и клетках основная часть связана с липопротеидами.
* Определение уровня альфа-токоферола в плазме крови.
Принцип метода: Альфа-токоферол плазмы экстрагируют смесью «этанол--гексан». Отобранную гексановую фазу выпаривают. К полученному остатку добавляют хлорное железо, способное восстанавливаться из трехвалентного состояния в двухвалентное под действием антиоксидантов (и прежде всего альфа-токоферола). О количестве альфа-токоферола судят по содержанию восстановленного железа, которое определяют реакцией с альфа-2-,альфа-2-дипиридилом, сопровождающейся образованием комплекса красного цвета.
Нормальная концентрация в сыворотке крови -- 5-20 мг/л.
Степень обеспеченности организма витамином Е можно характеризовать путем непосредственного определения его концентрации в крови, и косвенным методом, определяя перекисную резистентность эритроцитов [16].
Перекисная резистентность эритроцитов (ПРЭ) -- показатель обеспеченности мембран антиоксидантами, в первую очередь витамином Е, и их устойчивости к повреждающему действию перекисей.
Нормальная величина -- до 10%.
Увеличение свидетельствует о недостаточной антиоксидантной защите клеточных мембран, высокой подверженности ПОЛ и лабильности. Имеются сезонные колебания ПРЭ с повышением процента перекисного гемолиза в весенний период. [1].
Витамин С (аскорбиновая кислота) -- водорастворимый витамин, который, в отличие от животных, в организме человека не синтезируется и поступает только с пищей. Предотвращает окисление витаминов А и Е, восстанавливает окисленные формы ферментов и различных субстратов участвует в большом количестве обменных реакций. Регулирует проницаемость сосудистой стенки, существенно усиливает устойчивость организма к инфекциям, необходим при образовании коллагена, заживлении ран и ожогов.
Нормальная концентрация:
в крови --6-20 мг/л,
в моче --20-30 мг/сутки.
Суточная потребность -- 45-60 мг; существенно возрастает при физической и нервно-психической нагрузке, низкой и высокой температуре, облучении, курении (1 сигарета разрушает 25 мг витамина С), беременности и кормлении, хронических заболеваниях желудочно-кишечного тракта, приеме антибиотиков и сульфаниламидов. Аскорбиновую кислоту не рекомендуется принимать онкологическим больным в период лучевой и химиотерапии.
Недостаточность витамина С в пище способствует усилению ПОЛ, нарушениям обмена многих веществ, функций нервной и эндокринной систем, снижению устойчивости к инфекциям и проявляется слабостью, повышенной утомляемостью, раздражительностью, болями в конечностях и другими неспецифическими симптомами. Длительный авитаминоз вызывает развитие цинги.
3. Антиоксидантные ферменты.
Супероксиддисмутаза (СОД) -- фермент, катализирующий реакцию нейтрализации супероксидного радикала О2. Является основным ферментом внутриклеточной антирадикальной защиты. Нормальная активность в эритроцитах (метод восстановления НСТ) -- 1,04 ± 0,05 усл. ед./мг гемоглобина. Абсолютные величины колеблются в зависимости от используемых реактивов. Наиболее доступной для анализа является эритроцитарная СОД, содержащая CuZn.
*Определение активности эритроцитарной СОД методом R. Fried. Принцип метода: метод основан на определении степени ингибирования под действием эритроцитарной СОД реакции восстановления нитросинего тетразолия супероксидными радикалами.
Исследование активности СОД выполняют при комнатной температуре. Кровь должна быть взята с гепарином. Фермент может оставаться стабильным до 1 недели при хранении при температуре +4 С.
Активность фермента выражают в условных единицах (усл. Ед.). 50% ингибирования процесса восстановления нитросинего тетразолия по сравнению с контрольной пробой принято считать 1 усл. ед.
Нормативные величины:1,04±0,3/мг гемоглобина.
В начальный период усиленного образования свободных радикалов происходит повышение активности СОД для их нейтрализации. Если процесс радикалообразования продолжает усиливаться, то на определенном этапе происходит истощение компенсаторных резервов и активность СОД снижается ниже нормы, что свидетельствует о декомпенсации данного защитного механизма.
Увеличение активности СОД наблюдается при отравлениях гашишем, четырёххлористым углеродом, амитриптилином, фосфорорганическими соединениями, уксусной кислотой, при септицемии, очаговом туберкулёзе, лейкозах, мышечной дистрофии Дюшена, муковисцидозе, талассемии, инфаркте миокарда, при психических заболеваниях.
Увеличение активности СОД без соответствующей активации или отсутствии других антиоксидантных ферментов - каталазы ( гипо-, акаталаземия), пероксидаз является неблагоприятным изменением для организма из-за накопления перекиси водорода - продукта супероксиддисмутазной реакции.
Снижение активности СОД наблюдается при отравлении окисью углерода, соединениями свинца, кадмия, при септикопиемии, при ИБС, атеросклерозе сосудов головного мозга, при эпилепсии, у новорожденных с синдромом дыхательных расстройств, с ретинопатиями, у беременных с поздним токсикозом (диагностический тест для определения внутриутробной гипоксии плода). Низкие показатели активности фермента следует рассматривать как неблагоприятный прогностический признак, указывающий на снижение неспецифической резистентности организма.
Проводить определение активности СОД целесообразно с одновременным исследованием других компонентов АОЗ и показателей ПОЛ.
Каталаза -- фермент, осуществляющий разложение перекиси водорода до кислорода и воды. Максимальное количество содержится в эритроцитах. Обладает специфической антиоксидантной защитной функцией в отношении эндотелиальных клеток.
Нормальная активность -- 18,4 -- 25,0 мкЕД/эритроцит.
В начальную компенсаторную фазу радикалообразования происходит повышение активности фермента, в фазу декомпенсации -- снижение. С возрастом активность фермента падает.
*Определение активности каталазы методом E. Beutler.
Принцип метода: метод основан на определении скорости разложения перекиси водорода в мМ/мин спектрофотометрически при длинне волны 230. Для стабилизации гемолизата и разложения комплекса каталаза - перекись водорода добавляют этанол.
*Определения активности каталазы крови по методу Баха и Зубковой.
Принцип метода: метод основан на определении количества перекиси водорода, которое разрушается ферментом за 30 минут. В опыте определяют количество неразрушенной перекиси водорода в ходе каталазной реакции, в контроле количество перекиси ,взятой в пробу с ферментом, инактивированным кипячением. Перекись водорода оттитровывают пермаганатом калия в кислой среде. Реакция идет по уравнению:
2KMnO + 5H2O2 + 4 H2 SO + 2 KMnSO + 8H2O +5O2
Разность между цифрами титрования контроля и опыта соответствует количеству разрушенной перекиси водорода под действием каталазы.
Нормативные величины:
Метод титрометрии: каталазное число 12-20. В одном мкл. Крови у мужчин содержится 4·10- 5·10 эритроцитов, у женщин 3,9·10 - 4,7·10 эритроцитов.
Метод фотометрии: по E. Beutler 15,31·10 ± 2,39·10 МЕ/г гемеглобина.
Увеличение активности каталазы наблюдается при гемолитических состояниях, при хирургических вмешательствах проводимых под местной анестезией, у детей с бронхолёгочной патологией, ревматойдным артритом, тиреотоксическим зобом.
Снижение активности каталазы наблюдается при инфекционных заболеваниях, железодефицитной анемии, синдроме мальабсорбции, карциноме, у новорожденных с синдромом дыхательных расстройств, хронических отравлениях фосфором, мышьяком, свинцом, ртутью, общем наркозе, назначении антибиотиков. Определение активности каталазы целесообразно проводить с одновременным исследованием активности других АО-ферментов, содержания метгемоглобина и продуктов ПОЛ.
Глутатионредуктаза (ГР). ГР широко распространена в тканях человека, особенно в печени, почках, сердце и эритроцитах. Основное назначение этого фермента состоит в поддержании пула восстановленного глутатиона, который участвует в защите самых разнообразных белков и ДНК от окислительных повреждений, вызываемых и другими окислителями. ГР является лимитирующим звеном в системе глутатионредуктаза-глутатионпероксидаза, поэтому при оценке эффективности работы глутатионовой системы обычно определяют активность именно ГР.
Наиболее распространенным методом определения активности ГР является спектрофотометрический метод. Среди других методов следует отметить колориметрическое определение активности ГР по скорости образования восстановленного глутатиона при йодометрическом титровании или с помощью цветной реакции с нитропрусидом.
*Определение активности ГР методом Бойтлера.
Принцип метода: метод основан на спектрофотометрическом определении количества израсходованного в ходе ферментативной реакции кофермента НАДФН, учитываемого по изменению поглощения при 340 нм. Длинна волны 340 нм соответствует максимуму поглощения восстановленного кофермента. В ходе реакции по мере окисления НАДФН оптическая плотность инкубационной пробы снижается.
Активность ГР значительно повышается в сыворотке больных саркомой, у больных карциномой молочной железы и при других неопластических заболеваниях. Увеличение ГР наблюдается при гепатитах, механической желтухе и реже - при циррозе. Высокие значения активности могут определяться при остром инфаркте миокарда. Как правило, мегалобластическая анемия сопровождается повышением уровня активности ГР.
Глутатионпероксидаза (ГП). Катализирует реакцию окисления глутатиона Г- SH перекисью водорода (1-я реакция) или гидроперекисями ROOH (2-я реакция), образующийся в результате ПОЛ.
Вклад ГП в обезвреживание перекиси водорода по сравнению с каталазой более значителен. Она имеет большее сродство к перекиси водорода и разлагает ее даже при небольших концентрациях. В активном центре фермента находится селен. На 1 моль фермента приходится 4 грамма атома селена.
*Определение активности ГП методом E. Beutler.
Принцип метода: метод основан на определении скорости образования окисленного глутатиона, содержание которого определяется в сопряженной глутатионредуктазной реакции по степени окисления НАДФН при 340нм.
Г - S - S - Г + НАДФН>2Г - SH + НАДФ
В качестве гидроперекиси используют t-бутил гидропероксид.
Нормативные величины: По Beutler 30,8± 4,73 МЕ/г гемоглобина (при заборе крови с ЭДТА) и 34,2±3,84 МЕ/г гемоглобина (в гепаринизированной крови). По Тицу: 19,9±0,31 МЕ/моль гемоглобина и 0,89±0,14 НЕД/эритроцит.
Увеличение активности наблюдается при дефиците глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, б-талассемии, остром лимфоцитарном лейкозе.
Снижение активности ГП наблюдается при железодефицитной анемии, отравлении свинцом, серповидноклеточний анемии, дефиците селена.
Церулоплазмин (медная оксидаза). Медьсодержащий гликопротеид б2-глобулиновой фракции. Функции цирулоплазмина разнообразны: это основная оксидаза плазмы крови, реактант острой фазы, осуществляет транспорт Cu для синтеза СОД и цитохромоксидазы. Цирулоплазмин проявляет свои АО свойства экстрацеллюлярно без образования каких бы то ни было радикалов.
Чистый белок церулоплазмина имеет интенсивную голубую окраску.
Простой колориметрический метод, который предложил Ravin, широко используется в модификации (С.В. Бестужевой и В.Г. Колба).
Существуют и другие методы исследования: нефелометрический, манометрический и иммунологический. При манометрическом методе реакция проходит в аппарате Варбурга, измеряют скорость потребления кислорода (мкмоль потребленного кислорода за 1 мин на 1 литр сыворотки в определённых условиях). Отмечена превосходная корреляция между значениями, полученными колориметрическим методом Ревина и монометрическим. Колориметрический метод модифицирован для использования в автоанализаторе.
*Определение активности цирулоплазмина модифицированным методом Ревина.
Принцип метода: метод основан не ферментном окислении n-фенилендиамина церулоплазмином. Реакция останавливается добавлением фтористого Nа. По оптической плотности образующихся окрашенных продуктов судят о концентрации церулоплазмина.
Уровень церулоплазмина в сыворотке увеличевается при различных инфекционных заболеваниях, при остром и хроническом воспалительных процессах, сопровождающихся деструктивными и некротическими изменениями в тканях, при злокачественном росте и шизофрении.
Антиоксидантная активность (АОА) - комплекс ферментативных и неферментативных реакций связывания и разложения промежуточных продуктов пероксидации, тормозящих свободно-радикальное окисление липидов. Определяется чаще всего методом хемилюминисценции в модельных системах.
Нормальная величина для сыворотки крови -- 60-75%.
Высокий уровень АОА обеспечивает устойчивость к перекисным повреждениям клеточных мембран и низкий уровень ПОЛ.
Низкий уровень АОА способствует усилению ПОЛ, торможению процессов пролиферации и регенерации.
Клиническое значение определения АОА состоит в той, что одни патологические процессы развиваются на фоне повышенной АОА, а другие -- на фоне сниженной АОА и поэтому требуют разнонаправленной коррекции. [17].
Заключение
Таким образом, в основе сохранения свободнорадикального гомеостаза лежит баланс между прооксидантными и антиоксидантными процессами, поддерживающими перекисное окисление в пределах, не только совместимых с жизнью, но и полезных для нее. Нарушение этого баланса является отправной точкой в инициации «свободнорадикальной патологии». Срыв антиоксидантной защиты характеризуется развитием свободнорадикальных повреждений разных компонентов клеток и тканей. Все клеточные компоненты в той или иной степени подвержены перекисному окислению, но наиболее выражен этот процесс в липидных (фосфолипидных) структурах, прежде всего в липидном бислое мембран. Нарушение про-, антиоксидантного равновесия, сопровождающееся увеличением концентрации продуктов ПОЛ в тканях и жидкостях организма, отмечено при самых различных заболеваниях: воспалительных, сердечнососудистых, онкологических, инфекционных, ожоговой и лучевой болезни, при разнообразных токсических воздействиях, а также при старении организма. Все это позволяет исследователям рассматривать активацию ПОЛ как универсальный компонент неспецифической реакции организма на экстремальные воздействия, т.е. как звено стресс-реакции.
Из изложенного выше следует, что механизм поддержания прооксидантно-антиоксидантного равновесия достаточно сложен. С одной стороны, действуют окислительные и проокислительные факторы и субстраты: молекулярный кислород, ОНя, гидроперекиси, органические перекиси, эпоксиды, легко-окисляющиеся субстраты (липиды), окислительные ферменты и свободные ионы металлов с переменной валентностью, нейромедиаторы (катехоламины). С другой, -- антиоксидантные компоненты; ферменты (СОД, ГПО, глутатионтрансфераза, каталаза), гормоны (стероидные и тиреоидные), биоамины (серотонин, гистамин), жирорастворимые антиоксиданты -- компоненты мембран (токоферолы, убихиноны, ретиноиды, каротиноиды, фенольные соединения); водорастворимые антиоксиданты (тиоловые соединения, аскорбат, водорастворимые фенолы); ионы селена -- свободные и в составе антиоксидантных ферментов.
Для лабораторной диагностики выраженности окислительного стресса и определении показания для использования препаратов с антиоксидантными свойствами целесообразно оценивать состояние антиоксидантной системы, а также интенсивности свободнорадикальных реакций (процессов ПОЛ) в организме пациента. В результате проведённого анализа литературы можно сделать вывод, что для оценки состояния интенсивности перекисного окисления липидов в организме человека необходимо использовать интегративные подходы, использование только одного из указанных выше тестов не дает полной информации. Также лабораторная диагностика интенсивности ПОЛ необходима для суждения об АО-активности того или иного препарата, так как на основании клинических признаков невозможно адекватно оценить деиствие АО-препарата.
Список использованных источников
Дубинина, Е. Е. Окислительный стресс как реакция адаптации организма к экстремальным условиям / Е. Е. Дубинина //Вопросы медицинской химии. - 2001. - № 6., том 47 - С. 561-581.
Балаболкин, М. И. Роль окислительного стресса в патогенезе сосудистых осложнений диабета / М. И. Балаболкин, Е. М. Клебанова // Проблемы эндокринологии. - 2000. - № 6. - С. 29-34.
Владимиров, Ю.А. Свободные радикалы в главных системах / Ю.А. Владимиров, О.А. Азизова; под ред. А.И. Деев. - М.: ВИНИТИ, серия биофизика, 1991. - 252 с.
Свободные радикалы. Определение, номенклатура, классификация [Электронный ресурс] / академик РАМН, профессор Владимиров Ю.А. - 2006. - Режим доступа: http://www.eternalmind.ru. - Дата доступа: 25.03.2007.
Владимиров, Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. - М.: Медицина, 1972. - 252 с.
Шанин, Ю.Н. Антиоксидантная терапия в клинической практике / Ю.Н. Шанин, В. Ю Шанин, Е. В.Зиновьев. - Санкт - Петербург, ЭЛБИ - СПб., 2003 - 128 с.
Зайчик, А.Ш. Общая патофизиология (с основами иммунологии) / А.Ш. Зайчик, Л.П. Чурило. - Санкт - Петербург, ЭЛБИ - СПб., 2005. - 656 с.
Кашулина, А. П. Роль перекисного свободнорадикального окисления в патологии и методы его изучения / А. П. Кашулина, Е. Н. Сотникова // Мед. консультирование. - 1996. - № 2. - С. 20-24.
Буеверов, А. О. Оксидативный стресс и его роль в повреждении печени / А. О. Буеверов. // Российский журнал гастроэнторологии. - 2002. - № 4. - С. 21-25.
Хуцишвили, М. Б. Свободнорадикальные прцессы и их роль в патогенезе некоторых заболеваний / М. Б. Хуцишвили, С. И. Рапопорт. // Клиническая медицина. - 2002. - № 10. - С. 10-16.
Troy, C.M. Down-regulation of copper zinc superoxide dismutase causes apoptotic death in PC 12 neuronal cells / C.M. Troy // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1994. - № 14. - P. 6384 - 6387.
Болдырев, А. А. Введение в биомембранологию: учеб. пособие / Под ред. А. А. Болдырева. - М.: Изд-во МГУ, 1997. - 208 с.
Повреждение компонентов биологических мембран при патологических процессах [Электронный ресурс] / М.: - 2006. - Режим доступа: http://www.biophysics.hotmail.ru. - Дата доступа: 14.03.2007.
Radi, R. Peroxynitrite-induced membrane lipid peroxidation: the cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide / R. Radi // Arch. Biochem. Biophys. - 1991. - №2. - P. 481--487.
Даниловой, Л. А. Сборник по лабораторным методам исследования / Под ред. Л. А. Даниловой. - СПб.: Питер, 2003. - 736 с.
Лифшиц, В.М. В. И. Сидельникова. ?Медицинские лабораторные анализы?. Справочник. Издание второе исправленное и дополненное / В.М. Лифшиц, В. И. Сидельникова.- М.: ?Триада - Х?, 2003. - 312 с.
17. Николаев, А. Я. Биологическая химия / Николаев А. Я. - М.: Медицинское информационное агенство, 2001. - 496 с.
Размещено на Allbest.ru
Подобные документы
Исследование физиологии поджелудочной железы, роли панкреатического сока в процессе пищеварения. Анализ активных форм кислорода и путей их образования, биохимии свободно-радикальных процессов. Обзор состояния обменных процессов при остром панкреатите.
курсовая работа [467,4 K], добавлен 10.03.2012Синтез флавоноидов в растениях. Биологическая активность флавоноидов и их классификация. Определение антиоксидантной активности ДГК методом люминол-зависимой хемилюминесценции. Изучение перекисного окисления липидов в присутствии дигидрокверцетина.
дипломная работа [2,4 M], добавлен 25.06.2009Высокая реакционная способность молекулярного кислорода в основном состоянии и образование его высокоактивных форм, способных убивать живую клетку. Механизмы возникновения активных форм кислорода. Действие, функции и основные способы защиты организма.
курсовая работа [1,7 M], добавлен 01.05.2012Растительные и животные жиры как основные источники липидов для человека. Технологический процесс получения микробных липидов. Использование микробиологического способа производства липидов. Применение микробных липидов в пищевых производствах.
реферат [137,7 K], добавлен 18.06.2013Этиология и патогенез ишемии мозга. Свободно-радикальное окисление и антиоксидантная защита при патологии головного мозга. Процессы свободно-радикального окисления липидов в развитии и течении острых нарушений мозгового кровообращения. Модели ишемии.
дипломная работа [243,8 K], добавлен 15.12.2008Взаимодействие липидов с биологическими мембранами и модельными бислоями. Подавление бактериального, грибкового, протозойного и паразитарного роста. Влияние на процесс окисления, на структуру и активность белка, взаимодействие с ДНК, цитотоксичность.
реферат [33,6 K], добавлен 19.05.2017Общая характеристика и основные этапы обмена липидов, особенности процесса переваривания. Порядок всасывания продуктов переваривания липидов. Исследование различных органов и систем в данном процессе: стенок и жировой ткани кишечника, легких и печени.
презентация [4,5 M], добавлен 31.01.2014Исследование структурных особенностей простых липидов. Характеристика строительной, теплоизолирующей и энергетической функций липидов. Описания восков, соединений, образованных высшими карбоновыми кислотами и высокомолекулярными одноатомными спиртами.
презентация [905,6 K], добавлен 31.05.2015Пространственная структура мембранных липидов. Структура и термодинамика водно-липидных систем. Смеси липидов с водой и полиморфизм. Изучение пространственного строения липидов в кристаллах. Основные типы структурной организации водно-липидных систем.
реферат [2,9 M], добавлен 30.07.2009Виды биологически активных веществ. Характеристика продуктов липидной природы, области применения. Микроорганизмы - продуценты липидов, способы их культивирования. Технологическая схема экстракционного выделения биожира из биомассы дрожжей, его стадии.
курсовая работа [86,5 K], добавлен 21.11.2014
