Лабораторная диагностика интенсивности перекисного окисления липидов

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

ГОМЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

Медико-диагностический факультет

Кафедра клинической лабораторной диагностики

Лабораторная диагностика интенсивности перекисного окисления липидов

Курсовая работа

Исполнитель: Подстреха Елена Станиславовна

студентка группы Д-503

Научный руководитель: заведующая кафедрой, доктор медицинских наук, доцент Новикова Ирина Александровна

ГОМЕЛЬ 2016г

Реферат

В работе проведен анализ литературы об исследовании ферментативных и неферментативных путях образования активных форм кислорода, механизмы их повреждающего воздействия на живые клетки, в частности инициация свободнорадикального перекисного окисления липидов. Рассмотрены анти- и прооксидантные системы защиты организма, осуществляющие баланс между возникновением, метаболизмом и утилизацией активных форм кислорода.

Курсовая работа 35 страниц, 1 таблица, 17 источников.

Перечень ключевых слов: перекисное окисление липидов, свободно - радикальное окисление, активные формы кислорода, антиоксидантная защита, малоновый диальдегид.

Содержание

Перечень сокращений

Введение

1. Роль свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы в организме человека

1.1 Формы свободных радикалов в организме

1.2 Общая характеристика основных АФК, их биологическая роль

1.3 Физиологическая роль свободнорадикального окисления

1.4 Регуляция свободно-радикального окисления

1.5 Система антиоксидантной защиты организма

1.6 Патогенетические механизмы нарушений, развивающиеся при нарушении баланса антиоксидантной и прооксидантной систем

2. Свободнорадикальное (перекисное) окисление липидов

2.1 Участие АФК и продуктов ПОЛ в патогенезе заболеваний человека

2.2 Диагностика процессов перекисного окисления

Заключение

Список использованных источников

Перечень условных обозначений

АОА - антиоксидантная активность

АО - антиоксидант

АФК - активные формы кислорода

ГР - глутатионредуктаза

ГП - глутатионпероксидаза

МП - миелопероксидаза

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СОД - супероксиддисмутаза

СРО - свободно-радикальное окисление

ХЛ - хемилюминесценция

ЭПР - электронный парамагнитный резонанс

Введение

перекисный окисление липид активный кислород

В организме в результате окислительно-восстановительных реакций постоянно происходит генерация активных форм кислорода (АФК), которые обладают высокой реакционной способностью, вызывая, в частности, окислительную модификацию биополимеров: белков, липидов, нуклеиновых кислот, углеводов. Радикалы кислорода, несмотря на свою реакционность и потенциальную токсичность, в малых концентрациях являются нормальными метаболитами множества биохимических реакций в клетке. В физиологических условиях свободно-радикальные реакции протекают на низком уровне. Процессы, протекающие с участием радикалов кислорода, свидетельствует о важной роли этих соединений в поддержании гомеостаза, формировании резистентности организма против инфекций, обеспечении регенерации тканей и органов. Если процесс генерации АФК усиливается, это может явиться и является пусковым фактором развития целого перечня разнообразных патологических процессов.

Актуальность углубленной разработки проблемы патогенетической значимости свободнорадикального перекисного окисления обуславливается нарастающим экологическим неблагополучием. Изучение этого важного звена гомеостаза имеет непосредственное прикладное значение, т. к. позволяет разрабатывать и применять адекватные профилактические подходы, предупреждающие запуск цепной реакции свободнорадикального окисления или нейтрализующие токсичность продуктов ПОЛ.

1. Роль свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы в организме человека

Системы, участвующие в образовании АФК, и процессы, связанные с окислительной альтерацией биологических соединений, условно объединены понятием прооксидантная система.

К прооксидантам в живой клетке относятся высокие концентрации кислорода (например, при длительной гипербарической оксигенации больного), ферментные системы, генерирующие супероксидные радикалы (например, ксантиноксидаза, ферменты плазматической мембраны фагоцитов и др.), ионы двухвалентного железа.

Окислительные реакции -- основа энергообразования и жизнедеятельности всех клеток организма человека. Они могут протекать без присоединения кислорода (оксидазные реакции) и с присоединением молекулярного или атомарного кислорода -- оксигеназные реакции. Промежуточными продуктами последних является перекиси и эпоксиды, поэтому такие реакции называются перекисным окислением. Оно индуцируется высокореактивными свободными радикалами.

В физиологических условиях интенсивность перекисных процессов незначительна и поддерживается на стационарном уровне благодаря многокомпонентной системе нейтрализации постоянно образующихся свободных радикалов -- антиоксидантной системе.

Образование прооксидантов в тканях уравновешивается активностью внутри- и внеклеточных антиоксидантов, формируя определенный оптимальный уровень прооксидантно-антиоксидантного равновесия [1].

1.1 Формы свободных радикалов в организме

Известно множество окислительно-восстановительных реакций, в ходе которых образуются различные виды свободных радикалов. Свободные радикалы были открыты в конце прошлого столетия. К настоящему времени их описано более 8000. Свободные радикалы являются высокоактивными соединениями, которые образуются в физиологических условиях как вторичные продукты в процессе метаболизма, а также другими путями, включая редокс-реакции, осуществляемые путем одноэлектронного переноса; гомолиз инициаторных молекул, обладающих слабой ковалентной связью, радиолиз; фотолиз, термолиз.

Многие ксенобиотики, включая различные лекарственные препараты, алкоголь и др., метаболизируются в организме, генерируя свободные радикалы. Несмотря на большое разнообразие их происхождения и структуры, свободные радикалы подразделяются на 3 большие группы: 1) радикалы реактивного кислорода (ROS); 2) радикалы реактивного азота (RNS); 3) радикалы реактивного хлора (RCS) [2].

Свободный радикал -- это молекула, атом или группа атомов, имеющих неспаренный электрон на внешней атомной орбитали. АФК являются активными участниками большого числа химических реакций в клетках, оказывая разнообразное физиологическое действие [3].

Отличительные особенности свободных радикалов:

* наличие неспаренного электрона на внешнем энергетическом уровне;

* собственный магнитный момент;

* высокая химическая активность и малое время жизни;

* способность инициировать цепные реакции окисления;

Наиболее вероятно появление свободных радикалов в организме при последовательном присоединении электронов к кислороду и во время свободнорадикального перекисного окисления липидов.

Основные процессы, ведущие к образованию свободных радикалов в организме:

* последовательное присоединение электронов к кислороду в присутствии металлов переменной валентности;

* микросомальное и митохондриальное окисление, фагоцитоз;

* ферментативные реакции с участием гидролаз, оксидаз, дегидрогеназ;

* реакции автоокисления и биосинтеза (тиолы, катехоламины и т. д.);

* окисление чужеродных соединений - ксенибиотиков, некоторых лекарственных препаратов;

* действие негативных факторов среды (физические и химические инициаторы окисления);

* фотохимические процессы;

* перекисное окисление липидов.

Значение свободно радикального окисления:

- модификация физико-химических свойств биологических мембран;

-защитные функции, окисление чужеродных соединений, микробицидное действие;

- обмен веществ, аккумуляция и биотрансформация энергии;

- влияние на иммунитет, передачу информации.

Наиболее распространенные в организме формы свободных радикалов:

* Активные формы кислорода:

Оя2 - супероксидный анион радикал;

№O2 - синглетная форма кислорода;

OHя - гидроксильный радикал;

Н2О2 - перекись водорода;

Окисленные галогены: CLOя - гипохлорид, хлорамины;

Окислы азота: NOя - оксид азота;

Свободные радикалы образующиеся при перекисном окислении липидов: ROя, RO2я- моно-, димерные, полимерные, циклические, алкоксильные и перекисные радикалы жирных кислот[4].

1.2 Общая характеристика основных АФК, их биологическая роль

Радикалы кислорода образуются в ходе процессов, связанных с транспортом электронов по дыхательной цепи. В обычных условиях на генерацию АФК расходуется от 1 до 5 % потребляемого кислорода. Однако эта величина может существенно возрастать при изменении кислородного бюджета организма - при гипероксии или гипоксии. В результате последовательного восстановления молекулярного кислорода происходит образование супероксидного аниона, перекиси водорода, гидроксильного радикала.

Супероксиданион-радикал (Оя2) образуется при присоединении одного электрона к молекуле кислорода в основном состоянии. Радикал является относительно слабым окислителем и во многих биологических системах выступает в качестве донора электронов, восстанавливая ряд соединений. При взаимодействии с протоном О2 переходит в гидроперекисный радикал. Кроме этого, именно он является потенциальным источником гидроксильного радикала и перекиси водорода.

Супероксиданион-радикал - более реакционноспособное соединение, чем кислород. В организме супероксиданион-радикал представляет собой промежуточный продукт многих биохимических реакций, таких как окисление тиолов, флавинов, хинонов, катехоламинов, птеринов, а также метаболизма ксенобиотиков. Из источников супероксиданион-радикала наибольший интерес представляют гемоглобин, миоглобин, восстановленный цитохром С, НАДФН-оксидазы фагоцитирующих клеток и др. Основным источником радикала в крови являются нейтрофилы, генерирующие его при ряде реакций специфического и неспецифического иммунитета. Еще один фермент, специализированный на образовании супероксиданион-радикала -- это ксантиноксидаза, которая в нормальных условиях находится преимущественно в дегидрогеназной форме и может обратимо и необратимо переходить в оксидазную форму, что происходит при ишемии. Считается, что генерация радикала ксантиноксидазой необходима для метаболизма железа, регуляции тонуса сосудов и клеточной пролиферации, обеспечения микробицидного потенциала нейтрофилов.

Супероксиданион-радикал -- пусковое звено каскада свободно-радикальных реакций, приводящих к возникновению большинства АФК и продуктов ПОЛ. Он участвует в синтезе хемотаксических пептидов, усиливает митогенстимулированную пролиферацию лимфоцитов, ингибирует действие эндотелиального фактора расслабления, может повреждать мембраны эритроцитов, ингибировать Са2+-АТФ-азу, синтез РНК и белка эндотелиальных клеток, окислять белки сыворотки, в то же время его непосредственная цитотоксичность невелика.

Для регуляции уровня Оя2 в клетках служит высокоспецифичный фермент антиоксидант -- супероксиддисмутаза, которая обладает способностью существенно ускорять реакции дисмутации радикала в перекись водорода.

Перекись водорода (Н2О2). Присоединение двух электронов к молекуле кислорода или одного электрона к аниону О2 сопровождается образованием двухзарядного аниона О22?, который переходит в НО2я или перекись водорода. Перекись водорода относят к окислителям средней силы; в отсутствие ферментных антиоксидантов и ионов металлов переменной валентности она относительно стабильна и может мигрировать в клетки и ткани. Перекись водорода оказывает ограниченное повреждающее действие, вызывая, в частности, нарушение гомеостаза кальция в клетке. В организме ее источниками являются реакции с участием оксидаз (ксантиноксидазой, оксидазой L-аминокислот и рядом других), переносящими два электрона на молекулу кислорода, а также реакция дисмутации супероксиданион-радикала, катализируемая супероксиддисмутазой. Эта реакция является источником почти 80 % перекиси водорода в очаге воспаления.

Перекись водорода является промежуточным продуктом при образовании большинства АФК. Н2О2 -- один из источников возникновения наиболее токсичного из АФК -- гидроксильного радикала. В присутствии миелопероксидазы из нее происходит образование высокореакционных гипогалоидов -- НОС1, HOBr, HOJ, HOSCN.

В обычных условиях клетки млекопитающих достаточно устойчивы к воздействию перекиси водорода благодаря наличию ферментов -- глутатионпероксидазы и каталазы. Молекулы Н2О2 выполняют ряд регуляторных функций в клетке. Перекись может служить в качестве метаболического сигнала для индукции экспрессии генов, осуществляющих синтез структурных и функциональных белков в клетке.

Гидроксилъный радикал (НОя) является наиболее реакционноспособным и, соответственно, токсичным из всех АФК, образующихся в биологических системах. Радикал может разрывать любую углеводородную связь, при этом скорость его взаимодействия с органическими субстратами достигает величин, равных скорости диффузии (т. е. 107--1010 моль/с, что в 106 раз выше, чем для супероксиданион-радикала и перекиси водорода). По сравнению с другими АФК, НОя обладает наиболее высоким редокс-потенциалом, равным + 2,7, что позволяет ему атаковать и разрушать любые макромолекулы практически на месте в момент появления.

Основным источником гидроксильного радикала является реакция Фентона с участием металлов переменной валентности, главным образом, с Fe2+, по схеме Н2О2 + Fe+2 > Fe+3 + ОН + ОНя. Образование радикала также происходит в ходе окисления арахидоновой кислоты, в реакции Габер--Вейса, Осипова, при микросомальном окислении, в реакциях с флавиновыми ферментами и CoQ. Обратное восстановление Fe3+ возможно в реакции с О2, а также при взаимодействии с аскорбиновой кислотой, глутатионом, цистеином и другими окисляющими соединениями. Показано, что цитотоксическое и канцерогенное действие ионизирующих излучений напрямую связано с образованием гидроксильного радикала в процессе радиолиза воды. НОя также участвует в реализации микробицидного и цитотоксического действия гранулоцитов, моноцитов и Т-лимфоцитов. Гидроксильные радикалы вызывают повреждения нуклеиновых кислот, белков, а также других клеточных структур, ингибируют ряд фракций комплемента. Они индуцируют образование органических радикалов и таким образом запускают процессы ПОЛ. Ввиду высокой неспецифичности реакций радикала с разными органическими молекулами, его взаимодействие носит цепной характер. Важно отметить, что в организме нет специализированных ферментных систем, обладающих способностью инактивировать гидроксильный радикал. Низкомолекулярные соединения, такие как урацил, мочевая кислота, салицилаты, глюкоза, диметилсульфоксид, обладают способностью ингибировать ОНя радикал только при достаточно высоких концентрациях. Таким образом, при целом ряде патологических состояний, сопровождающихся избыточным образованием АФК и, соответсвенно, гидроксильного радикала, организм становится практически беззащитным перед повреждающим действием этого соединения. Предотвращение повреждений клеточных структур осуществляется только за счет снижения концентрации радикалов -- предшественников ОН, в частности, супероксиданион-радикала и перекиси водорода. Способностью разрушать эти радикалы-предшественники обладают СОД и каталаза.

Синглетный кислород(№O2). Образуется при изменении спина одного из электронов р-орбитали в молекуле кислорода. Возникновение №O2 как сопутствующего продукта отмечено во многих ферментативных реакциях с участием СОД, каталазы и пероксидаз, а также в реакциях с участием большинства АФК. Так, в реакции разложения перекиси водорода каталазой до 1%, образующегося кислорода возникает в синглетном состоянии. Синглетный кислород обладает высокой реакционной способностью и легко вступает в окислительные реакции с органическими соединениями. Он часто выступает в качестве индуктора реакций ПОЛ. Хотя №О2 обладает цитотоксическим действием и принимает участие в реализации микробиоцидного действия гранулоцитов, его вклад в эти процессы не является определяющим. Одним из наиболее эффективных гасителей синглетного кислорода в клетке является бета-каротин, одна молекула которого способна потушить около 1000 его молекул прежде, чем подвергнется окислительной деструкции [5].

АФК выступают в качестве вторичных посредников в процессах жизнедеятельности клеток. Включаясь в сигнальную трансдукцию, АФК влияет на ключевые звенья метаболических процессов: фосфорилирование, метаболизм Са2+, модуляция факторов транскрипции, гидролиз фосфолипидов. При любых стрессорных реакциях организма, сопровождающихся состоянием окислительного стресса, АФК участвуют в передаче сигнала от первичных посредников для запуска каскада реакций, необходимых для приспособления и выживания в экстремальных условиях.

Каждая ткань обладает определенной буферной ёмкостью АОЗ. Она зависит от состояния АОЗ межклеточной жидкости и самой клетки, отдельных её компонентов. Некоторые ткани в силу особенностей своей функциональной и метаболической активности обладают высокой чувствительностью к состоянию окислительного стресса, это связано с высокой потенциальной мощностью прооксидантной системы и низкой буферной емкостью АОЗ. К таким тканям относятся мозг, сетчатка, легкие. Это обусловлено важной регуляторной функцией, которую выполняют генерируемые АФК и радикальные метаболиты в этих тканях. В мозговой ткани это связано с передачей сигналов возбуждения, возникновения потенциала действия и включения в работу синапсов.

АФК - вторичные мессенджеры.

Метаболический фон любой клетки зависит от характера информации, поступающей из окружающей среды. Носителями этой информации являются первичные мессенджеры: гормоны, цитокины, нейротрасмиттеры. Этот процесс осуществляется за счет клеточной сигнализации или сигнальной трансдукции. А в передачу сигнала через клеточную мембрану включаются вторичные мессенджеры. В качестве вторичных посредников принимают активное участие АФК. Они осуществляют регулирующую роль в процессах роста клеток, апоптозе, клеточной адгезии, свертывания крови и т. д. Низкие (микромолярные) концентрации АФК увеличивают рост или усиливают ответ на стимуляцию роста во многих типах клеток, а антиоксиданты подавляют нормальную клеточную пролиферацию. Низкие концентрации Н2О2 стимулируют рост фибробластов. Ингибирование СОД или глутатионпероксидазы увеличивает клеточную пролиферацию. ОНя, являться фактором, усиливающим клеточную пролиферацию и активность митоген-активируемой протеинкиназы (МАР-киназа).

В физиологических концентрациях АФК в роли вторичных посредников образуется опосредованно через лиганд-рецепторное взаимодействие. В качестве таких лигандов могут выступать гормоны (инсулин, ангиотензин, паратиреоидный гормон, витамин Дз), цитокины, факторы роста. Образование лиганд-рецепторных комплексов сопровождается образованием АФК, которые активно включаются в сигнальную трансдукцию, влияя на ключевые звенья метаболических процессов в клетке.

Первичные мессенджеры осуществляют регуляцию уровня АФК в клетке за счет активации процессов их генерации с одной стороны и снижения активности отдельных звеньев АОЗ с другой. В этом процессе активное участие принимают цитокины. Цитокины стимулируют освобождение АФК из многих типов клеток, включая фибробласты человека, эпителиальные и эндотелиальные клетки. С АФК связана передача сигнала от тромбоцитарного фактора роста, эпидермального фактора роста, трансформирующего фактора роста в-1, фактора некроза опухолей. Участие интерлейкина-1 и интерферона в сигнальной трансдукции связывают с образованием О2?, а ФНО - с Н2О2.

АФК выполняют роль вторичных мессенджеров и в клетках костной ткани. ФНО, интерлейкин-1, паратиреоидный гормон и витамин Д стимулируют образование АФК за счет присутствующей в

остеокластах НАДФН-оксидазы. Вазоактивный пептид (ангиотензин II) проявляет свое действие на процессы мышечного сокращения и клеточный рост гладких мышц сосудов через генерацию внутриклеточного Оя2?. Источником Оя2? являлись НАДН и НАДФН-оксидазы, так как оба фермента активируются ангиотензином.

АФК в качестве вторичных мессенджеров участвует регуляции обмена Са2+, стимуляции фосфолирирования белков и активации факторов транскрипции.

В присутствии оксидантов увеличивается транспорт Са2+ через кальциевые-каналы и ингибируется АТФ-зависимый Са2+-насос.

Оксиданты, увеличивая активность различных

протеинкиназ, участвуют в регуляции многочисленных клеточных процессов, таких как митогенез, клеточная адгезия, апоптоз и т.д.

Также звеном действия оксидантов в качестве вторичных мессенджеров является фосфолипаза А2. Её активация оксидантами сопряжена с вовлечением многих путей передачи сигнала. Арахидоновая кислота, как продукт фосфолипазы А2 , является важным медиатором таких процессов как воспаление, иммунные процессы, НАДФН-оксидазная активность, свертывание крови.

Таким образом выделяют 3 возможных пути действия оксидантов в качестве вторичных мессенджеров на процессы в клетке, связанные с образованием сигнальных молекул:

Влияние на структуру клеточных мембран.

Влияние на состояние депо Са2+, что сопровождается его мобилизацией из депо и поступлением в цитозоль.

3.Активация фосфолипазы А2 [1].

1.3 Физиологическая роль свободнорадикального окисления

Любой радикал является индуктором свободнорадикальных реакций. Процессы свободнорадикального окисления (СРО) с участием АФК при достаточно низкой интенсивности относятся к нормальным метаболическим процессам. Радикалы кислорода индуцируют процессы ПОЛ, необходимые для процессов обновления фосфолипидов и регуляции проницаемости клеточных мембран. Важной физиологической функцией АФК является активация ряда мембранных белков и иммуноглобулинов, а также ферментов, регулирующих переключение метаболических путей и синтез макроэргических соединений в клетке. С процессами СРО непосредственно связаны окислительное фосфорилирование и скорость клеточного деления. Перекись водорода может выступать в качестве метаболического сигнала для внутриклеточных процессов, приводящих к окислению специфических SH-групп протеинкиназ. Будучи активированными, эти белки транслоцируются в ядро и индуцируют экспрессию групп генов, продукты экспрессии которых ответственны за различные формы защитных реакций клетки. Кроме этого, перекись обладает инсулиноподобным действием.

Продукты свободно-радикальных реакций и ПОЛ участвуют в биосинтезе прогестерона, стероидных и тиреоидных гормонов, лейкотриенов, тромбоксана А2, протромбина. Важным свойством активных метаболитов кислорода и, в частности, супероксиданион-радикала, является регуляция метаболизма соединительной ткани. АФК стимулируют пролиферацию фибробластов, синтез и распад коллагена и триптофана, участвуют в метаболизме железа. Некоторые из оксигеназ, а именно группа ферментов, получивших наименование цитохрома Р-450 (в настоящее время насчитывается более сотни изоформ), помимо гидроксилирования эндогенных соединений, используют кислород и ряд АФК для детоксикации липофильных ксенобиотиков. Цитохром Р-450 зависимые монооксигеназы и сопряженная с ними электронно-транспортная система осуществляют внедрение АФК непосредственно в молекулу субстрата, что приводит к образованию окисленного, более гидрофильного продукта. В организме цитохром Р-450-зависимые монооксигеназы выполняют ряд важнейших функций. Во-первых, это окислительная биотрансформация (биосинтез или деградация) эндогенных липофильных молекул-эндобиотиков (стероидов, ретиноидов, метаболитов арахидоновой кислоты), во-вторых, биотрансформация поступающих извне химических соединений-ксенобиотиков, которые не являются участниками нормальных биохимических процессов в клетке и подлежат удалению. Основная монооксигеназная реакция всегда сопровождается образованием супероксиданион-радикала, перекиси водорода, а иногда и активных метаболитов окисляемого субстрата. Преимущественно эти ферменты представлены в эндоплазматическом ретикулуме клеток, максимально ферментная система экспрессирована в гепатоцитах, надпочечниках и половых железах [6].

АФК участвуют в регуляции сосудистого тонуса путем ингибирования эндогенного оксида азота. Одна из радикальных форм кислорода -- пероксинитрил, легко превращающаяся в исходные продукты -- оксид азота и супероксиданион-радикал, является транспортной формой для N0я, в результате чего радиус действия этой сигнальной молекулы может значительно увеличиваться. Свободнорадикальная природа пероксинитрила является причиной ослабления и нивелирования многочисленных физиологических эффектов оксида азота. Взаимодействие же закиси азота и супероксиданион-радикала сопровождается резким усилением окислительного потенциала последнего.

Метаболиты кислорода участвуют в рекциях клеточного и гуморального иммунитета как регуляторы и эффекторы этих процессов. В частности, радикалы кислорода, генерируемые оксидазами нейтрофильных гранулоцитов и мононуклеарных фагоцитов, играют одну из основных ролей в реализации микробицидного, цитотоксического и иммунорегуляторного действия этих клеток. При этом основными эффекторами микробицидного действия являются гидроксильный радикал, перекись водорода и гипогалоиды.

АФК стимулируют пролиферацию иммунокомпетентных клеток. Доказано прямое участие супероксиданион-радикала в образовании хемотаксических факторов, вызывающих активацию и миграцию лейкоцитов в очаг воспаления. Способностью вызывать синтез хемотаксических пептидов обладает и гидроксильный радикал, который одновременно с этим усиливает митогенстимулированную пролиферацию и последующую дифференцировку лимфоцитов.

Многие важные процессы, такие как генерация конечных продуктов пуринового обмена и распад дофамина, сопровождаются выработкой АФК.

Адренэргическая стимуляция физиологически приводит к усилению, а холинэргическая - к ослаблению продукции эндогенных АФК, противоположно изменяет редокс-потенциал клетки и создает условия для пермессивного эффекта, когда один и тоже сигнал вызывает различный ответ клеток, в зависимости от их редокс-состояния. Так, например, ФНО вызывает либо гибель клеток, либо их пролиферацию, т.к. зависимый от него фактор транскрипции срабатывает только при сдвиге окислительного потенциала клеток - мишеней.

Осуществляя защитные реакции, клетки (макрофаги и гистиоциты) могут многократно усиливать продукцию АФК. При фагоцитозе происходит ?метаболический взрыв? в фагоцитах, т.е. многократное усиление потребления энергии фагоцитирующей клеткой. Значительная часть этой энергии расходуется НАДФН - зависимыми оксидазами на образование супероксидного радикала.

АФК осуществляют бактерицидный эффект в фаголизосомах, т.к. в отличие от лизосомальных гидролаз, АФК способны разрушать неповрежденные клеточные стенки бактерий и интактные мембраны клеток, кислородзависимый механизм завершающей стадии фагоцитоза более важен чем гидролитический.

АФК также секретируется вовне в процессе экзацитоза, в расчете на их способность разрушать причинный агент первичной альтерации, путем перекисного окисления мембран соседних клеток, осуществляют вторичное самоповреждение и способствуют выработке эйкозанойдных медиаторов воспаления [7].

1.4 Регуляция свободно-радикального окисления

Скорость СРО и содержание свободных радикалов в организме в норме поддерживается на определенном уровне сложной, многоступенчатой системой регуляции. В ней можно условно выделить специфические и неспецифические факторы, значение и вклад которых меняется на различных стадиях окисления. 

Неспецифические факторы:

* механизмы, регулирующие количество и качество субстрата окисления и его доступность;

* факторы, влияющие на инициаторы окисления, в частности, на состояние металлов переменной валентности;

* физико-химические свойства биологических мембран;

* механизмы, поддерживающие низкое содержание O2 в тканях.

Специфические механизмы:

* ферменты, ответственные за образование и метаболизм АФК (СОД, каталаза и др.);

* системы, утилизирующие перекисные продукты (глутатион-пероксидаза, глутатион-редуктаза и др.);

* перехватчики АФК (метионин, гистамин и др.);

* биоантиоксиданты (токоферол, убихинон, церулоплазмин)[8].

1.5 Система антиоксидантной защиты организма

Исходя из свойств радикальных производных молекулярного кислорода и органических перекисей, защита организма от их пагубного воздействия является одной из важнейших задач по поддержанию гомеостаза. Систему защиты тканей и клеток от токсических метаболитов кислорода и продуктов ПОЛ можно условно разделить на физиологическую (механизмы, осуществляющие регуляцию доставки и поступления кислорода к клеткам) и биохимическую (собственно антиоксидантную систему организма, т. е. широкий класс химических соединений, снижающих активность радикальных окислительных процессов). Физиологический компонент системы АО защиты организма обеспечивает равновесие между интенсивностью транспорта кислорода к клеткам и метаболическими процессами по его выгодной и безопасной утилизации. Эти механизмы ограничения свободнорадикальных реакций обеспечиваются за счет:

наличия каскада уровней парциального давления кислорода, понижающегося от альвеол к клеткам с 100-105 до 8-10 мм.рт. ст., то есть в 10-13 раз.

снижения напряжения кислорода в некоторых субклеточных структурах в 100-1000 раз по сравнению с парциальным давлением кислорода в капиллярах. Процесс опосредован относительно большой межкапиллярной дистанцией и высоким сродством цитохромоксидазы к кислороду;

редукции микроциркуляции в тканях при увеличении парциального давления кислорода в артериальной крови. Происходящий при этом так называемый «гипероксический вазоспазм» имеет несколько причин. Существенное значение придается снятию сосудорасширяющего действия СО, а также снижению активности NO-синтаз и, соответственно, снижении выработки основного фактора расширения сосудов -- оксида азота. Признается также и возможность прямого сосудосуживающего действия кислорода [6].

Биохимические механизмы антиоксидантной защиты реализуются собственно антиоксидантной системой организма, состоящей из тесно, структурно и функционально связанных между собой звеньев, обеспечивающих предотвращение избыточной активации ПОЛ и неконтролируемую продукцию АФК на всех этапах этих процессов как в клетках, так и в межклеточной жидкости и крови [7].

Биохимическую АО-систему организма условно можно разделить на специфическую и неспецифическую. Специфическая АО-система направлена на разрушение АФК и продуктов их дальнейших превращений. Действие неспецифической АО-системы связано с предотвращением условий и возможностей утечки электронов и генерации АФК в ходе окислительно-восстановительных реакций (в рамках окислительного фосфорилирования) или в процессе аутоокисления субстратов (микросомальное окисление).

Патогенному воздействию ПОЛ противостоят специализированные ферментные системы и целый ряд неферментных соединений. К специфическим АО-энзимам можно отнести супероксиддисмутазу, каталазу, глутатионзависимые пероксидазы и трансферазы. Эта группа ферментов локализующихся преимущественно внутриклеточно, обладает способностью разрушать свободные радикалы, а также участвовать в разложении гидроперекисей нерадикальным путем. Энзимы антирадикальной защиты характеризуются высокой избирательностью действия, направленного против определенных радикалов; специфичностью клеточной и органной локализации, а также использованием в качестве стабилизаторов металлов, к которым относятся медь, цинк, марганец, железо и ряд других.

Оксиданты	Антиоксиданты
Активные формы кислорода: Оя2 - супероксидный анион радикал; №O2 - синглетная форма кислорода; OHя - гидроксильный радикал; Н2О2 - перекись водорода; Окисленные галогены: CLOя - гипохлорид, хлорамины; Окислы азота: NOя - оксид азота; Свободные радикалы образующиеся при перекисном окислении липидов: ROя, RO2я- моно-, димерные, полимерные, циклические, алкоксильные и перекисные радикалы жирных кислот[.	Ферментные Супероксиддисмутазы Каталаза Глутатион (GSH-)-пероксидазы GSSG-редуктазы Глутатион- S-трансферазы УДФ-глюкуронилтрансферазы НАДФ- Н-хиноноксидоредуктаза НАДФ- Н-хиноноксидоредуктаза Неферментные Глутатион а-Токоферол (витамин Е) в-Каротин Ураты Билирубин Флавоноиды Альбумин Церулоплазмин Трансферрин

Таблица 1.Сводная таблица оксидантов и антиоксидантов.

Содержание АО-ферментов в различных тканях организма существенно различается. Так, их уровень и активность в клетках соединительной ткани в несколько раз ниже, чем в паренхиматозных органах. Уровень ферментативных АО в клетках находится под генетическим контролем. Так, повышение содержания супероксиданион-радикала или перекиси водорода в цитозоле клеток сопровождается активацией транскрипции генов, запускающих синтез около 40 белков, среди которых -- каталаза, супероксиддисмутаза, гидропероксидаза, а также эндонуклеаза репарации ДНК. Практически все воздействия, приводящие к усилению образования АФК в клетках, индуцируют синтез ферментативных АО.

В условиях гипоксии и гипероксии, т. е. состояний, усиливающих образование АФК, повышается уровень ферментных АО внутри клеток. В нормальных условиях содержание ферментных АО относительно постоянно и мало зависит от пола, отмечается некоторое снижение их уровня с возрастом. В то же время нормальное функционирование АО-системы организма и содержание ферментных АО резко нарушается при критических состояниях (ранениях, травмах, а также обширных ожогах кожи. Тяжелые травмы сопровождаются нарушением динамического равновесия прооксидантных и антиоксидантных систем, при этом содержание и активность эндогенных антиоксидантов, в том числе и АО-энзимов, резко снижается внутри и вне клеток [8].

Как уже отмечалось, ключевым ферментом АО-защиты является супероксиддисмутаза (СОД), открытая McCord J. и Fridovich I. в 1969 г. СОД относится к классу окислительно-восстановительных ферментов и присутствует в значительных количествах практически во всех про- и эукариотических клетках. В организме человека СОД обнаружена во всех органах и тканях, причем особенно высока внутриклеточная концентрация.

В крови фермент находится в следовых концентрациях, при экзогенном введении чрезвычайно быстро, в течение 5-10 минут выводится в неизмененном виде почками. Высокая концентрации СОД, сравнимая с внутриклеточной, отмечается в бронхоальвеолярной жидкости. Во внеклеточном пространстве фермент присутствует в очень малых количествах. Следствием этого в случае образования большого количества супероксиданион-радикалов во внеклеточном пространстве, например, в очаге воспаления, организм оказывается практически беззащитным перед повреждающим воздействием радикалов.

Основной функцией СОД является ускорение реакции дисмутации супероксидных радикалов, образующихся в ходе биологического окисления. Скорость спонтанной реакции при нейтральных значениях рН не превышает 7 х 105 М?1 с?1, в присутствии СОД она возрастает до 2 х 109 М?1 с?1 и выше, т. е. фермент ускоряет реакцию на три-четыре порядка.

СОД имеет несколько изоформ, различающихся строением активного центра. Железосодержащий изофермент характерен только для микроорганизмов, для клеток человека характерны две его другие разновидности. Марганецсодержащий фермент (Mn-СОД) локализован в митохондриях, цианидрезистентен. В общем объеме супероксиддисмутазной активности доля Mn-СОД невелика и составляет около 15%. До 40% СОД, сконцентрированной в ядрах клеток, приходится именно на марганцевую форму фермента, которая дисмутирует до 20% супероксидных радикалов, продуцирующихся в ядре клетки. Медь-цинковая форма энзима (Си, Zn-СОД), чувствительная к цианиду, содержится в цитозоле и межмембранном пространстве митохондрий. Считается, что атом меди обеспечивает каталитическую активность, а атом цинка -- стабилизацию структуры цитозольной изоформы фермента. Низкомолекулярые тиолы за счет восстановления иона Си2+, присутствующего в активном центре СОД, активируют энзим и ускоряют дисмутацию кислорода.

В большинстве случаев фермент состоит из двух одинаковых субъединиц (молекулярный вес колеблется в пределах 30-40 кДа), каждая из которых содержит каталитически активный ион меди и ион цинка, связанные общим лигандом -- имидазолом гистидина 61.

Важнейшая роль СОД для клеточного метаболизма предопределена не только широким распространением этого фермента, но и рядом его уникальных свойств: высокой термоустойчивостью, устойчивостью к действию протеаз, денатурирующих агентов, широким оптимумом рН каталитической активности. Фермент довольно устойчив в растворах -- выдерживает нагревание до 100° С в течение минуты, не теряет активности в диапазоне рН от 2 до 12.

Каталаза представляет собой гемсодержащий фермент с молекулярной массой 250 кДа. Также как и СОД, каталаза представлена во всех клетках организма, однако ее уровень в различных тканях неодинаков. Высокое содержание каталазы обнаружено в эритроцитах, почках и печени. В пероксисомах последних фермент составляет до 40 % всего белка. Реакция, катализируемая каталазой, в общем виде выглядит следующим образом.

Скорость катализа исключительно велика: одна молекула каталазы в секунду разлагает до 44 000 молекул перекиси водорода. Активность каталазы зависит от соотношения числа дисульфидных связей к количеству сульфгидрильных групп в молекуле фермента, которые участвуют в образовании ее активного центра. Из-за этого каталаза чувствительна к действию тиоловых ядов. Из-за большого молекулярного веса молекулы энзим практически не проникает через клеточные мембраны. Это является некоторым препятствием для использования препаратов каталазы в практике.

АО-ферменты СОД и каталаза, функционируя совместно, своевременно инактивируют АФК, супероксиданион-радикал и перекись водорода, образующихся в процессе нормального метаболизма клеток, а также при значительной интенсификации процессов ПОЛ. Однако данные ферменты обладают слабой активностью по отношению к липидным пероксидам, образующимся в ходе цепных реакций ПОЛ. Разрушение этих продуктов осуществляется с участием ферментной системы глутатиона.

Система ферментов глутатиона. Селенсодержащая глутатионпероксидаза способна эффективно разлагать гидроперекиси липидов и перекись водорода. Ее сродство к перекиси водорода выше, чем у каталазы, поэтому первая более эффективно работает при низких концентрациях перекиси, в то же время в защите клеток от окислительного стресса, вызванного высокими концентрациями перекиси водорода, ключевая роль принадлежит каталазе. Глутатионпероксидаза катализирует реакцию окисления глутатиона с образованием его конъюгированной формы, в ходе реакции перекись водорода разлагается до воды.

2G-SH + Н2О2 > G-S-S-G + 2Н2О

Фермент также катализирует реакцию восстановленного глутатиона с гидроперекисями липидов, при этом последние превращаются в жирные оксикислоты:

2G-SH + ROOH > G-S-S-G + R-OH+ Н2О

Наряду с этим, глутатионпероксидаза способна восстанавливать перекиси белкового и нуклеиновокислотного происхождения. Глутатионпероксидаза локализована в цитозоле (около 70 %) и митохондриях (20-30 %) всех клеток млекопитающих. Активный центр фермента содержит четыре атома селена, ковалентно связанных в форме селеноцистеина. Недостаток селена в рационе питания сопровождается снижением активности глутатионпероксидазы в клетках и, соответственно, пониженной устойчивостью организма к окислительному повреждению. В тяжелых случаях это может приводить к развитию аналогичной авитаминозу Е свободнорадикальной патологии, для которой характерны ожирение, некробиотические изменения в печени и гемолиз эритроцитов (болезнь Кешана).

Еще одним ферментом, использующим глутатион для осуществления АО-защиты, является глутатионтрансфераза. Глутатионтрансфераза содержится преимущественно в цитозоле клеток, в печени человека она составляет 2-4 % от общего количества цитозольного белка. Фермент, а точнее, группа ферментов, осуществляет конъюгацию восстановленного глутатиона с гидрофобными соединениями и восстановление органических перекисей. Элиминация производных липофильных ксенобиотиков, а также продуктов ПОЛ, в том числе гидроперекисей жирных кислот, осуществляется посредством их восстановления, нуклеофильного замещения или присоединения к молекуле глутатиона:

ROOH + 2G - SH > ROH +G - S - S - G + H 2О

RX+G - SH >R- S - G + XH

R + G - SH > HR - SG

В отличие от глутатионпероксидазы, для которой лучшими субстратами являются гидрофильные гидропероксиды с малым размером молекулы, глутатионтрансфераза не взаимодействует с перекисью водорода, а восстанавливает гидрофобные гидропероксиды с большим объемом молекулы: гидроперекиси полиненасыщенных жирных кислот -- линоленовой и арахидоновой, а также фосфолипидов. Кроме этого, фермент восстанавливает гидроперекиси мононуклеотидов и ДНК, участвуя тем самым в их репарации. Глутатионтрансфераза -- важный компонент АО-защиты, обеспечивающий удаление многих метаболитов окислительного стресса. Восстановленный глутатион необходим для нормальной работы глутатионзависимых ферментов. Поддержание его достаточного уровня осуществляется посредством синтеза, за счет его десорбции из связей с белками или же путем восстановления из окислений формы. Эта реакция осуществляется ферментом глутатионредуктазой, относящейся к флавопротеинам.

G-S-S-G + НАДФН + Н+ > 2G - SH + НАДФ +

Глутатионредуктазная система позволяет быстро пополнять пул восстановленного глутатиона в тканях. Основным источником НАДФН для этой реакции служит пентозный цикл окисления глюкозы, при этом НАДФ-зависимые дегидрогеназы пентозного цикла активируются окисленным глутатионом.

Снижение содержания восстановленного глутатиона в тканях создает благоприятные условия для блокирования SH-групп, входящих в состав ферментов и структурных белков клетки. Считается, что глутатион является основным агентом, защищающим тиоловые ферменты от окисления. К числу тиоловых ферментов относятся многие оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы и лигазы. Окисление SH-групп нарушает функционирование глкюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы, АТФ-азы, моноаминоксидазы, ксантиноксидазы, глутатионредуктазы и каталазы. Приведенные факты подтверждают мнения о том, что тиоловые соединения принимают самое непосредственное и широкое участие в механизме функционирования ферментативного звена АО-системы, выполняя не только антирадикальное, но и антиперекисное действие.

Водорастворимые низкомолекулярные тиоловые соединения: глутатион и эрготионеин. Первый из них является компонентом небелковой тиолдисульфидной окислительно-восстановительной системы и представляет собой трипептид, образованный аминокислотами цистеином, глутаминовой кислотой и глицином. Глутатион существует и двух формах -- восстановленной (до 97% от общего количества) и окисленной. Наряду с другими серосодержащими соединениями, глутатион является ингибитором АФК и стабилизирует клеточные мембраны. Ему принадлежит ведущая роль в нейтрализации гидроксильного радикала, образующегося в реакции Фентона или в результате ридиолиза воды под действием ионизирующих излучений [9].

1.6 Патогенетические механизмы нарушений, развивающиеся при нарушении баланса антиоксидантной и прооксидантной систем

Нарушение сбалансированности антиоксидантной (АОС) и прооксидантной систем (ПОС) обусловливает развитие окислительного стресса (ОС). Токсическое действие АФК проявляется при состояниях ОС, который сопровождается резкой интенсификацией свободно-радикальных процессов в тканях. Это является важнейшим патогенетическим звеном развития многих воспалительных процессов, радиационных поражений, сердечно-сосудистых, онкозаболеваний, химических и других интоксикаций. Механизм генерации АФК при многих патологических состояниях носит общий характер. Некоторые отличительные особенности можно выявить только на начальных стадиях. Так, при воспалительных процессах пусковым фактором интенсификации свободнорадикальных процессов является дыхательный взрыв, при гипоксии - нарушение в первую очередь системы тканевого дыхания, при химических поражениях - активация системы микросомального окисления. Таким образом, причины, вызывающие интенсификацию свободно-радикальных процессов, могут быть разными, но изменения на молекулярном уровне носят однотипный характер и процессы генерации АФК взаимосвязаны. Некоторые антиоксиданты в условиях ОС могут выступать в качестве прооксидантов. При состояниях ОС возрастает восстановительный потенциал клетки за счет субстратов, коферментов в восстановленном состоянии, что приводит к снижению рН в очагах ишемии тканей сердца и головного мозга. Это создает условия для повышения пула "активных форм" металлов переменной валентности. В условиях повышеной генерации АФК они могут участвовать в реакциях, связанных с генерацией радикальных продуктов. Так, в присутствии Fe/Cu и О2 тиолы (RSH) являются источниками радикалов, RS*, О2*-, Н2О2 и ОН*, НАДФН-радикалов НАД(Ф)*, аскорбиновая кислота -- семидегидраскорбат радикала [10]. Повышение уровня АФК сопряжено с интенсификацией процессов окислительной деструкции липидов, белков, нуклеиновых кислот, углеводов. Именно интенсификация этих процессов является основной причиной цитотоксического поражения тканей.

Как уже указывалось, причиной накопления активных форм кислорода являются нарушения нормального окислительного метаболизма клеток при патологии (шунтирование кислородом электротранспортных путей в митохондриях и в системе макросомального окисления при «утечке» электронов, трансформация дегидрогеназных путей в оксидазные, реакции аутоокисления, например, катехоламинов и пр.).

В концентрациях, превышающих физиологические, все эти соединения являются высокотоксичными для биологических систем всех уровней, от молекулярно-клеточного до организменного. Свойство осуществлять окислительное повреждение и деструкцию компонентов живых систем, обусловленное активными производными кислорода, получило обозначение как «токсичность кислорода».

Свободные радикалы кислорода являются нестойкими химическими соединениями и легко вступают в реакции с биомолекулами, вызывая их модификацию или деструкцию. Объектами неспецифических несанкционированных окислительных реакций с участием кислорода и его химически активных производных могут служить молекулы различной химической природы. АФК способны разрывать любую углеводородную связь и легко разрушают высокомолекулярные соединения: гиалуроновую кислоту, протеогликаны, коллаген, иммуноглобулины. В присутствии ионов двухвалентного железа АФК превращают оксигемоглобин в метгемоглобин. Окисление функциональных групп биологически активных веществ является причиной деградации структурных белков и липидов клеточных мембран и нуклеиновых кислот, ингибирования ферментов, изменения структуры и свойств гормонов и их рецепторов.

Результатом взаимодействия активных производных кислорода с молекулой ДНК является структурная модификация азотистых оснований, разложение пятичленного кольца дезоксирибозы, а также расщепление сахарофосфатного остова, что в конечном итоге приводит к фрагментации этого полимера. Доказано, что избыточная выработка АФК, в частности, супероксиданион-радикала, синглетного кислорода и гидроксильного радикала, может явиться причиной ряда хромосомных аббераций и мутаций ряда генов в лимфоцитах человека. Взаимодействие АФК с белками приводит к структурным изменениям этого типа биомолекул, заключающимся в модификации боковых группировок аминокислотных остатков, фрагментации полипептидных цепей и образованию ковалентных связей внутри молекул и между ними. Толерантность белков к АФК зависит от их аминокислотного состава, к свободнорадикальному повреждению более чувствительны циклические и серосодержащие аминокислоты. Из 20 незаменимых аминокислот наиболее уязвимыми для АФК, в частности для синглетного кислорода, являются гистидин, триптофан, метионин, тирозин и цистеин. Отличительной особенностью окислительного повреждения липидов в составе клеточных мембран является то, что в гидрофобной области их жирнокислотных остатков способен аккумулироваться молекулярный кислород. В результате этого, а также тесного и параллельного расположения по отношению друг к другу соседних жирнокислотных остатков создаются условия для развития окислительных повреждений по типу цепных реакций. Из-за ключевой роли в такой экспансии органических гидроперекисей этот процесс получил наименование перекисного окисления липидов [11].

2. Свободнорадикальное (перекисное) окисление липидов

Основными субстратами ПОЛ являются полиненасыщенные высшие жирные кислоты (ВЖК), находящиеся в структуре фосфолипидов мембран. На разных стадиях пероксидации ВЖК образуются диеновые и триеновые конъюгаты, пероксиды БЖК (R--ООя), гидроперекиси ВЖК (R--ООН), эндоперекиси, малоновый диальдегид и новые свободные радикалы. Сильнейшим катализатором процесса являются ионы металлов (Fe2+). Процесс может оборваться при образовании продуктов, не содержащих свободных радикалов.

Процессы ПОЛ можно условно подразделить на три последовательных этапа, или фазы развития: процессы зарождения цепей, процессы развития цепных реакций и обрыв цепей. На стадии зарождения цепей под действием свободных радикалов кислорода, ионизирующей радиации, ультрафиолетового облучения и ряда химических веществ, относящихся к прооксидантам, происходит образование органических радикалов (R).