Исследователями из Великобритании предлагается использовать специальное устройство для удаления масел и жиров из сточных вод [49]особенностью такого способа очистки является то, что для деструкции жиров и масел используются специальные культуры микроорганизмов, которые подаются в сточные воды из емкости с содержащей их жидкостью дозатором. Для увеличения эффективности очистки используется эффект флотации: воздух подается в диспергатор на дне.

В больших городах хозяйственно-фекальные сточные воды обычно подвергаются биологической очистке. Для этого служат специальные очистные сооружения аэробного (аэротенки, биофильтры) или анаэробного (метантенки) типа. При наличии мощных городских сооружений сюда же поступают стоки промышленных предприятий, которые смешиваются с бытовыми и проходят совместную обработку. В аэротенках органические загрязнители сточных вод разрушаются микроорганизмами активного ила до простейших продуктов. Активный ил представляет собой комплексный биоценоз, в состав которого входят микроорганизмы, простейшие и некоторые другие живые организмы, не играющие роли в очистке. Одним из важных свойств активного ила является способность образовывать хлопья. Эти хлопья состоят из частиц органических загрязнений, микробов и других живых существ. Благодаря способности к хлопьеобразованию активный ил отделяется от очищенной им воды, оседает и может быть удален из сооружения. Освобожденная от микрофлоры и продезинфицированная вода направляется в природные водоемы [50].

В Финляндии с 1983 года исследуется анаэробная обработка стоков. Проведенные исследования показали, что при продолжительности процесса от 1,7 до 55 суток эффект очистки по химическому потреблению кислорода (ХПК) составляет 77-78 %, снижение БПК - 73-79 %, удаление взвешенных веществ - 94-98 %. Таким образом, с помощью анаэробного метода достигается высокий уровень очистки [51].

Общие стоки кожевенных и меховых предприятий содержат до 1800-2460 мг/дм³ жиров или жироподобных веществ. В стоках от процессов отмоки и дубления их количество достигает более 4 г/дм³. Отработанные жидкости после обезжиривания, промывки свиного сырья и полуфабриката, а также после золения этого сырья содержат еще больше жира. После обезжиривания свиных шкур карбонатом натрия (15-17 г/дм³) в растворе образуется стойкая жировая эмульсия с содержанием жира 8-10 г/дм³. Значительное количество его содержится также в стоках клееварочных цехов. Так на Могилевском кожевенном заводе в стоках указанного цеха содержание жира достигает 8,3 г/дм³ [52].

Для предварительной очистки общего стока от взвешенных веществ, шерсти, сульфидов, жиров, СПАВ, ионов хрома может быть использована технологическая схема двухступенчатой флотационной очистки. Общий сток подвергается механической очистке, усредняется и поступает в камеру подщелачивания, где происходит корректировка рН сточных вод до 9,5-10, куда также подается до 25% реагентов. Далее общий сток поступает во флотационный шерстежироуловитель, работающий по методу безнапорной флотации, камеру хлопьеобразования с корректировкой рН до 8,5 и подачей 75-100% реагента, затем в напорный флотатор. После этого общий сток смешивается с очищенным дубильным стоком и полученная смесь направляется на биологическую очистку. В качестве реагентов возможно использование сульфата железа (11), хлорида жедеза (111) или сульфата алюминия [53].

В Богородском филиале Центрального проектно-конструкторского бюро (ЦПКТЛлегпрома) в лабораторных условиях проверялась возможность разложения отработанных растворов от процессов обезжиривания. Полное и быстрое разрушение этих эмульсий наступало после их подкисления до pН = 3-4. При последующем отстаивании в течение 1,5 - 2 ч. весь жир в виде рыхлой творожистой массы всплывал на поверхность и затем удалялся. Данное загрязнение следует утилизировать, оно может служить исходным сырьем для получения технического жира [40].

Приведенные данные свидетельствуют о том, что присутствие жировых веществ в водоемах нежелательно и решение этого вопроса может быть осуществлено, прежде всего путем совершенствования очистки промышленных выбросов, направляемых в окружающую среду, а также разработка таких технологических процессов и технических устройств, которые позволили бы рационально использовать исходное сырье. И исключили бы попадание вредных веществ в природную среду - речь идет о создании безотходной (малоотходной) технологии.

Таким образом, на основании литературного обзора можно заключить, что жиры играют важную физиологическую и биохимическую роль в живых организмах, являются одним из основных источников энергии. Служат основным сырьем для жироперерабатывающей промышленности в производстве мыла, олифы, глицерина, используется в качестве добавок к лекарственным средствам, для строительных растворов, бетона, а так же широко используется в меховой промышленности.

Также видна необходимость в очистке сточных вод от жировых компонентов. На эту тему проведено множество исследований, в том числе с использованием различных микроорганизмов. Так, липолитически активные организмы используют жиры в качестве источника питания, деструктируя составные жирные кислоты вплоть до альдегидов.

Наиболее эффективным методом очистки сточных вод, содержащих жировые вещества, является биологический способ, который применяется для удаления жиров с помощью микроорганизмов-деструкторов.

В связи с этим есть необходимость в изучении степени вовлечения жировых веществ в конструктивный и энергетический обмен прокариотическими организмами.

2 Объекты и методы исследования

Целью дипломной работы являлось изучение способности микроорганизмов деструктировать жировые вещества различной химической природы.

Для выполнения эксперимента был составлен сетевой график, представленный на рисунке 2.

Рисунок 2 - Сетевой график дипломной работы

2.1 Объекты исследования

Объектом исследования в дипломной работе являлись микроорганизмы, выделенные из различных природных жиров: нерпичьего (Н), нерпичьего, выращенного на среде с шёрстным жиром (Нв), шерстного (В) и микроорганизмы, выделенные из сточных вод после проведения процесса обезжиривания (3, 8).

Для выполнения работы были использованы следующие химические материалы:

1 Нерпичий жир - жидкость от светло-желтого до темно-коричневого цвета. Получают вытапливанием, экстрагированием, прессованием и сепарированием. В кожевенном производстве используют нерпичий жир с кислотным числом не менее 25.

2 Шёрстный жир -выделяют овцы в виде жиропота в количестве его достигает 5 - 10 % от массы шерсти. Сырой шерстяной жир, выделенный из промывных вод, - густая пастообразная масса бурого цвета. В нем содержатся кроме воска свободные жирные кислоты, глицериды, белки, слизи, красящие вещества, минеральные примеси и пр. Выделенные из шерстяного жира воски с примесью некоторых высокомолекулярных соединений называют техническим ланолином. В очищенном виде этот продукт называется ланолином. Он представляет собой светло-желтое мазеобразное вещество, обладающее высокой гигроскопичностью.

3 Агар-агар - ГОСТ 16280-88 пищевой. Представляет собой порошок белого цвета без постороннего запаха, вкуса. Наличие плесени и видимых посторонних включений не допускается. Физико-химические показатели должны соответствовать требованиям, указанным в таблице 1

Таблица 1 -- Физико-химические показатели агар-агара

Наименование показателей	Показатели
Цвет студня с массовой долей сухого агара 0,85 %, %, не менее	45 - 60
Прочность студня с массовой долей сухого агара 0,85 %, г, не менее	200 - 300
Температура плавления студня с массовой долей сухого агара 0,85 %, С, не ниже	80
Массовая доля влаги, %, не более	18
Массовая доля золы (в пересчете на сухое вещество), %, не более	4,5
Наличие йода и тяжелых металлов	Не допускается
Массовая доля общего азота (в пересчете на сухое вещество), %, не более	0,2

4 Питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой - порошок светло - жёлтого цвета рН=7,2±0,2. Препарат гигроскопичен. Приготовление: 15 г препарата растворяется в 1 л дистилированной воды. Состав (г/л): панкреатического гидролизата кальция - 10,05; хлорида натрия - 4,95.

5 Вода дистиллированная. Предназначена для аналитических целей Н₂О (ГОСТ 6709-73). Молекулярная вес 18. Концентрация водородных ионов в пределе 5,4-6,6. Сухой остаток не более 5 мг/л, после прокаливания не более 1мг/л.

6 Хлорид калия КСl, мол. масса 58,46 (ГОСТ 13380-68), добывают из недр открытым или подземным способом, получают из рапы озер или лиманов после естественного испарения воды, из морских вод сгущением растворов в специальных садочных бассейнах и выравниванием естественных рассолов на солевых заводах. Хлорид калия технический получают из отходов производства хлорида натрия. Эта соль содержит примеси хлорида магния и сульфата кальция. Применяется для приготовления синтетической среды.

7 Хлорид кальция технический (ГОСТ 450-77) получают в обезвоженном виде - CaCl₂, плавленном виде - СаСl 2Н₂О, в жидком виде. Применяют для приготовления синтетической среды.

8 Фосфат аммония (NH₄)₃РO₄, мол. масса 132,14 (ГОСТ 9097-74), - кристаллы белого или слабо-желтого цвета. Фосфат аммония технический (ТУ 6-03-395-75) получают из раствора фосфата аммония, являющегося отходом производства жидкого ангидрида.

Кроме того, использовались различные органические и неорганические кислоты и соли для определения культуральных свойств микроорганизмов и приготовления питательных сред.

2.2 Методы исследования

2.2.1 Методика приготовления питательных сред для культивирования микроорганизмов

Мясопептонный агар (МПА)

При культивировании микроорганизмов большое значение имеет обеспечение их соответствующим питанием. Белковой основой для всех сред является питательный бульон. Основой для приготовления мясопептонного бульона (МПБ) является мясная вода. Ее готовят следующим образом: 15 г сухого бульона растворяют в 1 дм³ дистиллированной воды и кипятят 1-3 мин. Для приготовления плотной питательной среды МПА к 1 дм³ МПБ добавляют 2-2,5% агар-агара от объема среды и расплавляют в автоклаве.

Синтетическая среда Рана

В 1 дм³ дистиллированной воды растворяют соли следующего состава (г/дм³): К₂HPO₄-5,0; (NH₄)₃РO₄-5,0; KCl-следы; СаCl₂-1,0; MgSO₄ Х 7H₂O-1,0; FeCl₃ Х 7H₂O-следы. В качестве источника углерода используют нерпичий жир в количестве 1 г/дм³. Для приготовления плотной синтетической среды добавляют агар-агар в количестве 2-2,5% от объема жидкой среды и расплавляют в автоклаве при давлении 1атм.

2.2.2 Выделение чистой культуры методом разведений

Разведения делают в стерильной водопроводной воде. Готовят определенный объем этого раствора и стерилизуют при 1 атм. В ходе одного опыта пользуются постоянным коэффициентом разведения, т.к. в этом случае уменьшается вероятность ошибки. Чаще всего делают десятичные разведения. Для этого берут пробирку с 10 см³ стерильного раствора и переносят стерильной пипеткой 1 см³ исследуемого материала в данную пробирку. Суспензию этого разведения тщательно перемешивают с помощью новой стерильной пипетки, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную смесь несколько раз. Это обеспечивает перемешивание суспензии и уменьшает адсорбцию клеток на стенках пипетки. Затем этой же пипеткой берут 1 см³ полученного разведения и переносят его во вторую пробирку. Таким образом, готовят и последующие разведения. Степень разведения определяется предполагаемым количеством микроорганизмов в образце и соответственно число разведений тем больше, чем больше микроорганизмов в исходном субстрате.

Для приготовления каждого разведения обязательно используют отдельную пипетку. Пренебрежение этим правилом может привести к получению ошибочного результата. Ошибка связана с адсорбцией микроорганизмов на стенках пипетки, в результате чего не все клетки удаляются из пипетки при приготовлении соответствующего разведения. Часть клеток, оставшаяся на стенках пипетки, может затем попасть в одно из последующих разведений, что и явится причиной получения завышенного результата.

2.2.3 Посев на агаризованные среды в чашки Петри

В стерильные чашки Петри наливают расплавленную на кипящей водяной бане агаризованную среду, по 20-30 см³ в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока не остынет агар. Для посева отбирают чашки, среда в которых осталась стерильной. Когда используют элективные среды или выделяют и учитывают микроорганизмы, требующие повышенной влажности, посев проводят сразу же или вскоре после застывания агара.

Посев делают из определенных разведений в зависимости от предполагаемого количества микроорганизмов в исследуемом субстрате. Стерильной пипеткой наносят определенный объем (обычно 0,05; 0,1 или 0,2 см³) соответствующего разведения, предварительно тщательно перемешанного, на поверхность агаровой пластинки в чашки Петри. Этот объем распределяют по поверхности среды стерильным шпателем. Затем этим же шпателем проводят по всей поверхности во второй чашке, куда посевной материале вносили. При выявлении микроорганизмов, количество которых в субстрате относительно не велико, посевной материал распределяют по поверхности среды только в одной чашке.

Из каждого исследуемого разведения делают таким образом 2 - 3 параллельных высева. Для параллельных высевов из одного разведения можно пользоваться одной пипеткой и одним шпателем. Для посевов из разных разведений используют другую стерильную пипетку и другой шпатель. Чашки с засеянными средами помещают в термостат, отрегулированный на определенную температуру, благоприятную для развития выявляемых микроорганизмов.

Подсчет выросших колоний проводят через определенное время после посева, которое зависит от скорости роста выявляемых микроорганизмов на используемой в опыте среде и данной температуре.

Подсчитывают количество колоний, выросших при высеве из определенного разведения на двух (одной) чашки Петри. Результаты параллельных высевов суммируют и определяют среднее число колоний, выросших при высеве из этого разведения. Колонии считают, как правило, не открывая чашки. Для удобства отмечают просчитанную колонию точкой на наружной стороне дна чашки, пользуясь стеклографом или чернилами по стеклу. При большом количестве колоний дно чашки делят на секторы, подсчитывают количество колоний в каждом секторе и результаты суммируют или используют полуавтоматические счетчики.

2.2.4 Изучение морфологии бактерий

Морфологические свойства изучают путем микроскопирования окрашенных мазков, приготовленных из исследуемой колонии. При этом отмечаются формы микробных клеток, характер их расположения, наличие спор, капсул, жгутиков тинкториальная способность (окрашивание по методу Грама), определяют чистоту культуры. Кроме просмотра окрашенных мазков, устанавливают наличие жгутиков путем исследования культур на подвижность в препаратах «висячая» или «раздавленная» капля, а также путем посева культуры на полужидкий мясопептонный агар (подвижные бактерии вызывают помутнение агара, а неподвижные растут по уколу).

Из колоний готовят мазки, затем окрашивают по Грамму, Трухильо, проводят окраску жгутиков по Леффлеру.

Техника окраски по Граму заключается в следующем:

- На обезжиренном стекле делают мазки микроорганизмов. Мазки высушивают на воздухе и фиксируют под пламенем горелки;

- Мазки окрашивают в течение 1 мин генцианвиолетом;

- Препарат промывают в слабой струе водопроводной воды в течение 2 с.;

- Окрашивают препарат раствором Люголя в течение 1 мин.;

- Промывают препарат слабой струей водопроводной воды;

- Погружают препарат на 30 секунд в 96 %-ный спирт, взбалтывая последний, после чего препарат подсушивают промокательной бумагой;

- Окрашивают мазки раствором фуксина Пфейффера в течение 30 с.;

- Промывают препарат в слабой струе водопроводной воды до исчезновения окраски в стоке, подсушивают промокательной бумагой и микроскопируют.

Грамположительные бактерии окрашиваются в синий или фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в красный.

Окраска по Трухильо заключается в следующем:

- Мазок фиксируют жаром;

- Наносят водный раствор малахитовой зелени (2 %) и в течение 3 мин подогревают на спиртовке до отхождения влаги;

- Промывают водой;

- Опускают на 1 мин в 0,25 % - ный водный раствор основного фуксина;

- Промывают водой;

- Высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.

При таком методе окраски споры окрашиваются в зеленый цвет.

Окраска жгутиков по Леффлеру:

- Мазок заливают на 15-20 минут протравой Леффлера, необходимо следить, чтобы протрава не подсыхала;

- Препарат промывают дистиллированной водой;

- Окрашивают карболовым фуксином Циля в течении 3 минут;

- Высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.

Клетки и жгутики окрашиваются в красный цвет.

2.2.5 Методика изучения культуральных свойств

Культуральные свойства определяют по характеру роста микробной культуры на плотной и жидкой питательных средах. Характер роста на плотной питательной среде изучают с подробным описанием формы, величины, цвета, поверхности, консистенции, краев и структуры колоний, образованных на синтетической питательной среде.

Микроскопическое изучение колоний проводят под микроскопом. Рассматривая колонии в проходящем свете невооруженным взглядом, описывают следующее: форму колоний; диаметр колоний; цвет, который обуславливается пигментом; рельеф колоний; поверхность; ее блеск, прозрачность; характер краев колоний; структуру колоний, ее консистенцию.

Для определения отношения микроорганизмов к кислороду делают посев уколом на мясопептонный агар (МПА). Посев уколом проводят бактериологической иглой путем прокалывания столбика агара в средней части, следя за тем, чтобы игла нигде не подходила к стенкам пробирки. Не доводя на сантиметр до дна пробирки иглу извлекают и обжигают над пламенем спиртовки.

2.2.6 Метод раздавленной капли

Применяется при исследовании морфологии и подвижности микроорганизмов.

Каплю микробной суспензии помещают на поверхность чистого обезжиренного предметного стекла. При работе с культурой, выросшей на твердой среде, на предметное стекло наносят каплю водопроводной воды, затем стерильной пипеткой берут небольшое количество культуры и перемешивают ее в капле. Покрывное стекло помещают ребром на предметное и осторожно помещают его на суспензию, следя за тем, чтобы между стеклами не было пузырьков воздуха. Избыток жидкости удаляют полоской фильтровальной бумаги.

2.2.7 Определение липолитической активности

Липолитические свойства культуры исследуют на среде определённого состава (бульон Штерна). Готовят бульон следующим образом: к 100 см³ МПБ добавляют 1 см³ глицерина и приливают 2см³ свежеприготовленного 10 %-ного водного раствора сульфита натрия, затем по каплям 10 %-й спиртовой раствор основного фуксина (? 5 кап.).

Культуры культивируют в термостате при 37 ⁰С. Отмечают изменение цвета среды, рН (лакмусовой бумагой), помутнение, наличие хлопков.

2.2.8 Приготовление бактериальной суспензии

Стерильную жидкую синтетическую среду разливают в стерилизованные конические колбы по 100 см³.

Для получения биомассы исследуемой культуры микроорганизмов, делают посев на скошенный агар.

Подготовленные таким образом культуры инкубируют в термостате 24 ч при температуре (375)С, по окончании чего в пробирки с микроорганизмами вводят 5 см³ соответствующей жидкой синтетической среды, осуществляя процесс механического воздействия. Приготовленную таким образом бактериальную суспензию вносят в колбы, содержащие по 100 см³ соответствующей жидкой синтетической среды.

Культивирование микроорганизмов проводят в термостате при температуре 385С, с переменным механическим воздействием, осуществляемом на Shaker Type, с частотой колебаний 200 об/мин, амплитудой 6 по 1 ч в сутки.

2.2.9 Определение общего количества микроорганизмов (КОЕ)

Сущность метода заключается в определении в 1 см³ воды общего содержания мезофильных аэробов и факультативных анаэробов при культивировании на синтетической питательной среде при температуре 40 С в течении 24 часов. Определение начинают с приготовления разведений. Для этого в несколько пробирок наливают 10 см³ стерильной воды. В первую пробирку стерильной пипеткой добавляют 1 см³ исследуемой воды. Новой стерильной пипеткой вносят пробу в пробирку со стерильной водой, после чего этой же пипеткой набирают 1 см³ из приготовленного разведения и переносят во вторую, из второй в третью и т. д. Из каждой пробы делают посев не менее двух различных объемов, выбранных с таким расчетом, чтобы на чашках выросло от 30 до 300 колоний. По истечении 24 часов при температуре 40 С подсчитывают число выросших колоний. Если выросло большое количество колоний, то дно чашки делят на секторы и подсчет ведут в каждом отдельном секторе. Результаты подсчета выражают в количестве бактерий на 1 см³ анализируемой воды с учетом посеянного объема.

2.2.10 Определение мутности

Мутность определяют фотометрическим методом при длине волны 540 нм и толщине поглощаемого слоя 30 мм. Определение мутности проводят до процесса высаливания. При этом исходный раствор отфильтровывают от жира. Стандартным раствором является дистиллированная вода.

2.2.11 Определение кислотности

10 см³ исследуемой жидкости вносят в коническую колбу емкостью 100-250 см³ и титруют 0,1 н раствором едкого натра в присутствии индикатора фенолфталеина до слабо-розовой окраски.

Реакция протекает по схеме:

СН₃СООН + NаОН = СН₃СООNа + Н₂О

Содержание органической кислоты (К), г/дм³ определяют по формуле (1):

а ? к ?0,006 ?1000

К = = а ? к ?0,6 , (1)

10

где К - содержание кислоты, г/дм³;

а - количество 0,1 н раствора щелочи, израсходованной на титрование, см³;

к - поправка к титру едкого натра;

0,006 - количество уксусной кислоты, соответствующей 1 см³ 0,1 н раствора гидроксида натрия.

2.2.12 Определение активной реакции среды

Активная реакция среды, т.е. степень ее кислотности или щелочности, характеризуется качественно концентрацией водородных ионов. Концентрацию ионов водорода выражают величиной рН.

Величину рН определяют потенциометрическим методом при помощи потенциометра со стеклянными электродами.

Перед началом измерений прибор включают в сеть при помощи тумблера и дают нагреваться в течение 20 минут.

Электроды перед погружением в раствор тщательно промывают дистиллированной водой и просушивают фильтровальной бумагой .

Вначале измерение проводят по шкале от 0 до 14 (грубое определение), а затем переключают прибор на более узкий интервал.

Перед измерением рН сточную воду хорошо перемешивают и измеряют температуру для введения необходимых поправок.

2.2.13 Биуретовый метод определения белка по Ярош

Метод используется в растворах белков с концентрацией от 0,04 до 1,6 мг/см³.

Необходимые реактивы. Биуретовый реактив - в мерную колбу на 1 дм³ наливают 400 см³ 0,2н раствора NaOH, добавляют 9г калия-натрия виннокислого, перемешивают до полного растворения, добавляют 3г сульфата меди (порошка) и 5г йодистого калия, объем доводят до метки 0,2н раствором NaOH; раствор мочевины - к 300г мочевины (карбамида) прибавляют кусочек тимола величиной с горошину, приливают 700 см³ дистиллированной воды и смесь нагревают, затем прибавляют 3г активного угля, перемешивают фильтруют в мерную колбу на 1 дм³, объем доводят до метки дистиллированной водой.

Техника определения. В пробирку наливают 2,4см³ раствора мочевины, 0,1см³ раствора белка и 2,5см³ биуретового реактива. Смесь хорошо перемешивают и пробирки помещают в водяную баню при температуре 40^оС на 10 минут. Затем их охлаждают до 20^оС. Через 30 минут после добавления биуретового реактива раствор колориметрируют на ФЭК при длине волны 540нм. Количество белка находят по калибровочной кривой, составленной по яичному альбумину.

Для построения калибровочной кривой готовят исходные водные растворы с содержанием 10, 20, 30, 40, 50, 60 мг белка в 10см³. Из полученных растворов отбирают в пробирки по 0,1см³, добавляют 2,4см³ раствора мочевины и 2,5см³ биуретового раствора и ведут определение описанным выше методом. Калибровочный график представлен на рисунке 3

Рисунок 3 - Калибровочный график зависимости оптической плотности от содержания белка

2.2.14 Метод определения протеолитической активности (ПС) Вильштеттера и Вальдшмидт-Лейтца в модификации

Метод основан на определении свободных карбоксильных групп в спиртовых растворах аминокислот и полипептидов.

Активность (ПС) выражают количеством миллиграммов аминного азота, которое образуется при гидролизе определенного количества 5%-ного раствора желатина с рН 7,3-7,5 1г препарата или 1см³ ферментного раствора за 1 час при температуре 40^оС.

За единицу протеолитической активности принимают количество фермента, которое образует 1мг аминного азота за 1 час в принятых условиях опыта.

Необходимые реактивы. Фосфатный буферный раствор с рН 7,3-7,5; 5%-ный раствор желатина, приготовленный на основе буферного раствора, перед употреблением раствор желатина нагревают на водяной бане до 40^оС; 1%-ный спиртовой раствор тимолфталеина; 0,1н раствор гидроксида натрия; 96%-ный этиловый спирт.

Техника определения. К 10см³ 5%-ного раствора желатина с рН 7,3-7,5 приливают 2см³ испытуемого ферментного раствора и сразу же отбирают 1см³ реакционной смеси в коническую колбу на 50-100см³, куда предварительно налито 20см³ 96%-ного этилового спирта и 0,2см³ 1%-ного раствора тимолфталеина. Пробу тут же титруют 0,1н раствором гидроксида натрия. После появления голубой окраски в растворе прибавляют еще 4 капли щелочи и на этом титрование заканчивают. Титрование проводят из микробюретки с ценой деления 0,02см³.

Оставшуюся смесь желатина с ферментным раствором помещают в термостат с температурой 40^оС для гидролиза. Через 3 часа 1см³ реакционной смеси отбирают во вторую коническую колбочку на 50-100см³, куда предварительно налито 20см³ 96%-ного этилового спирта и 0,2см³ 1%-ного раствора тимолфталеина и титруют аналогично контролю.

Расчет протеолитической активности ПС ведут по формуле (2):

ПС = , (2)

где ПС - протеолитичсекая активность, ед/г;

А - количество аминного азота, накопленное за время опыта в реакционной смеси, мг;

t - время протеолиза, ч;

Р - коэффициент, учитывающий разведение и пересчет на 1г препарата или 1см³ жидкого ферментного раствора.

Величина А рассчитывается по формуле (3):

А=(а-а_к)?1,4?К, (3)

где A - количество аминного азота, мг;

а - количество 0,1н раствора NaOH, пошедшее на титрование 1см³ опытной пробы, см³;

а_к - то же, для контрольной пробы;

1,4 - коэффициент пересчета количества 0,1н раствора щелочи в миллиграммы азота аминокислот и полипептидов;

К - поправка к титру щелочи.

2.2.15 Определение активности липазы (ЛС) (модифицированный метод Ота, Ямада)

За единицу ферментативной активности липазы принимают такое количество фермента, которое освобождает 21мкмоль олеиновой кислоты из 40%-ной эмульсии оливкового масла при рН 7,0 и температуре 37^оС в течении 1часа.

Метод основан на определении путем титрования щелочью жирных кислот, образовавшихся под действием липазы при использовании в качестве субстрата оливкового масла.

Необходимые реактивы. Раствор оливкового масла (субстрат); 2%-ный раствор поливинилового спирта; 1н раствор соляной кислоты (HCl); 0,05н раствор гидроксида натрия (NaOH); фосфатно-цитратный буфер с рН 7,0; 1%-ный раствор фенолфталеина; 90%-ный раствор спирта; 1%-ный раствор фермента.

Техника определения. 5см³ эмульсии субстрата и 4см³ буфера с рН 7,0 помещают в колбу Эрленмейера на 100см³, которую закрывают пробкой. Смесь выдерживают на водяной бане при температуре 37^оС в течении 10 минут. Затем к смеси добавляют 1см³ раствора фермента и хорошо перемешивают. Полученную смесь выдерживают при температуре 37^оС в течении 1 часа, после чего немедленно добавляют 30см³ этанола для прекращения реакции. Раствор титруют 0,05н раствором NaOH в присутствии 1%-ного раствора фенолфталеина до исчезновения окраски.

Контрольную пробу готовя следующим образом. К смеси субстрата и буфера с рН 7,0, выдержанной при температуре 37^оС, добавляют 30см³ этанола, затем 1см³ ферментного раствора и смесь немедленно титруют.

Разность между результатами титрований контрольной и опытной проб соответствует количеству 0,05н раствора NaOH, которое пошло на нейтрализацию жирных кислот, образовавшихся из оливкового масла под действием фермента.

Липазную активность фермента ЛС (в ед/г) определяют по формуле (4):

ЛС=, (4)

где ЛС - липолитическая активность, ед/г;

А - разность между результатами титрований опытной и контрольной проб, см³;

Т - титр щелочи;

В - концентрация образца ферментного раствора, г/см³.

2.2.16 Определение концентрации взвешенных веществ

Предварительно готовят фильтры следующим образом: промывают горячей водой (дистиллированной), затем высушивают до постоянного веса в сушильном шкафу при температуре 105^оС.

Для определения содержания взвешенных веществ их отделяют, фильтруя сточную воду, объемом 50-100 см³ через бумажный фильтр средней плотности, доведенный до постоянного веса. Оставшийся на стенках стакана осадок смывают небольшой порцией фильтрата и переносят на фильтр. Осадок смывают небольшим количеством (10-15 см³) спиртоэфирной смеси для удаления веществ, сорбированных на поверхности взвешенных веществ. Фильтр с осадком помещают в тот же бюкс, в котором его взвешивали до фильтрования, и высушивают в сушильном шарфу при температуре 105^оС в течение 2 часов. Бюкс закрывают крышкой и охлаждают в эксикаторе над прокаленным хлоридом кальция. Затем взвешивают с абсолютной погрешностью не более 0,0002 г.

Высушивание, охлаждение, взвешивание повторяют до достижения постоянной массы.

Содержание взвешенных веществ определяют по формуле (5):

Х = , (5)

где Х - содержание взвешенных веществ;

m₁ - масса бюкса с высушенным фильтром и осадком, г;

m₂ - масса бюкса с высушенным фильтром, г;

V - объем воды, взятой для фильтрования, см³.

2.2.17 Определение содержания органических веществ

Для определения химического потребления кислорода (ХПК) берут 1-5 см³ профильтрованной воды, прибавляют 2,5 см³ 0,25н раствора дихромата калия, 0,4 г сульфата ртути (II), 0,2-0,4 см³ сульфата серебра и при перемешивании приливают концентрированную серную кислоту (7,5 см³ на 1 см³ пробы, 15 см³ на 5 см³ пробы). При этом температура раствора поднимается до 100^оС. Через 2 минуты раствор охлаждают до комнатной температуры, приливают 100 см³ дистиллированной воды и титруют избыток дихромата калия 0,25н раствором соли Мора в присутствии 10-15 капель N-фенилантраниновой кислоты или 3-4 капель ферроина. Изменение окраски в первом случае от красной до изумрудно-зеленой, во втором - от голубовато-зеленой до красно-голубой.

Параллельно проводят контрольный опыт без сточной воды.

ХПК выражают в миллиграммах кислорода на 1 дм³ воды (мгО/дм³).

Расчет производят по формуле (6):

(V₁-V₂)?k?0.25?8?1000

ХПК = , (6)

V

где ХПК - химическое потребление кислорода, мг О₂/дм³;

V₁,V₂ - объемы 0,25н раствора соли Мора, израсходованные на титрование в контрольном опыте и пробы сточной воды, см³;

k - поправочный коэффициент для приведения концентрации раствора соли Мора к точно 0,25н;

0,25 - концентрация раствора соли Мора;

8 - эквивалент кислорода;

V - объем сточной воды, взятой на определение, см³.

2.2.18 Отбор проб методом асимметрической бахромы

Для сопоставимости результатов исследований различных факторов или технологических параметров необходимо исключить влияние топографии шкуры, полуфабриката или кожи. В этом случае для отбора средней пробы пользуются методом асимметрической бахромы (МАБ), который заключается в следующем. Намечают необходимое число вариантов исследования и задаются числом образцов (полосок), входящих в группу, предназначаемую для каждого варианта (обычно не менее 4). Чем больше число образцов, тем более достоверным будет среднее значение, характеризующее вариант. Размер образца предопределяется набором физико-механических или физических испытаний, которые предполагается провести, а все образцы должны уложиться в прямоугольник, вписанный в чепрачную часть, показанный на рисунке 3

5	1
4	2
3	3
2	4
1	5
5	1
4	2
3	3
2	4
1	5

Рисунок 3 - Схема отбора проб методом асимметрической бахромы

2.2.19 Определение колористических показателей волосяного покрова

Колористические показатели волосяного покрова определяются на приборе «Пульсар». Образцы тщательно расчесываются, накрывают стеклом и фотографируют. Далее работают при установлении кнопки «режим» - 3.

Предварительно прибор прогревают в течение 30 минут, затем нажатием кнопки «сброс» очищают панели вывода.

Первоначально производят калибровку прибора, для этого устанавливают «режим» - 0 (калибровка прибора); «вывод» - 0. Белую пластину помещают на место отражающего образца; черную - на место измеряемого образца, нажимают «пуск », после загорания «Б» извлекают черную пластину. Снова нажимают «пуск», загорается «I» извлекают белую пластину. Устанавливают на индикаторе «режим» - 1; «вывод» - 0 (измерение прозрачных проб) на место прозрачного образца - дистиллированную воду, нажимают пуск.

Для измерения рабочего образца устанавливают пробу. Нажимают «пуск», снимают показания индикатора в соответствии литературными данными.

2.2.20 Определение содержания несвязанных жировых веществ (ГОСТ 26129-84 Шкурки меховые и овчина шубная выделанные. Методы определения несвязанных жировых веществ)

Навеску измельченной кожевой ткани или волоса массой 0,5-0,6 г взвешенною с погрешностью не более 0,0002 г, помещают в бумажную гильзу и закрывают тампоном. Гильзу закрепляют в предварительно доведенной до постоянной массы колбе и соединяют колбу с обратным холодильником. В колбу заливают 50 см³ хлороформа или дихлорэтана. Колбу с растворителем нагревают на электрической плитке с асбестовым покрытием. Продолжительность экстрагирования при анализе кожевой ткани - 45 минут, при анализе волоса - 15-20 минут. Растворитель должен постоянно кипеть и, охлаждаясь и стекая с холодильника, попадать в центр гильзы. В дальнейшем растворитель отгоняют и колбу с жировыми веществами доводят до постоянной массы в сушильном шкафу при температуре 128-130?С. Продолжительность первой сушки 30 минут, последующих - по 15 минут.

Массовую долю жировых веществ вычисляют по формуле (8):

Х₁ = ?100, (8)

где Х₁ - массовая доля жировых веществ;

m - масса колбы с экстрагированными веществами, г;

m₁ - масса пустой колбы, г;

m₂ - масса навески кожевой ткани или волоса, г.

3 Экспериментальная часть

В настоящее время проблема загрязнения водного бассейна антропогенными сбросами во всем мире стоит на первом месте. Для региона республики Бурятия эта проблема является наиболее важной, так как на нашей территории находится мировое наследие - озеро Байкал. Характер стоков, поступающих в водный бассейн достаточно разнообразен, так как на территории республики находится довольно много средних и мелких предприятий по переработке пушно-мехового сырья, по производству мясной и молочной продукции, немаловажное значение имеет загрязнение бытовыми стоками. К основным загрязнителям стоков пушно-меховых предприятий относятся соли хрома (III) и (VI), красители, ПАВ, а также жировые вещества, которые образуются при проведении процессов отмоки и обезжиривания. При очистке сточных вод, содержащих жировые вещества, на первом этапе применяют физические и физико-химические методы очистки, наиболее распространенным из которых является метод флотации, на последующих этапах очистки большое распространение получили биологические методы, основанные на применении микроорганизмов-деструкторов жировых веществ. Известно, что деструкция жира на первом этапе происходит до глицерина и карбоновых кислот (основных составляющих в структуре жиров), интерес представляют последующие продукты деструкции. В связи с этим, целью дипломной работы являлось изучение морфолого-культуральных свойств микроорганизмов, выделенных из жировых материалов и из сточных вод после процесса обезжиривания, и исследование деструкции жировых веществ прокариотическими микроорганизмами.

3.1 Восстановление и исследование морфолого-культуральных свойств микроорганизмов, деструктирующих жировые вещества

С целью восстановления свойств микроорганизмов в жидкие питательные среды объемом 150 см³ на основе мясопептонного бульона (МПБ) и синтетической среды Рана, в которой в качестве источника углерода служил нерпичий жир (п.2.2.1), внесли исследуемые культуры в количестве 10⁵ кл/ см³ (петлей). Культивирование проводили в колбах Эрленмейера объемом 250 см³ в термостате марки «ТС-80М-2» при температуре (37±0,5)?С в течение 24 часов в состоянии покоя. После истечения заданного времени культивирования перенесли 0,1 мл. бактериальной суспензии и произвели посев на соответствующие плотные среды в чашки Петри.

Для исследования морфолого-культуральных свойств прокариотических организмов была восстановлена культура микроорганизмов методом штриха и разведений (п.п.2.2.2-2.2.3) на мясопептонном агаре (МПА) и на синтетической среде Рана. Культивирование проводили в перевернутых чашках Петри в термостате при температуре (37±0,5)?С в течение 24 часов для МПА и 48 часов для среды Рана.

Выделенные культуры были обозначены следующим образом: Нв - микроорганизмы, выделенные из жира нерпы, но адаптированные к росту на шерстном жире; Н - микроорганизмы, выделенные из жира нерпы; В - выделенные из шерстного жира; 3, 8 - культуры микроорганизмов, выделенные из сточных вод после проведения процесса обезжиривания меховой овчины.

При рассмотрении характера роста культур на разных средах можно отметить, что колонии микроорганизмов, выращенных на мясопептонном агаре, характеризуются более значительными размерами, по сравнению с культурами, выращенными на синтетической среде Рана, что обусловлено повышенной чувствительностью культур к агрессивной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода нерпичий жир, в количестве 1 г/дм³.

Исследование морфолого-культуральных свойств, выделенных колоний микроорганизмов проводили по следующим параметрам: окрашиванию по методам Грама, Трухильо и Леффлеру (п.2.2.4), определение подвижности методом раздавленной капли (п.2.2.6) и определение культуральных свойств (п. 2.2.5).

Результаты исследования морфолого-культуральных свойств бактерий представлены в таблице 3 и на рисунках А1-А5.

Таблица 3 - Сравнительная таблица морфолого-культуральных признаков исследуемых культур

Признак	Тип культуры
	Н	Нв	В	3	8
Место выделения	Природные жиры: шерстный, нерпичий.	Сточные воды после проведения процесса обезжиривания
Морфология	Коккобактерии	Палочки, сцепленные попарно и более
Рельеф колоний	Плоские
Прозрачность	Непрозрачная
Края колонии	Ровные
Структура колонии	Гомогенная
Консистенция	Мазеобразная
Окраска по Граму	+	+	+	+	+
Окраска по Трухильо	-	-	-	-
Окраска по Леффлеру	+	+	+	+	+
Подвижность	+	+	+	+	+
Расположение жгутиков	Перетрихи
рН (опт)	5,6-7,5
Температура (опт), оС	25-40
Форма колоний	Точечная

Окрашивание мазков показало, что все культуры являются грамположительными мелкими палочками, аспорогенными с перетрихиальным расположением жгутиков. Более подробно форму бактерий можно рассмотреть на рисунках 2-6, полученных в результате фотографирования окрашенных мазков на микроскопе Ломо Микмед-1 с помощью цифрового фотоаппарата «Samsung». По форме бактерий культуры типа Н, Нв и В следует отнести к коккобактериям - мелким палочкам, близким к овальной форме, в то время как культуры типа 8, 3 представляют собой бактерии, диплобактерии и стрептобактерии. Размер исследуемых микроорганизмов варьируется в пределах 0,1-0,5 нм.

При рассмотрении раздавленной капли бактериальной суспензии было отмечено броуновское движение бактерий, сопровождающееся вращательным движением, обусловленным перетрихиальным расположением жгутиков.

Результаты изучения культуральных свойств представлены на рисунках А6-А10. При изучении культуральных свойств установлено, что все культуры имеют точечные колонии матового цвета, непрозрачные, с ровными краями.

Для определения липолитической активности был произведен посев в бульон Штерна, содержащего в качестве субстрата глицерин. Посев производили следующим образом: для получения биомассы исследуемой культуры микроорганизмов производили посев на скошенную синтетическую среду и культивировали в течение 24 часов при температуре (37±0,5)?С, затем произвели смыв полученной биомассы 10 см³ бульона Штерна в пробирки, и термостатировали при температуре (37±0,5)?С в течение 120 часов в термостате марки «ТС-80М-2».

При рассмотрении поведения культур в данной среде выявлено, что уже к 24-48 часам культивирования имело место переход окраски бульона из розового в ярко - красный (рисунок А11), образование хлопьевидного осадка и газообразование. К 72 часам культивирования наблюдалось появление биопленки и пристеночного кольца, а к 96 часам посветление сред до светло-розового цвета. При рассмотрении окраски по столбу жидкости была отмечена ее дифференсация: окраска была более интенсивной в верхней части жидкости, что возможно обусловлено более высоким содержанием кислорода в этом слое. Следовательно, для роста данных микроорганизмов необходим кислород.

Также было отмечено изменение активной реакции среды (рН=7 контрольной пробы). Через 24 часа культивирования после заражения бульона Штерна при температуре (37±0,5)?С произошло понижение рН с 5 до 3 для всех исследуемых сред за исключением сред, содержащих культуру 8, активная реакция которой сохранялась в течение 72 часов и составляла рН=4, а к 120 часам культивирования повысилась до рН=5. Для остальных культур было характерно плавное повышение активной реакции среды до рН=5 к окончанию культивирования (120 часов).

На основе проведенных исследований следует отметить, что исследуемые культуры микроорганизмов обладают липолитической активностью, т.е. вовлекают вещества жировой природы (в качестве источника углерода) в конструктивный и энергетический обмен, что заметно по таким показателям среды как: появление хлопьевидного осадка, изменение цвета от восстановления индикатора при изменении рН. Однако выявления культуры с чётко выраженной максимальной величиной активности по липазе не было - наблюдается одинаково равнозначные характеристики роста на специализированной среде в течение всего периода культивирования.

3.2 Изучение толерантности исследуемых культур к факторам внешней среды

Для исследования влияния внешних факторов на динамику роста и развития микроорганизмов, а также для культур, продуцирующих суммарный продукт жизнедеятельности микроорганизмов с максимальной липолитической и минимальной протеолитической активностью провели скриннинговое исследование.

Для этого культивирование проводили в колбах Эрленмейера объемом 250 см³, содержащей 200 мл бактериальной суспензии на основе жидкой синтетической среды Рана (п.2.2.8). Количество вводимой биомассы 10⁵ кл/см³ на 200 см³ рабочей жидкости. Культивирование микроорганизмов проводили в термостате при температуре (375)С, осуществляя переменное механическое воздействие на встряхивателе «Shaker Type-357», с частотой колебаний 200 об/мин, амплитудой 6 по 2 ч в сутки в течение 48 часов. Для изучения динамики активности микроорганизмов через каждые 24 часа снимали такие показания, как подсчет величины КОЕ (п.2.2.9), мутность (п.2.2.10), кислотность (п.2.2.11), активная реакция среды (п.2.2.16) после 48 часов культивирования был определен суммарный продукт жизнедеятельности микроорганизмов (п.2.2.12). Кроме того, определяли показатели для контрольной среды - не зараженной культурами микроорганизмов.

Для определения липолитической и протеолитической активностей эндофермента бактериальную суспензию после 48 часов культивирования подвергали центрифугированию при 5000 об./мин. в течение 15 минут. Осадок, образующийся в результате центрифугирования замораживали, после чего растирали в фарфоровой ступке со стеклом, добавив 100 см³ дистиллированной воды. Полученную суспензию центрифугировали при 5000 об./мин. 10 минут для удаления стекла. После того как, стекло удалили в полученную жидкость вводили 30% от объема (NH₄)₂SO₄ для высаливания белка и центрифугировали при 5000 об./мин. в течение 15 минут, после чего на стенках центрифужной пробирки образовывался желтый налет, который собирали в колбу Эрленмейера объемом 100 см³ и приливали 30 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивали и и отбирали пробы для определения липолитических, протеолитических свойств (п.2.2.13, 2.2.14) и суммарного продукта жизнедеятельности микроорганизмов.

Для определения липолитических и протеолитических свойств экзофермента в над осадочную жидкость полученную после первого центрифугирования при определении свойств эндофермента вводили 30% от объема (NH₄)₂SO₄ для высаливания белка, и проводили все операции аналогично как при определении активностей эндофермента.

Протеолитическую активность определяли по методу Вильштеттера и Вальдшмидта-Лейтца (п.2.2.13) и рассчитывали по формулам (2) и (3).

Пример расчета протеолитической активности для культуры Н:

а = 1,4 мл.; а_к = 1,29 мл.

А = (1,4-1,29) ? 1,4 ? 1 = 0,154 мг.

0,154 ? 12 ? 100

ПС = = 3,08 ед. на 1 г. культуры.

3 ? 1 ? 2 ? 10

Липолитическую активность определяли по модифицированному методу Ота, Ямада (п.2.2.14) и рассчитывали по формуле (4).

Пример расчета липолитической активности для культуры Н:

В = 46,3 г/см³; А = 0,25 см³.

0,25 ? 2 ? 50

ЛС = = 0,54 ед./г.

46,3

Дальнейшие расчеты проводили аналогичным образом. Результаты, полученные после проведения скриннинговых исследований, представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Результаты проведения скриннинговых исследований

Показания	Тип культуры
	Н	Нв	В	3	8	Контр
	0ч	48ч	0ч	48ч	0ч	48ч	0ч	48ч	0ч	48ч
рН	7,25	7,40	7,28	7,44	7,30	7,40	7,33	7,40	7,37	7,10	7,31
Кислотность, г/дм3	1,26	1,56	1,20	1,26	1,20	1,38	1,50	1,20	1,50	1,44	1,20
Оптическая плотность D5402	7,00	8,10	6,20	5,60	5,80	5,60	6,60	4,60	4,00	5,80	5,60
КОЕ, кл/см3	3,3?105	5,1?105	1,2?106	6,1?106	5,8?105	4,1?106	7,3?105	5,3?106	2,4?106	6,8?106	-
Сум-ый продукт жизн-ти, гр./дм3	0,08	0,05	0,17	0,04	0,03	-
Протеолитическая активность экзофермента, ед./гр.	3,08±0,12	5,32±0,25	8,26±0,23	3,36±0,27	5,60±0,32	-
Протеолитическая активность эндофермента, ед./гр.	1,82±0,23	3,64±0,19	2,66±0,31	5,60±0,24	11,2±0,30	-
Липолитическая активность экзофермента, ед./гр.	0,54±0,26	1,16±0,23	0,26±0,14	1,79±0,12	1,79±0,23	-
Липолитическая активность эндофермента, ед./гр.	0,83±0,21	2,15±0,17	0,76±0,28	2,87±0,26	3,59±0,11	-

Полученные результаты показывают, что для всех культур, за исключением культур 3 и 8, характерен рост кислотности к 48 часам культивирования, что связано с вовлечением жирового материала в конструктивный и энергетический обмен микроорганизмами. В результате метаболических процессов наблюдается деструкция жирового материала до глицерина и карбоновых кислот, в результате образования которых повышается кислотность среды. К примеру, кислотность среды, содержащей культуру Н возрастает с 1,26 г/дм³ до 1,56 г/дм³, что соответствует наиболее максимальному возрастанию кислотности по сравнению с остальными средами. Наименьшая интенсивность возрастания данного показателя отмечена для сред, содержащих культуру Нв - увеличение с 1,2 г/дм³ до 1,26 г/дм³.

Оптическая плотность определяли на фотоколориметре ФЭК-4 при длине волны 540 нм, чувствительности 2 и толщине поглощающего слоя 3,025 мм. При изучении динамики изменения значений мутности можно отметить, что для бактериальных суспензий культур Н и 8 характерен рост данного показателя в течение 48 часов культивирования, связанный с наступлением для культур микроорганизмов благоприятной для их бурного развития лог-фазы. Наибольшее увеличение значения мутности характерно для среды, содержащей культуру 8. К 48 часам культивирования наблюдался рост мутности с 4,0 до 5,8, что связано с интенсивным вовлечением природных жировых веществ в клеточный метаболизм. Уменьшение значения мутности наблюдалось у бактериальных суспензий культур Нв, В и 3. Данная динамика может объясняться процессами автолиза, в частности возрастанием лимитирования по субстрату и образованием альдегидов

Изменение рН рабочей жидкости проводили на цифровом иономере Анион 7000. Из данных таблицы видно, что уменьшение рН наблюдалось только для среды, содержащей культуру 8, что вероятно связано с деструкцией жира и образованием глицерина и карбоновых кислот, обуславливающих кислую реакцию среды.