Моделирование биохимических и генетических процессов в клетке

Размещено на http://www.allbest.ru/

Введение

Каждая биологическая система обладает свойством саморегуляции, то есть способностью перестраиваться в зависимости от внешних воздействий так, чтобы сохранился оптимальный уровень ее функционирования.

Существуют различные способы регуляции жизнедеятельности клетки, которые можно условно отнести к генетическому, биохимическому и физиологическому уровням регуляции. В пределах каждого из них действуют механизмы, в основе которых лежит последовательность конкретных метаболических процессов. Понять динамические свойства этих регуляторных механизмов можно на основе общесистемного подхода, рассматривающего поведение каждого из элементов сложной системы как результат его взаимодействия с остальными элементами.

Одним из наиболее развитых подходов для решения этой проблемы в современной биофизике является математическое моделирование. В кинетических моделях отражается динамика изменения концентраций различных составных элементов биологической системы, которая определяется скоростями отдельных элементарных реакций.

В основе процессов обмена клетки со средой и внутреннего метаболизма лежит сложная сеть организованных определенным образом во времени и пространстве различных реакций. В результате этих процессов изменяются концентрации различных веществ, численность отдельных клеток, биомасса организмов или, например, величина трансмембранного потенциала в клетке. Изменения всех этих переменных величин во времени составляют кинетику биологических процессов, которую хорошо описывают современные математические модели [1].

На сегодняшний день благодаря развитию математического моделирования возможность создания комплексной математической модели клетки, способной учитывать кинетику изменения содержания основных компонентов клетки, осуществлять исследование метаболических процессов, а также анализировать генетический материал, стала осуществимой, по крайней мере, для прокариот. Однако есть сложности в построении подобной модели для эукариотических клеток, ввиду большого количества исследуемых параметров и сложности взаимодействия изучаемых параметров клетки между собой.

Целью работы стало:

- изучение и освоение основ работы современных программных обеспечений для осуществления моделирования всех биохимических и генетических процессов в клетке

- построение математической модели динамики изменения объема и потенциала эритроцита в зависимости от концентраций проникающих ионов и рН внеклеточной среды на базе ранее созданной модели для липосомы

Выполняя построение математической модели, мною были поставлены следующие цели:

- осуществить расчет изменения потенциала, объема, водного потока и концентраций проникающих ионов эритроцита в зависимости от внеклеточного рН

- осуществить симуляцию гибели эритроцита методом фиксации трансмембранного потенциала

- исследовать скорость изменения потенциала, объема, водного потока и концентраций проникающих ионов эритроцита в зависимости от низких показателей внеклеточного рН (0,3 - 0,9)



Глава 1. Обзор литературы

клетка эритроцит биохимический моделирование

Первые математические модели биологических систем были созданы еще в начале ХХ века, однако более подробно начать обзор данных моделей следует с рассмотрения интегральной модели регуляции объема, рН и ионного содержания эритроцитов, созданной В. Лью и Р. Букином в 1986 году.

Данная модель является самым простым примером применения математического моделирования в биофизике, т.к. она учитывает только кинетику изменения заряда, неидеального осмотического поведения гемоглобина и других растворенных в клетке веществ с изменением мембранного ионного транспорта эритроцита [2]. Алгоритм вычислений разрабатывался таким образом, чтобы иметь возможность предсказывать поведение всех измеряемых переменных во времени определенным способом, позволяющим оптимизировать сравнение полученных результатов с экспериментально определенным поведением данных переменных. Данная модель осуществляет последовательность вычислений промежуточных состояний системы за очень короткие периоды времени, пока системой не будет достигнуто состояние равновесия, характеризующееся практически полным отсутствием изменений всех ее исследуемых параметров. Это дает возможность гибко воспроизводить любые экспериментальные разработки, оптимизируя таким образом направление количественного сравнения между экспериментально измеренным и предсказанным моделью результатом.

В разработке интегральной модели регуляции объема, рН и ионного содержания эритроцитов было использовано минимальное количество самых достоверных начальных параметров, наиболее математически простые уравнения и максимальная гибкость при разработке алгоритма вычислений. Таким образом, можно утверждать, что данная модель осуществляет простое интегральное представление функций регуляции ионного транспорта, рН и объема одиночного эритроцита (не находящегося во взаимодействии с другими клетками, т.е. в условиях достаточно сильного разведения).

Полученные результаты послужили основой для создания более сложных моделей, в которых расчет кинетики биохимических реакций стал применяться как базис для моделирования системы метаболизма клетки. Такие модели являются более востребованными, т.к. имеют более широкое практическое применение, чем простые кинетические модели.

В качестве примера модели, объединяющей в себе возможность осуществления кинетических расчетов динамики изменения параметров клетки и применения результатов данных расчетов для анализа метаболизма, следует рассмотреть модель симуляции динамики системы метаболизма эритроцита человека.

Данная модель была разработана на базе системы компьютерной алгебры - Mathematica, который содержит множество функций для аналитических преобразований и численных расчётов. Целью данного программного обеспечения является всестороннее ознакомление научного сообщества с моделированием динамики системы метаболизма эритроцита человека посредством широкой доступности модели и использования ей стандартного вычислительного аппарата [3].

Модель метаболизма эритроцита включает в себя кинетические выражения для 35 белков, 6 транспортных каналов, каналы утечки натрия и калия, а также натриевый и калиевый АТФ-азный насос. Используемые в модели кинетические выражения выведены на основании многолетних исследований таких ученых, как Roigas (1965), Worthington и Rosemeyer (1976), Otto (1977), Morelli (1978), Vandenberg (1986). Модель включает в себя только кинетику метаболической системы, в ее состав не входит осмотическое давление, имеются ограничения электронейтральности (Werner and Heinrich, 1985) и связывание гемоглобина (Yoshida and Dembo, 1990).

Создателями модели были написаны специальные функции для адаптации программного обеспечения Mathematica к расчетам кинетики эритроцита. Основными операциями, осуществляемыми пакетом, являются интегрирование уравнений массового баланса и симуляция изменений, возникающих при изменении концентраций или потоков белков в течение длительного времени.

Также программа обладает следующими возможностями:

1) Графическое изображение метаболической сети в состоянии равновесия потоков и размеров пулов;

2) Нахождение состояния равновесия системы;

3) Временная калибровка метаболической сети;

4) Моделирование метаболических путей.

Несмотря на простоту метаболической сети эритроцита в сравнении с другими клетками, ее симуляция с помощью данной модели метаболизма позволяет пользователю проникнуть в суть общих процессов клеточного метаболизма, которые могут впоследствии являться частью более сложных метаболических путей. Так как даже самые простые системы метаболических путей являются трудными для изучения в целом, последующее моделирование более сложных систем будет иметь важное значение для анализа метаболизма реальных биологических объектов.

В качестве еще одной модели анализа метаболизма следует рассмотреть модель системы метаболизма и динамики эритроцита человека. Данная модель является результатом разработок интегрированных моделей системы метаболизма эритроцита на протяжении последних 30-ти лет (Атауллаханов и др., 1981; Брумен и Генрих, 1984; Генрих и Рапопорт, 1975; Jacobasch и др., 1983; Лью и Букин, 1986; Макинтайр и др., 1989; Рапопорт и Генрих, 1975; Шустер и др., 1988; Thorburn и Kuchel, 1987; Yoshida и Dembo, 1990).

Модель системы метаболизма и динамики эритроцита человека обширная, но не совсем полная модель всех основных метаболических процессов, происходящих в этой простой клетке. Данная модель включает в себя не только кинетические уравнения, описывающие кинетику гемоглобина, но и различные ограничения, как, например, осмотическое давление и электронейтральность. Таким образом, осуществляется моделирование динамики эритроцита как ответ на выведение системы метаболизма клетки из состояния равновесия в неравновесное состояние. Общая схема регуляции гомеостаза клетки координируется изменением переменных, составляющих кинетические уравнения, описывающие модель (величины трансмембранных потоков потенциалопределяющих ионов, значение мембранного потенциала, концентрации проникающих и непроникающих ионов и т.д.). Данное моделирование позволяет выявлять взаимодействия между потоками веществ из и во внеклеточное и клеточное пространство, реакцию клетки на окислительно-восстановительные процессы, имеющие место на поверхности мембраны эритроцита и т.д. [4].

Однако модель регуляции системы метаболизма и динамики эритроцита разработана не до конца. Полный ее вариант должен будет включать все физико-химические ограничения процессов функционирования эритроцита, а также осуществлять регуляцию участия определенных ферментов в процессах метаболизма.

Следующим этапом развития математического моделирования стало изучение генетического материала клетки, как еще одного важного параметра наряду с кинетикой и метаболизмом. Современные математические модели включают в себя возможность исследования всех трех данных параметров в непосредственном взаимодействии друг с другом, т.е. как единую систему со сложными внутренними взаимодействиями.

Один из примеров таких моделей - E-CELL (программное обеспечение для моделирования поведения целой клетки).

E-CELL - специальная программная среда для моделирования и симуляции биохимических и генетических процессов с целью их детального изучения. Представляет собой единую, объектно-ориентированную платформу для симулирования комплекса взаимодействий между генными продуктами цельных геномов. Данная система позволяет пользователю самому определять функции белков, белок-белковые взаимодействия, белок-ДНК взаимодействия, регуляцию экспрессии генов и другие особенности клеточного метаболизма как набор реакционных правил.

E-CELL симулирует клеточное поведение посредством численного интегрирования дифференциальных уравнений, описываемых набором правил, который (набор правил) выбирает пользователь по своему усмотрению. На дисплее монитора компьютера пользователь имеет возможность наблюдать за изменениями концентраций белков, белковых комплексов и других химических соединений в клетке.

Модель E-CELL состоит из трех списков, загружаемых пользователем в ходе выполнения моделирования. Список веществ определяет все объекты, которые будут находиться в клетке и внеклеточной среде. Список правил инициализирует все реакции, которые будут применяться для данной клетки. Системный список формирует пространственную и/или функциональную структуру клетки и ее окружения. Состояние клетки в каждый период времени представляется в виде таблицы значений клеточных концентраций веществ наряду с глобальными значениями параметров клетки - объема, рН и температуры. С помощью механизма симуляции генерируется каждое последующее состояние системы во времени путем вычислений всех функций, определенных в списке правил. Также пользователь может сам создавать списки веществ и правил, формируя новые модели для исследования.

Графический интерфейс модели E-CELL обеспечивает возможность наблюдения пользователя за процессом вычислений на протяжении всего времени симуляции. Самым важным является интерфейс отладочной программы, который позволяет пользователю выбирать интересующие его вещества и типы реакций, а также наблюдать за их количественными изменениями. Данный интерфейс представляется в виде окна, показывающего двумерный график, изменяющийся соответственно количественному изменению веществ или реакций в моделируемой системе.

Обобщенным уравнением кинетики реакций, используемой в модели E-CELL, является уравнение:

,

где - концентрация n-того вещества, - стехиометрический коэффициент n-того вещества, скорость каждой реакции выражается как функция, зависящая от двух параметров - и .

Неферментативные реакции определяются как реакции первого порядка. Их скорости непосредственно зависят от концентрации веществ и выражаются уравнением:

,



где k - константа скорости.

Ферментативные реакции выражаются с помощью уравнения Михаэлиса-Ментен:

,

где - концентрация вещества, - максимальная скорость реакции, - константа Михаэлиса.

Помимо всех вышеперечисленных функций модели, она обеспечивает возможность проведения виртуальных экспериментов. Например, пользователь может «задержать» клетку в состоянии полного отсутствия в ней глюкозы. Таким образом, можно наблюдать гибель клетки из-за утечки АТФ. Также процесс гибели клетки можно наблюдать посредством удаления одного из значимых генов, например, синтеза белков[5].

Конечно, нельзя не отметить самый главный пример математической модели, позволяющей исследовать основные параметры любой клетки - кинетику, метаболизм и генетический материал, - Karyote - модель для моделирования физико-химической геномной и метаболической систем клетки.

Платформа для моделирования Karyote объединяет в себе три основных элемента (модуля):

1) Модуль для построения модели и сохранения расчетных данных, позволяющий определить тип моделируемой клетки с помощью параметров сети реакций, структуры и транспортных процессов, заданных пользователем, а также выбрать окружающую среду и другие параметры моделируемых явлений;

2) Симулятор геномных и метаболических процессов осуществляет решение уравнений, описывающих метаболические реакции, полимеризации транскрипции/трансляции и обмен молекулами частей клетки между собой и с окружающей средой;

3) Информационный теоретический модуль (ITM), автоматизирующий калибровку и разработку образца, объединяет множество типов данных с вычислениями клеточной динамики.

В Karyote может быть реализована различная скорость реакций - быстрая (процесс уравновешивания исследуемой системы) и медленная (приближение к равновесному состоянию), а также могут быть добавлены специальные эффекты работы ферментов и их минорных разновидностей, ускоряющих процесс установления равновесия системы. Данная модель предусматривает неподвижность окружающей клетку среды.

Пользовательский интерфейс позволяет автоматизировать генерацию и решение уравнений в соответствии с многократной временной шкалой с целью разобщения динамик различных процессов в клетке для их более подробного наблюдения [6].

Модель Karyote дает доступ к обширному набору процессов и включает в себя множество особенностей:

· Общий конечный уровень состояния системы и быстро уравновешиваемые реакции;

· Минорные разновидности (например, ферменты) со связанными равновесными циклами любой сложности;

· Компартментизация, посредством которой процессы протекают в определенных зонах клетки (цитоплазма или органеллы) и осуществляется обмен молекул между данными зонами;

· Геномные модули, содержащие данные о последовательностях генов, используемые для симуляции процессов транскрипции и трансляции;

· Контроль и регуляция экспрессии генов;

· Уравнения для вычисления электрического потенциала в разных компартментах клетки, а также пассивных и активных потоков между ними;

· Мембранные процессы (ионные насосы или мембранные ферментные реакции), которые требуют привлечения молекул, находящихся по обе стороны мембраны и в ее пределах;

· Сетевой графический ввод / вывод;

· Введение в основы моделирования.

Если подвести итог всему вышесказанному, то следует отметить, что на данный момент самая важная область исследований в системной биологии - анализ и интеграция функциональных наборов данных о геноме человека. Разработка технологий исследования генома предоставила исследователям специальные инструменты для получения информации о состоянии каждого отдельного нуклеотида или белка. Данными инструментами являются математические модели, применяемые для широкого диапазона биологических систем. Некоторые из них способны самостоятельно регулировать процесс прохождения эксперимента и объяснять выявленные патологии функционирования модельного объекта (E-CELL, Karyote) [5], [6]. Однако на данный момент все еще наблюдается несогласованность между огромным количеством данных, полученных в эксперименте (характеристика сложного физиологического ответа организма) и данными, получаемыми от разработанных механистических вычислительных моделей, работа которых основана на использовании реальных параметров и ограничений, присущих живой клетке. Из-за огромной нехватки информации о динамике взаимодействия для большинства биологических компонентов, методы разработки специального расчетного программного обеспечения в большей степени базируются на информационной теории или вероятностных методах. Более того, разработка математических моделей, представляющих целый комплекс клеток, в ближайшее время является неосуществимой задачей для семейства эукариотов. Общее число компонентов такой модели будет слишком большим, а взаимодействия между ними ввиду малой их изученности будет описано некорректно [7].



Глава 2. Материалы и методы

Для построения модели динамики осмотического поведения эритроцита мной была использована интегрированная среда разработки программного обеспечения - Borland C++ Builder 6.

Модель имеет многооконный интерфейс, возможность построения графиков и записи результатов расчетов в файл. В процессе моделирования пользователь имеет доступ к справочному средству, в котором можно ознакомиться с методикой осуществления моделирования на данном программном обеспечении, подробным описанием каждого уравнения и переменной, входящей в его состав, а также используемых при расчетах констант.

Модель описывается системой из 57 уравнений.

(2.1)

(2.2)

(2.3)

(2.4)

(2.5)

(2.6)

(2.7)

(2.8)

(2.9)

(2.10)

(2.11)

(2.12)

(2.13)

(2.14)

(2.15)

(2.16)

(2.17)

(2.18)

(2.19)

(2.20)

(2.21)

(2.22)

(2.23)

(2.24)

(2.25)

(2.26)

(2.27)

(2.28)

(2.29)

(2.30)

(2.31)

(2.32)

(2.33)

(2.34)

(2.35)

(2.36)

(2.37)

(2.38)

(2.39)

(2.40)

(2.41)

(2.42)

(2.43)

(2.44)

(2.45)

(2.46)

(2.47)

(2.48)

(2.49)

(2.50)

(2.51)

(2.52)

(2.53)

(2.54)

(2.55)

(2.56)

(2.57)

В представленных уравнениях используются следующие символы и определения:

- количество раствора в 1 л клеточной воды,

, - концентрация раствора во внутри- () и внеклеточном () пространстве

Индекс - обозначает количество

- ионы

- вода

- исходный объем клетки,

- изменение объема клетки за один цикл (приращение за )

- площадь поверхности клетки,

- объем исследуемого образца,

- суммарный объем всех клеток в исследуемом образце,

- гематокрит

и - константы проницаемости клеточной мембраны за счет электродиффузионных () и диффузионных () потоков,

и - потоки компонент за счет электродиффузии () и диффузии (),

- величина отношения внутри- и внеклеточных концентраций проникающих анионов ()

- величина межмембранного потенциала,

- количество клеток в исследуемом образце

, - величины осмолярности во внутри- () и внеклеточном () пространстве

- интервал между вычислениями каждого последующего цикла

- время эксперимента

- изменение количества раствора в 1 л клеточной воды за время прохождения одного цикла (приращение за )

- заряд иона

- константа Фарадея,

- универсальная газовая постоянная,

- абсолютная температура,

Основные уравнения для клетки

1. Изотоничность

2. Начальная электронейтральность



3. Уравнения потоков

4. Постоянство электронейтральности

5. Вычисление переходов

6. Перераспределение проникающих растворов между клетками и внеклеточной средой

Определения

(D1)

(D2)

(D3)

(D4)

(D5)

(D6)

(D7)

На первом этапе работы программы производится ввод начальных данных о состоянии клетки для осуществления расчета ее исходного состояния (reference state). Все расчеты осуществляются в единицах СГС.

Когда определены параметры исходного состояния клетки, необходимо ввести время эксперимента и интервал между вычислением каждой последующей итерации.

Когда данная операция произведена, мы имеем возможность запустить цикл, условия которого были заданы выше.

Уравнения (1) и (2) используются для расчета начального потенциала клетки согласно уравнению Нернста.

Уравнения (3) и (4) дают возможность вычислить начальные внутри- и внеклеточные концентрации ионов

Уравнение (5) определяет начальный рН внутриклеточной среды

Уравнение (6) дает расчет осмотического коэффициента гемоглобина (данный коэффициент является определяющим параметром неидеального осмотического поведения гемоглобина, исследуемого в модели)

Уравнение (7) осуществляет расчет суммарного объема эритроцитов согласно заданным ранее сведениям о начальном объеме эритроцита и значению гематоктира (отношение объема эритроцитов крови к объему плазмы).

Уравнение (8) вычисляет объем внеклеточной жидкости в заданном объеме образца согласно, вычисленному ранее суммарному объему эритроцитов в данном образце.

Уравнение (9) помогает определить количество эритроцитов в заданном объеме образца. В последующих расчетах данная величина принимается за константу.

Уравнения (10) и (11) рассчитывают осмолярность внутри- и внеклеточной среды и .

Уравнение (12) позволяет рассчитать начальную величину потока воды через мембрану эритроцита.

Уравнения (13-16) и (17-20) описывают количество вещества () во внутри- и внеклеточной среде и .

Уравнения (21-23) определяют начальные величины электродиффузионных потоков ионов () через мембрану эритроцита .

Уравнения (25-26) рассчитывают начальные величины диффузионных потоков ионов () через мембрану эритроцита .

Уравнение (27) описывает обменный поток анионов и ионов водорода согласно циклу Якобса-Стюарта

Уравнения (28-31) являются суммами величин электродиффузионных и диффузионных потоков ионов () через мембрану эритроцита .

Уравнение (32) рассчитывает количество циклов вычислений в течении данного эксперимента .

Уравнения (33-36) позволяют определить приращение количества вещества () во внутри- и внеклеточной среде за одну итерацию.

Уравнение (37) определяет приращение количества воды во внутри- и внеклеточной среде за одну итерацию.

Уравнения (38-41) и (42-45) производят расчет нового количества вещества () во внутри- и внеклеточной среде и после завершения одного цикла.

Уравнение (46) рассчитывает новый объем эритроцита после завершения одного цикла.

Уравнение (47) позволяет рассчитать приращение объема эритроцита после завершения одного цикла.

Уравнение (48) производит расчет нового суммарного объема эритроцитов после завершения одного цикла.

Уравнение (49) определяет новый объем внеклеточной жидкости в заданном объеме образца согласно вычисленному ранее суммарному объему эритроцитов в данном образце после завершения одного цикла.

Уравнения (50-53) и (54-57) рассчитывают новые значения концентраций ионов () во внутри- и внеклеточной среде и за одну итерацию.

2.1 Расчет начального состояния клетки

1. Задание начальных параметров

2. Вычисляем из

(1)

3. Вычисляем согласно

(2)

4. Рассчитываем начальные внутри- и внеклеточные концентрации ионов из уравнений

(2.3)

(2.4)

5. Определяем начальный рН внутриклеточной среды эритроцита (2.5)

6. Зная заданное количество гемоглобина в эритроците, осуществляем расчет осмотического коэффициента гемоглобина

(2.6)

7. Определяем суммарный объем внутриклеточного раствора

(2.7)

8. Зная , вычисляем объем внеклеточной жидкости в исследуемом образце

(2.8)

9. Используя заданные значения внутри- и внеклеточных концентраций ионов, определяем осмолярность внутри- и внеклеточной среды

(2.10)

(2.11)

10. Определяем количество ионов в исследуемом образце

(2.9)

11. Используя решения уравнений (7) и (8), находим величину потока воду через клеточную

(2.12)

12. Определяем внутри- и внеклеточное количество вещества

(2.13)-(2.20)

13. Вычисляем потоки компонент за счет электродиффузии () и диффузии ()

(2.21)-(2.24)

(2.25)-(2.26)

14. Определяем поток проникающих ионов водорода и анионов согласно циклу Якобса-Стюарта



(2.27)

15. Находим общий поток проникающего раствора

(2.28)-(2.31)

2.2 Вычисление изменений параметров клетки

После того, как начальное состояние клетки вычислено с помощью приведенных выше 57 уравнений, дальнейшие расчеты осуществляются с помощью цикла.

1. Требуемые изменения значений параметров или концентраций, определение количества итераций

(2.32)

2. Определяем приращение за

(2.33)-(2.37)

3. Согласно вычисленным значениям находим новые количества внутри- и внеклеточного вещества

(2.38)-(2.41)

(2.42)-(2.45)

4. Вычисляем новый объем клетки



(2.46)

5. Определяем приращение за

(2.47)

6. Находим суммарный объем клеток в исследуемом образце

(2.48)

7. Вычисляем объем внеклеточной жидкости , определив из уравнения (36)

(2.49)

8. Теперь можно вычислить новые внутри- и внеклеточные концентрации ионов в конце интервала , -

(2.50)-(2.54)

(2.54)-(2.57)

9. Когда известно значение , становится возможным вычислить ,

10. Находим новое значение общего потока проникающего раствора

11. Вычисление нового значения мембранного потенциала из условия постоянства электронейтральности [4]

12. Новые значения осмолярности находим согласно уравнениям

13. Теперь возможно определить новое значение потока воды через мембрану клетки за время

Далее, вычислив все необходимые значения параметров и концентраций за один цикл, программа возвращается к уравнению (2.33) и повторяет расчеты цикла согласно заданной продолжительности эксперимента.



ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ МОДЕЛИРОВАНИЯ

Выполняя построение математической модели, мною были поставлены следующие цели:

- осуществить расчет изменения потенциала, объема, водного потока и концентраций проникающих ионов эритроцита в зависимости от внеклеточного рН

- осуществить симуляцию гибели эритроцита методом фиксации трансмембранного потенциала

- исследовать скорость изменения потенциала, объема, водного потока и концентраций проникающих ионов эритроцита в зависимости от низких показателей внеклеточного рН (0,3 - 0,9)

3.1 Расчет изменения потенциала, объема, водного потока и концентраций проникающих ионов эритроцита

3.1.1 Влияние внеклеточного рН

Согласно литературным данным [8] для расчетов мной были выбраны в качестве начальных следующие параметры эритроцита:

- концентрация ионов внутри клетки

- концентрация ионов внутри клетки

- концентрация ионов внутри клетки

- начальный объем клетки

- площадь поверхности клетки

- объем исследуемого образца

- уровень гематокрита

- концентрация ионов во внеклеточной среде

- концентрация ионов во внеклеточной среде

- концентрация ионов во внеклеточной среде

- количество гемоглобина во внутриклеточной среде

- газовая постоянная

- постоянная Фарадея

- температура

- константа для расчета потока Якобса-Стюарта

На первом этапе моделирования исследуемое количество клеток было помещено в раствор, все параметры которого, кроме рН, соответствовали стационарному состоянию эритроцита. Путем постепенного изменения значения внеклеточного рН от 1 до 10 (перевода эритроцита из кислой среды в щелочную), я исследовала влияние рН на изменение концентраций проникающих ионов клетки . Результаты расчетов (графики 1 - 6) показали, что изменение рН в растворе приводит к изменению времени установления равновесного состояния эритроцита, а также более значительным изменениям концентраций ионов . В случае нахождения эритроцита в кислой среде (графики 1 - 8) процесс перехода клетки в стационарное состояние занимает около 50 мсек. Приобретение окружающим эритроцит раствором большего количества щелочных свойств (графики 9 - 14) приводит к сокращению времени данного процесса (установления стационарного состояния) до 6 - 10 мсек.

Полученные результаты объясняются влиянием повышенного количества ионов водорода во внеклеточной среде при помещении эритроцита в раствор с рН менее 5. Такое состояние клетки соответствует пониженной осмотичности эритроцита по сравнению с окружающей его средой. Это приводит к увеличению времени изменения основных параметров эритроцита (в том числе и концентраций ионов ), пока не произойдет выравнивание осмотических показателей клетки и окружающего ее раствора.

График 1. рН = 1 (внутриклеточные концентрации ионов )	График 2. рН =1 (внеклеточные концентрации ионов )
График 3. рН = 1,5 (внутриклеточные концентрации ионов )	График 4. рН = 1,5 (внеклеточные концентрации ионов )
График 5. рН = 2 (внутриклеточные концентрации ионов )	График 6. рН = 2 (внеклеточные концентрации ионов )
График 7. рН = 3 (внутриклеточные концентрации ионов )	График 8. рН = 3 (внеклеточные концентрации ионов )
График 9. рН = 5 (внутриклеточные концентрации ионов )	График 10. рН = 5 (внеклеточные концентрации ионов )
График 11. рН = 7,4 (внутриклеточные концентрации ионов )	График 12. рН = 7,4 (внеклеточные концентрации ионов )
График 13. рН = 9,4 (внутриклеточные концентрации ионов )	График 14. рН = 9,4 (внеклеточные концентрации ионов )

Аналогичный эксперимент был проведен и для изучения изменения других параметров эритроцита, как потенциал и трансмембранный поток воды. Полученные результаты также подтверждают динамику изменения времени установления клеткой стационарного состояния. При рН окружающей эритроцит среды менее 5 (графики 15 - 22) время достижения равновесия около 80 мсек, при рН более 5 (графики 22 - 26) данное время сокращается до 10 мсек.

Таким образом, видно, что рН внеклеточной среды влияет на скорость достижения эритроцитом стационарного состояния.

3.1.2 Фиксация трансмембранного потенциала

Произведя фиксацию потенциала эритроцита и пронаблюдав за изменением его основных параметров, выяснилось, что (согласно расчетам модели) по истечении 100 - 150 мсек происходит осмотический гемолиз исследуемой клетки.

В результате фиксации потенциала эритроцита произошел практически полный выход внутриклеточных ионов и гемоглобина в окружающую клетку среду [9]. Так как интенсивность водного потока внутрь эритроцита регулируется изменением потенциала клетки, произошел процесс входа воды внутрь эритроцита, его набухание и разрушение, после превышения объема в 150 мкм³ [10].

График 27. рН = 7,4 (внутриклеточные концентрации ионов )	График 28. рН = 7,4 (внеклеточные концентрации ионов )
График 29. рН = 7,4 (потенциал)	График 30. рН = 7,4 (водный поток)
График 31. Внутриклеточный рН	График 32. Внеклеточный рН
График 33. Коэффициент сжимаемости гемоглобина

3.1.3 Влияние малых значений рН на скорость изменения потенциала и водного потока эритроцита

Водородный показатель pH широко используется для характеристики кислотно-основных свойств различных биологических сред.

Кислотность реакционной среды особое значение имеет для биохимических реакций, протекающих в живых системах. Концентрация в растворе ионов водорода оказывает влияние на физико-химические свойства и биологическую активность белков и нуклеиновых кислот, поэтому для нормального функционирования организма поддержание кислотно-основного гомеостаза является важной задачей[11].

Очень малые значения рН (0,3 - 0,9) (рис. 1) оказывают значительное влияние на проницаемости каналов для основных проникающих ионов [12]. В очень кислых растворах [H+] > 10^?7, то есть концентрация ионов водорода в окружающей эритроцит среде настолько велика, что в течении первых 10 мсек происходит резкий скачок потенциала клетки и его скорости из-за нарушения осмотического баланса, а также замедление скорости водного потока в клетку [13]. Результаты эксперимента подтверждают гибель эритроцита (рис. 2), т.к. показатели всех параметров клетки стремятся к нулю. Одновременно с этим наблюдается рост данных показателей в окружающей эритроцит среде. Это свидетельствует о разрыве клеточной мембраны и выходе всех структурных компонентов эритроцита в окружающую среду [14].

Скорость водного потока в клетку в течении первых 5 мсек претерпевает замедление (график 40). Это обуславливается нарастанием скорости потенциала приблизительно за такой же период времени (график 38). После достижения величиной водного потока критической отметки следует предположить, что происходит разрыв мембраны эритроцита, что обуславливается резким снижением величины потенциала клетки, величины внутриклеточного водного потока, а также величин скорости изменения потенциала и водного потока [15].

Разработанная модель моделирует гемоглобин эритроцита как статическую структуру, то есть не предусматривает его выход из клетки за исключением гемолиза эритроцита [16] , [17], [18]. Однако состояние внутриклеточной конформации гемоглобина отслеживается с помощью коэффициента сжимаемости. Скорость гибели эритроцита согласуется со скоростью изменения коэффициента сжимаемости клетки (график 42). Достижение данным коэффициентом значения равного нулю говорит о полном выходе гемоглобина из клетки [19].

График 35. Внутриклеточные концентрации ионов	График 36. Внеклеточные концентрации ионов
График 37. Потенциал	График 38. Скорость изменения потенциала
График 39. Водный поток	График 40. Скорость изменения водного потока
График 41. Внутриклеточный рН	График 42. Коэффициент сжимаемости гемоглобина



Выводы

1. Изменение рН среды, окружающей эритроцит, в сторону увеличения ее (среды) кислотных свойств приводит к замедленному времени изменения основных параметров эритроцита. Изменение рН среды, окружающей эритроцит, в сторону увеличения ее (среды) щелочных свойств приводит к ускорению времени изменения основных параметров эритроцита, а, соответственно, и времени достижения клеткой стационарного состояния;

2. Фиксация потенциала эритроцита обуславливает гемолиз клетки;

3. Влияние малых значений рН на скорость изменения потенциала и водного потока эритроцита является разрушительным для клетки. В результате эксперимента произошли изменения показателей основных структурных элементов клетки, которые (показатели) являются характерными для гемолиза эритроцита.



Литература

1. Рубин А.Б., Пытьева Н.Ф., Ризниченко Г.Ю. Кинетика биологических процессов. М.: Изд-во МГУ, 1987. 300 с.

2. Lew VL, Bookchin RM (1986) Volume, pH and-ion content regulation in human red cells: analysis of transient behavior with an integrated model. J Membr Biol 92: 57-74.

3. N. Jamshidi, J.S. Edwards, T. Fahland, G.M. Church, B.O. Pallson. Dynamic simulation of the human red blood cell metabolic network. Vol. 17, №3, 2001, pages 286-297.

4. F. Ortega, K. Sameith, N. Turan, R. Compton, V. Trevino, M. Vannucci, F. Falciani. Models and computational strategies linking physiological response to molecular networks from large-scale data. A (2008) 366, pages 3067-3089, Journal The Royal Society.

5. M. Tomita, K. Hashimoto, K. Takahashi, S. Tanida, K. Saito. E-CELL: software environment for whole-cell simulation. Vol. 15, № 1, 1991, pages 72-84.

6. P. Ortoleva, E. Berry, Y. Brun, J. Fan, M. Fontus, K. Hubbard. K. Jaqaman. The Karyote Physico-Chemical Genomic, Proteomic, Metabolic Cell Modeling System. Vol. 7, № 3, 2003, OMICS A Journal of Integrative Biology.

7. K. Kauffman, J.D. Pajerowski, N. Jamshidi, B.O. Palsson, J.S. Edwards. Description and Analysis of Metabolic Connectivity and Dynamics in the Human Red Blood Cell. Vol. 83, August 2002, pages 646-662, Biophysical Journal.

8. Julio A. Hernбndez and Ernesto Cristina. Modeling cell volume regulation in nonexcitable cells: the roles of the Na + pump and of cotransport systems. Am J Physiol Cell Physiol 275:C1067-C1080, 1998.

9. Virgillo L. Low, Carol J. Freeman, Olga E. Ortiz, and Robert M. Boolkchin. A Mathematical Model of the Volume, pH, and Ion Content Regulation in Reticulocytes. Physiological Laboratory, Cambridge University, Cambridge, United Kingdom; and Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, New York 10461.

10. Baskurt O.K., Meiselman H.J. Blood rheology and hemodynamics// Semin. Thromb. Hemost. 2003. V. 29. ‹ 5. P. 435-450.

11. Brugnara, C., T.V. Ha, and D.C. Tosteson. 1989. Acid pH induces formation ofdense cells in sickle erythrocytes. Blood. 74:487-495.

12. Lang F., Lang K.S., Wieder T., Myssina S., Birka C., Lang P.A., Kaiser S., Kempe D., Duranton C., Huber S.M. Cationchannels, cell volume and the death of an erythrocyte// Pflьgers Arch. 2003. V. 447. ‹ 2. P. 121-125.

13. Sardini A., Amey J.S., Weylandt K.H., Nobles M., Valverde M.A., Higgins C.F. Cell volume regulation and swellingactivated chloride channels // Biochim. Biophys. Acta.2003. V. 1618. ‹ 2. P. 153-162.

14. Maher A.D., Kuchel P.W. The Gardos channel: a review of the Ca2+-activated K+ channel in human erythrocytes //Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2003. V. 35. ‹ 8. P. 1182-1197.

15. Jacobs R.L., Stead L.M., Brosnan M.E., Brosnan J.T. Hyperglucagonemia in rats results in decreased plasma homocysteine and increased flux through the transsulfuration pathway in liver // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. ‹ 47. P. 43740-43747.

16. Jacobash G.S., Minakami S., Rapoport S.M. // Cellular and molecular biology of erythrocytes / Eds Yoshikawa J. & Rapoport S.M. Tokyo: University of Tokyo Press, 1974.

17. Baskurt O.K., Meiselman H.J. Blood rheology and hemodynamics // Semin. Thromb. Hemost. 2003. V. 29. ‹ 5. P. 435-450.

18. Halperin J.A., Brugnara C., Kopin A.S., Ingwall J., Tosteson D.C. Properties of the Na+-K+ pump in human red cells with increased number of pump sites // J. Clin. Invest. 1987. V. 80. ‹ 1. P. 128-137.

19. Lew V.L., Hockaday A.R. The effects of transport perturbations

on the homeostasis of erythrocytes // Novartis Found Symp. 1999. V. 226. P. 37-50. Discussion P. 50-54.

Размещено на Allbest.ru