Использование дифракционных методов для анализа структуры, фракционного состава и равновесных взаимодействий биологических макромолекул

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДИФРАКЦИОННЫХ МЕТОДОВ ДЛЯ АНАЛИЗА СТРУКТУРЫ, ФРАКЦИОННОГО СОСТАВА И РАВНОВЕСНых ВЗАИМОДЕЙСТВИй БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ

Введение

Процессы, связанные с обменом липидов в организмах, относятся к важнейшим метаболическим процессам. Известно, что различные типы нарушений липидного обмена сопровождаются изменениями фракционного и субфракционного состава сывороточных липопротеинов (ЛП) крови [1-13]. Выявлено участие ЛП в механизмах нарушения липидного обмена, сопровождающих развитие не только атеросклероза, но и целого ряда других патологий (диабет, гепатит, панкреатит и др.). Поэтому для диагностики и профилактики заболеваний людей и животных, а также для оценки эффектов лечений имеется острая необходимость точно и быстро (экспрессно) определять фракционный состав липопротеинов в сыворотках крови. Авторами работ [16-20] была разработана новая методика анализа структуры и фракционного состава ЛП на основе дифракционного метода МУРР. Методика не требует применения дорогостоящих реактивов и позволяет относительно быстро определять фракционный состав ЛП в прямой шкале размеров (радиусов) ЛП частиц и в абсолютных единицах концентраций (мг/дл). В работах [3, 4, 21] было показано, что кровь здоровых людей также содержит до 40% так называемых модифицированных липопротеинов. В связи с этим для диагностики дислипопротеинемий (ДЛП) необходимо измерять концентрации не только общих, но и модифицированных липопротеинов, причем во всех основных фракциях и подфракциях липопротеинов.

Для препаративного выделения модифицированных ЛП из сывороток крови используют полиэтиленгликоли (ПЭГ). Известно, что растворы полиэтиленгликолей способны осаждать из сывороток крови агрегированные иммунные глобулины и иммунные комплексы [1-6]. При различных концентрациях ПЭГ происходит преципитация различающихся по молекулярной массе и размерам иммунных комплексов. Так, например, низкие концентрации ПЭГ (< 3%) осаждают комплексы крупных размеров, высокие концентрации (> 6%) вызывают преципитацию и низкомолекулярных соединений, а 3,5% ПЭГ осаждают наиболее распространенные «промежуточные» комплексы средних размеров.

Дифракционные методы изучения строения нано-частиц вещества, основанные, в частности, на рентгеновском или световом рассеянии, позволяют проводить всесторонние исследования макромолекул в растворе. При рассеянии под малыми углами можно изучать их общее строение, а под средними и большими - особенности их внутренней структуры [14, 15]. Благодаря этому данные методы получили весьма широкое распространение. Дифракционные методы дают информацию о структуре и взаимном распределении рассеивающих масс (неоднородностей электронной или оптической плотности) - информацию, которую невозможно получить другими (недифракционными) методами. Эти физические методы анализа позволяют проводить научные исследования внутренней структуры и дисперсного состава веществ и материалов различных типов: коллоидные растворы и гели биополимеров (белки, нуклеиновые кислоты, вирусы, клетки), а также взвеси органических и неорганических частиц. Исследования и анализы дифракционными методами проводятся с использованием специальных приборов - дифрактометров [14, 15].

Метод малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) позволяет непосредственно определять значения структурных параметров частиц размером от единиц до нескольких тысяч ангстрем. В этот диапазон, как известно, попадают все белки, нуклеиновые кислоты, нуклеопротеиды, липопротеиды и другие макромолекулярные комплексы, а также малые и средние вирусы. С использованием метода МУРР могут быть получены такие важные характеристики биополимеров, как молекулярный вес, размеры, объём, форма частиц, дисперсный состав (распределение по размерам) и целый ряд других параметров [14].

Метод светорассеяния (СР) отличается высочайшей чувствительностью, а применение более длинноволнового излучения (по сравнению с МУРР; отличие может составлять тысячи раз) позволяет определять структурно-дисперсные характеристики рассеивающих частиц размером от 40 нм до нескольких микрон и более [15]. Кроме того, существуют и чисто физические отличия в механизмах взаимодействия излучений с веществом анализируемых частиц: рассеяние в МУРР происходит на неоднородностях электронной плотности, а в СР - на неоднородностях оптической плотности, отличающихся показателями преломления. Поэтому эти два дифракционных метода хорошо дополняют друг друга [14, 15].

Целью настоящей дипломной работы является изучение равновесных и неравновесных молекулярных взаимодействий биологических макромолекул (сывороточных белков крови) с полиэтиленгликолями различной молекулярной массы, включающее следующие задачи:

1. Освоение двух дифракционных методов анализа (МУРР и СР) и новых методик анализа сывороточных белков крови, в частности, липопротеинов (общих и модифицированных).

2. Исследование эффектов молекулярных взаимодействий белков сывороток крови с различными полиэтиленгликолями в допреципитационных и преципитационных стадиях.

3. Математический и статистический анализ полученных экспериментальных данных.

4. Выбор «оптимального» полиэтиленгликоля (определенной молекулярной массы) и определение его оптимальной концентрации для препаративного выделения и анализа модифицированных липопротеинов.

1. Обзор литературы

1.1 Физико-химические свойства полиэтиленгликолей

полиэтиленгликоль липопротеин кровь сывороточный

Полиэтиленгликоли - полимеры окиси этилена, используются в качестве растворителей, эмульгаторов, связывающих элементов, загустителей, структурообразующих компонентов [22]. Их общая химическая формула: НО - [СН₂СН₂О -] n. Как правило, ПЭГ синтезируют с молекулярными массами от 150 до 40000 Да. При молекулярных массах менее 400 Да ПЭГ находятся в жидкой фазе, а при больших - в порошкообразном состоянии. ПЭГ в растворе способен связываться с протеином различными способами, но существуют преобладающие, например, наиболее часто связывание с белком происходит в азот-содержащих местах или в областях структуры белков, содержащих имидазольную группу гистидина. Кроме того, химические связи ПЭГ с лизином и аргинином, например, препятствуют расщеплению модифицированных молекул трипсином. Одно из важнейших свойств ПЭГ - их высокая гидрофильность [22]. Высокое содержание атомов водорода в молекуле ПЭГ создает водородные связи с молекулами воды, что влечет за собой образование «водного облака» вокруг комплексов «ПЭГ - белок». За счет этого значительно повышается их гидродинамический радиус.

1.2 Сывороточные белки крови, их классификация и функции

Сыворотки крови состоят из сложной смеси белков с разной структурой и функциями [5]. Разделение на фракции белков методом электрофореза (ЭФ) основано на различной подвижности белков в разделяющей среде под действием электрического поля. Обычно методом ЭФ выделяют 5-6 основных стандартных фракций сывороточных белков: альбумины и 4-5 типов глобулинов (альфа-1 (2), бета-1 (2), и гамма-глобулины.

Фракция альфа-глобулинов включает в себя острофазные белки: альфа1-антитрипсин - ингибитор многих протеолитических ферментов - трипсина, химотрипсина, плазмина. Они обладают широким спектром защитных функций. К альфа-глобулинам также относятся транспортные белки (тироксинсвязывающий глобулин, транкортин, альфа - липопротеины). Их функции: связывание и транспорт кортизола, тироксина и обратный транспорт липидов, соответственно.

Фракция бета-глобулинов содержит трансферрин (белок-переносчик железа), гемопексин (связывает гем, что предотвращает его выведение почками и потерю железа), компоненты комплемента (участвующие в реакциях иммунитета), бета-липопротеины (участвуют в прямом транспорте холестерина и фосфолипидов) и часть иммуноглобулинов.

Фракция гамма-глобулинов состоит из иммуноглобулинов: IgG, IgA, IgM, IgE. Функционально эти макромолекулы представляющих собой антитела, обеспечивающие гуморальную иммунную защиту организма от инфекций и чужеродных веществ. Гамма-глобулины используются в качестве препаратов для профилактики и лечения, главным образом, инфекционных заболеваний. Препараты из них называют также иммуноглобулинами. Гамма-глобулины оказывают губительное действие на вирусы, бактерии, спирохеты и простейшие. Этим определяется их важная роль в предупреждении и лечении ряда инфекционных заболеваний. При введении гамма-глобулинов искусственно создается состояние так называемого пассивного иммунитета. Обычно их получают из крови людей, переболевших определенным заболеванием, или из крови животных, которым специально вводили соответствующие вакцины. Как правило, гамма-глобулины образуются (синтезируются) на второй неделе после начала иммунизации или болезни.

При многих заболеваниях встречается нарушение «нормального» соотношения концентраций фракций белков плазмы крови (диспротеинемии). Диспротеинемии при наблюдении в динамике могут характеризовать стадию заболевания, его длительность, а также эффективность проводимых лечебных мероприятий.

1.3 Общие и модифицированные ЛП

Известно, что поступление и вывод из организма липидов осуществляется с участием липопротеинов (ЛП) крови - сложных белков, транспортирующих липиды к органам тела и от них в печень [4-6]. В настоящее время огромен интерес к изучению структуры и функции ЛП крови, а также к их роли в развитии ряда патологических состояний (дислипопротеинемий (ДЛП)), таких, как инфаркты, инсульты, артериальная гипертензия, диабет и многих других. Сегодня ЛП привлекают внимание ученых и медиков-практиков и как транспортная форма, которая осуществляет перенос не только липидов, но и витаминов, гормонов, различных ксенобиотиков [1-6].

Липопротеины - это очень гетерогенный класс соединений [4-6]. Различают 4 основных фракции ЛП крови, отличающиеся друг от друга соотношением белкового и липидных компонентов, средней плотностью и размером частиц: хиломикроны (ХМ), липопротеины очень низкой (ЛПОНП), низкой (ЛПНП) и высокой плотности (ЛПВП). Сывороточные липопротеины крови представляют собой компактные мицеллообразные структуры - комплексы с гидрофобным ядром из триглицеридов (ТГ) и этирифицированного холестерина (ЭХС) и с гидрофильной оболочкой из аполипопротеинов (апол-белки), фосфолипидов (ФЛ) и свободного (неэтирифицированного) холестерина (НЭХС) [4, 20]. Причем гидрофильная оболочка у ЛП всех классов имеет практически одинаковую толщину, близкую к 22 А, а размеры гидрофобного ядра варьируют в широких пределах [16-20]. Также известно, что липопротеины крови имеют строение, сходное с жидкими кристаллами, но при этом образующие их компоненты (БК, ТГ, ФЛ, ЭХС и НЭХС) связаны друг с другом нековалентно [6].

Модифицированные ЛП образуются в организме из нормально синтезированных и секретированных в кровь ЛП. Причиной модификации обычно является появление свободных радикалов, продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), а также некоторых метаболитов [3, 4]. Таким образом, к модифицорованным in vivo ЛП относятся перекисно-модифицированные и гликозилированные ЛП, аутоиммунные комплексы ЛП-антитело и агрегированные ЛП.

В настоящее время для анализа ЛП крови и диагностики нарушений липидного обмена применяют ряд физических и химических методов (ультрацентрифугирование, ЭФ и др.) [6]. В работах [16-20] был предложен новый подход к анализу фракционно-компонентного состава сывороточных ЛП крови с использованием метода МУРР. Кроме того, авторами была предложена единая математическая модель строения частиц сывороточных ЛП крови человека. Полученные в данных работах [19, 20] результаты свидетельствуют об эффективности применения метода МУРР для определения фракционно-компонентного состава общих и модифицированных ЛП непосредственно в цельных плазмах или сыворотках крови. Новая методика анализа ЛП в сыворотках крови отличается экспрессностью (0.5 ч на анализ), простотой подготовки образцов для анализов, использованием всего одного вспомогательного реактива (вещества-контрастера типа сахарозы), высокой точностью и разрешением вплоть до отдельных субфракций.

Аутоиммунные комплексы липопротеид-антитело

О наличии циркулирующих в крови иммунных комплексов, содержащих ЛП в качестве антигена, известно давно, однако долгое время оставалось неясным, имеют ли эти комплексы какое-либо отношение к атеросклерозу [3]. Образование циркулирующих в крови иммунных комплексов (ЦИК) «модифицированный ЛП - антитело» можно рассматривать как проявление защитной реакции организма, направленной на быстрое удаление из кровотока модифицированных (т.е. ставших чужеродными) ЛП. Это происходит путем активного захвата иммунных комплексов купферовскими клетками печени [3, 4].

Перекисно-модифицированные ЛП

Из всех классов ЛП перекисное окисление липидов (ПОЛ) затрагивает в первую очередь именно ЛПНП [3, 4]. Легкая подверженность ЛПНП пероксидации, очевидно, объясняется особенностями их липидного состава. Основными антиоксидантами этих ЛП являются: б-токоферол, г-токоферол, в-каротин и убихонон-10. ПОЛ в частицах ЛПНП - сложный многоступенчатый и еще не до конца выясненный процесс. Постоянно возникающие в живом организме свободные радикалы O₂^-, HO₂^* и НО^* генерируют образование гидроперекисей ненасыщенных ЖК, входящих в состав ФЛ, ТГ и ЭХС липопротеидов низкой плотности. В окисленных ЛПНП обнаружены в повышенных количествах 7-кето-холестерин, 7б- и 7 в-гидроксихолестерины. Перекисной модификации подвергаются также подфракции ЛПОНП, что, несомненно, повышает их атерогенность [4].

Отдельно следует сказать о перекисной модификации фракции ЛПВП. В опытах in vitro изолированные ЛПВП также подвергаются окислению, причем при равных концентрациях холестерина в пробе степень окисления ЛПВП и ЛПНП оказалась практически одинаковой. В частицах ЛПВП окислению подвергаются ненасыщенные ЖК фосфолипидов и эфиров холестерина, а также стероидное ядро и боковая цепь ХС. Кроме того, образование продуктов ПОЛ часто ведет к повреждению апобелков ЛПВП. В первую очередь повреждаются остатки триптофана, а затем уже тирозина и лизина. Это ведет к изменению функциональных свойств ЛПВП и, прежде всего, к ослаблению холестерин-акцепторной функции.

Гликозилированно-модифицированные ЛП

Гликозилирование - весьма распространенный тип модификации белков, в ходе которой происходит неферментативное ковалентное присоединение моносахаридов (преимущественно глюкозы) к аминогруппам белков [5]. Гликозилированию подвергаются все классы ЛП, но по объему наибольшая доля падает на ЛПНП и ЛПВП. Гликозилирование ЛП имеет место и в норме, но особенно активно оно протекает у лиц с повышенным уровнем глюкозы в крови, в частности у диабетиков. Так, если в норме у человека гликозилировано 1,3-2% лизиновых остатков ЛПНП, то у диабетиков эта величина возрастает в 2-3 раза.

Следует особо отметить еще один важный фактор: в ответ на появление в крови гликозилированных ЛП может развиться аутоиммунный ответ с образованием антител на эти ЛП. Было показано [6], что если кроличьи ЛПНП подвергнуть гликозилированию in vitro (блокирование глюкозой 12% e-аминогрупп) и затем вернуть их тому же кролику внутривенно, то в ответ на введение аутологичных гликозилированных ЛПНП образуются антитела.

1.4 Методы рентгеновской и оптической дифракции

Рассеяние плоской волны веществом

Пусть плоская монохроматическая волна A₀exp(ik₀r) падает на рассеивающий центр О, который под действием излучения становится источником сферической волны (рис. 1). Тогда в точке наблюдения L, результирующая волна имеет вид [14].

(2.1)

Здесь k₀ и k - волновые векторы падающей и рассеянной волн, |k₀| = |k|= 2р/л, л - длина волны, А₀ и А₀b/|r| - амплитуды этих волн, r - вектор, соединяющий точку L с рассеивающим центром в точке О. Амплитуда рассеянной сферической волны равна произведению амплитуды падающей волны и коэффициента b/|r|, где значение b определяется видом падающего излучения и природой рассеивающего центра, находящегося в точке О. Чем сильнее взаимодействие падающей волны с центром О, тем больше коэффициент b. Он имеет размерность длины и носит название длины рассеяния, или амплитуды рассеяния точечного центра. Рассеяние плоской монохроматической волны на реальных объектах, состоящих из совокупности ядер и электронов, можно рассматривать как точечные рассеивающие центры.

Рис. 1. Рассеяние плоской волны точечным центром (а) и ограниченной областью, задаваемой потенциалом ц(r') (б)

Рассеивающую способность произвольного скопления ядер, электронов при облучении их рентгеновскими лучами или светом можно характеризовать рассеивающей плотностью ц(r) - скалярным полем, заданным в ограниченной области пространства. Для рентгеновского рассеяния ц(r) - плотность распределения заряда, в случае света - это оптическая плотность вещества, зависящая от показателя преломления. Взаимодействие волны (рентгеновского излучения или света) с веществом можно представить себе таким образом, что волна электромагнитного излучения взаимодействует со всеми ядрами, электронами и валентными оболочками, которые становятся источниками сферических волн. Суперпозиция этих волн представляет собой первое приближение к реальному рассеянию. Можно показать, что функция

(2.2)

является амплитудой упругого рассеяния на скалярном поле ц(r). Это - так называемое первое борновское приближение, иными словами - приближение однократного рассеяния.

Выражение (2.2) представляет собой интеграл Фурье, т.е. разложение функции f(h) по базисной системе ортогональных функций - экспоненциальных функций exp(ihr). Решение обратной задачи - нахождения ц(r) при известной функции f(h) - дается обратным преобразованием [14]

(2.3)

Таким образом, преобразования Фурье лежат в основе расчетов амплитуд рассеяния по заданной системе рассеивающих центров и плотности поля рассеяния по заданной амплитуде рассеяния, если, разумеется, выполнены условия первого борновского приближения. При определении атомной и молекулярной структуры вещества стараются всегда так поставить эксперимент, чтобы это приближение (и тем самым взаимные интегральные фурье-преобразования (2.2) и (2.3) для амплитуды и плотности рассеяния) выполнялось. Экспериментально определяется не сама амплитуда рассеяния, а интенсивность I(h), пропорциональная квадрату амплитуды рассеяния:

 (2.4)

Щ - телесный угол). Функция I(s) называется интенсивностью рассеяния (название, принятое в рентгеноструктурном анализе и в светорассеянии). Видно, что размерность этой функции - квадрат длины. Важной характеристикой объекта является полная интенсивность (или полное сечение) рассеяния, которая дается интегрированием (2.4) по всем углам:

(2.5)

Главной задачей структурного анализа вещества является восстановление распределения рассеивающей плотности ц(r) по измеренной функции I(h) [14, 15].

Формула Гинье. Угловое разрешение

С точностью до h⁴ имеем разложение интенсивности I(h) в близи точки h = 0 [14, 15]:

(2.6)

Выражение в скобках в правой части (2.6) можно рассматривать как первые два члена разложения в ряд Маклорена функции ехр(-h²R²_g/3). Поэтому с точностью до членов, пропорциональных h⁴, для начальной части кривой рассеяния можно записать

(2.7)

Это - так называемая формула Гинье, выведенная им еще в 1939 г. [14]. Для установления связи параметров I(0) и R_g со строением частицы подставим разложение:

sin(hr)/hr = 1 - h²r²/6 + h⁴r⁴/120 - h⁶r⁶/5040 +…

в формулу Дебая [14]:

Поместив начало координат в центре массы частицы, можно получить выражение:

.

Это - известное выражение для радиуса инерции частицы относительно ее центра массы.

Таким образом, начальная часть кривой рассеяния вне зависимости от конкретного строения частицы описывается с помощью двух параметров: I(0), который характеризует общее количество рассеивающей материи, и R_g, который несет информацию о ее распределении относительно центра массы частицы [14, 15].

Цель дифракционного эксперимента - это измерение интенсивности рассеяния I(h) при определенных величинах модуля вектора рассеяния h = 4 • р • n • (sin и)/л, где n - показатель преломления окружающей частицу среды [14, 15]. Для исследования структуры частиц или вообще каких-либо неоднородностей плотности определенного масштаба нужно иметь возможность вести измерения рассеянного излучения в определенном интервале значений шкалы h, А^-1. Для дисперсных систем с более крупными размерами частиц надо использовать меньшие значения h и наоборот. Поэтому измерения рассеянного излучения необходимо проводить при таких углах рассеяния 2и, при которых реально используемые длины волн (л) излучения не могут существенно превышать межплоскостные расстояния: для рентгеновского излучения это 1 ч 2 А [14].

Формирование весьма узкого пучка первичного излучения, падающего на образец, достигается коллимационной системой первичного монохроматического пучка (рис. 2).

Pиc. 2. Схема формирования первичного и рассеянного излучения при малых углах рассеяния в прямом (а) и обратном (б) пространствах: 1 - источник излучения; 2, 3, 4 - круглые отверстия коллиматора; 5 - образец; 6 - плоскость приемника излучения

Система двух круговых диафрагм малого размера, разнесенных на большое расстояние (по сравнению с размером отверстий), позволяет приблизиться к условиям плоской волны. Величина проекции первичного пучка в плоскости приемника, а в сочетании с выбранным расстоянием от образца до детектора и тот наименьший угол 2и_min (соответственно h_min), начиная с которого ведутся измерения интенсивности рассеянного излучения, и определяют разрешение конкретной коллимационной системы. Таким образом, верхний предел размеров неоднородностей, которые могут быть исследованы на данных установках (дифрактометрах), определяется углом 2и_min, а нижний предел разрешения всегда соответствует величине 2и = 180^о [14, 15].

2. Описание экспериментов

2.1 Измерение рентгенограмм рассеяния от анализируемых образцов

Измерения малоугловых рентгенограмм проводили на дифрактометре фирмы Siemens (Германия) методом пошагового сканирования с использованием гониометра и рентгеновского сцинтилляционного детектора [14]. Малоугловые рентгенограммы измеряли в угловом диапазоне: h = 0.013 - 0.22 А^-1, где h = 4 • р • sin(И)/л; 2И - угол рассеяния. Для измерения рентгеновского рассеяния использовалась кювета из кварцевого капилляра диаметром 0.65 мм и с толщиной стенок 0.01 мм, установленная в металлическую оправу. Длина волны используемого излучения л = 1.54 А, температура образцов при измерении рентгенограмм 20^оС. Непосредственное измерение рентгенограмм МУРР проведено в.н.с. ГНЦ ВБ «Вектор» Тузиковым Ф.В., имеющим соответствующие допуски работы с рентгеновским оборудованием. В рентгенограммы вносились поправки на фоновое рассеяние, поглощение, коллимацию, проводилось сглаживание. Первичная математическая обработка экспериментальных данных МУРР и вычисление функций распределения сферических частиц по размерам выполнялись на ЭВМ PC по алгоритмам, описанным в [14], а также с использованием процедур оптимизации.

На рис. 3 приведена общая схема дифрактометров, в частности, малоуглового дифрактометра.



Рис. 3. Общая схема дифрактометров. 1 - источник излучения (рентгеновская трубка, лазерный источник) с коллиматором; 2 - анализируемый образец; 3 - падающий пучок излучения; 4 - рассеянное рентгеновское или световое излучение, вызванное образцом 2; 5 - приемная щель; 6 - рентгеновский или световой детектор (приёмник рассеянного излучения)

Чтобы исключить рассеяние рентгеновских лучей другими (кроме ЛП) белками крови, в анализируемые образцы плазмы предварительно вводили нейтральное (для структуры биополимеров) рентгеноконтрастное вещество - NaNO₃, создавая плотность, равную средней плотности гидратированных белков. Плотность растворителей в образцах обеспечивали с помощью формулы [16-20]: m = V ? (с₀ - с_с) ? с_к/(с_к - с₀), где V, с₀ - объем и требуемая конечная плотность растворителя в образце (в сыворотке, плазме и контрольном буфере); с_с - исходная плотность жидкого образца; m, с_к - масса и плотность используемого сухого вещества-контрастера. Плотность растворителей контролировали пикнометрически. В сыворотках крови учитывали их разбавление за счет объема вещества сухого контрастера и вводили соответствующие поправки на концентрацию.

2.2 Измерение индикатрисс светорассеяния

Прибор для измерения светорассеяния от анализируемых образцов (световой дифрактометр) состоял из одного фотодетектора и 14 лазерных монохроматических источников, установленных по внутреннему периметру камеры светорассеяния. В центр камеры помещали образец, а управление установкой и получение значений интенсивности производили при помощи компьютера. При этом поочередно включались лазерные источники и рассеянное излучение попадало в фотоприемник (детектор), после чего сигнал с приемника поступал на фотоэлектронный умножитель, откуда через аналоговый цифровой преобразователь передавался на компьютер. Индикатриссы светорассеяния измеряли в угловом диапазоне 2И = 33,75 ч 67,5⁰ (h = 0.0011 ч 0.0022 А^-1), где h = 4 • р • n ? sin(И)/л; n - показатель преломления буферной смеси (~1,35). Длина волны используемого светового излучения л = 4300 А, температура образцов при измерении индикатрисс 20⁰С. В индикатриссы вносили поправки на фоновое рассеяние и поглощение излучения образцом.

Калибровку прибора проводили для контроля влияния факторов, влияющих на точность измерений эффектов светорассеяния (состояние чистоты кюветы, аппаратные искажения и помехи). Для этого регулярно измерялись индикатриссы рассеяния (зависимости интенсивности рассеяния от угла) для стандартного образца (Daw Latex, Sigma, полистерин, диаметр частиц 2R = 0,234 мкм). Известно, что радиус инерции (Rg) и радиус (R) для однородной сферы связаны, как [14].

Для всех полученных в работе экспериментальных данных был проведен математический и статистический анализ. Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статистики с применением t-критерия Стьюдента для средних арифметических (результаты считали достоверными при Р < 0,05).

2.3 Титрование сывороток крови полиэтиленгликолями

Для титрования и анализа модифицированных ЛП методом МУРР предварительно в сыворотки и плазмы крови добавляли растворы ПЭГ до необходимой концентрации, после чего эти смеси инкубировали при 8^оС в течение 18 ч [1, 2]. Осадки отделяли центрифугированием (центрифуга Т-51, Германия) при 6000 об/мин в течение 30 мин. Для растворения осажденных иммунных комплексов к осадку добавляли физиологический раствор (pH 7,4) в объеме исходной сыворотки [3]. Окончательную диссоциацию иммунных комплексов, включающих и модифицированные ЛП, проводили путем добавления сухого NaNO₃, используемого в качестве контрастера.

При титровании сывороток крови ПЭГ методом светорассеяния пластмассовую или стеклянную цилиндрическую кювету заполняли буферной смесью (физиологический раствор, 750 мкл, pH 7,4). Далее добавляли 100 мкл сыворотки и тщательно перемешивали, после чего производили титрование растворами ПЭГ по 5 или 10 мкл вплоть до достижения запланированных конечных концентраций. При каждой концентрации ПЭГ производили измерение интенсивностей рассеянного света (по четырем точкам углов рассеяния). Из полученных данных с использованием специальной программы вычислялись средние значения радиусов инерции (Rg) образованных комплексов «ПЭГ - белки», а также значения интенсивностей светорассеяния в нулевом угле (I(0)) [14, 15].

3. Результаты

3.1 Экспериментальные данные по светорассеянию

На рис. 4 приведена индикатрисса светорассеяния от стандартного образца в координатах Гинье (ln I(h), h²). Видно, что точки индикатриссы рассеяния хорошо соответствуют линейному графику и высокой монодисперсности частиц латекса. Значение радиуса инерции (Rg = 912 ± 15 А), вычисленное из наклона этого графика оказалось близко к ожидаемому (Rg = 906 А) для данного стандартного образца (частицы стандартизованного латекса - однородные сферы).

Для изучения особенностей взаимодействия различных ПЭГ с белками сывороток крови нами были выбраны ПЭГ с молекулярными массами от 1000 до 20000 Да. Были приготовлены растворы ПЭГ в физрастворе с максимальными концентрациями (с учетом их растворимости). Для удобства экспериментов необходимо было привести все ПЭГ к одной объемной концентрации. Для этого измеряли индикатриссы светорассеяния от каждого из приготовленных исходных растворов ПЭГ. Как и следовало ожидать, для частиц в растворе с молекулярными массами от 1 до 20 кДа индикатриссы светорассеяния практически не отличались от констант (из-за соотношения длины волны света (4300 А) и размера молекул ПЭГ (20-100 А)). Поскольку известно, что , где С, М - концентрация и средняя молекулярная масса рассеивающих частиц, соответственно, то это позволяет определять необходимые коэффициенты разведения [15]. На рис. 5 приведены графические зависимости экспериментальных интенсивностей светорассеяния в нулевой угол (I(0)) до и после приведения их к одной концентрации.



Рис. 4. График Гинье для стандартного образца (Daw Latex, Sigma, полистерин, диаметр частиц 2R = 0,234 мкм). .

Рис. 5. Зависимость интенсивностей светорассеяния в нулевом угле (I(0)) для различных ПЭГ в исходном (черные точки) и приведенном состоянии концентраций (светлые кружочки).

(кроме ПЭГ-20000, у которого предельная концентрация разведения оказалась существенно ниже, чем у других ПЭГ). Таким образом, все концентрации используемых ПЭГ были приведены к концентрации 250 мг/мл, что соответствует примерно 25% объемной и весовой концентрации.

Таблица 1. Результаты титрования объединенной сыворотки ПЭГ-6000. Объем исходного буфера V = 750 мкл (метод светорассеяния)

Угол светорассея- ния 2и, град	Объемы компонентов смесей, мкл
	Сыворотка	ПЭГ-6000
	+100	+5	+10	+15	+20	+25	+30	+35	+40	+45
	Интенсивности светорассеяния, имп/сек
33,75	10841	14712	16972	19996	21939	25727	30153	37964	42101	65158
45,00	9300	12149	14126	16438	17703	20830	24579	29853	43190	53074
56,25	7182	7768	8050	8644	8776	9840	10928	13082	15125	25112
67,50	6668	7064	7228	7645	7670	8469	9366	10832	14455	20243
Средние значения параметров
I(0), имп/с	12812	19336	23837	29466	33523	40619	49267	63577	73792	106617
Rg, А	863	1011	1099	1168	1221	1257	1293	1303	1288	1285

Рис. 6. Графики Гинье для объединенной сыворотки, титруемой ПЭГ-6000 (метод светорассеяния). Нижние графики соответствуют меньшим концентрациям ПЭГ-6000, а верхние - большим, соответственно



Рис. 7. Значения интенсивностей светорассеяния (I(0)) от комплексов «ПЭГ-белки», образующихся в объединенной сыворотке крови при взаимодействии сывороточных белков с различными ПЭГ

Рис. 8. Средние значения радиусов инерции (Rg) комплексов «ПЭГ-белки», образующихся в объединенной сыворотке крови при взаимодействии сывороточных белков с ПЭГ-4000, ПЭГ-6000 и ПЭГ-8000



Рис. 9. Значения параметра 10¹⁴*I(0)/Rg⁶, пропорционального среднему физическому титру комплексов «ПЭГ-белки», образующихся в объединенной сыворотке крови при взаимодействии сывороточных белков с ПЭГ различной молекулярной массы

На рис. 7-8 приведены сводные графики изменения средних значений параметров I(0) и Rg при титровании объединенной сыворотки (разведение в буфере 1:16) различными ПЭГ.

Для получения дополнительной информации о молекулярных механизмах взаимодействия ПЭГ с сывороточными белками на рис. 9 приведены графики рассчитанных значений параметра 10¹⁴*I(0)/Rg⁶, пропорционального среднему значению физического титра комплексов «ПЭГ-белки» в смесях сыворотки крови с ПЭГ.

3.2 Анализ общих и модифицированных ЛП методом МУРР

Далее были исследованы реакции взаимодействия сывороточных белков с различными ПЭГ при концентрациях, при которых достигается эффект осаждения. Этот эффект и будет использоваться нами далее для препаративного отделения модифицированных ЛП от общих.

Для анализа общих и модифицированных ЛП методом МУРР также использовали объединенную сыворотку от 11-ти пациентов с нормолипемией. Подготовку образцов к измерениям, измерения рентгенограмм МУРР и математическую обработку данных проводили, как описано в работах [16-21]. В табл. 2 приведены результаты анализа по определению концентраций фракций и подфракций общих сывороточных ЛП в объединенной сыворотке крови. Из сравнения со статистическими данными нормолипемии

Рис. 10. Зависимость концентраций основных фракций модифицированных ЛП в преципитатах объединенной сыворотки (n = 11) от концентрации ПЭГ-6000

Таблица 2. Результаты анализа по определению спектра общих сывороточных ЛП в объединенной сыворотке крови пациентов с нормолипемией (n = 11). Средний возраст пациентов 38 лет

Фракции и подфракции ЛП	Концентрации ЛП (по холестерину)
	Результаты анализа	Нормолипемия, n = 120 [13]
	мг/дл	мМоль/л	мг/дл	мМоль/л
ЛПВП3	19,6	0,51	10 25	0,25 0,65
ЛПВП2	26,5	0,69	30 50	0,75 1,30
ЛПВП (фракция)	46,1	1,19	40 75	1,00 1,95
ЛПНП1-3	99,9	2,59	60 80	1,55 2,10
ЛППП	22,0	0,57	20 30	0,50 0,75
ЛПНП (фракция)	122,0	3,16	80 110	2,10 2,85
ЛПОНП3-5	5,8	0,15	10 15	0,25 0,40
ЛПОНП1-2	1,2	0,03	1 5	0,02 0,13
ЛПОНП (фракция)	7,0	0,18	10 20	0,25 0,50
Общие концентрации липидов
Общ ХС	175,0	4,53	150 190	3,80 4,95
Общ ТГ	132,1	1,49	90 150	1,02 1,70

Примечание: ЛПВП₃, ЛПВП₂ - подфракции ЛП высокой плотности (ЛПВП); ЛПНП_1-3, ЛППП - подфракции ЛП низкой плотности (ЛПНП); ЛПОНП_3-5, ЛПОНП_1-2 - подфракции ЛП очень низкой плотности (ЛПОНП).

ЛП ЛП	ЛПВП3	ЛПВП2	ЛПВП	ЛПНП1-3	ЛППП	ЛПНП	ЛПОНП2	ЛПОНП1	ЛПОНП	ЛП(Все)
Общ. ЛП, мг/дл	19,0	27,1	46,1	99,9	22,0	122,0	5,8	1,2	7,0	175,1
Мод. ЛП, мг/дл	7,4	12,9	20,3	75,7	14,8	90,5	5,3	0,9	6,2	117,0
Ст. мод., %	38,9	47,6	44,0	75,8	67,3	74,2	91,4	75,0	88,6	66,8

Таблица 3. Сравнительные данные о концентрациях фракций модифицированных ЛП в объединенной сыворотке после преципитации с различными ПЭГами. Анализ методом МУРР

Полиэтиленгликоли (ПЭГ)	ЛПВП, мг/дл	ЛПНП, мг/дл	ЛПОНП, мг/дл	Общ. ХС, мг/дл
	Концентрации ЛП по холестерину
ПЭГ 1000 (42%)	19.6 ± 0.9	69.9 ± 2.2	1.7 ± 0.1	91.2 ± 1.6
ПЭГ 4000 (42%)	14.2 ± 0.9	91.2 ± 2.5	7.9 ± 0.7	119.3 ± 2.8
ПЭГ 6000 (8%)	20.3 ± 1.1	90.5 ± 2.0	7.2 ± 0.8	118.0 ± 2.7
ПЭГ 8000 (16%)	20.5 ± 1.1	85.6 ± 2.9	7.6 ± 0.6	113.7 ± 2.5
Степень модификации ЛП (по преципитации с ПЭГ-6000), %
ПЭГ 6000	44.0	74.1	100	67.4

Видно, что полученные результаты действительно близки к нормальным значениям концентраций ЛП.

В табл. 3 и на рис. 10 приведены конечные результаты титрования методом МУРР цельной объединенной сыворотки крови различными ПЭГ при концентрациях, при которых термодинамическое равновесие смещается в сторону образующихся комплексов и происходит их осаждение (преципитация).

Было важно определить диапазоны концентраций ПЭГ, при которых происходит полная преципитация всех основных фракций модифицированных ЛП.

4. Обсуждение результатов

Как видно из рис. 7-8, значения параметров I(0) и размеров (Rg) образующихся комплексов «ПЭГ-белки» в смесях сначала почти линейно увеличиваются при повышении концентрации ПЭГ до 10 мг/мл (1%), а затем рост размеров комплексов замедляется и почти полностью прекращается, а значения I(0), наоборот, начинает резко возрастать. Также следует отметить, что полученные в экспериментах кривые титрования объединенной сыворотки различными ПЭГ заметно отличаются между собой.

Для получения информации о молекулярных механизмах взаимодействия ПЭГ с сывороточными белками использовали экспериментальные данные СР, приведенные на рис. 7-8, и рассчитанные из них значения параметра 10¹⁴*I(0)/Rg⁶, пропорционального среднему значению физического титра комплексов «ПЭГ-белки» в смесях сыворотки крови с ПЭГ (см. рис. 9). Действительно, поскольку I(0) ~ n · M² ~ n · V², где M и V - средние молекулярные массы и объемы образующихся комплексов, то отношение I(0)/Rg⁶ с точностью до калибровочного коэффициента характеризует значение физического титра комплексов «ПЭГ-белки» в смесях. Из рис. 9 видно, что после первых же порций ПЭГ в смесях титр резко падает (это связано с образованием более крупных комплексов из отдельных сывороточных белков и аутоиммунных комплексов). Далее процесс падения замедляется, а при концентрациях 10 мг/мл и выше начинается резкое увеличение титра комплексов но, как видно из рис. 10, размер комплексов при этом остается почти неизменным. Следует отметить, что в отличие от графиков рис. 7 и 8, графики физического титра комплексов «ПЭГ-белки» на рис. 9 почти совпадают между собой. Поскольку представленные на рис. 7-9 экспериментальные данные соответствуют допреципитационным (равновесным) стадиям взаимодействия сыворочных белков с ПЭГ, то все они свидетельствуют о сходстве их молекулярных механизмов взаимодействия.

Как видно из рис. 10, при концентрациях ПЭГ-6000 в диапазоне 6 ч 8% (60 ч 80 мг/мл) происходит полная преципитация фракций модифицированных ЛП в нативной объединенной сыворотке крови и при дальнейшем увеличении концентрации ПЭГ-6000 эффект преципитации остается неизменным. А вот для других ПЭГ, а именно, ПЭГ-1000, 4000 и 8000 преципитация фракций модифицированных ЛП происходит при значительно более высоких концентрациях соответствующих ПЭГ и при том не полная (см. табл. 3). Для ПЭГ-20000 эксперименты с применением методов СР и МУРР вообще не удалось провести из-за сильной агрегации этого ПЭГ с сывороточными белками уже при самых малых концентрациях ПЭГ, в результате чего также резко повышается вязкость растворов. Поэтому применение именно ПЭГ-6000 для целей препаративного выделения и анализа модифицированных ЛП вполне обосновано [1-3]. Кроме того, подтвердились данные, что концентрация ПЭГ-6000, при которой происходит полное отделение модифицированных ЛП от немодифицированных, равна 6-8% [1, 2].

В табл. 3 приведены значения степени модификации фракций ЛП используемой в работе объединенной сыворотки пациентов с нормолипемией. Степень модификации наименьшей оказалось у фракции ЛПВП (44%), а наибольшей - у ЛПОНП (~100%) и в целом около 68% ЛП оказались «чужеродными» ЛП. Такой результат не соответствует ранее полученным данным [3, 4, 21], где только около 40% ЛП модифицированы у пациентов с нормолипемией. Связано это, по-видимому, с тем, что в данной работе использовали объединенную сыворотку, в которой образовалось много дополнительных комплексов ЦИК «ЛП - антитело», которые также преципитировали с ПЭГ и привели к завышенным значениям степени модификации.

Из полученных в работе результатов видно, что, как и отмечалось в работах [1, 2] при различных концентрациях ПЭГ происходит образование различающихся по молекулярной массе и размерам иммунных комплексов. Так, например, низкие концентрации ПЭГ (< 10 мг/мл (1%)) приводят к образованию комплексов крупных размеров, 1-2% ПЭГ осаждают наиболее распространенные «промежуточные» комплексы средних размеров, а более высокие концентрации (> 20 мг/мл) вызывают, по-видимому, преципитацию более низкомолекулярных белковых фракций.

Следует подчеркнуть, что методика детального анализа фракционно-компонентного состава сывороточных ЛП на основе метода МУРР появилась совсем недавно [19, 20]. Поэтому проведение данного исследования является важным этапом дальнейшего развития новых высокоинформативных методов анализа сывороточных ЛП крови, в частности, модифицированных ЛП, для научной и практической медицины.

Выводы

1. Успешное изучение основ теории и практики использования двух физических (дифракционных) методов анализа (МУРР и СР) позволило применить эти методы для анализа структуры и фракционного состава биологических макромолекул (суммарных сывороточных белков крови, общих и модифицированных ЛП), а также их комплексов.

2. В результате исследования эффектов равновесных молекулярных взаимодействий суммарных белков, содержащихся в сыворотках крови, с различными полиэтиленгликолями (ПЭГ-1000, ПЭГ-4000, ПЭГ-6000, ПЭГ-8000, ПЭГ-20000) в допреципитационном диапазоне концентраций полиэтиленгликолей (0 ч 1,5%) установлено, что механизмы равновесного комплексообразования ПЭГ-4000, ПЭГ-6000 и ПЭГ-8000 с сывороточными белками очень близки и не зависят от молекулярной массы полиэтиленгликолей.

3. Изучение молекулярных взаимодействий белков сывороток крови с различными полиэтиленгликолями (ПЭГ-1000, ПЭГ-4000, ПЭГ-6000, ПЭГ-8000 и ПЭГ-20000) в преципитационном диапазоне концентраций полиэтиленгликолей 3 ч 11% позволило выбрать в качестве оптимального ПЭГ-6000 с концентрацией 6 ч 8% для препаративного выделения и анализа модифицированных ЛП.

4. Показано, что полиэтиленгликоли ПЭГ-4000 и ПЭГ-8000, хотя и дают близкие результаты, но не удовлетворяют методическим условиям: требуются высокие концентрации полиэтиленгликолей и происходит неполное отделение модифицированных от общих ЛП. Полиэтиленгликоли с молекулярными массами 1000 и 20000 Д из-за концентрационных и гидродинамических эффектов вообще не могут использоваться для целей препаративного выделения модифицированных ЛП.

Список литературы

1. Канская Н.В., Карпов Р.С. Способ определения модифицированных липопротеидов крови. А.С. №1720015А1. МКИ G01N 33/92. Приоритет от 25.10.89. Опубл. 15.03.92 г. Бюлл. №10.

2. Канская Н.В., Карпов Р.С. Способ выявления лиц с фактором риска ишемической болезни сердца. А.С. №1327007, МКИ G01N 33/564, Приоритет от 26.07.85, Опубл. 30.07.87 г., Бюлл. №28.

3. Карпов Р.С., Канская Н.В., Осипов С.Г. Роль иммунной системы в развитии гиперлипопротеидемий. Томск: Изд-во Томского Университета, 1990, 165.

4. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения. Руководство для врачей. М., Харьков, Минск: Изд-во «Питер», 1999, 505.

5. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. М.: Мир, 1993, 1, 225-298.

6. Холодова Ю.Д., Чаяло П.П. Липопротеины крови. Киев: Наукова думка, 1990, 208.

7. Tardieu A., Mateu L., Sardet C., Weiss B., Luzzati V., Aggerbeck L., Scanu A.M. Structure of human serum lipoproteins in solution. //J. Mol. Biol. 1976. V.101. P.129-153.

8. Laggner P., Muller K.W. The structure of serum lipoproteins as analysed by x-ray small-angle scattering. //Quarterly Rev. of Biophys., 1978. V.11. №3. P.371-425.

9. Mills G.L., Lane P.A., Weech P.K. Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. A guidebook to lipoprotein technique. //Elsevier. 1984. V.14. 512p.

10. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Липопротеиды, дислипопротеинемии и атеросклероз. Л: Медицина. 1984. С. 1-168.

11. Gotto A.M., Pownal H.J., Havel R.J. Plasma lipoproteins. //Methods in Enzimology. 1986. V.128. Part A.P.3-122.

12. Bellamy M.F., Nealis A.S., Aitken J.W., Bruckdorfer K.R., Perkins S.J. Structural changes in oxidised low-density lipoproteins and of the effect of the anti-atherosclerotic drug probucol observed by synchrotron X-ray and neutron solution scattering. //Eur.J. Biochem. 1989. V.183. P.321-329.

13. Shen B., Scanu A.M., Kezdy F.J. Structure of human serum lipoproteins inferred from compositional analysis. //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1977. V.74. №3. P.837-841.

14. Cвергун Д.И., Фейгин Л.А. Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние. М.: Наука, 1986, 280 с.

15. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия. М.: Мир, 1984. Т.2. С. 309-429.

16. Тузиков Ф.В., Тузикова Н.А., Мистюрин Ю.Н. Способ анализа липопротеидов в плазме крови методом малоуглового рентгеновского рассеяния. Патент РФ №2099693, МКИ G01N 33/53, Приоритет от 22.12.93 г., Опубл. 20.12.97 г., Бюлл. №35.

17. Тузиков Ф.В., Тузикова Н.А., Панин Л.Е., Никитин Ю.П., Крылова И.Н. Определение фракционного состава липопротеинов крови методом малоуглового рентгеновского рассеяния. Биологические мембраны, 1998, 15 (4), 421-433.

18. Тузиков Ф.В., Тузикова Н.А., Панин Л.Е., Никитин Ю.П. Новый метод диагностики нарушений липидного обмена. Вестник РАМН, 1998, 3, 42-47.

19. Тузиков Ф.В., Рагино Ю.И., Тузикова Н.А., Иванова М.В., Галимов Р.В., Никитин Ю.П. Определение фракционного и субфракционного составов липопротеинов крови методом малоуглового рентгеновского рассеяния. Сравнение с биохимическим методом. // Вопросы медицинской химии. 2002. Т.48. №1. С. 84-93.

20. Tuzikov F.V., Tuzikova N.A., Galimov R.V., Panin L.E., Nevinsky G.A. General model to describe the structure and dynamic balance between different human serum lipoproteins and its practical application. //Med. Sci. Monit. 2002. V.8 (6). №6. P.79-88.

21. Сизиков А.Э., Тузиков Ф.В., Тузикова Н.А., Галимов Р.В., Коненкова Л.П., Зонова Е.В., Королев М.А., Герцог О.А., Козлов В.А. Особенности нарушений липидного обмена у больных ревматоидным артритом. // Ревматология. 2004. (в печати).

22. http://www.invitro.ru/protein-fractions.htm «Белковые фракции».

Размещено на Allbest.ru