В экспериментах по биотестированию может быть иногда зарегистрирована стимуляция - положительная тест-реакция на воздействие токсикантов, содержащихся в природных объектах. Например, при подавлении токсикантами дыхательных ферментов у светящихся бактерий возникает усиление их свечения. Сложность интерпретации таких данных заключается в том, что эффект стимуляции может возникнуть и при исследовании вод определенного состава, например, при высоком содержании в них биогенных элементов могут увеличиться темпы роста водорослей.

Токсичность, устанавливаемая методами биотестирования, является интегральным показателем загрязнения природных сред. Как и все интегральные показатели, он имеет недостаток - не раскрывает загрязняющие вещества, присутствующие в пробе, поэтому результаты биотестирования не всегда совпадают с данными гидрохимического анализа. Это может объясняться очень многими причинами. Например, в исследуемой воде могут присутствовать загрязняющие вещества, которые невозможно определить используемыми методами или присутствие которых не предполагается и не измеряется [21].

Существует два основных метода биоиндикации: пассивный и активный.

Пассивная биоиндикация - исследование у свободноживущих организмов или их сообществ повреждений и отклонений от нормы, являющихся признаками неблагоприятного воздействия.

Активная индикация, или биотестирование - исследование последствий неблагоприятных воздействий в стандартных условиях на наиболее чувствительных к данному фактору организмах - тест-организмах. Тест-объект - организм, используемый при оценке токсичности химических веществ, природных и сточных вод, почв, донных отложений, кормов и др. Тест-объекты, по определению Л. П. Брагинского - «датчики» сигнальной информации о токсичности среды и заменители сложных химических анализов, позволяющие оперативно констатировать факт токсичности водной, независимо от того, обусловлена ли она наличием одного точно определяемого аналитически вещества или целого комплекса аналитически не определяемых веществ [23].

Различают:

1) Острые биотесты, выполняемые на различных тест-объектах по показателям выживаемости, длятся от нескольких минут до 24-96ч.

2) Краткосрочные хронические тесты с длительностью 7 суток, которые заканчиваются, как правило, после получения первого поколения тест-объектов.

3) Хронические тесты. Измеряются характеристики тест-объектов, охватывающие несколько поколений. Хроническая токсичность среды проявляется через некоторое время в виде нарушений жизненных функций организмов, плодовитости, продуктивности, хода развития и возникновения патологических состояний (токсикозов), уродств (мутаций) в потомстве, сокращения продолжительности жизни [24].

Наиболее распространенные биологические тест-объекты:

1.Микроорганизмы, вирусы (энтеробактерии, сальмонеллы, псевдомонады, дрожжи и др.).

2.Водоросли.

3.Простейшие и низшие животные (планктонные рачки).

4.Клеточные культуры и ранние зародыши экспериментальных животных при культивировании.

5. Водные и околоводные растения.

6. Водные насекомые и личинки.

7.Позвоночные животные (рыбы и др.).

8.Гнотобиотические системы и микрокосмы [24].

Микроорганизмы широко используются в различных методах тестирования. Так, использование и исследование микрофлоры, сопутствующей загрязнению природных сред определенными веществами, позволяет повысить чувствительность традиционных методов. Среди биоты микроорганизмы во многих случаях являются оптимальным индикатором, учитывая их повсеместное распространение, высокую численность, большой вклад в процессы обмена веществ, энергии биоценозов, а также быструю смену поколений [24].

Данные, полученные при испытании токсичности веществ на водорослях, дают информацию о концентрациях токсикантов, оказывающих стимулирующее или тормозящее действие на водные системы. Водоросли технически довольно легко выращивать в больших количествах в регулируемых условиях в аквариумах. Наиболее известный пример водорослей как индикаторов загрязнения - «цветение» водоемов, т. е. бурный рост цианобактерий и микроводорослей, как показатель эвтрофикации [24,38].

Растения-макрофитыспособны накапливать преимущественно растворенные в воде металлы и в течение продолжительного времени удерживать их в своем организме, по-разному в разных частях растения, что используется в биомониторинге. Изучая содержание тяжелых металлов в разных частях растения, а также в разновозрастных растениях, можно проследить изменение уровня загрязнения водной среды во времени (сезонные и годичные).

Основной критерий, по которому определяется состояние фитоиндикатора в лабораторных условиях, - уровень фотосинтеза. Активность фотосинтеза определяет жизнеспособность растений, их урожайность и хорошо отражает все изменения среды обитания. Но уровень активности фотосинтеза непосредственно трудно измерить, поэтому используются косвенные индикационные признаки - сухая биомасса, количество растворимых белков, активность отдельных ферментов, например, пероксидазы, цитохрома P450 и др. Наблюдается прямая корреляция между степенью влияния на экосистему и снижением активности фотосинтеза. В зеленых наземных частях растений снижаются сухая биомасса, концентрация растворимых белков и активность фотосинтетических ферментов. [24, 39].

На уровне популяции в качестве индикаторов используются и водные насекомые. Определяются такие индикационные признаки, как общая численность, количество видов, численность популяций, биомасса, трофические группы, экологические индексы. Эти группы хорошо отражают нарушение экосистем сменой своих видов. В нарушенных экосистемах большие специализированные виды заменяются космополитными видами [24].

Рыбы могут использоваться при определении острой и подострой токсичности. В водных экосистемах по чувствительности к облучению и его химическим аналогам на первом месте стоят рыбы, затем ракообразные и моллюски, за ними водоросли и бактерии. На другие химические вещества рыбы реагируют слабо по сравнению с планктоном и многими ракообразными, однако токсические воздействия на рыб оказываются более многообразными. Рыбы могут усваивать вредные вещества через кожу, жабры и желудок, поэтому перед проведением токсикологических опытов необходимо иметь предварительные данные о поведении веществ в водных системах, характере переноса в пищевых цепях, с тем чтобы выбрать подходящий для данных условий окружающей среды способ введения вещества в организм - парентеральный (через кожу), пероральный (через рот, желудок) или через воду (через жабры). Ключевыми данными для оценки биологической активности в сублетальной области являются изменения внешних и внутренних процессов жизнедеятельности рыб (изменения в ее органах и функциональные нарушения). Виды рыб для испытаний выбирают, исходя из критерия максимальной и минимальной чувствительности вида; в качестве модельных видов часто используют карпа (минимально чувствительный) и форель (максимально чувствительный), в лабораторныхтест-системах- аквариумных рыбок гуппи (Poecilia reticulata Peters) [24].

Все лабораторные модели гнотобиотических систем и микрокосмов имеют собственную динамику; тем самым их соответствие реальным природным условиям ограничено. Поэтому в качестве анализируемых параметров берут лишь такие, методы измерения которых достаточно просты, репрезентативны и чувствительны по отношению к загрязнениям [24].

Существуют различные виды биоиндикации: неспецифическая, специфическая. Если одна и та же реакция вызываются различными факторами, то говорят о неспецифической биоиндикации. Если же те или иные происходящие изменения можно связать только с одним фактором, то речь идет о специфической биоиндикации [12].

Также различают прямую и косвенную биоиндикацию. При прямой биоиндикации фактор среды действует непосредственно на биологический элемент; прикосвенной - наблюдаемые изменения у биоиндикатора происходят под влиянием других непосредственно затронутых элементов [24].

Биотестирование и биоиндикация могут проводиться на разных уровнях организации живых организмов: на молекулярном, клеточном, организменном, популяционном и биоценотическом [24].

В зависимости от времени развития биоиндикационных реакций выделяются различные типы чувствительности тест-организмов:

I тип - биоиндикатор проявляет быструю реакцию, продолжающуюся некоторое время, после чего перестает реагировать на загрязнение;

II тип - биоиндикатор в течение длительного времени линейно реагирует на воздействие возрастающей концентрации загрязнения;

III тип - после быстрой сильной реакции наблюдается ее затухание, сначала резкое, затем постепенное;

IV тип - под влиянием загрязнения реакция биоиндикатора постепенно становится все более интенсивной, но при достижении максимума, постепенно затухает;

V тип - реакция и типы неоднократно повторяются, возникает осцилляция биоиндикаторных параметров [24].

Чувствительные биоиндикаторы реагируют значительным отклонением текущего состояния от нормы. Уаккумулятивных биоиндикаторов результаты воздействий проявляются постепенно, без быстро проявляющихся нарушений. Пример последних - накопление тяжелых металлов растениями-аккумуляторами, двустворчатыми моллюсками и т.п. [24].

Использование различных видов рыб в качестве биоиндикаторов

Многочисленные публикации свидетельствуют об успешном использовании рыб как индикаторов нарушений "здоровья" экосистемы при токсичном загрязнении вод. Рыбы занимают верхний уровень в трофической системе водоемов. В условиях интенсивного загрязнения степень устойчивости организма рыб определяется способностью эффективно метаболизировать и выводить поступающие в организм токсиканты. Патологические изменения в их организме позволяют определить степень токсичности водной среды, оценить кумулятивные эффекты, а также сформировать представление о потенциальной опасности группы веществ, поступающих в водоем, и для человека. Изменения физиологических показателей рыб регистрируются численными значениями, которые возможно использовать при построении доза-эффектных зависимостей. Поэтому в ряде крупных международных проектов в оценках экологических последствий загрязнения вод предпочтение отдается исследованию рыб на уровне организма [25].

Существуют виды рыб, с помощью которых можно оценить степень загрязнения окружающей среды, осуществлять постоянный контроль ее качества и изменений. Например, зеркальный карп и золотая рыбка становятся беспокойными при наличии в воде стоков нефтяной и химической промышленности. Высокая чувствительность щуки к загрязнению делает ее надежным индикатором состояния питьевой воды. Индикаторами чистоты водоема могут служить подкаменщик сибирский и форель [26].

Учёные создают первых мутантов, которые будут служить человеку. Это генетически изменённые безмолвные рыбы, которые в ближайшем будущем будут использоваться как термометры и лакмусовые бумажки. Исследователи отделения биологических наук Национального университета Сингапура выводят новый вид рыбы-зебры, которая будет реагировать на загрязнение воды изменением цвета чешуи [25].



Глава 4. Программа и объём выполненных работ

Эксперименты по биотестированию на определение чувствительности рыб рода Barbus, проводились на базе лаборатории по биотестированию в главном отделении Рос НИИВХ, с помощью специального аппарата ToxProtect64 (рис.1). Данная установка позволяет отслеживать плавательную активность рыб в толще воды, с помощью инфракрасных датчиков, расположенных по всему периметру аквариума (рис.2). Определение уровня активности производится благодаря перекрыванию световых лучей, количество которых установка пересчитывает как величина активности рыб за минуту. Критерием токсичности воды в экспериментах по биотестированию являлось снижение общей активности рыб ниже 3 свето-перекрываний/мин, и/или повышение поверхностной активности выше 2 свето-перекрываний/мин для барбуса суматранского и снижение общей активности рыб ниже 5 свето-перекрываний/мин, и/или повышение поверхностной активности выше 5 свето-перекрываний/мин для барбуса золотистого. Так же оценивался показатель удельной активности - соотношение показателей общей и поверхностной активности. В случае возникновения критической ситуации (токсичности) система подаёт звуковой и световой сигнал [27].

Аппарат ToxProtect64

Объём аквариума составляет 10 л. Температура воды в аквариуме на протяжение всего эксперимента составляла 20-24 °C. В каждом эксперименте было задействовано 10 рыб. Для более точных результатов была сформирована средне размерная и однополая группа из здоровых и демонстрирующих высокую активность особей. В течении эксперимента рыб не кормили. После каждого эксперимента все рыбы менялись. Продолжительность экспозиции тест-организмов в испытуемой среде составляла 24 ч. Мертвую рыбу регистрировали по отсутствию признаков движения и дыхания (рис 3, 4) [27].

Тест-организмы

В качестве тест-объекта для определения токсичности воды в автоматической системе биосигнализации ToxProtect64 использовалась лабораторная культура рыб рода Barbus, Барбус огненный или золотистый Pethia conchonius (Hamilton, 1822) (рис. 5) и Барбус суматранский или тигровый Puntigrus tetrazona (Bleeker, 1855) (рис 6). Данный вид рыбы отвечает таким показателям, требуемым для эксплуатации ToxProtect64 как размерам (не более 60 мм), степенью подвижности, стайностью, обитанием в среднем и нижнем слое воды, что необходимо для определения показателя поверхностной активности.

Барбус огненный или золотистый Pethia conchonius (Hamilton, 1822). Данный вид в естественных условиях населяет воды Бангладеш, северо-восточной части Индии и Юго-восточной части Азии. Предпочитает стоячую воду [28].

Барбус огненный обладает овальной формой тела, плоское по бокам. В аквариуме их длинна достигает 5 см, в природных условиях могут вырастать до 8 см. Ярко выражен половой диморфизм - самка имеет светло-оливковый или желтоватый цвет, самец имеет сильный огненный отлив, в начале хвостового стебля располагается чёрное пятно.

Оптимальная температура для содержания данного вида в аквариумных условиях 18 - 25 °C, минимальная температура, которую может перенести барбус без серьёзных последствий для организма 15 °C, жёсткость воды может составлять 4--18°. Для нормальной жизнедеятельности в аквариуме желательно иметь не менее 5 особей, так как вид ведёт стайный образ жизни. Особи в аквариуме располагается в средних слоях толщи воды.

Барбус суматранский или тигровый Puntigrus tetrazona (Bleeker, 1855). Вид лучепёрых рыб семейства карповых [29]. Обитает в водоёмах островов Суматра, за что и получил своё название, и Калимантан.

Данный вид обладает высоким, плотным сильно сжатым с боков телом. Окраска золотисто-розовая спина более тёмная, чем брюшко. По бокам располагаются вертикальные чёрные полосы. Половой диморфизм выражен размером и окраской тела. Их длинна может достигать 5 см.

Оптимальная температура для содержания должна быть 22 - 24°C, могут кратковременно переносить температуру не ниже 15°C. Жёсткость воды до 17°, pH 6,5--7,0. Наличие особей в аквариуме должно составлять не менее 5, так как вид является стайным. Располагаются в средних и нижних слоях толщи воды.

Оба вида соответствуют параметрам необходимым для проведения экспериментов в аппарате ToxProtect64 так как: их размеры не превышают 60 мм, являются малоподвижными, обитают в нижних и средних слоях толщи воды, не прихотливы.

Химические вещества используемые в экспериментах

Для проведения опытов, были взяты 3 химических вещества: соединение меди (CuSO₄*5H₂O) - медный купорос, цинка Zn(CH3COO)2*2H2O - ацетат цинка и хрома (K₂CrO₇) - дихромат калия. Эти соединения были выбраны в связи с тем что, они являются самыми распространёнными загрязняющими веществами в городе Екатеринбург. По нормативным документам они относятся к 1 классу опасности (цинк) и 2 классу опасности (медь, хром). Являются токсичными для всех живых организмов и могут вызвать серьёзные физиологические отклонения, при определённых концентрациях.

Воздействие химических веществ на живой организм

Сульфат меди. Неорганическое соединение, медная соль серной кислоты с формулой (CuSO₄*5H₂O). Нелетучее, не имеет запаха. Безводное вещество бесцветное, непрозрачное, очень гигроскопичное. Сульфат меди(II) хорошо растворим в воде [30]. Сульфат меди используется в медицине, сельском хозяйстве, в пищевой промышленности, строительстве и в металлургии, отрасли транспорта и связи, текстильной, авиационной, электротехнической промышленности.

Медь входит в список основных загрязняющих веществ питьевой воды Свердловской области. Повышенное содержание меди в воде ведёт к поражению почек и печени. В области лишь 17% централизованных источников водоснабжения имеют согласованные с органами Роспотребнадзора и утвержденные в установленном порядке проекты зон санитарной охраны [31]. В области 90% населённых пунктов, на сегодняшний день не удовлетворяют требованиям СанПиН 2.1.4.1074-01 «Вода питьевая» [31].

Медь является жизненно важным элементом, который входит в состав многих витаминов, гормонов, ферментов, дыхательных пигментов, участвует в процессах обмена веществ, в тканевом дыхании и т.д. [30]. В организм попадает в основном с пищей. Наиболее высокое содержание меди в морских продуктах, крапиве, бобовых, яблоках, шпинате и др. Лучше всего в организме человека усваивается двухвалентная медь. В крови медь связывается с сывороточным альбумином (12-17%), аминокислотами - гистидином, треонином, глутамином (10-15%), транспортным белком транскуприном (12-14%) и церулоплазмином (до 60-65%) [30]. Суточная норма меди в организме составляет 2-3 мг. Недостаток меди так же отрицательно сказывается на здоровье человека. Токсичной концентрацией для человека считается 200 мг/сутки. Больше всего медь откладывается в печени, почках, мозге и крови.

Причины повышенной концентрации меди в организме человека. Вдыхание пыли и паров соединений меди на производстве, бытовое отравление растворами соединений.

Влияние избытка меди в организме.

· функциональные расстройства нервной системы (ухудшение памяти, депрессия, бессонница);

· при вдыхании паров может проявляться "медная лихорадка" (озноб, высокая температура, проливной пот, судороги в икроножных мышцах);

· воздействие пыли и окиси меди может приводить к слезотечению, раздражению конъюнктивы и слизистых оболочек, чиханию, жжению в зеве, головной боли, слабости, болям в мышцах, желудочно-кишечным расстройствам;

· нарушения функций печени и почек;

· поражение печени с развитием цирроза и вторичным поражением головного мозга, связанным с наследственным нарушением обмена меди и белков (болезнь Вильсона-Коновалова);

· аллергодерматозы;

· увеличение риска развития атеросклероза;

· гемолиз эритроцитов, появление гемоглобина в моче, анемия [30].

Ацетат цинка (цинк уксуснокислый), Zn(O2CCH3)2 -- химическое соединение, уксуснокислая соль цинка (рис 7). Бесцветные кристаллы, растворимые в воде и органических растворителях (метанол, ацетон, анилин, пиридин). Встречается в виде кристаллогидратов и безводных форм. Может быть получено путём растворения карбоната цинка или цинка в уксусной кислоте [32]. Применяют в пищевой промышленности, при деревообработке, строительстве, медицине, в металлургии и машиностроение.

Цинк является одним из самых важнейших элементах в организме. Он оказывает влияние на более чем 400 биохимических реакций, необходим для образования алкогольдегидрогеназы, обезвреживает спирты в организме. Цинк так же очень важен для образования ферментов, которые синтезируют нуклеиновые кислоты, участвуют в деление клеток, распаде углеводов и белков [33]. Присутствует в составе инсулина, участвует в процессах передачи нервных импульсов, необходим для нормальной работы иммунной системы. При дефиците цинка больше всего страдает репродуктивная система. Ухудшается зрение, образование язв на коже и слизистых, кожные заболевания, продолжительные простудные заболевания, аллергии, уменьшение содержания инсулина [33]. В организм цинк попадает с пищей. Наибольшее его количество содержится в морепродуктах брокколи, орехах и семенах, и др. растительной пище. С пищей животного происхождения цинк поступает в организм в более усвояемой форме. Суточная норма меди составляет примерно 8 мг для женщин и 11 мг для мужчин. В отличие от меди цинк не может откладываться в организме. Токсической концентрацией для человека является 150мг/сутки. С пищей такого большого количества этого микроэлемента невозможно, но токсическую концентрацию можно получить при:

· контакт с соединениями цинка на производстве;

· прием пищи из гальванизированных контейнеров, оцинкованной посуды;

· превышение дозировки БАДов и медикаментов (включая цинксодержащие мази);

· нарушения обмена цинка [33].

Цинк может очень быстро всасываться через кожу и вызывать отравление. При таксиках наблюдаются боли в мышцах, груди и животе, развитие тошноты и рвоты, учащённое сердцебиение, развитие отдышки.

Дихромат калия (двухромовокислый калий, бихромат калия), (K₂CrO₇) - ихромат калия - это вещество неорганической природы происхождения, его получение производится путем химического синтеза [34].

Хром имеет широкий ряд применения: металлургия, машиностроение, кораблестроение, производство оружия, строительство, производство металлокерамических изделий, медицина.

В организм хром попадает в основном с пищей. Больше всего его содержится в бобовых и семенах, морепродуктах, ягодах, фруктах и молочных продуктах. Оптимальное для человек количество хрома в сутки составляет от 0,05 мг до 0,2 мг. Опасная для здоровья доза составляет 2 г. Хром необходимый организму элемент так как он отвечает за выработку инсулина, регулирование обмена веществ и расщепление углеводов. Некоторые люди подвержены риску отравлению хромом на металлургических предприятиях путём вдыхания хромовой пыли.

При недостаточном количестве хрома в организме у человека наблюдаются головные боли, проблемы со сном, ослабленный иммунитет, развитие сахарного диабета и атеросклероза. При избыточном количестве хрома в организме у человека может возникнуть целы ряд заболеваний. Самым распространённым является дерматиты и экземы, способствует развитию заболеваний пищеварительной системы. При избытке хрома нарушается работа почек и печени.

При обследовании проб воды Волчихинского водохранилища - главного источника снабжения водой города Екатеринбурга, обнаружено превышение концентрации меди, марганца, цинка, нитратов и прочих вредных веществ, а также загрязнение микроорганизмами [35].

Таблица 1. Сравнительная таблица ПДК для питьевой воды и рыбохозяйства

	питьевая вода, мг/л	водоёмы рыбохозяйственного наз-ия, мг/л
медь	1	0,001
цинк	5	0,01
хром	0,05	0,001

Так как эксперимент проводился на рыбах, ПДК были взяты для рыбохозяйственных нормативов. Были выбраны концентрации 1 ПДК, 5 ПДК и 10 ПДК. Таким образом, 1ПДК меди составляет 0,001 мг/л. 1 ПДК цинка составляет 0,01 мг/л, а 1 ПДК хрома 0,001 мг/л. Вода использовалась водопроводная, отстоянная, после завершения эксперимента вся вода сливалась из аквариума, аквариум промывался и заливалась новая вода. Для мониторинга брались особи крупного размера с ярким окрасом, что свидетельствовало о их нормальном физическом состоянии. По завершению каждого эксперимента все рыбы заменялись новыми. Каждое исследование проводилось в течение 24 часов. Эксперимент был проведён в период апрель - май.

Результаты исследований

В контрольных условиях в отстоянной водопроводной воде с двумя приемами пищи картина поведения в течении суток рыб вида барбус суматранский по тестируемым признакам представлена на рисунке ниже.

Рисунок 8. Показатель общей активности барбуса суматранского при нормальных условиях

Рисунок 9. Показатель поверхностной активности барбуса суматранского при нормальных условиях

Рисунок10. Удельный показатель активности барбуса суматранского при нормальных условиях

Общая активность рыб (Activitycount), поверхностная активность (CoveredLEDstop), удельная активность (Specificactivity) в контрольных условиях. Информация показывает, что общая активность рыб колеблется в пределах от 5 до 15 свето-перекрываний/мин, в среднем 10 свето-перекрываний/мин. Наблюдается два всплеска активности (в 00 и в 12 часов) до 20 свето-перекрываний/мин в период кормления. В утренние часы (6-8 часов) активность может снижаться до 4 свето-перекрываний/мин. Поверхностная активность данного вида очень низкая и ее всплески вызваны процессами кормления. В контрольных условиях она не превышает 2 свето-перекрывания/мин. Показатели удельной активности зависят от поверхностной и в контрольных условиях близки к 0.

Картина поведения в отстоянной чистой воде в течении суток рыб вида барбус огненный по тестируемым признакам:

Рисунок 11. Показатель общей активности барбуса огненного при нормальных условиях

Рисунок 12. Показатель поверхностной активности барбуса огненного при нормальных условиях

Рисунок 13 Удельный показатель активности барбуса огненного при нормальных условиях



Информация показывает, что общая активность рыб колеблется в пределах от 15 до 30 свето-перекрываний/мин, в среднем 20 свето-перекрываний/мин. Наблюдается два всплеска активности (в 13 и в 07 часов) до 35 свето-перекрываний/мин в период кормления. Ночью (2-6 часов) активность может снижаться до 10 свето-перекрываний/мин. Поверхностная активность данного вида выше по сравнению с барбусом суматранским.

Медь. (CuSO₄*5H₂O) - медный купорос.

1. Для проведения первого эксперимента использовался медный купорос в количестве 1 ПДК (0,001 мг). Количество раствора введённого в аквариум составляет 1,5 мл на 15 литров воды. В качестве биотеста - барбус суматранский.

Из выше приведённых графиков мы видим: при введении в воду 1 ПДК медного купороса, средний показатель общей активности равен 7, что соответствует нормальной активности рыб. Показатель поверхностной активности был выше нормы. Это говорит о том что рыбы среагировали на добавление химиката. Предполагается что, медь обжигает жабры рыбы и она поднимается на поверхность в поисках другого источника кислорода. В течение эксперимента погибла одна особь. Однако отклонений в поведении барбусов практически не наблюдается.

2. Мы получили следующие результаты при участии барбуса огненного в качестве биотеста, на 1 ПДКА медного купороса:

При введении в воду 1 ПДК медного купороса, средний показатель общей активности равен 12, что ниже нормы. Показатель поверхностной активности был выше нормы. Смертность при данной концентрации не наблюдалась.

3. При концентрации 5 ПДК (0,005 мг) медного купороса, 7,5 мг на 15 литров.

Из этих данных мы видим что, показатель общей активности рыб равен 5. Падение активности наблюдалось уже после 2 часов после начала эксперимента. Показатель поверхностной активности был значительно выше. В течение эксперимента 3 раза срабатывал сигнал предупреждения. Это говорит о том, что биотесты находились в предтоксичном состоянии. Смертность при данной концентрации составила 10%.

4. При концентрации 5 ПДК (0,005 мг) медного купороса, 7,5 мг на 15 литров, барбус огненный показал следующую активность:

Рисунок 14. Показатель общей активности барбуса огненного при 5 ПДК медного купороса

Рисунок 15. Показатель поверхностной активности барбуса огненного при ПДК медного купороса

Рисунок 16. Удельный показатель активности барбуса огненного при 5 ПДК медного купороса

Показатель общей активности равен 5, что в 4 раза меньше нормы. Поверхностная активность так же мыла значительно выше. Рыбы начали проявлять низкую активность сразу после добавления химического вещества в аквариум. По окончанию эксперимента смертность составила 20%.

5. При 10 ПДК (0,01 мг), раствора 15 мл на 10 л барбус суматранский показал следующую активность:

Рисунок 17. Показатель общей активности барбуса суматранского при 10 ПДК медного купороса

Рисунок 18. Показатель поверхностной активности барбуса суматранского при 10 ПДК медного купороса

Рисунок 19. Удельный показатель активности барбуса суматранского при 5 ПДК медного купороса

Как видно из графиков, барбусы сначала показали нормальную активность. Но через 7 часов активность начала постепенно снижаться и через 9 часов установка дала сигнал тревоги, что свидетельствует об острой токсичности воды. При данной концентрации смертность вида составила 30%.

На первом графике видно, что активность начала падать уже через 30 минут после начала эксперимента. Показатель поверхностной активность был очень высоким, что свидетельствует о том, что рыба почти всё время эксперимента держалась верхних слоёв толщи воды, что не характерно для данного вида. Смертность составила 60%.

Цинк. Zn(O2CCH3)2 - ацетат цинка.

6. Для проведения дальнейшего эксперимента использовался ацетат цинка в количестве 1 ПДК (0,01 мг). Количество раствора введённого в аквариум составляет 15 мл на 15 литров воды. В качестве биотеста - барбус суматранский.

Рисунок 20. Показатель общей активности барбуса суматранского при 1 ПДК ацетата цинка

Рисунок 21. Показатель поверхностной активности барбуса суматранского при 1 ПДК ацетата цинка

Рисунок 22. Удельный показатель активности барбуса суматранского при 1 ПДК ацетата цинка



Показатель общей активности равен 5. В течение всего эксперимента установка дала 3 предупреждения, первый был после 2 часов после старта. Сигнал тревоги включился через 10 часов. Смертность 60%.

Показатели активности барбуса огненного при концентрации 1 ПДК

Рисунок 23. Показатель общей активности барбуса огненного при 1 ПДК ацетата цинка

Рисунок 24. Показатель поверхностной активности барбуса огненного при 1 ПДК ацетата цинка

Рисунок 25. Удельный показатель активности барбуса огненного при 1 ПДК ацетата цинка

Как видно из графиков, показатель общей активность очень низкий, а показатели поверхностной активности очень высокий. Установка дала сигнал предупреждения через 2,5 часа и сигнал тревоги через 18 часов. Смертность составила 40%.

7. При 5 ПДК (0,05 мг), ацетата цинка,75 мл раствора на 15 литров воды, барбус суматранский.

Рисунок 26. Показатель общей активности барбуса суматранского при 5 ПДК ацетата цинка

Рисунок 27. Показатель поверхностной активности барбуса суматранского при 5 ПДК ацетата цинка

Рисунок 28. Удельный показатель активности барбуса суматранского при 5 ПДК ацетата цинка

При данной концентрации общая активность была критически низкой уже через 4 часа после начала эксперимента. Смертность составила 90%.

Сигнал тревоги сработал через 7,5 часов. Смертность составила 80%. Активность была в критическом состоянии.

Хром. (K₂CrO₇) - дихромат калия.

8. Для проведения этого эксперимента использовался дихромат калия в количестве 1 ПДК (0,001 мг). Количество раствора введённого в аквариум составляет 1,5 мл на 15 литров воды. В качестве биотеста - барбус суматранский.

В течение всего эксперимента организмы показывали нормальную активность.

9. Результаты барбуса огненного при воздействии на него дихромата калия с концентрацией 1 ПДК.

Рисунок 29. Показатель общей активности барбуса огненного при 1 ПДК дихромата калия

Рисунок 30. Показатель поверхностной активности барбуса огненного при 1 ПДК дихромата калия

Рисунок 31. Удельный показатель общей активности барбуса огненного при 1 ПДК дихромата калия

Общая активность барбуса огненного была чуть ниже норм, что говорит о том, что биотесты среагировали на добавление токсического вещества.

10. Для проведения этого эксперимента использовался дихромат калия в количестве 5 ПДК (0,005 мг). Количество раствора введённого в аквариум составляет 7,5 мл на 15 литров воды. В качестве биотеста - барбус суматранский.

В течение всего эксперимента общая и поверхностная активность находились в пределах нормы. Реакции организмов на добавление токсиканта не наблюдалась.

11. 5 ПДК барбус огненный

Таблица 2. Сравнение показателей общей активности

	суматранский	огненный
Медь
1ПДК	7	12
5ПДК	5	5
10ПДК	3	6
Цинк
1ПДК	6	5
5ПДК	2	3
Хром
1ПДК	12	5
5ПДК

Выводы

Исходя из полученных данных, мы можем сделать вывод, что барбус огненный более быстро реагирует на добавление токсичных веществ в воду, следовательно, этот вид более чувствителен по сравнению с барбусом суматранским.

Исследования, проведённые с медным купоросом при концентрации 1 ПДК и 5ПДК показали ожидаемую реакцию.

В ходе исследования с применением ацетата цинка, была выявлена острая токсичность даже при 1 ПДК, которая составляет по рыбохозяйственному нормативу 0,01 мг/л, а согласно СанПиН 2.1.4.1074-01 - 0,001мг/л, это даёт основание полагать, что в первом случае ПДК завышена.

При воздействии дихромата калия острая токсичность не была выявлена даже при высоких концентрациях, однако через несколько дней, после окончание исследования все особи погибли. Это говорит о том, что хром имеет длительное токсическое воздействие.



Глава 5. Экономическая часть

5.1 Общие положения

В настоящее время, всё большую популярность приобретают методы биотестирования окружающей среды. Они имеет свою определённую экономическую эффективность. И сравнивая данный метод с методами химического анализа необходимо отметить что, на этапах внедрения этого метода отмечается крупные капиталовложения для закупки оборудования. При дальнейшей эксплуатации оборудования и тест-объектов экономические затраты снижаются многократно. Значение и возможности биотестирования в настоящее время не имеют экономических критериев оценки, так как нет экономических расчётов эффективности биотестирования. Сама необходимость и научная обоснованность биотестирования не вызывает сомнения. В данной главе приведены укрупнённые расчёты расходов на биотестирование по основным показателям. При разработке метода и поиска решений были использованы приоритетные загрязняющие вещества для анализа поведения тест-организмов - медь, цинк, хром.

Рассчитаем приблизительную стоимость проведения анализа методом биотестирования на аппарате ToxProtect64 и барбусом огненным в качестве тест-организма. Средняя стоимость одной особи составляет 60 рублей. Для проведения одного эксперимента необходимо 10 особей. В итоге мы получаем 600 рублей без учёта иных затрат.

В таблице 3 приведены расценки на выполнение количественного химического анализа проб воды за 2017 год в ФГБУ РосНИИВХ.

Таблица 3. Стоимость определение наличия и содержания веществ в пробах химическим анализом в РосНИИВХ

Вещ-во	цена, руб.
медь	649,00
цинк	649,00
хром	295,00

Стоимость количественного химического анализа включает подготовку проб к анализу, выполнение измерений, оформление протокола количественного химического анализа.

Для сравнения стоимости метода биотестирования и методов химического анализа были взяты расценки различных лабораторий, занимающихся химическим анализом воды.

Таблица 4. Расценки химических анализов

Наименование организации	Цена, руб	Кол-во хим. показателей	Время, дни
Лаборатория «роса центр»	500,00	9	5
Центр гигиены и эпидемиологии в Свердловской области	4170,80	21	10
Лаборатория "барьер"	3500,00	14	5
Лаборатория «контур»	2300,00	11	5
Торгово-инжиниринговая компания «Вагнер».	2200,00	9	1
Лаборатория Экологического Фонда «Вода Евразии»	1400,00	7	1
Компания Инженер-Консалт	8000,00	23	-
Западно-Уральская Буровая Компания	1500,00	30	-
Западно-Уральская Горнопромышленная компания	4500,00	12	12
Центр экологического сопровождения	9087,18	17	5
Независимая аналитическая лаборатория "академлаб"	4000,00	11	-

Как мы видим из приведённых ниже данных анализ питьевой воды химическим методами в несколько раз дороже биотестирования. Но в отличие от химического метода, анализ с помощью живых организмов не показывает наличие определённых химических элементов. Однако даёт более быстрые результаты в случае острой токсикации проб анализируемой воды. В соответствии с этим рекомендуется проводить химический анализ совместно с биотестированием для более быстрых и точных показателей.

5.2 Расчет затрат на проведение эксперимента

В затраты на проведение эксперимента включены расходы на экономические реактивы, расходные материалы. Затраты формируются как произведение использованного количества материала (N_p) и цены за единицу (Ц_пл-заг), и рассчитываются по формуле:

З = N_p* Ц_пл-заг

Количество материалов рассчитывается в объеме на проведение эксперимента. Количество израсходованных реактивов подсчитаны путем суммирования затраченных количеств этих веществ за время проведения исследований. Цена материалов принята по прайс листам [36]. Результаты расчетов представлены в таблице 5.

Таблица 5. Стоимость расходных материалов и химических реактивов

№ п/п	Наименование	Единица измерения	Цена за ед.,руб.	Расход материалов	Сумма, руб.
1	Колбы цилиндрические (V=1л)	шт	256,50	1	256,50
2	Шприц пластиковый (V=100мл)	шт	110,70	1	110,70
3	Шприц пластиковый (V=10мл)	шт	35,00	1	35,00
4	Ведро оцинкованное (V=10 л )	шт	156,00	1	156,00
5	Сачок аквариумный	шт	74,00	1	10,00
6	Медный купорос	кг	150,00	0,1	15,00
7	Ацетат цинка	кг	220,00	0,1	22,00
8	Дихромат калия	кг	200,00	0,1	20,00
9	Барбус суматранский	шт	50,00	80	4000,00
10	Барбус огненный	шт	60,00	80	4800,00
Итого	9425,20

Итого затраты, связанные с использованием реактивов составили 9,43 тыс. руб.

2) Расчет амортизационных отчислений

В работе использовалось следующее лабораторное оборудование: аппарат ToxProtect64, ноутбук.

Расчет амортизационных отчислений проводится на лабораторное оборудование [37]. Цены приняты по прайс листам [36]. Затраты, связанные с амортизационными отчислениями, приведены в таблице 6.

Таблица 6. Расчет амортизационных отчислений на оборудование

№ п/п	Наименование	Балансовая стоимость, тыс. руб.	Амортизационные отчисления
			Норма, %	Сумма, тыс. руб./год
1	Аппарат ToxProtect64	100	14,3	14.3
2	Персональный компьютер	23	33.3	7.66
Итого	21.96

Итого, за время длительности эксперимента, амортизационные отчисления на оборудование составили:

(21.96 * 1) / 12 = 1,83 тыс. руб.,

где, 1 - длительность эксперимента, месяц

12 - годовое амортизационное обслуживание, месяц

3) Расчет фонда заработной платы

В расчет фонда заработной платы включены выплаты руководителю, консультанту и работнику проекта.

Сумма выплат руководителю, консультанту и работнику проекта проводится исходя из штатного расписания, должностных окладов специалистов и различного рода доплат (таблица 7).

Таблица 7. Расчет фонда заработной платы руководителя, консультанта и работника проекта

Наименование	Численность, чел.	Оклад, тыс. руб./месяц	Премия (35%), тыс. руб.	Доплата по районному коэффициенту, (15%), тыс. руб.	Итого фонд заработной платы, тыс. руб./месяц,	Средний фонд рабочего времени в месяц, ч	Время, выделенное для руководства, час	Итого фонд заработной платы, тыс. руб.
Руководитель проекта	1	17	5.95	2,55	25,50	160	60	9,56
Консультант проекта	1	16	5,60	2,40	24,00	160	15	2,25
Работник проекта	1	7	2,45	1,42	10,87	160	160	10,87
Итого	22.68

Итого фонд по заработной плате составили 22,68 тыс. руб.

4) Расчет суммы страховых взносов

Страховые взносы включают суммарные отчисления в фонд социального страхования, пенсионный фонд, фонд обязательного медицинского страхования, составляют 30% от начисленного годового фонда заработной платы. Размер отчислений на социальные нужны:

22,68 * 0,30 = 6,80 тыс. руб.,

где 22,68 - фонд заработной платы руководителя проекта, консультанта и работника, тыс. руб.

5) Расчет арендной платы за нежилое помещение

По договору с арендодателем, арендная плата за нежилое помещение с включенными в стоимость затрат на коммунальные услуги составляет 5000 рублей в месяц. Итого, за 1 месяц длительности эксперимента, арендная плата за нежилое помещение составляет:

1*5000=5 тыс.руб.

6) Расчет затрат по охране труда

Расходы по охране труда включают расходы, связанные с обеспечением работников спецодеждой, спецобувью и прочими средствами индивидуальной защиты; на проведение периодических медицинских осмотров.

Расходы по данной статье определяются укрупнено и составляют 8% от фонда заработной платы работающих:

22,68 * 0,08 =1,81 рублей,

Где 22,68 - фонд заработной платы руководителя проекта, тыс. руб.

7) Расчет затрат по статье «Накладные расходы»

Расходы принимаются в размере 15% от суммы предыдущих расходов:

47,55 * 0,15 = 7,13тыс. руб.

8) Смета затрат на проведение лабораторных исследований

Таблица 8. Смета затрат на проведение лабораторных исследований

№ п/п	Наименование	Сумма, тыс. руб.
1	Затраты на материалы	9,43
2	Амортизационные отчисления	1,83
3	Заработная плата	22,68
4	Обязательные страховые отчисления	6,80
5	Расходы за арендную плату	5,00
6	Затраты по охране труда	1,81
	Накладные расходы	7,13
Итого	54,68

Вывод: Таким образом, затраты на проведение эксперимента по определению и сравнению чувствительности тест-организмов барбуса суматранского и барбуса огненного, составляют 54,68 тыс. руб. В случае заключении коммерческого договора на проведение таких работ стоит заложить размер коммерческой прибыли, (20%), где стоимость составит 65616 руб.



Заключение

экологический пресноводный биоидикация природный

Как уже было сказано, биоиндикация становиться практически не заменимым методом в мониторинге пресноводных экосистем. Использование живых объектов даёт преимущества перед физико-химическими методами, в связи с простотой, скоростью реакцией и экономичностью.

Анализ химическими методами дают качественные и количественные характеристики фактора, но лишь косвенно судят о его воздействии на все живые организмы в экосистеме. Биоиндикационные методы, наоборот, позволяет получить информацию о биологических последствиях изменения среды и сделать лишь косвенные выводы об особенностях самого фактора. Таким образом, при оценке состояния среды следует сочетать химические методы с биологическими.

В рамках программы исследований необходимо отметить, что данные виды рыб, барбус суматранский и барбус огненный, могут быть использованы в качестве био-тестов при работе на аппарате ToxProtect64. Все эксперименты, проведённые в лабораторных условиях показали, что данные виды имеют определённую реакцию на добавление медного купороса, ацетата цинка и дихромата калия при повышенных концентрациях. Результаты эксперимента показали, что вид - барбус огненный более чувствителен ко всем представленным химикатам. Поэтому при дальнейшей эксплуатации данного аппарата рекомендуется использовать именно представителей рода барбуса огненного.



Список используемой литературы

1.Капустин В.Г, Корнев И.Н. География свердловской области [Электронный ресурс]: Электронный учебник / В.Г. Капустин, И.Н. Корнев - Режим доступа: http://geografia-sverd.ucoz.ru/index/geograficheskoe_polozhenie/0-5. - свободный. Дата обращения: 03.04.2017.

2.Капустин В.Г, Корнев И.Н. География свердловской области [Электронный ресурс]: Электронный учебник / В.Г. Капустин, И.Н. Корнев - Режим доступа: http://geografia-sverd.ucoz.ru/index/prirodnye_kompleksy/0-45. - свободный. Дата обращения: 03.04.2017.

3.Капустин В.Г, Корнев И.Н. География свердловской области [Электронный ресурс]: Электронный учебник / В.Г. Капустин, И.Н. Корнев - Режим доступа: http://geografia-sverd.ucoz.ru/index/pogoda_i_klimat/0-30. - свободный. Дата обращения: 03.04.2017.

4.Капустин В.Г, Корнев И.Н. География свердловской области [Электронный ресурс]: Электронный учебник / В.Г. Капустин, И.Н. Корнев - Режим доступа: http://geografia-sverd.ucoz.ru/index/pochvy/0-42. - свободный. Дата обращения: 04.04.2017.

5.География Свердловской области [Электронный ресурс]: - Режим доступа: http://pandia.ru/text/80/122/4615-2.php. - свободный. Дата обращения: 07.04.2017.

6.ФБУ «Российский центр защиты леса». Свердловская область [Электронный ресурс]: - Режим доступа: http://chelyabinsk.rcfh.ru/08_10_2014_fe8d2.html. - свободный. Дата обращения: 08.04.2017.

7.Министерства природных ресурсов и экологии Свердловской области. Государственный доклад «О состоянии и об охране окружающей среды Свердловской области в 2015 году»

8.Романков П.С. Экологическая обстановка в Свердловской области [Электронный ресурс]: - Режим доступа: http://www.medroad.ru/raznoe/ekologicheskaja-obstanovka-v-sverdlovskoi-oblasti.html. - свободный. Дата обращения: 10.04.2017.

9.Исмагилов Р. Р. Проблема загрязнения водной среды и пути ее решения // Молодой ученый. -- 2012. -- №11. -- С. 127-129. В 21 веке вопрос о чистой воде стоит особенно остро.

10. Экопортал. Факты загрязнения воды в мире [Электронный ресурс]: - Режим доступа: https://ecoportal.info/fakty-zagryazneniya-vody-v-mire/. - свободный. Дата обращения: 10.04.2017.

11. Кампа Е., Уорд Д. Г., Лейппранд А. Сближение с водной политикой Европейского Союза (ЕС). Краткий путеводитель для стран-партнеров по Европейской политике добрососедства, и России. [Электронный ресурс]: - Режим доступа: http://ec.europa.eu/environment/enlarg/pdf/pubs/water_ru.pdf. - свободный. Дата обращения: 10.04.2017.

12. Теоретические основы биоиндикации. [Электронный ресурс]: - Режим доступа: http://www.studfiles.ru/preview/1904846/page:2/. - свободный. Дата обращения: 10.04.2017.

13. Черных Г. С., Старостин А. С. Анализ современного состояния и тенденций пресноводных ресурсов России и меры по предупреждению чрезвычайных ситуаций, связанных с их загрязнением и дефицитом // Стратегия гражданской защиты: проблемы и исследования. 2014. №1. С.75-84

14. Малышева А. В., Козина Л. Н. Основные направления рационального использования водных ресурсов // Вестник НГИЭИ. 2015. №6 (49). С.52-60

15. Анализ // Мониторинг. 1993. №1. URL: http://cyberleninka.ru/article/n/analiz. - Дата обращения: 15.05.2017.

16. Долженко В. А., Государственной контроль за использованием и охраной водных объектов: проблемы теории и судебной практики.

17. [Электронный ресурс]: - Режим доступа: http://scjournal.ru/articles/issn_1997-292X_2011_7-3_19.pdf. - свободный. Дата обращения: 16.05.2017.

18. ФБУ «Российский центр защиты леса». Свердловская область [Электронный ресурс]: - Режим доступа: http://chelyabinsk.rcfh.ru/08_10_2014_fe8d2.html. - свободный. Дата обращения: 08.04.2017.

19. Плагин О.А., Водные ресурсы Свердловской области [Электронный ресурс]: - Режим доступа: http://svyato.info/5791-vodnye-resursy-sverdlovskojj-oblasti.html. - свободный. Дата обращения: 16.05.2017.

20. Методы биоиндикации: учебно-методическое пособие / М.Н. Мукминов, Э.А. Шуралев. - Казань: Казанский университет, 2011. - 48с.

21. Филенко О. Ф. Место биологических методов в контроле качества окружающей среды/ О. Ф. Филенко // Биоиндикация в мониторинге пресноводных экосистем: сб. науч. ст. -- Санкт-Петербург, 2007. -- С. 8-12.

22. Н.Л. Измайлова, О.А. Ляшенко, И.В. Антонов Биотестирование и биоиндикация состояния водных объектов Учебно-методическое пособие к лабораторным работам по прохождению учебной (ознакомительной) практики, 2014 Санкт-Петербург.

23. Значение комбинированного, сочетанного, комплексного, последовательного и интермиттирующего действия различных химических и физических факторов на организм области [Электронный ресурс]: - Режим доступа: http://lektsia.com/1x2ea4.html. - свободный. Дата обращения: 17.05.2017.

24. Петросян А.А., Биотестирование в вопросах и ответах [Электронный ресурс]: - Режим доступа: http://www.bioassay.narod.ru/biotest/biot.html. - свободный. Дата обращения: 17.05.2017.

25. Мониторинг окружающей среды, биотестирование и биоиндикация [Электронный ресурс]: - Режим доступа http://www.studfiles.ru/preview/5865383/page:31/. - свободный. Дата обращения: 17.05.2017.

26. Бойцов М.С., "Рыбы как биоиндикаторы экологического состояния водохранилищ" [Электронный ресурс]: курсовая работа / М. С. Бойцов - Режим доступа: http://otherreferats.allbest.ru/ecology/00257500_0.html. - свободный. Дата обращения: 17.05.2017.

27. Животные-биоиндикаторы окружающей среды [Электронный ресурс]: - Режим доступа http://studbooks.net/1221158/ekologiya/analiticheskiy_obzor_literatury html. - свободный. Дата обращения: 17.05.2017.

28. Отчёт по Сургуту.

29. Википедия - свободная энциклопедия. Огненный барбус [Электронный ресурс]: - Режим доступа https://ru.wikipedia.org/wiki/Огненный_барбус. - свободный. Дата обращения: 19.05.2017.

30. Википедия - свободная энциклопедия. Суматранский барбус [Электронный ресурс]: - Режим доступа https://ru.wikipedia.org/wiki/Суматранский_барбус. - свободный. Дата обращения: 19.05.2017.

31. Влияние меди на организм человека Суматранский барбус [Электронный ресурс]: - Режим доступа http://bot52.ru/cu.htm. - свободный. Дата обращения: 19.05.2017.

32. Вода в регионах [Электронный ресурс]: - Режим доступа http://gostresurs.ru/voda-v-regionah. - свободный. Дата обращения: 19.05.2017.

33.Википедия - свободная энциклопедия. Ацетат цинка [Электронный ресурс]: - Режим доступа https://ru.wikipedia.org/wiki/Ацетат_цинка http://receptdolgolet.ru/organizm/vliyanie-cinka-na-organizm-cheloveka.html. - свободный. Дата обращения: 19.05.2017.

34. Otzivak.ru. Дихромат калия [Электронный ресурс]: - Режим доступа http://otzivak.ru/interesnoe/fakty/dixromat-kaliya-k2cr2o7/. - свободный. Дата обращения: 20.05.2017.

35.ecology-of. Экология в Екатеринбурге и Свердловской области [Электронный ресурс]: - Режим доступа http://ecology-of.ru/sdat-vtorichnoe-syre/ekologiya-v-ekaterinburge-i-sverdlovskoj-oblasti/. - свободный. Дата обращения: 20.05.2017.

36.http://ekb.pulscen.ru/

37.оценщик. Постановление СМ СССР от 22 октября 1990 г. N 1072 "О единых нормах амортизационных отчислений на полное восстановление основных фондов народного хозяйства СССР" [Электронный ресурс]: - Режим доступа http://www.ocenchik.ru/docs/657.html. - свободный. Дата обращения: 20.05.2017.

38.Булохов А.Д. Экологическая оценка среды методами фито-индикации. Брянск, 1996. 104с.

39.Виноградов Б.В. Растительные индикаторы и их использование при изучении природных ресурсов. М.: Высшая школа, 1964, 328 с.



Приложение

Рисунок 1.

Рисунок 2.



Рисунок 3.

Рисунок 4.

Размещено на Allbest.ru