Применение Drosophila melanogaster в целях биотестирования

Размещено на http://www.allbest.ru/

Оглавление

• Введение
• Глава 1. Биотестирование, как метод экологического исследования
• 1.1 Суть биотестирования и предъявляемые к его методам требования
• 1.1.1 Требования к методам биотестирования
• 1.1.2 Подходы биотестирования
• 1.2 Методы биотестирования
• 1.3 Место биотестирования на молекулярно - генетическом уровне
• Глава 2. Методика экспериментов
• Глава 3. Характеристика Drosophila melanogaster как модельного биологического объекта
• 3.1 История использования дрозофилы как модельного объекта в биологических исследованиях
• 3.2 Особенности Drosophila melanogaster как тест - объекта
• 3.3. Питательные среды для поддержания линий дрозофил.
• 3.4. Метод учёта частоты доминантных летальных мутаций у Drosophila melanogaster
• Глава 4. Пути повышения эффективности использования Drosophila melanogaster в биотестировании
• 4.1 Сложности, возникающие в биотестировании
• 4.2 Пути решения проблем биотестирования с использованием Drosophila melanogaster
• Заключение
• Список литературы

Введение

• Многие известные заболевания человека имеют соответствие в генетическом коде плодовой мушки. Исследования на дрозофиле помогают понять фундаментальные биологические процессы, которые непосредственно связаны с человеком и его здоровьем. Они используются в моделировании некоторых заболеваний человека, например, таких как, болезни Паркинсона, Хантингтона и Альцгеймера, а также для изучения механизмов, которые лежат в основе рака, диабета, иммунитета, наркотической зависимости и многих других.
• Drosophila melanogaster широко используется и для оценки качества окружающей среды. Так же она является генетической моделью при исследованиях насекомых, которые могут переносить опасные инфекционные болезни человека (Например, Culex pipiens - Вирус Западного Нила, Anopheles gambiae - малярию, Aedes aegypu - лихорадку Денге). Результаты исследований, полученные на дрозофиле, также дают ключ к пониманию генетических процессов, выявляемых при изучении важных для сельского хозяйства насекомых, таких как пчелы и тутовый шелкопряд, и насекомых - вредителей, к которым относится саранча и многие виды жуков и тлей.
• Актуальность темы дипломной работы состоит в том, что Drosophila melanogaster широко используется и имеет огромное значение в жизни человека. Но во время ее культивирования и использования в исследованиях можно столкнуться с рядом проблем, которые необходимо изучать для облегчения работы с ней. Кроме того, существует мало литературы по методам ее культивирования.
• Объект исследования - методика культивирования и использования Drosophila melanogaster в биотестировании.
• Предмет исследования - эффективность методики.

Цель работы - разработать методы оптимизации использования Drosophila melanogaster в целях биотестирования.

Для того чтобы достигнуть поставленной цели были поставлены следующие задачи:

• 1.Выделить проблемы, связанные с биотестированием Drosophila melanogaster.
• 2. Найти подходы к реализации решения проблем.
• 3. Экспериментальным путем установить эффективность собственных и известных из литературы путей повышения эффективности использования Drosophila melanogaster как тест - объекта.
• Глава 1. Биотестирование, как метод экологического исследования

1.1 Суть биотестирования и предъявляемые к его методам требования

молекулярный генетический дрозофила биотестирование

Биотестирование -- это такая процедура установления токсичности среды, при которой специальные тест - объекты информируют об опасности, при этом не зависят от того, какие вещества и в каком сочетании вызывают изменения жизненно важных функций [Ляшенко, 2012].

Определение характера и степени токсичности тестируемой среды и является целью биотестирования.

Само биотестирование основано на регистрации биологически важных показателей, так называемых тест - функций, исследуемых тест - объектов. После регистрации этих показателей производиться оценка их состояния в соответствии с выбранным критерием токсичности. В свою очередь тест - функции бывают биологические и физиологические. К биологическим функциям относятся выживаемость, плодовитость, размножение и качество потомства, а к физиологическим - дыхание, показатели крови, активность питания, обмен веществ [Ляшенко, 2012].

Тест - объектами (или иначе тест - организмами) называют такие биологические объекты, которые используют для оценки токсичности химических веществ. Проявляющийся токсический эффект регистрируют и оценивают в эксперименте.

Биотестирование в отличие от аналитических методов подразумевает слежение за антропогенными и природными процессами в биологических средах, которые включают всю совокупность взаимодействия агентов внешней среды с живым, в том числе и такие как выяснение ответной реакции биосред на антропогенные и природные воздействия [Иваныкина, 2010]. Такими ответами могут служить реакции на стресс - факторы. Методы имеют много преимуществ. Например, они более информативны для определения прямой реакции экосистемы на антропогенное воздействие. С помощью данных подходов в экологическом мониторинге можно получать объективную, а также количественную оценку процессов регенерирования объектов окружающей среды. Можно также, благодаря этим методам, оценить эффективность мероприятий по охране природы [Балакирев, 2013]. Также еще одним достоинством метода является определение общей токсичности, которые создаются присутствием экотоксикантов, не нормирующиеся существующими стандартами, но обладающие способностью вызывать разнообразные генотоксические, токсические, цитотоксические или мутагенные эффекты [Журавлева, 2006].

Кроме того, химико-аналитические и гидрохимические методы могут быть неэффективными, в силу их недостаточно высокой чувствительности. Биота может подвергаться токсическим воздействиям, которые не регистрируются техническими средствами связи с тем, что любой аналитический датчик не способен воспринимать такие низкие концентрации веществ по сравнению с живыми объектами [Мелехова, 2007].

В основе биотестирования лежит метод биологического моделирования. В определенной мере всякая модель является специфической формой отражения действительности. При биотестировании происходит перенос знаний с примитивной системы (смоделированной в лаборатории) на более сложную систему (экосистема в реальных условиях) [Маячкина, 2009]. По некоторым данным биотестирование - обязательное дополнение к химическому анализу, а также является интегральным методом оценки токсичности водной среды [Туманов, Постнов, 1983]. В стандарты по контролю качества вод различного назначения включены и методы биотестирования [Александрова, 2013].

Для того чтобы оценить состояние разных организмов, находящихся под воздействием естественных или антропогенных факторов проводят тестирование на биологических объектах, которые представляют собой комплекс различных подходов. Эффективность физиологических процессов, которые обеспечивают нормальное функционирование организма (например, такие как дыхание, обмен веществ, активность питания и тому подобное) является основным показателем их состояния. На воздействие среды организм реагирует посредством сложной физиологической системы буферных гомеостатических механизмов, но только при оптимальных условиях поддерживает оптимальное протекание процессов развития. Под воздействием неблагоприятных условий гомеостаз может быть нарушен, что приводит к состоянию стресса. Эти нарушения могут происходить до появления изменений, которые используются параметрами жизнеспособности. Таким образом, методы биотестирования, основываются на исследовании механизмов гомеостаза и его эффективности, а также позволяют уловить присутствие воздействия стресс - фактора раньше, чем другие, обычно используемые методы [Мелехова, 2007].

1.1.1 Требования к методам биотестирования

Для того чтобы быть пригодным для использования методы биотестирования должны соответствовать определенным требованиям. Эти требования мы рассмотрим ниже.

Чувствительность является одним из наиболее важных требований применяемых методов. В настоящее время возрастает потребность в таких методах, когда становится необходимым оценивать не только необратимые изменения в среде, но и первоначальные незначительные отклонения в системе, когда еще ее можно вернуть в прежнее нормальное состояние.

Так же методы должны быть универсальны как в отношении химического, биологического или физического оцениваемого воздействия, так и вида живых существ и экосистем, по отношению к которым проводится такая оценка. Также система должна быть относительно доступной и простой, пригодной для широкого использования. Существует много современных молекулярно - биологических тестов оценки качества среды, но в силу своей высокой стоимости и технологической сложности они оказываются недоступными.

Так же немало значимы и другие требования. Например, они должны характеризовать наиболее важные и общие параметры жизнедеятельности биоты. Применяться для оценки любых экологических изменений среды. Быть адекватными для любого вида живых существ и любого типа воздействия. Методы биотестирования должны быть приспособлены для использования исследований в природе и для лабораторного моделирования.

1.1.2 Подходы биотестирования

Подходами можно условно назвать совокупность методов, которые характеризуют сходные процессы происходящими с тест - объектами под влиянием антропогенных факторов. Существует шесть основных подходов: морфологический, физиологический, генетический, биофизический, биохимический и иммунологический. Эти методы биотестирования пригодны для оценки любой водной и наземной экосистемы по тест - функциям растений и животных. По комплексу морфологических, генетических, физиологических, биохимических, биофизических и иммунологических параметров можно определять состояние живых организмов. Применяемый комплекс методов исследования и тестов охватывает разные стороны индивидуального развития организма, обеспечивая интегральную оценку состояния биоты и качества среды в целом.

Морфологический подход

При техногенном воздействии на природные экосистемы происходит снижение численности популяций. В значительной мере на это влияет эмбриональная и личиночная смертность. Эмбрионы и личинки особо чувствительны к повреждающим факторам. Воздействие стрессора на организм приводит к несоответствию нормам строения разных морфологических признаков. Процессы воспроизведения организмов -- это сложная цепь взаимозаменяемых событий.

Процессы воспроизведения организмов -- это сложная цепь взаимозаменяемых событий. Любое из этих звеньев может нарушить воздействием токсичной среды. Чтобы диагностировать влияние воздействия загрязнений на морфологические характеристики используют методы оценки флуктуирующей асимметрии.

Симметрия как вид согласованности отдельных частей живых организмов имеет общебиологическое значение. В настоящее время для биологических объектов использует классификацию асимметрий по Л. Ван Валену [Захаров, 1987]. Согласно этой классификации асимметрия подразделяется на три типа: направленная асимметрия, антиасимметрия и флуктуирующая асимметрия. Речь идет о направленной асимметрии в том случае, когда структура на одной стороне развита больше, чем на другой (например, сердце млекопитающих). Если же развитие структуры идет больше на одно из сторон, то это антиасимметрия (например, правша и левша в популяции человека). А если отклонения незначительные ненаправленные от строгой билатеральной симметрии, то это уже флуктуирующая асимметрия.

Если организм неспособен развиваться по точно определенному плану, то это можно говорить, что это результат, флуктуирующий асимметрии. Различия между сторонами не передаются на генетическом уровне и не обладают адаптационным значением. Флуктуирующая асимметрия характеризует состояние морфогенетического гомеостаза, выступая в качестве меры стабильности развития. Морфогенетический гомеостаз -- это способность организма к формированию генетически предопределенного фенотипа при его минимальном уровне индивидуальных нарушений. Отсюда следует, что флуктуирующая асимметрия один из наиболее обычных доступных для анализа проявлений случайной изменчивости развития.

Величина асимметрии реагирует на разные стрессоры антропогенного характера, поэтому она может служить мерой нарушения развития организма. Реальность использования асимметрии в биоиндикации была доказана многими авторами на примере разных растений и животных. Флуктуирующая асимметрия -- это один из общих онтогенетических показателей, которые характеризуют стабильность индивидуального развития, а также дают оценку состояния природных популяций и зависят от состояния среды. Таким образом, величину флуктуирующей асимметрии, а также ее зависимость от определенных факторов можно определить только на популяционном уровне. Кроме того, В. М. Захаров показал, что флуктуирующая асимметрия -- практически единственная форма фенотипической изменчивости с известной причиной обусловленности [Захаров, 1987].

Физиологический подход

Наиболее важная характеристика этого подхода - это энергетика физиологических процессов, которая очень чувствительна к стрессовому воздействию среды. Энергетический обмен может быть наиболее экономичным лишь в оптимальных для этого условиях. Интенсивность энергетического обмена аэробного организма можно определить, измерив, скорость потребления кислорода. Организм при оптимальных условиях находится на самом низком энергетическом уровне, а при ухудшении условий увеличивается потребность в кислороде.

Другая основная характеристика для оценки стрессовых воздействий, -- это темп и ритмика ростовых процессов.

Поведенческая активность живых организмов является важной характеристикой физиологических процессов. Свойства внешней среды проявляются в интенсивности воздействия на популяцию или организм отдельных факторов или их комбинаций.

Степень отклонения исследуемых от стандартных поведенческих реакций животных является одним из первичных и регистрируемых на визуальном уровне сигналов изменений в окружающей среде. Этот сигнал может быть отнесен к реакциям «первого ранга».

Наибольший интерес представляют типы поведения, которые относятся к эволюционно-универсальным реакциям и свойственны всем эукариотам, включая человека. К таким феноменам относятся спонтанная двигательная активность как врожденная форма поведения и память -- приобретенная форма поведения.

В целом поведение животных рассматривается как неустойчивое взаимодействие приобретенных и врожденных элементарных реакций. Эти реакции необходимы для быстрой и эффективной адаптации к условиям среды. Изучение поведения является сложным процессом, который требует очень тщательных наблюдений в природе, подкрепленных лабораторными экспериментами.

Закономерности поведения, которые возникли у простейших в ходе эволюции, так же сохраняются и у более развитых животных. Таким образом, поведение - эволюционно обусловленный показатель состояния физиологии животного. Таким образом, на основании изменений в поведении животных одного вида можно прогнозировать нарушения поведения животных другого вида. На выбор форм поведения для биотестирования влияет их чувствительностью к изменениям, которые происходят в окружающей среде [Мелехова, 2007].

Генетический подход

Мутагенную активность среды характеризует наличие и степень проявления генетических изменений, а возможность сохранения этих генетических изменений в популяциях отражает эффективность функционирования иммунной системы организмов.

В норме клетка элиминирует и распознает многие генетические нарушения (например, посредством иммунной системы или за счет внутриклеточных систем происходит апоптоз клетки). Индикатором стресса является превышение спонтанного уровня таких нарушений. Генетические изменения выявляются на различных уровнях: генном, хромосомном и геномном. По этим уровням выделяют следующие типы мутаций: генные, хромосомные и геномные. Генные, или точковые, мутации делятся на две группы: вставки или выпадения нуклеотидов, которые приводят к сдвигу рамки считывания генетического кода и замена оснований в ДНК. Так же их подразделяют на прямые и обратные (реверсии). Мутации типа сдвига рамки считывания менее склонны к спонтанным реверсиям, чем мутации типа замен оснований. Хромосомные аберрации или перестройки - тип мутаций, при которых происходят различные нарушения структуры хромосом. А геномными называются такие мутации, при которых происходит изменение количества хромосом в ядре.

Генетические тесты относительно просты, высокочувствительны и хорошо воспроизводимы. Они основываются на оценке изменения хромосом в соматических клетках, например, таких как изменения кариотипа, хромосомные аберрации, сестринские хроматидные обмены и другие.

Для того чтобы выявить канцерогены и мутагены на практике применяют краткосрочные генетические тесты.

В качестве канцерогенов идентифицированы относительно немногие химические вещества. Однако канцерогенная активность в основном определяется на основании способности вещества вызывать опухоль у лабораторных животных в результате воздействия их на протяжении жизни. Такие исследования могут занимать много времени (2 - 3 года), а также требуют высококвалифицированных специалистов и реактивы, которые находятся в дефиците. Это стало причиной поиска альтернативных путей выявления химических веществ, обладающих канцерогенными свойствами. В результате были разработаны сравнительно недорогие тесты, во многих из которых используют другие биологические системы вместо цельного организма млекопитающих. Такие тесты стали называть краткосрочными, так как на проведение таких тестов требуется меньше времени, чем для классических долгосрочных исследований на грызунах.

Известно, что причиной значительной доли заболеваний у человека являются генетические дефекты. Но еще неизвестно, в какой степени химические вещества, присутствующие в окружающей среде обусловливают генетические болезни. Это неудивительно, так как вероятность опасности для здоровья определяется только на протяжении жизни, по меньшей мере, одного поколения.

Почти все краткосрочные тесты позволяют получить результаты максимум в течение нескольких недель. Многие из них проводят на специальных экспериментальных биологических системах, не используя целостные живые организмы (то есть in vitro). Так же они демонстрируют на основе хромосомных нарушений, генных мутаций или повреждения ДНК, при этом многие из них являются тестами. В таких тестах применяется очень широкий спектр организмов от бактерий и дрожжей до насекомых, растений и культивируемых клеток млекопитающих.

Существуют также краткосрочные тесты, в которых лабораторные животные подвергаются воздействию изучаемого химического вещества на протяжении определенного времени: от нескольких часов до нескольких недель.

Хотя в литературе описано более ста тест - систем для исследования генотоксичности, на деле же регулярно применяются менее 20 из них, а некоторые вообще доступны только в специализированных лабораториях [Мелехова, 2007].

Биофизический подход

Биофизические методы контроля качества среды всегда основываются на инструментальном определении нарушений биохимических и биофизических процессов тестируемых организмов. Одни из таких процессов позволяют регистрировать способность к генерированию электрических потенциалов, другие же оценивают показатели электропроводности тканей, третьи -- изменения функций мембранных структур клеток и т.д.

Люминесцентные и флуориметрические методы получили наибольшее распространение для контроля состояния важнейших функциональных систем организмов. Благодаря этим методам можно проводить количественные измерения в режиме реального времени. Так же они обладают высокой чувствительностью, а в ряде случаев автоматизируют процесс измерения. С помощью этих методов можно быстро протестировать качество среды, провести детальный анализ (например, состояния фитопланктонного сообщества) и прогнозировать его развитие. В свою очередь в ходе экспедиционных работ можно анализировать получаемую информацию и вносить коррективы в планы исследования. Представленная методология и комплексное использование люменометрической и флуорометрической аппаратуры дают информацию о пространственно-временной изменчивости физиологических и биофизических процессов, которые определяют нормальное функционирование биосистем [Мелехова, 2007].

Биохимический подход

По результату биохимических реакций, уровню ферментативной активности и накоплению установленных продуктов обмена можно оценить критическое воздействие среды. В ответ на стрессовое воздействие нужную информацию могут дать некоторые показатели основных биохимических процессов (например, концентрации хлорофилла у фотосинтезирующих растений), структуры ДНК в результате биохимических реакций (например, при оксидантном стрессе) и изменения содержания в организме определенных биохимических соединений (например, терпеноидов) [Мелехова, 2007].

Иммунологический подход

Цитогенетический подход характеризирует эффективность иммунной системы организма в отношении элиминации клеток с генетическими нарушениями. Для его дополнения используют развернутую оценку изменений иммунореактивности животного, а так же исследуют параметры иммунитета (например, состав крови и гемолимфы, наличие антител в жидкостях организма, концентрации белков плазмы).

Изучение изменений врожденного и приобретенного иммунитета у животных (позвоночных и беспозвоночных) во время оценки состояния окружающей среды является сутью иммунологического подхода. Для этого критерием состояния служат параметры иммунитета животных, их популяций и сообществ экосистем при техногенном воздействии и в нормальных условиях [Мелехова, 2007].

1.2 Методы биотестирования

В биотестировании применяется множество различных методов. Некоторые из них мы рассмотрим ниже.

Метод индивидуальных линий парамеций

Этот метод применяется для определения острой летальной токсичности воды. Основан он на определении количества погибших или обездвиженных особей после размещения в тестируемой воде или вытяжке. Признаком острой летальной токсичности этого теста является обездвиживание или гибель 50% и больше особей за 1 час в тестируемой воде в сравнении с их исходным количеством. В качестве тест - объектов используют специальную лабораторную монокультуру Paramecium caudatum Ehrenberg (то есть одноклеточные организмы размером 180 - 300 мкм). Питаются они мелкими жгутиконосцами, водорослями и бактериями. Для выращивания культуру парамеций используют водопроводную воду без содержания свободного хлора (то есть дехлорированную). В эту воду добавляют пастеризованное молоко, разбавленное в 20 раз такой же водой. В основном культуру инфузорий пересевают только один раз в месяц, но при необходимости пересев проводят один раз в три недели. Для кормления инфузорий используют молоко, разбавленное в 20 раз водопроводной дехлорированной водой. Кормят культуру каждый день. Оптимальная температурой для содержания культуры парамеций является температура 24-28°С. Культуру можно оставлять при комнатной температуре. Так же ее содержат в темноте, чтобы не развивались водоросли [Галицкая,2011].

Этот метод применяется для определения острой токсичности поверхностных, пресных, грунтовых, питьевых и сточных вод.

Метод оценки токсичности воды с использованием параметров хемилюминесценции

Метод основан на определении параметров индуцированной хемилюминесценции (ХЛ) воды или водных экстрактов донных осадков в системе перекись водорода - люминол в ТРИС-Н1 буфере (pH = 7,4).

Хемилюминесценция -- это свечение тел, которое вызвано химическим воздействием (например, свечение фосфора при медленном окислении), или при протекании химической реакции (например, каталитические реакции некоторых эфиров щавелевой кислоты с пероксидом водорода в присутствии люминофора). Хемилюминесценция связана с тепловыделяющими химическими процессами. Возникает она в результате рекомбинации образующихся в системе свободных радикалов - химически и биологически активных соединений, являющихся продуктами одноэлектронных (свободнорадикальных) окислительно-восстановительных реакций. Соединение-индуктор вводится в систему, чтобы придать протекающим в ней свободнорадикальным реакциям цепной или лавинообразный характер и тем самым спровоцировать так называемую медленную вспышку хемилюминесценции. Оценка токсичности ведется по интегральному параметру, представляющему собой среднее арифметическое из всех отклонений исследуемых параметров ХЛ опытной пробы от соответствующих параметров контрольной пробы, независимо от знака отклонения [Корпакова, 2007].

Метод предназначен для контроля качества окружающей среды, экспресс - оценки содержания токсических веществ в биологических жидкостях и выявления неблагоприятной экологической ситуации.

Метод оценки токсичности по изменению люминесценции светящихся бактерий

Биотесты микробиосенсор В17-677F (на основе светящихся лиофилизированных бактерий Photobacterium phosphoreum из коллекции культур ИБСО) и микробиосенсор ЕСК (на основе генетически модифицированного штама E. coli Z905, несущего плазмиду PHL1 с lux-геном из Photobacterium leiognathi) разработаны в институте биофизики СО РАН. Биотесты являются стандартными тест - объектами для измерения интегральной токсичности исследуемых водных образцов, исключают потребность культивирования и поддержания бактериальных культур с маркерным lux-геном.

Отобранные пробы воды хранят при 40°С, затем анализируют с их предварительной фильтрацией и без нее. К клеточной суспензии, содержащей 109-1010 клеток/мл (в 3% растворе хлорида натрия), добавляются растворы с определенной концентрацией токсикантов. Интенсивность бактериальной люминесценции измеряется с использованием стандартной методики с помощью биолюминометра, который создан в Институте биофизики.

Токсичность образца оценивается по величине биолюминесцентного индекса, который рассчитывается по формуле (1):

БИ=(I_o/I_k) или БИ=(I_o/I_k)100%,(1)

где БИ - остаточная относительная активность люминесценции,

I_o - интенсивность свечения бактерий в опытном кювете,

I_k - интенсивность люминесценции бактерий в контрольном кювете.

«Норма» БИ = 0,8 - 1,2 отн. Ед. или 80 -120 % [Родичева, 2004].

Применяется данный метод для оценки загрязнения природных водных источников, промышленных стоков и почв.

Метод биотестирования с помощью Daphnia magna

В качестве тест - объектов используются лабораторные монокультуры рачков - фильтраторов Daphnia magna Str. Daphnia magna Str является стандартной тест - объектом в водной токсикологии [Зерщикова, 2004].

Дафнии относятся к роду ветвистоухие рачки. Рачок овальной формы, передвигается в воде скачками при помощи антенн, которые развитых несоразмерно с телом. Само тело неявно сегментировано на головной, грудной и брюшной отделы и сжато с боков. Самки крупнее самцов в 2 - 2,5 раза. Снаружи туловище покрывает прозрачный двустворчатый хитиновый панцирь, который состоит из двух слоев и несет защитную функцию туловища вместе с 5 парами конечностей. В пространстве между верхней и верхнебоковой стенками раковины и спиной туловища образуется выводковую камеру. В этой камере вынашиваются яйца, а также протекает их эмбриональное развитие. В основном дафнии отлавливают в теплое время года. В осеннее время можно собрать эфиппии в больших количествах на поверхности воды, из которых можно выводить культуру. Но в этом случае, невозможно заранее предугадать какие именно виды, будут преобладать.

Оптимальные условия для дафний: свет 14 - 16 часов в день, pH = 7,2 - 8,0, температура 20 - 24°С, слабая аэрация. При содержании дафний в лабораторных условиях их ежедневно подкармливают хлореллой (200 тыс. клеток/мл) или пекарскими дрожжами (2мл суспензии на 1 л воды). В нормальных условиях вода должна быть слабо-зеленого или слабо-коричневого цвета, а при неблагоприятных условиях она обретает коричневый цвет.

В качестве корма также используются хлебопекарные дрожжи. Для этого 1 г свежих или 0,3 воздушно-сухих дрожжей заливают 100мл дистиллированной воды. После набухания дрожжей все тщательно перемешивают. Образовавшуюся суспензию отстаивают в течение 30 минут. Недостаточную жидкость в пропорциях 3 мл на 1 л воды добавляют в сосуды с дафниями. При средней плотности тест - культуры 20-30 половозрелых самок в 1 л воды подкармливание проводят 1 - 2 раза в неделю.

Спустя несколько месяцев культура дафний истощается. В этом случае рекомендуется устроить им «зимовку» для стимулирования откладки эфипииев. Достаточно просто уменьшить интенсивность кормежки, а потом и вообще перестать их подкармливать и немного понизить температуру, чтобы образовалась масса эфиппиев [Бубнов, 2007].

Дафний для опытов разводят в лабораторных условиях. Для контроля можно использовать аквариумную воду с постоянной аэрацией, в которой культивировали рачков. Опыты проводятся в стеклянных сосудах вместимостью 300 см³. В сосуды помещают по шесть экземпляров 5-6 - суточных дафний, в трех повторностях на каждый опыт. Токсичность определяют по гибели 50% дафний и более в опыте по сравнению с контролем согласно шкале токсичности Н.С. Строганова. В ходе опытов регистрируются такие показатели, как выживаемость, физиологическое состояние дафний и симптомы гибели [Мичукова, 2006].

Данный метод применяется для определения качества сточных, природных вод, системы хозяйственно - питьевого водоснабжения, донных отложений.

Allium test

Для проведения мониторинга окружающей среды на цитогенетическом уровне эксперты Всемирной организации здравоохранения рекомендуют использовать в качестве стандартного Allium test. В этом тесте объектом исследования является меристема проростков корешков лука посевного - Allium cepa сорта Штут-гартен-Ризен.

Луковицы A. cepa помещаются в стаканчики на 25 мл с тестируемыми растворами. Так же параллельно с этими опытами закладывается контроль.

Для соответствия современного стандарта по проведению опытов по этому методу проводят повторность, используя при этом по три луковицы каждого варианта. Луковицы проращивают в течение четырех дней. Затем срезаются у каждой луковицы корни под основание донца и проводят оценку токсического и митозмодифицирующего действия. В первом случае определяют длину корней и исследуют изменение длины корней, что является показателем токсичности изучаемого фактора и используется в качестве краткосрочного скрининг - теста. Методика эксперимента следующая: проращивают луковицы в течение четырех дней, далее измеряют длину каждого корешка. Затем определяется среднее арифметическое (X) и ошибка среднего (m) для варианта опыта. После измерений корни фиксируются в фиксаторе Кларка. Для цитогенетического анализа, согласно методике готовятся препараты давленых корневых меристем (по 9 препаратов на вариант опыта).

Для определения митозмодифицирующего действия используют показатели митотического индекса (MI, %). Он определяется как отношение числа делящихся клеток к общему числу рассмотренных на препарате клеток. Чтобы вскрыть причины изменения митотической активности, анализируется продолжительность каждой фазы митоза, и определяются фазные индексы. Фазные индексы - это отношение количества клеток, находящихся на стадии профазы, метафазы и так далее, к общему количеству проанализированных митозов. Обозначаются они следующим образом ПИ, % - профазный индекс; МИ, % - метафазный и тому подобное. Проводится сравнение долей различных фаз в контрольных и опытных вариантах.

Allium test является экономичным, так как на нем (в отличие от микроорганизмов) можно регистрировать все типы генетических повреждений: геномные, хромосомные, генные, а также в свою очередь позволяет выявлять мутагены (непосредственно повреждающие ДНК) и промутагены (генетически безопасные факторы, но приобретающие мутагенную активность в процессе метаболизма в организме) [Песня, 2012].

Данный метод используется для анализа мутагенности, митотоксичности и токсичности различных факторов. А также для мониторинга окружающей среды.

Методика биотестирования по гибели пресноводных аквариумных рыб Poecillia Reticulata Peters (гуппи)

В качестве тест - объектов используют мальков гуппи в возрасте от 24 до 48 ч. Для выведения этих мальков используют рыб не старше 2 лет (продолжительность жизни гуппи 3 - 3,5 года), без каких - либо признаков на заболевания.

Самцов и самок, использующих в тестировании содержать в отдельных аквариумах, так как совместное содержание влияет на рост самцов. В этом случае они будут расти медленнее, чем должны. Половозрелые гуппи имеют четко развитые половые признаки. Это облегчает их сортировку. Самки достигают длину до 6 см. Самцы же мельче, длиной примерно 3-4 см. Также самцов и самок можно различить по их окраске. Самцы более яркие, чем самки, у них преобладают серовато-коричневые тона с очень яркими красными, голубыми, зелеными и черными пятнами. Самки же чаще желто-зеленые. Анальный плавник у самок и молодых самцов округлый. С возрастом, в период полового созревания, анальный плавник самцов начинает удлиняться и превращается в подвижный гоноподий.

Для содержания производителей используют любые аквариумы с постоянной температурой воды 25±1°С.

Посадки производят со следующей плотностью: самцы на 1 - 2 дм³ воды на экземпляр, самок - не менее 4 дм³. Перед тем как разместить рыб аквариумы засаживают растениями без жестких, режущих кромок. Предпочтение стоит отдать густым мелколистным, плавающим растениям (например, риччия, сальвиния). В аквариуме должно быть свободное пространство для плаванья.

Освещаются аквариумы верхним светом не менее 8 ч в сутки. В качестве источника света можно использовать обычные лампы дневного света.

Для разведения и содержания производителей используют только питьевую воду. Ее отстаивают в течение 7 суток, аэрируют, фильтруют, и затем термостатируют 25±1°С. В такой воде должно содержаться не менее 4 мг/дм³ растворенного кислорода. Один раз в месяц 1/3часть воды меняют на свежую. Добавлять воду нужно именно той же температуры, что и в аквариуме. При испарении воды в аквариум добавляют дистиллированную воду. Корм рыбам дают в таком количестве, чтобы они могли съесть все без остатка за 3 - 5 минут.

Для получения мальков для тестирования, самок и самцов помещают в один аквариум. Гуппи относятся к рыбам с внутренним развитием икры, которые способны к нересту полностью оформившихся мальков.

По темному пятну перед анальным плавником самки можно определить ее готовность к нересту. При этом форма брюшка становиться похоже на прямоугольник и становится намного шире спины.

Самку, готовую к нересту, помещают в отдельную посудину для нереста, вместимостью не менее 4 дм³ и содержащую большое количество мелколистных растений. Нерестовые посудины наполняют водой такого же качества, как и для содержания производителей с постоянной температурой 25±1°С.

Самки поедают своих мальков, поэтому их следуют удалять после нереста. Для кормления мальков используют специальную «пыль», в состав которой входит: эвглена, молоди ветвистоусых рачков, инфузории, коловратки и личинки веслоногих рачков. Если такая «пыль» отсутствует, то можно их кормить перетертой сухой дафнией, а также любым другим сухим кормом. На 100 рыб такого корма необходимо не более 1 грамма в сутки. С ростом рыб, в их рацион вводятся резаный трубочник, мотыль, коретра и другие живые корма. Одно- и двухдневных мальков кормят по 5 раз в день, более взрослых 2-3 раза.

Для избегания неравномерности развития мальков их сортируют и постепенно переводят из нерестовых посудин в аквариумы вместимостью 50дм³, а далее 200 дм³. Воду в аквариумы заливают такую же, как и для производителей гуппи.

Тестируемые организмы (возрастом 1 - 2 суток) перед постановкой экспериментов проверяют на пригодность для биотестирования. Для этого устанавливают среднюю летальную концентрацию раствора эталонного вещества C₂Cr₂O₇ за 24 часа биотестирования (ЛК₅₀ за 24ч). Готовят C₂Cr₂O₇ известный концентрацией 10 мг/дм³, используя при этом дистиллированную воду. Далее из исходного раствора готовят серию растворов с концентрациями C₂Cr₂O₇ от 100 до 200 мг/дм³ с интервалом 25 мг/дм³, используя культивационную воду.

Биотестирование этих растворов проводят продолжительностью 24 часа в соответствии со следующими операциями:

1.Разбавленная проба воды или водной вытяжки, буровых растворов и растворы с различными концентрациями вещества (смеси веществ) готовят прибавлением определенного объема анализируемой пробы в дехлорированную питьевую воду.

2.Приготовленные пробы воды или водной вытяжки, буровых растворов и растворы с различными концентрациями вещества (смеси веществ) наливают в сосуды по 5 дм³, то есть закладывают опыт. Другие сосуды наполняют таким же образом дехлорированной питьевой водой для контроля. Повторность опытов и в контроле трехкратная.

3.В каждый из опытных и контрольных сосудов помещают по 10 экземпляров гуппи в возрасте от 24 до 48 ч.

4.Продолжительность биотестирования составляет 96 ч. Во время биотестирования рыб не кормят.

5.Ежедневно подсчитывается количество живых рыб, и удаляются погибшие особи. Погибшими считают рыб, которые не подают признаков движения и дыхания при прикосновении к ним стеклянной палочки.

Полученные результаты заносят в таблицу и строят график зависимости «% погибших рыб - время». По графику находят ЛТ₅₀ для C₂Cr₂O₇.

На основании полученных результатов рассчитывают ЛК₅₀ за 24 ч для C₂Cr₂O₇. Если полученная величина ЛК₅₀ для C₂Cr₂O₇ за 24 ч находится в экспериментально установленном диапазоне реагирования тест - объектов 106 - 175 мг/дм³, гуппи пригодны для биотестирования. Если ЛК₅₀ за 24 ч для C₂Cr₂O₇ не находится в указанном диапазоне реагирования, то проверяют условия культивирования тест - объектов, чтобы выяснить причины ухудшения состояния культуры.

Методика основана на установлении разницы между количеством погибших рыб в контрольной воде и воде с токсичными веществами, что и является критерием острой летальной токсичности. Гибель рыб 50% или более в опыте по сравнению с контролем в течение 96 ч [Бубнов, 2007].

Метод применяется для установления токсичности подземных, поверхностных и сточных вод, буровых растворов, донных отложений, водных растворов отдельных веществ и их смесей.

1.3 Место биотестирования на молекулярно - генетическом уровне

Этот метод не самый популярный, но используется для оценки качества окружающей среды. Например, для оценки степени токсического загрязнения среды наряду с широко распространенными методами химического анализа активно используются и методы биотестирования. А использование Daphnia magna и вовсе является обязательным в России при установлении ПДК отдельных веществ в воде рыбохозяйственных водоемах [Хмырева, 2010].

Так же методы биотестирования охватывают почву, водные объекты, нижние слои атмосферы. Специалисты разных областей науки используют методы биотестирования. Например, в сельском хозяйстве для быстрого тестирования кормов на токсичность, в гуманитарной и ветеринарной медицине для исследования свойств внутренних сред высших организмов, в экологической токсикологии для анализа вод и почв и так далее [Терехова, 2011]. С помощью методов биотестирования, которые в основном разработаны для природных, питьевых и сточных вод, можно осуществлять интегральную оценку качества почв. В качестве наиболее распространенных тест - объектов используют пресноводных рачков Daphnia magna, инфузорий, микробные биосенсоры, и другие. Из-за специфического содержания тест - культур, не все методы биотестирования можно использовать в качестве оперативных.

Также методы биотестирования используются для понимания и изучения биологических процессов человека, которые могут быть связаны с его заболеваниями. Например, такие как врожденный иммунный ответ, продолжительность жизни, васкулогенез, обучение и память, циркадные ритмы, регуляция роста и так далее [Юрченко и другие, 2015].

Глава 2. Методика экспериментов

Для изучения различных этапов работы с Drosophila melanogaster выполнялись модельные эксперименты с различными продуктами питания. Для экспериментов использовали дрозофил линии vestigial (vg), культивируемые при средней температуре равной 23єС в течении длительного времени на кафедре зоологии и экологии ВоГУ. Мухи выращивались на среде, состоящей из агар-агара, манной крупы, сахара и дрожжей. Срок развития составлял в среднем 9 дней.

Для изучения путей, приводящих к повышению эффективности культивирования Drosophila melanogaster, использовали классический биологический эксперимент.

Опыт культивирования дрозофил в течение двух лет показал, что культуру часто поражают плесневые грибы. Для изучения закономерностей их появления и разработки метода борьбы изучались факты поражения среды плесневыми грибами. С этой целью фиксировалось степень поражения субстрата на пятый день.

Поскольку существует мнение, что культура заражается плесневыми грибами с помощью мух, был проведен эксперимент по их стерилизации. Стерилизация - процесс уничтожения всех видов микроорганизмов, включая грибы, с помощью химического или физического воздействия. Суть эксперимента заключалась в следующем: мух пересаживали на соду.

Поскольку определенную трудность составляет, пересадка мух на субстрат изучались способы иммобилизации тест - объекта с минимальной смертностью. Рассмотрены следующие методы: пересадка пупарий на субстрат и уменьшение активности мух при помощи понижения температуры.

В ходе экспериментов наблюдалось появление плесневых грибов, а также смертность мух от пониженных температур. В первом случае эмпирически определялось проективное покрытие субстрата плесневыми грибами. А во втором эксперименте, мы пересаживали мух в чашки Петри и помешали их в холодильник и морозильную камеру. В каждой чашке было по 10 мух. Всего было заложено 10 опытных образцов. Через каждую минуту доставали по одной чашки Петри (остальные оставались в холодильнике и морозильной камере при температуре: +1єС и 15єС). Спустя две минуты производился подсчет выживших мух.

Для экспериментов мы использовали следующие оборудование: холодильник, морозильную камеру, чашки Петри, секундомер, уличный термометр.

Поддержание линий дрозофилы

Для поддержания линии получали ряд последовательных поколений, сохраняя их гомозиготность. Засорения можно избежать путём постоянного контроля и оценки чистоты линии при каждой пересадки мух, используемых для дальнейшего размножения.

В баночку помещали не более пяти самок и такое же количество самцов. При большем количестве самок возрастает опасность перенаселения, в результате которого плодовитость мух снижается. Если линия обладает низкой жизнеспособностью и плодовитостью, следует увеличить количество самцов в расчёте на одну самку. Для того чтобы не потерять линии, каждую из них вели в нескольких баночках (не менее 5 - 20).

Оптимальной считается среда не более 1-2 дней приготовления. Использование более «старой» среды не целесообразно. При проведении опытов по скрещиванию самцы находились вместе с самками около 4-5 суток. После этого, во избежание перенаселения, родительское поколение удаляли из баночки [Козак, 2007].

Культуру держали при температуре 24 - 25єС, поскольку при этой температуре цикл развития равен приблизительно 10 суткам. Для поддержания линий некоторыми авторами рекомендуется температура 20єС (цикл примерно будет равен 12 - 15 дней). При температуре 27єС цикл развития сокращается до 9 суток. С понижением температуры цикл развития сильно замедляется [Медведев, 1968].

Приготовление питательной среды

Основными компонентами использованной среды для культивирования являются сахар, дрожжи, манная крупа, вода и агар-агар (табл. 1) [Медведев, 1968].

Таблица 1 -- Состав питательной среды для дрозофилы (в расчёте на определённое количество бутылок)

Количество бутылок	5	10	20	30	40	50	60	70	80
Вода	100	200	300	400	500	600	700	800	900
Агар	1,2	2,5	3,8	5,1	6,4	7,7	9,0	10,2	11,5
Дрожжи	11,5	21,4	32	43	54	64	75	86	94
Манная крупа	4	7	11	14	18	21	25	29	32
Сахар	4	7	11	14	18	21	25	29	32

На технических весах взвешивали все составные части среды. К навеске агар-агара добавляли соответствующее количество холодной воды и дрожжи, периодически помешивая, доводили до кипения. Варили среду в стеклянной колбе, поскольку в эмалированной посуде она, как правило, пригорает.

По истечении 30-минутного кипения добавляли сахарный песок и манную крупу и постоянно помешивали, чтобы избежать образования сгустков манной крупы. Кипятили 15 минут.

После окончания варки среду охлаждали до 60-70єС и разливали в специальные баночки, которые заранее стерилизовали в жарочном шкафу. Разливали среду так, чтобы она не попадала на стенки. Баночки закрывали стерильными ватными пробками. Такая среда пригодна для использования в течение двух-трех дней при условии хранения её в холодильнике.

Глава 3. Характеристика Drosophila melanogaster как модельного биологического объекта

3.1 История использования дрозофилы как модельного объекта в биологических исследованиях

На протяжении столетий Drosophila melanogaster занимает центральное место в генетических исследованиях и является главным модельным объектом в экспериментальной биологии. В сущности, история открытий на дрозофиле показывает этапы становления генетики. Безусловно, генетика конечной целью своего применения видит человека, но в силу этических и биологических ограничений, человек не может рассматриваться как объект генетических экспериментов [Юрченко и другие, 2015].

В 1908 года Томас Хант Морган начал свои исследования с Drosophila melanogaster. Он был, первым кто выбрал ее для своих работ. Сначала их вылавливал сачком в бакалейных и фруктовых магазинах, а опыты проводил в так называемой «Fly room» (мушиной комнате). Это была тридцатипятиметровая комната в Колумбийском университете, заставленная бутылками, банками, плошками и колбами, в которых разводились мухи. В 1910 году Т.Х. Морган обнаружил мутацию «белые глаза» у Drosophila melanogaster. Им было показано, что мутантный ген локализуется в Х-хромосоме [Юрченко, Голубовский, 1988]. Определив, что ген окраски глаз дрозофилы локализован в Х-хромосоме, а также проследив за поведением генов в потомстве определенных самцов и самок, Т.Х. Морган и его сотрудники получили убедительное подтверждение предположения о сцеплении генов [Самин, 2000]. В 1910 году опубликована первая генетическая работа Т.Х. Моргана «Ограниченная полом наследственность у дрозофилы», посвященная описанию мутации белоглазости.

К 1913 году Т.Х. Морган выявил уже целый ряд различных мутаций дрозофилы, которые приводили к изменению морфологии крыла и окраски глаз. Эти мутации также были сцеплены с полом. Далее, продолжая свои исследования, Т.Х. Морган задумался о причинах того, что некоторые гены наследовались реже, чем того следовало ожидать. Он предположил, что хромосомы, которые собраны в пары, могут расщепляться и обмениваться своими участками, генами. Этот процесс был назван кроссинговером. В последствие на основе этого выдвинули, а затем подтвердили предположение о линейном расположении генов в хромосомном материале. А расстояние между генами было условлено измерять с помощью условных единиц, которые в последствие были именуемы от фамилии ученого - морганидами.

Работа Т.Х. Моргана и его сотрудников позволила увязать в единое целое данные цитологии и генетики, а также позволила создать хромосомную теорию наследственности.

За это открытие в 1933 году Т.Х. Морган был награжден Нобелевской премией по медицине и стал первым ученым-генетиком, который получил эту премию. А благодаря своему взносу в работу Моргана, дрозофила стала экспериментальной моделью [Юрченко и другие, 2015].

В 1926 году ученый Герман Джозеф Мёллер, ученик Т.Х. Моргана, провел ряд опытов по воздействию рентгеновского излучения на живые организмы. В качестве модельного объекта снова выступила дрозофила. В результате своих исследованиях он выявил четкую взаимосвязь между дозой радиационного облучения и количеством летальных мутаций в популяции дрозофил. С этими данными в 1927 году Г.Д. Мёллер выступил на V международном Генетическом Конгрессе в Берлине. В 1928 году результаты его исследований были подтверждены на осах и кукурузе, а 1946 году за свои работы в области мутагенного действия рентгеновских лучей Г.Д. Мёллер была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине [Юрченко и другие, 2015].

С дрозофилой работал и русский ученый Феодосий Григорьевич Добржанский, она являлась генетическим объектом в его исследованиях. В свое время он стажировался в лаборатории Т.Х. Моргана. Ф. Г. Добржанский смог установить генетические основы полиморфизма популяций дрозофилы - подразделяя их на репродуктивно изолированные (не способные скрещиваться друг с другом) группы. Ф.Г. Добржанский показал, что преимущества разных рас дрозофилы проявляются при разных условиях, определяемых, например, временем года, характером доступной пищи, температурой окружающей среды, высотой над уровнем моря. Совместно с Д.М. Смитом он определял скорость естественного отбора в природных, а затем и в экспериментальных популяциях. Исследования Ф.Г. Добржанского создали предпосылки для объяснения механизма формирования новых рас и видов и позволили построить синтетическую теорию эволюции [Захаров, 2010].

В 1917 г. Николаем Константиновичем Кольцовым была организована лаборатория генетики на базе Института экспериментальной биологии, в которой с 1921-1929 гг. работал Сергей Сергеевич Четвериков. В 1925 - 1926 годах проводилось первое в мире широкомасштабное экспериментальное исследование насыщенности природных популяций дрозофилы наследственными изменениями - мутациями. Вместе с С.С. Четвериковым участвовала его жена А.И. Четверикова и 10 его ближайших учеников и сотрудников, которые входили в состав лаборатории генетики: Н.К. Беляев, Б.Л. Астауров, С.М. Гершензон, Е.И. Балкашина, Е.А. Тимофеева - Ресовская, Н.В. Тимофеев - Ресовский, С.Р. Царапкин, А.Н. Промптов, Д.Д. Ромашов, П.Ф. Рокицкий [Бабков, 1985; Фандо, 2005]. В 1922 году С.С. Четвериков с успехом провел свои исследования. Эксперименты были проведены на местных и привезенных Г.Д. Мёллером видах дрозофилы. В 1926 г. публикуют основополагающую статью ученого «О некоторых моментах эволюционного процесса с точки зрения современной генетики», которая положила начало популяционной генетике. С.С. Четвериков доказал, что мутации в природных популяциях животных не исчезают, могут накапливаться в гетерозиготном состоянии и давать материал для изменчивости и естественного отбора. В этой статье ученому удалось связать учение Дарвина и законы наследственности, установленные генетикой. Сходные работы в этой области были выполнены зарубежными исследователями - англичанами Р. Э. Фишером и Дж. Холдейном и американцем С. Райтом в 1930-е гг.