Поиск и оптимизация условий культивирования, влияющих на синтез микроорганизмами экономически значимого продукта

Более конкретно - для пары вектор - столбцов (1;7) сочетание (- -) встречается 3 раза, сочетание (+ +) 3 раза, (+ -) 5 раз,(- +) 5 раз, в то время как в ортогональной паре вектор-столбцов (1;2) все названные комбинации встречаются по 4 раза. Неортогональные пары вектор - столбцов плана табл.7 перечислены не полностью.

Следовательно, по крайней мере, для перечисленных вектор - столбцов априорные частоты встречаемости общих пар факторов в паре экспериментов получаются отличными от равномерного распределения, что приводит к сильно смещенному учету сочетаний факторов по три и более, априорному преимуществу одних сочетаний факторов и потере других сочетаний. Такое расположение факторов уменьшает качественное разнообразие проверяемых вариантов питательных сред и смещает оценки учета групп факторов, внося трудно контролируемые предпочтения одних комбинаций факторов перед другими.

Кроме этого, в рассматриваемом плане табл.8 отсутствует вариант испытания, в котором все факторы находятся на верхнем уровне. Следовательно, при построении плана с противоположными уровнями будет отсутствовать эксперимент со всеми факторами на нижнем уровне, что усложняет применение непараметрического критерия - метода парных сравнений, эффективного в случае большой ошибки измерения ВП, или при качественной оценке ВП. Отсутствие эксперимента с расположением всех факторов на верхнем (нижнем) уровне приводит к потере многих комбинаций факторов и сокращает количество проверяемых вариантов условий культивирования при том же, как и в плане таб.6, числе опытов. Эксперимент, учитывающий все факторы на одном уровне так же служит внутренним стандартом при обработке результатов поиска. Некий эталон, по которому можно судить, есть ли меньшая комбинация факторов с таким же или большим ВП, нет ли во всей выборке ингибирующих факторов. Это несложно сделать по месту эксперимента со всеми верхними уровнями факторов в ранжированном ряду. Если названный эксперимент - достоверно самый лучший, то нужна вся выборка, если в середине распределения, то есть ингибирующие факторы и нужны не все, т.е. задача отсеивания решается нагляднее, проще и полнее.

Предлагаемый план табл.6 подходит так же для задачи поиска сочетаний факторов, влияющих на синтез целевого продукта при наличии синтеза при культивировании на гидролизате или вытяжке природного сырья после разделения его физико-химическими методами (ионообменная хроматография, гель - фильтрация и т.д.) при наличии большого количества фракций. Из плана табл.6 при наличии проверяемых факторов не более 16 можно выбрать оптимальный план в смысле равномерного учета сочетаний пар факторов и максимального количества противоположных экспериментов, оставив столбцы 1-4 и 11 - 14 (всего 8 столбцов).

Предлагаемая запись плана ОЭ табл.6 позволяет уменьшить вероятность ошибки при выполнении экспериментальной части работы, поскольку обозначение факторов легко увязать с нумерацией столбцов. Упорядоченность расположения факторов в таб. 6 меньше напрягает внимание и уменьшает вероятность промаха исполнителем. Это отвечает 0-гипотезе о наибольшей значимости сочетания факторов (1;-2) на указанных уровнях. Если после реализации эксперимента и ранжировку результатов получилось иное расположение, то эту 0-гипотезу можно обоснованно отвергнуть.

Кроме этого, было увеличено количество проверяемых факторов путем размещения на каждом уровне новой добавки (сверхнасыщенность плана поискового эксперимента 2-го типа). Так, в первом столбце поместили пару глюкоза 2г/л - эритрит 2г/л, т.е. на верхнем уровне - глюкоза, на нижнем - эритрит. Во втором столбце - фосфат натрия 4 г /л, рН 7,2, на верхнем уровне (ВУ), на нижнем уровне (НУ)- фосфат той же концентрации, рН 7,8. Столбец 3 - ВУ гидролизате казеина кислотный 10 г /л, НУ - 5 г /л. Столбец 4 ВУ аргинин 20 мг/ л, НУ лизин 30 мг/ л. Столбец 5 (С5) - ВУ цистин 10 мг/ л, НУ метионин 8 мг/ л., .С :6 ВУ глютамин 200 мг/ л, НУ- лейцин 20 мг/ л. С7 ВУ - гистидин 10 мг/ л, НУ - феилаланин 15 мг/ л. С8 ВУ - треонин 20 мг/ л, НУ - триптофан 5 мг/ л. С9 ВУ - тирозин 15 миг /л, НУ -валин 20 мг/ л. С10 ВУ - пантотенат Са 1 мг/ л, НУ -холин 1 мг/ л. С11 - ВУ фолиевая кислота 1 мг/ л, НУ - никотинамид 1 мг/ л . С12 ВУ - пиридоксаль 1мг/ л, НУ тиамин 1 мг л . С13 ВУ - СаСl₂300 мг л, НУ СаСl₂ 150 мг/ л. С14 ВУ - МgSO₄ 200 мг /л, НУ - МgSO₄ 100 мг /л. С15 ВУ - NаСl 5 г /л, НУ - NaCl 1 г/ л.

Такая сверхнасыщенность второго типа (количество проверяемых факторов выше количества испытаний) позволяет добиться максимального качественного разнообразия проверяемых вариантов при выбранном количестве испытаний.

В дополнение к этому количество экспериментов было увеличено в 2 раза путем построения к каждой строке исходного плана табл.6 противоположной строки. В целом был достроен такой же план, в котором уровни в вариантах экспериментов переставлены местами. Наличие пар противоположных экспериментов упрощает обработку с применением непараметрического критерия - метода парных сравнений /7/, необходимого при большой ошибке измерений либо качественной и экспертной оценке ВП, а также при построении корреляционных таблиц и корреляционных полей. Пары противоположных экспериментов по расположению факторов на уровнях варьирования позволяют обнаружить небольшие различия ВП даже при качественном анализе и экспертных оценках ВП. При минимальном привлечении арифметических вычислений, только на основе логических рассуждений, строго обоснованных математиками, без проведения значительного объема арифметических вычислений в явном виде на ранней стадии применения многофакторного поискового эксперимента и обработки результатов измерений. Это служит минимально субъективной основой постановки следующих опытов.

Наличие эксперимента, в котором все факторы находятся на верхнем (нижнем) уровнях позволяет учесть все теоретически возможные сочетания, а также служит внутренним стандартом для проверки гипотезы о том, что не все выбранные факторы необходимы для обеспечения нужного синтеза. Предлагаемое увеличение в 2 раза количества экспериментов методически несложно, достаточно поменять пробирки с добавками местами и работать по тому же плану.

Задача ОЭ - найти хотя бы одно сочетание факторов, обеспечивающих синтез целевого продукта, отличный от 0. Само по себе первичное выделение для проверки относительно небольшого числа подозреваемых переменных и их концентраций (интенсивностей) из нескольких сотен потенциально возможных до проведения эксперимента лежит вне математики, полностью определяется опытом, интуицией и фантазией исследователя, а также способностью учесть априорную и аналоговую информацию.

Естественно, что чем больше выделено множество подозреваемых факторов на первом этапе, то тем вероятнее найти регуляторную комбинацию добавок. Увеличение количества подозреваемых факторов на первом этапе подразумевает использование активных поисковых экспериментов с большим количеством испытаний в серии, что повышает точность измерения ВП и надежность прогнозов.

На втором этапе, после нахождения группы активных факторов, можно поставить уточняющий эксперимент по плану таб.9, построенному на основе ПФЭ 2³ по правилу таб.5.

Таблица 9

План второго шага ОЭ на основе ПФЭ 2³

В таб. 9 условие ортогональности всех вектор - столбцов выполнено, но столбец 7 исходной таблицы можно заменить на противоположный (альтернативный столбец) при сохранении ортогональности вектор - столбцов (равномерному учету пар факторов). Это приведет к потере сочетаний факторов (1;6;7) и (1;5;7) и некоторых других. Такой план оптимален при наличии информации об ингибирующем или нейтральном действии указанных сочетаний факторов. Сочетания (3;4;6), (4;6;7), (5;6;7) присутствуют по 2 раза, что можно учесть при наличии информации из предварительных экспериментов об их возможной важной роли. Все возможные варианты рассмотреть сложно и нет смысла в этом. Необходимо производить выбор плана, близкого к оптимальному, для каждого конкретного случая. Наличие априорной или полученной на первом этапе информации о сильнодействующих сочетаниях факторов, либо нейтральных по влиянию на ВП позволяет учесть это и применить планы поиска, оптимальные для каждого конкретного случая, особенно на последующих, уточняющих этапах поиска.

План табл. 9 построен из ПФЭ 2³ по правилу табл.5. Его так же можно рассматривать как дробную реплику максимальной дробности от ПФЭ 2⁷ (ДФЭ 2^7-4). В названном плане учтены все возможные сочетания факторов по 2 (ортогональность вектор - столбцов) и смещены оценки для сочетаний факторов высших порядков. В плане таб.9 верхние уровни факторов учтены более полно, чем нижние, т.к. отсутствует строка (план эксперимента), в которой все факторы находятся на нижнем уровне. Можно построить план, который будет смещен в пользу предпочтения нижних уровней.

Таблица 10

План ОЭ второго шага, смещенного в пользу нижних уровней

В плане таб. 10 отсутствуют сочетания факторов (1;3;7); (3;4;7); (4;5;6); (2;3;6); (3;4;6). Сочетания (-1;-2;-3); (-1;-3;-5); (-1;-6;-7) присутствуют по 2 раза. Представлены все теоретически возможные сочетания факторов на нижних уровнях. Одновременное использование планов таб.9 и таб.10 позволяет учесть все сочетания факторов по 3 из 7 испытуемых с одинаковым весом. Сочетания факторов более высоких порядков будут учтены с минимальными смещениями. Более полный план из 8^ми столбцов (до 16 факторов) на 16 строчек (экспериментов) можно получить из плана таб.1, выбрав столбцы 1-4 и 11-15.

В классическом руководстве Максимова, Федорова /1/ приведены двухуровневые планы сверхнасыщенных отсеивающих экспериментов по методу случайного баланса, рассчитанные Booth, Cox. Эти планы позволяют проверить до 35 факторов на 16 экспериментах при общепринятой расстановке факторов или до 70 факторов при предложенной выше альтернативной расстановке 2^х факторов в каждом столбце (каждый новый фактор на одном из уровней, сверхнасыщенность второго типа)

Двухуровневые планы можно расширить введением дополнительных столбцов, учитывающих изменения дополнительных факторов на 3^х и более уровнях без ограничений на оптимальность по каким-либо критериям, что вполне оправдано на первоначальных, поисковых этапах работы, при минимальной информации об особенностях культивирования конкретного продуцента. Иногда в литературе по планированию такие планы называют частично сбалансированными неполноблочными планами. Например, можно поставить эксперимент по плану таб.1 при трех разных температурах культивирования. Такие планы можно назвать относительно оптимальными. Их построение, увеличение количества проверяемых факторов и уровней варьирования концентраций (интенсивностей) ограничивается только фантазией экспериментатора и экономическими возможностями, во многом стоимостью (и временем) измерения ВП или стоимостью испытания.

После реализации первого ОЭ возможно, что только в нескольких экспериментах ВП отличен от 0 и это уже хорошо, т.к. искомое сочетание факторов попало в проверяемое множество. Построение корреляционных таблиц и отображение связи факторов с ВП в виде корреляционных полей; расчет коэффициентов корреляции рангов по различным критериям; позволяют установить причинно-следственные связи между реализованными условиями культивирования и полученными значениями ВП; найти сильнодействующие сочетания факторов, наглядно представить полученные результаты. Это весьма существенно при коллективной работе, когда теоретику необходимо максимально наглядно и убедительно предсказывать экспериментаторам условия последующих экспериментов.

Из плана таб.9 можно построить 7! других, заменяя первоначальные столбцы на их противоположные (альтернативные). Каждый план будет оптимален для своих начальных условий, смещая частоты учета сочетаний факторов по 3 и выше. Поскольку первоначально выбранные факторы (столбцы) эквивалентны, то независимых планов будет 8 - исходный план, серия с перестановкой уровней одного столбца, двух, трех … и семи (план таб.10). Все возможные варианты планов и их области оптимального применения нет смысла перечислять. Главное - понять логику рассуждений при планировании активного поискового эксперимента и обработке результатов измерений ВП, в особенности на последующих, уточняющих стадиях и самостоятельно строить (выбирать) наилучший для каждого конкретного случая план уточняющего поиска. Вообще говоря, если нет ограничений экономического характера, то наиболее полную информацию даст ДПФЭ, но для группы из 4^х подозреваемых факторов это 16 экспериментов, что не всегда возможно реализовать. Особенно при необходимости ставить повторы для обеспечения приемлемой точности.

В математике есть класс алгоритмически неразрешимых задач, в принципе не решаемых путем выполнения конечного числа шагов. Но поиск условий культивирования микробов к таким не относится, поскольку каждый продуцент ограничен в своих генетических, пищевых и синтетических возможностях. Проблема может быть только в том, что будет нужен неизвестный ранее фактор, который не доступен коммерчески. К тому же такой фактор может быть сложно очистить из природного сырья. Пример - до сих пор не решена задача культивирования бледной трепонемы на искусственных питательных средах, не смотря на важность проблемы и многочисленные попытки решить эту задачу.

Питательные потребности большинства перспективных штаммов в значительной мере известны, задача состоит в выборе комбинации, близкой к оптимальной для синтеза экономически значимого продукта для конкретного продуцента и эта задача нередко разрешима за конечное количество шагов. Совершенствование методов и увеличение количества решенных задач увеличивают вероятность решения новых.

При изучении живых систем, даже таких относительно простых как микроорганизмы, невозможно учесть все возможные варианты и предложить набор универсальный алгоритмов на все случаи жизни. Тем не менее, задача поиска регуляторных факторов решается за конечное количество опытов, особенно если синтез ЦП происходит на искусственных питательных средах. В случае синтеза ЦП продуцентом только в организме чувствительного экспериментального животного, задача усложняется многократно и без гарантированного успеха.

Необходимым моментом при поиске условий культивирования является и интуиция исследователя. Задача математики - планирование активных экспериментов по неким критериям, близким к оптимальным, обработка больших массивов измерений и представление результатов в удобной форме для прогноза и обоснования последующих экспериментов. Критерии оптимальности формулирует исследователь исходя из конкретной задачи и материально - технических возможностей. Предлагаемый критерий по равномерному учету максимального количества пар факторов в серии экспериментов - лишь одна из многих возможностей. Формулировка критерия оптимальности на ранних стадиях многофакторного поиска не обязательна, можно работать и на интуитивном уровне.

Первоначальный выбор на проверку группы подозреваемых факторов и их интенсивностей (концентраций) из очень большого количества потенциально возможных лежит вне математики, в принципе не формализуем и полностью определяется интуицией исследователя. Без интуиции браться за поисковые работы бессмысленно. Успешное решение хотя бы одной задачи поиска регуляторных факторов подтверждает наличие у исследователя такого непонятного и неопределенного качества, как интуиция.

При нахождении небольшой группы сильно действующих факторов перед постановкой ПФЭ для оптимизации процесса, есть смысл поставить уточняющую (переходную) серию опытов для экспериментального обоснования выбора активной группы и их концентраций (интенсивностей), варьируя переменные на 3-х уровнях по близкому к оптимальности плану таб.11. Как и приведенные выше, план не единственный, возможны вариации по выбору сочетаний уровней интенсивностей (концентраций) факторов. Наличие ПК предоставляет новые возможности по построению подобных планов, близких к оптимальным для конкретной задачи, максимально увязанный с конкретными начальными и граничными условиями. План облегчает обработку результатов измерений при построении корреляционных полей и таблиц.

Таблица 11

План трехуровневого переходного к оптимизации уточняющего эксперимента

В плане таб. 11 буквами обозначены факторы, нижними индексами - уровни, парные сочетания факторов присутствуют с одинаковыми частотами, хотя учтены не все, теоретически возможные. План не единственный, но близкий к оптимальному согласно сформулированным выше критериям.

Количество экспериментов в серии в первую очередь зависит от стоимости каждого опыта. План таб.11. можно расширить до 8 экспериментов (строк), добавляя эксперименты, в которых все факторы находятся на одном уровне (все факторы на 2-ом и все факторы на 3-ем уровнях). Такое расширение сохраняет учет парных сочетаний факторов, увеличивает количество учтенных сочетаний факторов и увеличивает представленность сочетаний факторов более высоких порядков, незначительно смещая частоты представленности сочетаний факторов более высоких, чем парные, порядков. Наличие трех уровней варьирования интенсивностей каждого фактора облегчает оценить тенденцию влияния фактора на ВП, в отличие от двухуровневых планов. Наличие трех уровней варьирования интенсивностей факторов позволяет более точно и надежно оценить тенденцию по влиянию на синтез ЦП при большой ошибке измерений, что строго доказано математиками ранее.

Поскольку при многофакторном поиске можно говорить только о постановке серии экспериментов, близкой к оптимальной, то выбор нужного плана во многом определяется стоимостью каждого эксперимента. При невысокой стоимости есть смысл увеличивать количество проверяемых факторов и экспериментов в одной серии до максимума. Постановка серий экспериментов, объединенных одним временем и одним инокулятом, позволяет повысить точность измерений ВП за счет уменьшения систематической ошибки и временного дрейфа неконтролируемых воздействий при возможности выбора внутреннего стандарта (опыта, принимаемого за эталон для сравнения).

Наличие ПК и многочисленных прикладных программ по работе с многомерными пространствами позволяют относительно несложно суммировать все проведенные наблюдения и строить различные 2-х и3-х мерные сечения поверхности отклика, облегчая исследователю представление вида поверхности отклика в окрестности центра эксперимента, что значительно облегчит планирование последующих серий опытов.

Ранжировку строк в таблице по возрастанию (убыванию) некой величины автоматически производят текстовые редакторы, перестановку столбцов таблицы тоже можно сделать, не обращаясь к специализированным математическим программам. В крайнем случае эту работу можно провести ручную при помощи прозрачной пленки и фломастера, либо ножниц и клея.

Нахождение оптимальных условий синтеза

Оптимизация биологического процесса сводится к экспериментальному отысканию условий, при которых ВП достигает максимального значения. Подразумевается любая характеристика процесса, представляющая интерес для экспериментатора (биомасса, накопление какого-либо целевого продукта, представляющего экономический интерес и т.д.). Условия протекания процесса определяются комплексом факторов, от которых зависит его выход. В случае подбора оптимальных сред этот комплекс включает в себя химический состав питательной среды и условия культивирования организмов, такие как температура, перемешивание, аэрация и т.д./1/.

Оптимизацию в широком смысле слова следует проводить по всей совокупности факторов, влияющих на ВП. В рамках рассматриваемых ниже методов не существует принципиальной разницы между физически разнородными факторами по характеру их влияния на ВП, вследствие чего можно одновременно проводить оптимизацию как состава среды, так и условий культивирования. Однако на практике приходится сталкиваться с более узкой задачей подбора оптимального состава сред при заданных условиях культивирования или, иными словами, проводить оптимизацию по группе факторов (например, химические компоненты среды) при постоянном уровне остальных факторов /1/. В некотором смысле, это обобщение метода однофакторной оптимизации, но в данном случае меняют одновременно несколько факторов на фоне фиксированных остальных возможных переменных.

При этом следует иметь в виду, что смена условий культивирования, как правило, приводит к необходимости включения новых факторов в область управляемых или контролируемых переменных. Увеличение ВП проводит к увеличению потребления компонент, которые ранее считались малозначимыми. Наиболее рациональным для оптимизации биологических объектов является двухуровневые ПФЭ или ДФЭ, поскольку биологические процессы достаточно длительны, ВП в большинстве случаев определяют биохимическими методами, что делает нерентабельным использование схем планирования типа симплекс - процедуры или случайного поиска, когда каждый последующий шаг рассчитывают на основании результатов предыдущего. Достоинством одновременной постановки большой серии опытов является и то, что появляется возможность учета временного дрейфа за счет ведения внутренних эталонов для каждой серии опытов, например, в простейшем случае, постановка опыта, в котором все факторы находятся на верхнем (нижнем) уровне, либо берут некую “среднюю точку” по интенсивностям (концентрациям).

Необходимым моментом оптимизации является описание оптимальной области и условий, близких к оптимуму. Возможно нахождение условного экстремума, поэтому после нахождении оптимальных условий для некой группы факторов, неплохо поставить новый ОЭ по группе факторов и убедится в их незначимости или значимости и перейти к оптимизации по новой группе факторов.

Независимо от конкретной схемы планирования, после нахождения оптимальной совокупности существенных факторов, есть смысл в дополнительной проверке “несущественности” тех факторов, которые были отсеяны на первых этапах. С этой целью после нахождения некого оптимума может быть поставлен ОЭ на новом фиксированном уровне существенных факторов. Стратегия такого поиска описана Максимовым и Федоровым /1/.

После нахождения группы сильнодействующих факторов и их активных уровней можно прейти к оптимизации процесса. В качестве переходного исследования от ОЭ к оптимизационному ПФЭ можно рекомендовать трехуровневый план таб.11, который повышает надежность выбора факторов и их уровней для оптимизации процесса. При проведении оптимизации с использованием двухуровневых ПФЭ или ДФЭ следует учесть ряд ограничений этого хорошо известного метода /1,4/.

Поверхность отклика ВП в зависимости от интенсивностей управляемых переменных при выращивании микроорганизмов имеет сложный многомерный вид, вообще говоря, неизвестный экспериментатору. Функция отклика в зависимости от управляемых переменных непредставима в виде достаточно простой и наглядной алгебраической форме. Но в окрестности некой точки можно разложить любую сложную неизвестную функцию, описывающую поверхность отклика, в ряд Тейлора по степеням x, у (пример для случая двух управляемых переменных).

(1) f(x,у) = a + вx +су + dxy + R(x,y) /9/.

Поскольку математика не дает возможности оценить величину остаточного члена R(x,y), то приходится делать достаточно спорное предположение, что R(x_,у) = 0 и переходить к модели

f(x,y) = a + bx + cy + dxy,

которая, вообще говоря, может быть и неадекватной из-за неизбежного пренебрежения остаточным членом R(x,y), что является первым “подводным камнем”.

В уравнении (2) нужно определить неизвестные a,b,c,d, располагая четырьмя измеренными значениями f(x_i ,y_i) - ВП (1;..;4). Получается система из четырех линейных уравнений для четырех переменных, которая может иметь единственное решение.

Дадим геометрическую интерпретацию уравнению (2). При фиксированных значениях f(x ,y) = const (линии равного выхода) получаем уравнения для различно ориентированных относительно осей х. и у искаженных гипербол. Следовательно, в пространстве это могут быть - гиперболический цилиндр (стационарное возвышение), либо гиперболический параболоид (седловидная поверхность), либо однополостный гиперболоид /9/.

Уравнение (2) в принципе не описывает поверхность типа параболоида или двухполостного гиперболоида, для этого в уравнении должны присутствовать новые члены вида ех² + fу², которые в дополнении к уравнению (2) для линий равного выхода могут описывать семейство эллипсов, смещенных и разноориентированных относительно начала координат, а в пространстве описывают параболоид или двухполостный гиперболоид. Но именно параболоид или двухполостный гиперболоид (“шапочка”) наиболее адекватно описывает поверхность отклика вблизи максимума. Следовательно, ДПФЭ - достаточно грубая модель, которую следует воспринимать в большей степени как информацию к размышлению, а не как однозначное и не подлежащее сомнению руководство к действию.

Современные достижения прикладной математики, наличие персональных компьютеров и разнообразных доступных прикладных программ устраняют вычислительные проблемы, но остаются принципиальные проблемы решения системы линейных уравнений с неточными коэффициентами, так называемых плохо обусловленных систем (ПОСЛУ), которые относятся к некорректно поставленным задачам /10,11/.

ПОСЛУ - такая система, при решении которой с конечной (не важно какой) точностью, появляются ложные решения, зависящие также от последовательности выбора уравнений из системы при решении методом подстановки /11/. Появление ложных решений связано с тем, что компьютер (калькулятор) производит арифметические действия с конечной (не важно, какой) точностью и в процессе вычислений накапливаются ошибки округления /10,11/. Другой источник неустойчивости решения ПОСЛУ - приближенные значения коэффициентов при переменных как эмпирических значений /11/. Один из путей регуляризации некорректно поставленных задач - проверка вычисленных корней подстановкой /10/. Поэтому при использовании программ для ПК следует отдать предпочтение тем программам, в которых при решении ПОСЛУ предусмотрены автоматизированный перебор уравнений и подпрограмму по автоматической проверке полученных решений подстановкой (проверка на обусловленность). Не отрицается и интуитивный путь выбора истинного решения из нескольких, предлагаемых компьютером /10/, полученных в результате различной последовательности выбора уравнений.

Кроме того, ПОСЛУ с неточными коэффициентами сама по себе является некорректно поставленной задачей, т.е. небольшое изменение начальных условий приводит к значительному изменению решения, полученные решения неустойчивы. Рассмотрим пример, описанный в литературе /13/.

СЛУ (1)

х+10у = 11,1

10х+101у=111 решение системы (1) - х=11,1; у=0.

СЛУ (2)

х+10у=11

10х+101у=111 решение системы (2) - х=1; у=1.

Различия свободных членов на 1% в первых уравнениях систем (1) и (2) приводят к сильному (более 100%) изменению решений и при этом каждое решение для своей системы является единственным и истинным. Увеличение числа уравнений и неизвестных увеличивает неустойчивость возможных решений.

Кроме этого, если в уравнении (2) d=0, то получится переопределенная СЛУ, в которой число уравнений больше числа неизвестных.

Дадим геометрическую интерпретацию. Как известно /9/, система двух линейных уравнений с двумя неизвестными может иметь единственное решение, геометрический смысл которого - точка пересечения двух прямых 1 и 2 (рис. 5).

Рисунок 5. Геометрическая интерпретация возможных решений переопределенной системы линейных уравнений

В переопределенной СЛУ третье уравнение описывает третью прямую -3 (рис. 2), которая может совпадать с одной из двух первых, либо проходить через точку пересечения первых двух, но может проходить совсем в стороне - прямая 4 (рис. 2).

При наличии ошибки, с которой задаются управляемые переменные х. и у, а также ошибки измерения ВП, вокруг каждой прямой будет некий коридор ошибок. Учитывая приблизительный характер самой модели, можно в качестве единственного решения выбрать точку, равноудаленную ото всех прямых (точка А). Но пока эта часть полностью принадлежит человеку и подобных программ для ПК еще нет.

Для ПФЭ 2⁴ при использовании модели типа (2) получим 4 переменных для 16 уравнений, и нахождение единственного решения приобретает не столько математический, сколько философский смысл. Прикладная математика обходит эту сложность тем, что программы для решения СЛУ на основе ДПФЭ решают расширенную систему. Например, для 4-х переменных и 16-ти экспериментов это будет система с 15-ю неизвестными, расставленными по плану табл. 6. Одну и ту же систему компьютер будет решать для количества переменных от 4 до 15-ти включительно, автоматически вводя фиктивные переменные сверх выбранных экспериментатором при работе с программами, в которых предусмотрено специализированное окно для расчетов по плану ДПФЭ. Искусственно введенные столбцы описывают взаимодействие факторов, каждая линейная комбинация описывает свой набор взаимодействующих предшественников, подобно столбцам, начиная с №5 таб. 6.

Поскольку последующие столбцы являются линейной комбинацией первых, то полученные уравнения будут описывать прямые, проходящие через общую единственную точку, что доказывается в классических курсах по аналитической геометрии. При использовании программ, рассчитанных на решение СЛУ без привязки к ПФЭ, следует учесть этот момент. Решение СЛУ по результатам ПФЭ с применением стандартных программ общего назначения необходимо проводить, самостоятельно расширяя количество переменных за счет введения фиктивных, описывающих взаимодействие факторов по правилу таб.5. Например, для ПФЭ 2⁴ из 16 уравнений можно оставить 5, но это можно сделать многими неоднозначными способами и получить несколько противоречащих моделей, но можно расширить количество переменных до 15 ти взяв расширенный план таб.6. Это позволит учесть и взаимодействие между факторами, часто встречающееся в микробиологии.

Поэтому, на наш взгляд, наиболее рационально до построения полиномиальной модели провести обработку полученных результатов измерений ВП наибольшим количеством способов - построение корреляционных таблиц и полей, использование непараметрических критериев и т. д. /7/ для получения дополнительной информации, выделения сильно действующих факторов и обоснованно отбрасывая незначимые факторы и их сочетания до расчета коэффициентов полинома. После этого из обобщенной полиномиальной модели можно обоснованно построить модель со значительно меньшим количеством переменных. Так в работе /12; 14/ после соответствующей обработки было оставлено 5 переменных из первоначально подозреваемых 15. Последующие расчеты уточнили вид модели, и осталось только 3 члена. Такая предварительная обработка позволяет обнаружить ложные решения, в которых коэффициенты полинома не вписываются в допустимый коридор ограничений, полученный из применения дополнительной информации на основе корреляционных таблиц и полей, без значительного количества арифметических расчетов.

Поскольку ПОСЛУ с неточными коэффициентами и конечной точностью вычислений относится к некорректно поставленным задачам /10,11/, то выбор наиболее адекватного решения (регуляризация некорректно поставленной задачи) должен проводиться с использованием дополнительной информации /11/. При этом, чем больше уравнений, тем больше дополнительной информации можно получить, используя статистические методы обработки полученной информации до формулировки полиномиальной модели и решения СЛУ.

По нашему мнению, необходимо не менее 8 экспериментальных точек (от 3^х до 7^ми факторов, ДПФЭ 2³), что позволяет построить корреляционную таблицу, применить сериальный критерий с надежностью не менее 80% , а также метод парных сравнений, не требующие арифметических вычислений, а только преобразования первоначального плана корреляционную таблицу перестановкой строк и столбцов для увеличения наглядности и логического осмысления результатов согласно разработанным математиками правилам (сериальный критерий, метод парных сравнений). Увеличение количества подозреваемых переменных при постановке первого ОЭ увеличивает вероятность успешного поиска не только из-за увеличения количества проверяемых факторов, но и из-за повышения точности, вызванной увеличением количества экспериментов в серии, и независимых измерений ВП - преимущества применения пространства высокой размерности. Одновременная постановка серии экспериментов позволяет учесть возможный временной дрейф результатов измерений ВП, переходя к относительным единицам и внутренним эталонам для каждой серии, позволяя точнее сравнивать и использовать результаты различных серий.

Неустойчивость решения СЛУ как модели ДПФЭ следует также и из природы микробов, поскольку одно или несколько из проверяемых переменных могут оказаться регуляторными факторами для синтеза ЦП. При наличии неконститутивного оперона интенсивность синтеза целевого продукта может колебаться в десятки раз при относительно небольших изменениях управляемых переменных (на десятки %), что выражается в сильной кривизне поверхности отклика (зависимость ВП от управляемых переменных).

Исходя из вышеизложенного, после постановки ДПФЭ, не следует спешить с вычислением “точных значений” коэффициентов полинома гиперболической модели типа (2). Согласно нашему опыту, перспективнее обработать результаты измерения ВП с применением метода парных сравнений и сериального критерия. Хорошую информацию дает построение распределения ВП в зависимости от номера эксперимента в ранжированном ряду, расчеты коэффициентов корреляции рангов по нескольким критериям, построение нескольких корреляционных таблиц с учетом ошибки измерения ВП и перестановкой перекрывающихся значений ВП в ранжированных рядах, построение корреляционных полей.

Оправдывается подход, при котором несколько низкоточных методов обработки результатов измерений и рассмотрение альтернативных моделей оказываются более конструктивным, чем применение одного высокоточного, поскольку высокая точность вычислений коэффициентов полиномиальной модели - кажущаяся, особенно при значительной ошибке измерений ВП, который в случае химического эксперимента можно довести до нескольких процентов, а микробиологический или медико-биологический - гораздо менее точный. Многие измерения параметров бактериальной популяции проводятся с точностью 10 -20%, что считается неплохим и близко к предельно возможной точности измерения в бактериологии /16/. Нередко ошибку измерений вообще трудно оценить и приходится пользоваться качественными оценками (например, реакция агглютинации или диффузионной преципитации, другие иммунохимические измерения, кроме РИА и ИФА и т.д.).

Если сглаженная функция распределения ВП в зависимости от ранга эксперимента представляет собой достаточно монотонную кривую типа 1 (рис. 3), близкую к обратно пропорциональной зависимости, то есть смысл искать коэффициенты полинома гиперболической модели типа (2). Если указанное распределение имеет более сложный вид типа кривой 2 (рис. 3), то нужно разбивать выбранные факторы на более мелкие блоки и ставить дополнительные эксперименты, хотя и в этом случае уже можно провести отсеивание и сократить количество подозреваемых факторов. Наличие участков, близких к горизонтальному, на распределении типа 2 (рис. 6) отражает наличие почти эквивалентных сочетаний выбранных факторов. Сложная зависимость ВП от номера эксперимента говорит о невозможности применения полиномиальной модели, о неадекватности гиперболического приближения поверхности отклика в изучаемой окрестности контролируемых факторов и необходимости дополнительных экспериментов.

После анализа полученной информации и доказательств адекватности гиперболической модели можно провести качественную ранжировку значимости факторов, обоснованно выбрать сильнодействующие, отбросить слабые факторы и их сочетания и принимать решение о целесообразности и виде полиномиальной модели

Рисунок 6. Возможные зависимости выхода процесса от номера эксперимента в ранжированном ряду после постановки серии опытов

Получив несколько решений СЛУ, что быстро и несложно даже при использовании ПК со слабыми процессорами, выбираем решения, наиболее соответствующие полученной ранее информации.

Описанный подход был использован при изучении влияния условий культивирования на антигенный состав вакцины чумного микроба /12/ и при изучении влияния условий культивирования на синтез антигена F41 E.coli ВГНКИ 397А / 37-14 / /8,20/.

Постановка ПФЭ 2⁴ для изучения вакцины чумного микроба позволила в первой же серии из 16 экспериментов найти условия, при которых пестицин и рН: - антиген экспрессировались независимо при разных условиях культивирования. Это согласуется с опубликованными ранее данными генетиков о том, что эти антигены находятся в составе разных оперонов и регулируются независимыми промоторно-операторными участками. В сериях однофакторных экспериментов получить такую информацию было бы крайне затруднительно. Но генетикам необходимо располагать данными физиологов, чтобы строить модели регуляции экспрессии того или иного признака внешними условиями.

Для продуцента диагностические важного проективного антигена F41 энтеропатогенной кишечной палочки после многофакторного поиска была сконструирована среда, обеспечивающая более высокий уровень синтеза названного антигена клетками. Это послужило основой для получения высокотитражной специфической антисыворотки и значительно повысило надежность определения указанного антигена в полевых штаммах, подозреваемых как возбудители колидиаррей молодняка крупного рогатого скота. Такая информация позволяет обоснованно провести эпизоотологический анализ вспышки инфекции и провести рациональную терапию больных животных, в первую очередь - антибиотикотерапию. Возможность наращивать штаммы с большим количеством протективного антигена служит основой эффективного осуществления специфической вакцинопрофилактики.

Предлагаемый подход с использованием семейства синтетических сред, составленных по близкому к оптимальности плану из индивидуальных химических соединений разных классов, учитывает только самую общую внутреннюю структуру живой системы, основан, прежде всего, на контроле внешних условий и изучении реакций системы. По нашему мнению такой подход может быть обобщен не только на плохо изученные штаммы микроорганизмов, но и для подбора и оптимизации рационов у более организованных живых систем и иные выходы процесса. Это следует из того, что регуляция активности оперонов условиями окружающей среды едина у всех живых организмов /15/.

Частные примеры применения многофакторного поиска

Рассмотрим конкретный пример. Объектом исследований служил штамм Е.соli ВГНКИ 397А/37-14 , продуцент диагностически значимого в ветеринарной микробиологии протективного поверхностного антигена F41. Подобные штаммы вызывают холероподобные диарреи у новорожденных телят и вспышки инфекции в крупных хозяйствах с высоким количеством летальных исходов, принося значительные убытки. Первоначально располагали сывороткой анти-F41, полученной к указанному референс - штамму, которая давала реакцию агглютинации бактериальных клеток при их культивировании на среде Минка /5/ с оценкой (+), на пределе чувствительности. Это медленное (5 - 6 мин) неполное образование мелких зерен из суспензии бактериальных клеток, видимые при небольшом увеличении, и отсутствие агглютинации при культивировании на агаре Хоттингера или кровяном и шоколадном агаре. Максимально возможная оценка агглютинации - (4+) - быстрое (1-2 сек) слипание всех клеток в крупные, видимые невооруженным глазом, быстро восстанавливающиеся после перемешивания конгломераты. Морфологически названный антиген - фимбрии на поверхности клеток - при просмотре в электронном микроскопе не выявляли. Возникло предположение, что ген, ответственный за синтез антигена F41, подвержен регуляции компонентами питательной среды.

Для проведения поиска факторов, влияющих на синтез целевого продукта, был выбран план ОЭ, представленный в таб. 4 и факторы, указанные выше в качестве примера в общей части, по сверхнасыщенной схеме 2-го типа (два фактора в одном столбце, по одному фактору на уровень).

В результате серии экспериментов, поставленных по вышеприведенной схеме, было найдено, что регуляторными факторами для синтеза антигена F41 клетками E coli ВГНКИ 397А/37-14 являются величина рН, концентрации глюкозы и неорганического фосфата. Такую информацию было практически невозможно найти в сериях однофакторных экспериментов, потому что только в экспериментах первой серии по плану таб.5 в №№1-4 ВП отличался от 0. Поскольку ВП - синтез значимого антигена - определяли полуколичественно, в капельной реакции агглютинации со специфической антисывороткой на пределе чувствительности, то в силу низкой точности измерения применять полиномиальную модель было нецелесообразно, что подробно рассмотрено выше.

Кроме этого, наличие практически одинакового ВП в первых 4^х экспериментах и ВП = 0 в других (ступенчатое распределение зависимости ВП от № эксперимента, кусочно-непрерывная связь ВП = F(№э)), делает невозможным применение результатов для расчета коэффициентов полиномиальной модели. Построение корреляционной таблицы и применение сериального критерия позволяет наглядно выделить группу сильнодействующих факторов, установить связь между явлениями, оценить надежность сделанных выводов и обоснованно спланировать следующую серию экспериментов. После проведения дополнительных серий многофакторных и однофакторных экспериментов с меньшим количеством подозреваемых факторов была сконструирована плотная питательная среда на основе кислотного гидролизата казеина и дрожжевого экстракта с таким соотношением фосфата и глюкозы при рН 8.0. Разработанная среда позволила значительно увеличить синтез диагностически значимого антигена F41 клетками Е.соli ВГНКИ 397A/37-14 при небольшом снижении урожая биомассы, выращенного на чашке. Глубинное культивирование на основе найденной комбинации условий было неудачным для синтеза указанного антигена.

В качестве примера приводим следующие цифры - при иммунизации 8 кроликов живой культурой, выращенной на среде Минка только от одного животного была получена антисыворотка, которая давала реакцию агглютинации с оценкой (+) без разведения антисыворотки. Иммунизация убитой культурой, выращенной на разработанной среде, позволила получить от худшего животного антисыворотку, дающую агглютинацию с оценкой (3+) в разведении 1/10, от лучшего в разведении 1/30, всего было использовано 7 кроликов. Оценка (3+) - слипание бактериальных клеток в течение 1 мин. в устойчивые к перемешиванию конгломераты различной величины. Допускается наличие небольшого количество не слипшихся клеток.

При просмотре в электронном микроскопе (негативный контраст, фиксация фосфорно-вольфрамовой кислотой) наблюдали классические фимбрии, в отличие от клеток, выращенных на среде Минка. Повышение качества агглютинации до уровня (4+) было затруднено нестабильностью экспрессии признака F41 при выращивании продуцента на разработанной среде. Клонирование признака F41 не привело к получению более стабильного и активного продуцента. Полученные результаты были признаны патентоспособными /8/.

Поскольку ВП измеряли с высокой ошибкой из-за отсутствия более точных методов, то полученные результаты не столько служили для количественных расчетов, сколько способствовали экспериментальному нахождению области, близкой к оптимальной. Такой подход легко оспорить и трудно обосновать, но в данном случае он сработал.

Применение убитой культуры для инъекций кроликов повышает выход животных, выдержавших курс гипериммунизации (1,5 месяца). При инактивации культуры происходит частичная инактивация антигенов, поэтому такую процедуру можно проводить только с клетками, которые содержат много нужного антигена в своем составе.

В дальнейшем была сконструирована плотная питательная среда на основе пептона (7 -12 -г/л) с лактозой (2 - .4 - г/л) при рН 8,0. Количество добавляемого фосфата (3 -10 г/л) зависит от партии пептона и содержания в нем неорганического фосфата. Замена глюкозы на лактозу повышает как селективность среды для роста лактозоположительных кишечных палочек, так и технологичность, т.к. лактоза не образует токсичных соединений с азотсодержащими компонентами при автоклавировании в составе готовой среды в режимах до 1 атм., 30 мин.

При наличии хорошей партии пептона, не обсемененной спорообразующими микробами, достаточно прокипятить 5-10 мин. готовую среду и сразу использовать. Даже в случае низкой обсемененности достаточно прокипятить готовую среду дважды в течение дня. Это весьма практично при работе с быстрорастущими штаммами, не подлежащими длительному хранению и дальнейшему использованию после измерения нужных биохимических или иммунохимических свойств.

Полученные в дальнейшем результаты с использованием разработанной среды и наличии высокотитражной специфичной антисыворотки /8,20/ свидетельствуют, что отсутствие в среде углеводов полностью выключает синтез антигена F41. Такие клетки можно использовать при фракционирования поливалентной сыворотки для удаления посторонних антигенов в качестве афинного сорбента. Наличие эритрита тоже отрицательно влияет на синтез антигена. Маннит, сорбит, ксилоза, мальтоза влияют на синтез антигена F41 положительно. Другие углеводы, сахароспирты и жирные кислоты не испытывали. Добавление глицерина приводит к образованию обильного внеклеточного полисахарида, значительно затрудняющего суспендирование бакмассы в физрастворе до смешивания с антисывороткой.

Описанная выше среда на основе пептона и лактозы обеспечивает синтез антигена F41 при глубинном культивировании, но работа в этом направлении не была завершена, среда нигде не описана ранее. При применении различных источников углерода в составе разработанной среды, возможно, наблюдать штаммоспецифичное разнообразие экспрессии антигена, что происходит при эпизоотологическом анализе распространения антигена F41 среди изолятов кишечной палочки, выделенных из неблагополучных по колидиарреи хозяйств. Эту работу проводили на базе бывшей фирмы “Диавак'' под руководством Гусева В.В. и при помощи Тазиной О.И. и Глазкова Н.К.

Вид клеток кишечной палочки ВГНКИ 397А /37-14, выращенных на разработанной среде /8,20/. Фимбрии представлены в большом количестве и достаточно наглядно. Белая черта на фото - 1 мкм. Для фото выбрана одна из лучших клеток, поскольку разброс в количестве фимбрий на клетку в популяции весьма велик.

Описанный подход многофакторного поиска был использован при изучении влияния условий культивирования на антигенный состав вакцины чумного микроба /12/. Приводимые здесь детали планирования ОЭ и обработки ПФЭ не были опубликованы ранее в силу специфики журнала /12/ и опубликованы позже /14,20/. Постановка ПФЭ 2⁴ для изучения вакцины чумного микроба позволила в первой же серии из 16 экспериментов найти условия, при которых пестицин и F - антиген экспрессировались независимо при разных условиях культивирования, что согласуется с опубликованными ранее данными генетиков о том, что эти антигены находятся в составе разных оперонов и регулируются независимыми промоторно - операторными участками. В сериях однофакторных экспериментов получить такую информацию было бы крайне затруднительно. А генетикам необходимо располагать данными физиологов, чтобы строить модели регуляции экспрессии того или иного признака конкретным продуцентом.

Таблица 12

Корреляционная

В таб. 12 рН6 обозначает антиген рН6, Pst - антиген пестицин.

Работу проводили с вакцинным штаммом Y.pestis EV линии НИИЭГ. Влияние параметров культивирования и состава питательных сред на синтез антигенов изучали, используя план ПФЭ 2⁴/1/. Корреляционная таблица 11 составлена перестановкой строк исходного плана по группировке антигенов рН6 и Pst. Жизнеспособность определяли как отношение КОЕ к оптической плотности бактериальной суспензии, измеренной на красном фильтре ФЭК в кювете 1 см оптического пути.

Из представленных данных видно, что синтез рН6 антигена коррелирует с повышенной аэрацией в объеме среды 25 мл на колбу 700 мл и пониженной жизнеспособностью популяции. Имеется одно “выскакивающее” значение в опыте №13, которое можно объяснить промахом при постановке эксперимента в виде пропущенной или лишней добавки.

Параметры, стимулирующие синтез антигена Pst, находятся в области рН 7,0, объеме среды 100 мл, и повышенном показателе жизнеспособности. Уровни показателей жизнеспособности клеток, продуцирующих названные антигены, достоверно отличаются друг от друга. Одновременный синтез антигенов рН6 и Pst наблюдали только в одном эксперименте, что, возможно, обусловлено неким промахом при простановке серии опытов, что естественно в практической работе. Синтез мышиного токсина и антигена F1 от условий культивирования не зависел.

Полученные данные подтверждают, что возможно управление процессом культивирования с целью получения культуры, обогащенной определенным антигеном. Это упрощает дальнейшую биохимическую очистку для получения чистых препаратов антигенов, используемых для получения специфических антисывороток и при иммунохимических реакциях с изучаемой культурой.

Ранжировка результатов ПФЭ по уровням концентраций клеток и применения вышеуказанных распределений (данные не приведены) показало, что основными факторами, влияющими на общее количество клеток, являются концентрация галактозы, совместное действие рН и аминного азота и совместное действие галактозы и аминного азота. Согласно этому были проведены количественные расчеты, которые подтвердили, что именно эти параметры влияют на рост культуры. При этом зависимость нелинейная и определяется, прежде всего, взаимодействием факторов.

Приведенные экспериментальные данные демонстрируют, что только использование многофакторного эксперимента позволило решить задачи поиска регуляторных факторов для указанных выше культур. В серии однофакторных экспериментов этого бы сделать либо вовсе не удалось, либо удалось бы с большими трудозатратами и непредсказуемым везением.