Поиск и оптимизация условий культивирования, влияющих на синтез микроорганизмами экономически значимого продукта

Использование плана многофакторного поиска, близкого к оптимальному, позволило быстро найти минимальную группу регуляторных факторов среди достаточно большого множества подозреваемых и в первой же серии оценить тенденцию влияния найденных факторов и их концентраций (интенсивностей) на ВП, что позволило осознанно поставить следующие эксперименты при относительно небольших трудозатратах.

Пример многофакторного поиска компонентов питательной среды для культивирования Trichoderma аureoviride, любезно предоставленный К.М. Минеральные соли, характерные для этого микроба, взяты как константы.

Таблица 13

План поиска добавок для культивировании Т.А.

План таб. 14 на первый взгляд построен без каких либо критериев оптимальности, тем не мене дает обильную информацию к размышлению при проверки 12 добавок на 10 опытах. Но при более детальном анализе видно, что выдержано основное условие многофакторного поиска - выбрана группа из 12 подозреваемых соединений разных классов - аминокислоты и углеводы, за тем проводили испытания, делая групповые выборки. Максимальная выборка - 11 факторов, остальные в интервале от 4 до 6 факторов в опыте. Это близко к оптимальному разбиению выбранного множества 1:2. Устойчивость серии экспериментов, состоящей из отдельных опытов с различными выборками подозреваемых факторов, не требует выдерживать жесткую оптимальность, которая на первом этапе не обязательна и весьма расплывчата.

Даже без ранжировки видно, что сильно действующими факторами являются добавки сахарозы и метионина, остальные аминокислоты практически взаимозаменяемы, но нужны, прочие углеводы малозначимы по влиянию на выход биомассы. Т.е. даже практически первый построенный план многофакторного поиска более информативен, чем серия однофакторных экспериментов. Попробуйте самостоятельно оценить минимальное количество опытов по методу Зайделя-Гаусса для проверки значимости 12 выбранных экспериментов (задача отсеивания и нахождения сильно действующих факторов, сокращения количества изучаемых факторов).

Приведенный пример достаточно убедительно демонстрирует, что классификация проверяемых факторов на сильно действующие (позитивные, индукторы), нейтральные и токсичные (ингибиторы, корепрессоры) позволяет объединять их в достаточно большие группы и ставить серийные эксперименты по сверхнасыщенной схеме, когда количество проверяемых факторов превышает количество единичных испытаний. При этом возможно получить несложно трактуемые результаты без значительных арифметических вычислений и обоснованно поставить следующую серию поиска сильнодействующих факторов, либо перейти к нахождению оптимального соотношения выделенных сильно действующих факторов, если их количество сократилось до некого приемлемого уровня.

Можно считать приемлемым количеством 4-5 выделенных факторов. Тогда ПФЭ 2⁴ это 16 опытов, в 2 повторностях - 32 опыта и при работе с колбами - вполне реальные цифры. Для 5 факторов соответственно 32 и 64 эксперимента, что тоже реально, либо те же 16 и 32, если ставить ДФЭ 2^5-1 , выбрав некое сочетание факторов незначимым на основании предварительных испытаний.

Контурно-графический анализ результатов измерений

Для обработки результатов экспериментов с минимальным количеством арифметических вычислений можно использовать контурно-графический анализ Клейнмана и Берча /цит. по /18/. Сущность его состоит в упорядоченном расположении опытов в факторном пространстве путем построения графических зависимостей ВП от управляемых переменных в виде двумерных сечений поверхности отклика. Получение дополнительной информации происходит путем линейной экстраполяции графических зависимостей через построение на двумерных сечениях поверхности отклика линий постоянного уровня ВП в зависимости от концентрации (интенсивности) разнообразных парных выборок факторов.

Х

Рис. 6. Контурно-графический метод

Методами контурно-графического анализа можно строить на кальке контурные линии различных сечений функции отклика, характеризующей процесс. Совмещая координатные оси этих графиков, и просматривая кальки на просвет, можно достаточно быстро выбрать оптимальные условия ведения процесса. Работа не сложная и не связана с большим количеством арифметических вычислений. Недостаток этого метода - необходимость располагать большим количеством экспериментальных точек, измеренных с высокой точностью. Однако при решении задач по увеличению выхода биомассы, когда работа идет с чашками или пробирками, когда проще засеять несколько десятков проб, несложно набрать необходимую статистику и обеспечить приемлемую точность измерения ВП при минимальных арифметических вычислениях. При этом отпадает необходимость глубоко анализировать небольшое количество измерений с помощью разных статистических методов, не всегда понятных экспериментатору.

Схемы Берча и Клейнмана не исчерпывают всех возможных вариантов расположения экспериментальных точек в факторном пространстве. Следует иметь в виду, что расстояние между экспериментальными точками не должно быть слишком большим. В противном случае при значительной кривизне и сложной форме поверхности отклика неизбежные погрешности линейной экстраполяции могут отрицательно сказаться на разработку возможных прогнозов.

Заключение

Описанный выше подход основан на минимальном знании внутренней структуры изучаемого объекта, в первую очередь генетики и физиологии, и предназначен быть базой, как для изучения (построения) частной физиологии, так и частной генетики живой системы. Этот подход оперирует в основном контролем внешних условий и измерением реакций системы, не обязательно с высокой точностью. Допускается использование качественных и экспертных оценок, что важно при сложных реакциях мало изученной системы. В ряде случаев можно обойтись отображением результатов измерений в виде графиков, корреляционных таблиц и полей при минимуме арифметических вычислений. По нашему мнению, такой подход может быть применим и к системам более высокой, чем микробы, организации и более сложным синтезам. Поскольку ВП в большинстве случаев измеряют с применением химических методов, то и для чисто химических процессов такой подход тоже применим, особенно для задач поиска условий кристаллизации или ферментативной активности. В органической химии исследователи оперируют в большинстве случаев небольшим количеством переменных. В таком случае можно ограничится планами на уровне ДФЭ, трехуровнего плана таб.11 и ПФЭ.

Литература

Максимов В.Н., Федоров В.Д., Применение методов математического планирования эксперимента при отыскании оптимальных условий культивирования микроорганизмов. М.,МГУ.,1969., 125 с.

Ленинджер А., Биохимия., М., “Мир”., 1874., 956 с.

Стейнер Р., Эдельберг Э., Ингрэм Дж., Мир микробов., т.1., М., “Мир” 1979.,320 с.

Максимов В.Н., Многофакторный эксперимент в биологии. М.,МГУ.,1983. 452с.

Шулюпин О.К. Критерии оценки оптимальности отсеивающих экспериментов. Депонированная рукопись. НПО “Медбиоэкономика” 17.11.88. реферат опубликован в библиографическом указателе ВИНИТИ “Депонированные научные работы” 1989г,№ 3, стр.115.

Morris J.A., Thorng C., Scott A.C., Adhesion in vitro and in vivo associated with an adhesive antigen (F41) produced by a K99 mutant of the reference strain E.coli B41. Inf. Imm. 1982. V.38. № 3, р.1148-1153.

Архипов Г.П., Лаврова И.Г., Трошина И.М., Некоторые современные методы статистического анализа в медицине., М. “Медицина”. 1971., 123 с.

Шулюпин О.К., Светоч Э.А., Жиленков Е.Л., Гусев В.В., Тугаринов О.А., Малахов Ю.А., Питательная среда для выявления фимбриального антигена адгезии F41. Патент SU 1720652., 23.03.1992 г. Бюл.№11., 4 с.

Корн Г., Корн Т., Справочник по математике. М. “Наука”. ГРФМ. 1984.831с.

Эберт К., Эдерер Х. Компьютеры, применение в химии. М.“Мир”.1988. 264с.

Тихонов А.Н., Уфимцев М.В., Статистическая обработка результатов экспериментов. М. МГУ. 1988. 135 с.

Гремякова Т.А., Степаншина В.Н., Шулюпин О.К., Негрий В.Ф., Мицевич Е.В., Экспрессия основных антигенов и ростовые свойства клеток Yersinia pestis в средах различного состава при 37⁰С. ЖМЭИ. 1993., № 1,с.16-20.

Хургин Я.И. Да, нет, или может быть. М. “Наука”. ГРФМЛ.1983. 206 с.

Шулюпин О.К. Проведение работ по поиску условий культивирования, влияющих на синтез микроорганизмами значимого продукта. Пущино. 20007 г. 11-я международная Пущинская школа-конференция. Сборник тезисов.331 с.

15. Уотсон Дж. Молекулярная биология гена. М. Мир. 1978. 456 с.

16.Мейнелл Дж., Мейнелл Э. Экспериментальная микробиология. М. Мир , 1967.345 с.

17. Martin, J.E.< et al/1967/Public Health Rep. 82 361.

18.Саутин С.Н. Планирование эксперимента в химии и химической технологии. “Химия”. 1975.48 с.

20. htt://www.smolensk.ru/user/sigma/MMOR/N-29-html/Shulyupin-2.htm

Размещено на Allbest.ru