Молекулярні механізми кросинговеру

Размещено на http://www.allbest.ru/

Молекулярні механізми кросинговеру

кросинговер сумчастий гриб



Вступ

Кросинговер -- це явище обміну ділянками гомологічних хромосом після кон'югації у профазі-1 мейозу. Результатом цього процесу є обмін генетичною інформацією між хромосомами. Це є одним з головних чинників еволюції,так як забезпечує комбінаторну мінливість.

Великі внески у вивченні цього процесу зробили Т. Морган, К.Штерн. Явище кросинговеру описане в підручниках Жимулєва, Інге-Вєчтомова, в книзі Корякова, але всі вони засновані на застарілій моделі Р. Холідея.

Досконало молекулярні механізми кросинговеру не вивчені. Але в цій роботі ми будемо опиратись на новітні уявлення про цей процес, використовуючи перш за все роботу О.Е. Костеріна.



Механізм кросинговеру

Відомі два типи кросинговеру: мітотичний і мейотичний.

Мітотичний кросинговер (Mitotic crossover)-явище скоріше шкідливе, ніж корисне. Він підвищує рівень гомозиготності клітин, що може, зокрема, стати причиною раку.

Для запобігання мітотичного кросинговеру у еукаріотів є спеціальні анти-кроссоверні білки, в тому числі BLM (Bloom syndrome helicase).

В механізмі мейотичного кросинговеру у еукаріотів задіяні елементи механізму, пов'язаного з заліковуванням подвійних розривів, загального для прокаріотів і еукаріотів.

Кросинговер стає можливим тільки після того, як забезпечено спарування і вирівнювання гомологів. За висловом П.М. Бородіна, першим етапом спаровування гомологів є грубе вирівнювання «по штрих-коду» - один одного «узнають» ділянки ДНК, що мають подібний набір білків хроматину, який багато в чому визначається первинною структурою. До таких ділянок насамперед належать теломерні і центромерні ділянки, блоки гетерохроматину.

Слідом за цим настає тонке вирівнювання по гомології ДНК, яке зазвичай завершується утворенням синаптонемного комплексу. Механізм вирівнювання по гомології ДНК заслуговує особливої ??уваги. На стадії лептотени білок Spo11, гомологічний топоізомеразі архебактерій, вносить в ДНК множинні двонитчасті розриви (від кількох сотень до кількох тисяч).

Потім з розривами зв'язується білок RAD51 і розплітає ДНК на певну довжину,( У дріжджів - SRS2, мутанти якого мають підвищену інтенсивність кросинговеру і більш чутливі до мутагенів). Далі розрив розширюється з кожної сторони шляхом руйнування того ланцюга ДНК, який в цьому місці має 5'-кінець, так, що на деяку відстань від розриву ДНК виявляється однонитчастою і закінчується 3'-кінцем. Один з таких одноланцюгових кінців зв'язується з білками RAD51 і RAD54, інший - з білком DMC1.

Одноланцюговий кінець ДНК активується і починає блукати, поки не виявить подвійний ланцюг ДНК, що містить комплементарну ділянку. При цьому він здатний витісняти з подвійного ланцюга ДНК ділянку, косплементарну йому і гомологічну собі, і сам утворювати дуплекс з нею. Тим самим він здійснює інвазію (single end invasion). Все це показано на спрощеній схемі:

Рис.1. Single end invasion

Вслід за інвазійним кінцем, в нову подвійну спіраль-акцептор залучається набагато більша довжина інвазійної нитки ДНК, при цьому подвійна спіраль-донор розплітається. Цей процес має назву міграція гілки (branch migration). Витіснена з подвійної спіралі-акцептора одноланцюгова ділянка ДНК утворює так звану D-петлю (D-loop), яка знаходить одноланцюгову ділянку ДНК-донора і утворює з ним дуплекс. При міграції гілки D-петля також розширюється, подвійна спіраль ДНК-донора розплітається, і обидва дуплекси, утворені ланцюгами ДНК від різних хроматид, розширюються (надалі називатимемо «гетеродуплексами»). Міграція гілки, утворення D-петлі і розширення гетеродуплексів поширюється і по іншу сторону від точки ініціації обміну (точки інвазії, відповідній точці початкового дволанцюгового розриву), так що D-петля виявляється приблизно симетричною до цієї точки.

В результаті ми отримуємо два ДНК-дуплекси, утворених ланцюгами ДНК від двох різних хроматид. Однак ці дуплекси мають однонитчасті проломи, відповідні первинному розширенню двонитчастого розриву. У цьому місці другий ланцюг ДНК добудовується по матриці наявної. В точці, де одноланцюгова ділянка на ДНК-донорі закінчується (зліва на наших схемах), знову синтезований ланцюг зшивається з 5-кінцем іншого ланцюга ДНК-донора, і у нас виходить симетрична з точки зору ланцюгів ДНК проміжна структура: ділянка, де два ДНК дуплекси утворені ланцюгами різних хроматид, обмежена з кожного боку місцями, де обидві «чужі» ланцюги, перехрещуючись, повертаються в свої хроматиди. Такий перехрест ланцюгів ДНК від різних дуплексів називається структурою Холлідея (Holliday structure) або напівхіазмою, так що проміжна структура обмежена з кожного боку такою структурою Холлідея і іноді сама називається подвійною структурою Холлідея (double Holliday structure).

Нижче показані два крайні варіанти проміжних структур, обидва з яких зустрічаються у сумчастих грибів. Зверху показана проміжна структура, характерна для дріжджів. У ній практично відсутня міграція гілок. Знизу показана проміжна структура сумчастого гриба Sordaria fimicola, у якої довжина міграції гілок багато перевершує величину розширених однонитчастих розривів (стрілками показані 3'-кінці ).



Рис.2. Проміжні структури в сумчастих грибів

У мейозі інвазія в основному відбувається в молекулі ДНК гомолога, а не сестринської хроматиди. Дослідження на дріжджях показали, що інвазії в сестринську хроматиду механічно заважають вже сформованому до того часу осьового елементу синаптонемного комплексу. В результаті знаходження сестринської хроматиди в якості ДНК, гомологічної інвазивному кінцю, виявляється менш імовірним, а утворені сестринські гетеродуплекси - менш стабільними. Тому з кінетичних причин переважна кількість проміжних структур формується між несестринськими хроматидами гомологів. У тих випадках, коли гомолог відсутній - наприклад у випадку делецій або унівалентів (неспарених хромосом), наприклад В-хромосом - то у відсутності «більш легкої мішені» інвазія в кінці кінців відбувається і в сестринську хроматиду. В результаті, наприклад на унівалентних В-хромосомах, в профазі мейозу можна спостерігати рекомбінаційні вузлики. Ми пам'ятаємо, що в мітотичному кросинговері, де синаптонемний комплекс відсутній зовсім, сестринська хроматида виявляється більш кращим (приблизно на два порядки!) партнером для обміну.

За допомогою всієї цієї складної механіки здійснюється тонке вирівнювання гомологічних хромосом по гомології первинної структури ДНК, яке, як ми побачимо нижче, необхідне для кросинговеру.

Внесення розривів і інвазія у більшості еукаріот відбуваються до формування синаптонемного комплексу, забезпечуючи необхідне для нього гомологічне вирівнювання хромосом. Що характерно, невеликі ділянки порушення гомології, наприклад, невеликі інверсії в гетерозиготі (ділянки ДНК, в одному з гомологів повернені на 180^о), не перешкоджають формуванню синаптонемного комплексу по всій довжині біваленту. Однак у дрозофіли навпаки, формування синаптонемного комплексу передує розривам. Швидше за все, вона може це собі дозволити тому, що у неї гомологічні хромосоми перебувають у вирівняному стані не тільки в профазі мейозу, але і в інтерфазі.

Коли кількість впізнань досягає якогось критичного рівня, подвійні структури Холідея починають розділятися. Їх розділення відбувається шляхом ліквідації перехресть між двома подвійними ланцюгами ДНК. Це досягається шляхом розрізання двох одноланцюгових ДНК, що створюють перехрестя, і заліковуванні утвореного одноланцюгового розриву.

Структурам Холідея властива так звана ізомеризація. ДНК - достатньо гнучка рухлива молекула, і її обертання в ділянках перехрестя може створювати два варіанти структури Холідея, при якій або нерекомбінантні ланцюги ДНК будуть перехрещеними, а рекомбінантні - неперехрещені, або навпаки, нерекомбінантні ланцюги ДНК будуть неперехрещеними, а рекомбінантні - неперехрещені. На рисунку знак рівності позначає різні площинні представлення однієї і тієї ж ситуації, тобто пов'язані ним картинки топологічно еквівалентні.

Рис.3.Ізомеризація структури Холідея



Ці два альтернативних стани виявляються далеко не рівноімовірними, і на те, яке саме буде домінувати, впливає присутність низки спеціальних білків.

Розділення структур Холлідея може відбуватися по одному з двох варіантів - або по конверсійному шляху, або по рекомбінаційному шляху. Вибір шляху відповідає одному з ізомерів, показаних вище, але визначається не випадковим вигинанням ниток ДНК, а тим, з якими білками пов'язана та чи інша структура Холідея.

При роздленні по конверсійному шляху структура Холідея розділяється, виходячи з такого ізомеру, де перехрещені ланцюги ДНК, один з яких брав участь в інвазії, а другий - утворював D-петлю. При цьому обидва брали участь у обміні хроматиди (дволанцюгове ДНК) зшиваються так, як вони вступали в обмін, і можуть нести зміни тільки в ділянці, що побувала в складі гетеродуплексів.

Розділення по рекомбінаційному шляху відбувається виходячи з такого ізомеру, де перехрещуються ті ланцюги ДНК, які не брали участь в інвазії і не утворювали петлі. У результаті саме вони виявляються розрізаними в області перехрестя і надалі пришиваються до ланцюгів у складі подвійних ланцюгів, що звільнилися від перехрещення. Як наслідок, обидва ланцюги кожної хроматиди виявляються зшитими з ланцюгами іншої хроматиди, тобто дволанцюгові молекули виявляються зшитими хрест-навхрест. Повторимо ту ж картинку, доповнивши її розділенням структури Холідея, ліворуч - по конверсійному шляху, праворуч - по кросоверному. Нагадаємо, що зображена «ліва» структура і мається на увазі ще одна структура праворуч, причому правіше її два верхні ланцюги ДНК, що прийшли від однієї хроматиди, повністю «сірі», а дві нижні, що прийшли від іншого - «червоні».



Рис.4.Розділення структури Холідея різними шляхами

Однак ми зараз розглянули одну структуру Холлідея, а у нас їх є дві, з двох боків від проміжної структури. Якщо обидві з них розділяться по конверсійному шляху, то кросинговер не відбудеться. Таку ситуацію легко візуалізувати на вже приведених схемах проміжних структур (повторимо її ще раз, знову в двох крайніх варіантах протяжності міграції гілок у дріжджів і сордаріі), якщо подумки розрізати перехрещені нитки ДНК в місцях перехрещення і зшити їх так, щоб вони не перехрещувалися.

Рис.5.Розділення двох структур Холідея по конверсійному шляху.



Однак при цьому в складі кожного ланцюга в ділянці колишньої проміжної структури або залишаться гетеродуплекси, або вони будуть репаровані по одному з ланцюгів.

Якщо ж хоча б одна з двох структур Холідея розділилася по кросоверному шляху, ми будемо мати кросинговер. На наведеній нижче схемі для проміжної структури дріжджів зліва показаний випадок, коли таким чином розділилася права структура Холідея, праворуч - коли так розділилася ліва структура Холідея.

Рис.6.Розділення правої і лівої структур Холідея по кросоверному шляху

Легко побачити, що процедура розрізання перехрестів і зшивання сусідніх кінців призведе тепер до того, що кожен з ланцюгів ДНК кожної з хроматид виявляться пришитими до ланцюгів протилежної хроматиди праворуч і ліворуч від колишньої структури Холідея, тобто ми будемо мати кросинговер. Слід звернути увагу на те, що кросинговер зачіпає обидва ланцюга ДНК задіяних у ньому хроматид, але з деяким зрушенням (на довжину колишньої проміжної структури).

Неважко зрозуміти, що якби обидві структури Холідея однієї проміжної структури розділились по кросоверному шляху, то ми знову не мали б кросинговеру (вірніше, мали б подвійний кросинговер з дуже близькими точками розриву). Але такого судячи з усього просто не буває-для розділення структури Холідея по кроссоверному шляху необхідна зборка певного білкового комплексу і не виключено, що два таких комплекси не поміщаються на одну проміжну структуру.

Закономірності інтерференції

У дріжджів обидва варіанти розділення структур Холідея приблизно рівноймовірні. У багатоклітинних велика частина D-петель розділяється за конверсійним шляхом, і лише деякі - за рекомбінаційним.

У дріжджів розділення по рекомбінаційному вимагає присутності білка MSH4, до якого потім приєднуються білки MLH1 і MLH3. У ссавців відбуваються множинні посадки MSH4 на хромосоми в момент їх спаровування, їх кількість все зменшується, і нарешті в тих сайтах, де з'являються білки MLH1 і MLH3, відбувається кросинговер. Відсутність будь-якого з двох білків виключає у ссавців більш 90% кросоверних подій. Інші 10% кросинговеру йдуть по якомусь іншому механізму, з залученням інших білків.

Всі згадані білки належать до родини білків mismatch repair і беруть участь у репарації гетеродуплексів. І всі вони безпосередньо взаємодіють один з одним під час кросинговеру.

На стадії пахітени в місцях, в яких відбувся кросинговер, під електронним мікроскопом видно досить великі, близько 90 нм, білкові гранули - пізні рекомбінаційні вузлики, що представляють собою комплекси вищезазначених і, можливо, якихось ще білків. Як ми вже говорили, флюоресцентні антитіла до MLH1 також добре маркують точки майбутнього кросинговеру вже на стадії пахітени, як це візуалізувано на фотографії П.М. Бородіна (місця посадки MLH1 тут дрібні точки, що світяться зеленим, тоді як великі - це центромери):



Рис.7. Точки майбутнього кросингговеру на стадії пахітени

На цій стадії хромосоми компактизовані ще не дуже сильно і, головне, рівномірно, тому відстань між сусідніми сайтами посадки MLH1 більш-менш адекватна фізичній відстані (уздовж молекули ДНК). Ця відстань варіює, і щоб зрозуміти як саме, слід побудувати і проаналізувати його статистичний розподіл.

Рис.8. Розподіл відносних дистанцій між сусідніми точками локалізації MLH1



Розподіл Пуассона кількості випадкових подій на відрізку шкали довжиною T

P (n) = хn e-х / n!

(де x = лT) не є єдиним розподілом, який характеризує простий пуассонівський процес. Можна розглянути також розподіл довжини інтервалів шкали між сусідніми випадковими подіями. Воно буде описуватися так званим показовим розподілом.

P (y) = л e-лy

Зауважимо, що якщо розподіл Пуассона задано на множині невід'ємних цілих чисел, що показове - на безлічі невід'ємних дійсних чисел. Всупереч інтуїтивним очікуванням, цей розподіл має максимум в нулі і J-подібну форму (тобто воно монотонно зменшується в міру збільшення y).

Рис.9.Розподіл Пуассона



Як нам тепер і слід було очікувати на підставі існування інтерференції, реальний розподіл відстаней між точками посадки MLH1 не відповідає показовому розподілу. Перш за все, воно має максимум, відмінний від нуля. Однак воно виявилося в дивовижній відповідності до гамма-розподілу, вірніше розподілу Ерланга. Гамма-розподіл має додатковий параметр k. Якщо він заданий на множині натуральних чисел, то воно називається розподілом Ерланга. Це розподіл також породжується простим пуассоновським процесом. Воно є розподіл інтервалів шкали не між сусідніми, а між k-ми сусідніми подіями: від кожної події до другого наступного за k = 2, до третього при k = 3 і т. д. Показовий розподіл - це розподіл Ерланга з k = 1 . На жаль, розподіл Ерланга не висловити простими формулами. Він при великих k наближається до нормального.

Рис.10. розподіл Ерланга

Виходить, що в основі кросинговеру все ж лежить простий пуассонівський процес, але він властивий не кросинговеру, а передуючій йому події, тоді як кросинговер відбувається на кожному k-му такій події. Передуючою подією тут є дволанцюговий розрив, який розвивається в проміжну структуру. Відстань між ними якраз таки повинна відповідати розподілу Пуассона, однак візуалізувати їх не вдається, оскільки розриви відбуваються на стадії лептотени, коли хромосоми ще занадто довгі і переплутані.

Проміжні структури розділяються по конверсійному або кросоверному шляху. Виходить, що існує якийсь механізм, що змушує розділятися по кросоверному шляху кожну k-у проміжну структуру. Природа цього механізму поки невідома. Не виключено, що якісь білки маркують проміжні структури і при цьому збираються в агрегати - k-(або близько того), залишаючи k +1 структуру вільною для зборки комплексу білків, необхідних для розділення структури Холідея по кросоверному шляху.

Є дані, що зазначена закономірність працює на ділянках бівалентів з непорушеним синатонемним комплексом. Навколо точок порушення останнього внаслідок хромосомних перебудов інтерференція різко падає, а у грибів, що не мають синаптонемного комплексу в мейозі, відсутня і інтерференція. Синаптонемний комплекс якимось чином бере участь у передачі «сигналу» про те,що відбувся кросоверний обмін. Не дивно, що інтерференція не передається і через центромеру - тому двоплечі хромосоми як правило обов'язково мають мінімум одну хіазму на кожному плечі.

Таким чином, для кросинговеру та інтерференції на даному етапі наших знань ми як мінімум вже можемо прийняти досить точну математичну модель.

Ті ж експериментальні дані дозволяють емпірично оцінити значення параметра k для різних організмів, тобто відповісти на питання - кожен який розрив відбувається у них по кросоверному шляху. У ссавців виходить приблизно така картина:

у кішки k ~ 3,5,

у собаки 6,5,

у миші 9-12,

Співвідношення між кількістю місць посадки білка RAD51, які можна помітити флюоресцентними антитілами до нього і порахувати на стадії лептотени (але не виміряти відстань між ними, так як хромосоми на цій стадії ще мало конденсовані, довгі і переплутані) і кількістю місць посадки MLH1 в пахітені дуже добре узгоджуються зі значеннями параметра k, експериментально оціненими на основі форми розподілу відстані між посадками одного лише MLH1.

У дріжджів приблизно половина двонитчастих розривів в профазі мейозу супроводжується кросинговером, але про значення параметра k у них говорити не можна, так як у них існує інший, неінтерферуючий шлях.

Генна конверсія

Аналіз, проведений на гетерозиготних модельних об'єктах, що відносяться до аскоміцетів - дріжджях, нейроспор і сордарій, іноді виявляв мейотичні тетради з аномальними співвідношеннями алелей, яке, здавалося б, не могло вийти в результаті мейозу. Як ми знаємо, в першому поділі мейозу розходяться два гомолога, а в другому - дві хроматиди. Гетерозиготи отримують різні алелі від своїх двох батьків, вони знаходяться кожна на своєму гомолозі та подвоюються в S-фазі мейоциту, коли в кожному гомолозі утворюються по дві хроматиди. Незалежно від якого б то не було кросинговеру, в одній тетраді ми повинні спостерігати два продукти мейозу з одним алелем і два з іншим алелем. Однак іноді можна спостерігати і інші співвідношення. Перші такі результати були отримані К. Ліндегерном в 1949 р. У гетерозиготних дріжджів він іноді спостерігав тетради із співвідношенням алелей 3:1 і 1:3. На цій підставі він відродив гіпотезу генної конверсії, висловлену в 1930 р. Вінклером для пояснення кросинговеру через таємниче взаємне перетворення алелей один в одного. У якомусь сенсі в нашому випадку це виявляється правильним, як ми побачимо нижче.

У нейроспори і Sordaria fimicola в якості переважаючого типу конверсії можна спостерігати октади аскоспор (клітини, що виходять при першому мітотичному поділі аскоспор однієї тетради - саме те, що міститься в одному аску обох згаданих цвілей) із співвідношенням алелей 5:3 і 3:5. Якщо дочекатися наступного поділу тетрад дріжджів і також отримати октади, то рідко такі співвідношення можна отримати і у них (хоча у дріжджів переважаючим типом аномальних октад є все ж 6:2 і 2:6). Появу таких співвідношень було названо постмейотичною сегрегацією. Неважко здогадатися, що такі співвідношення можуть отримуватися за рахунок того, що хроматида, що потрапила в клітину тетради, в області аналізованого гена була представлена ??гетеродуплексом, і в s-фазі наступного мітотичного циклу кожен ланцюг дав початок хроматиді з різним аллелем.

Іноді можна спостерігати коконверсію двох близько зчеплених (не більше 1 см) локусів, і ймовірність її тим більша, чим ближче розташовані локуси. Припустимо, в потомстві дигетерозиготи у фазі відштовхування a + / + b ми можемо наближати, на приклад, тетради a + / a + / a + / + b. Це свідчить про те, що конверсія має протяжність, тобто захоплює деяку ділянку ДНК. Винятково рідко можна спостерігати навіть реципрокну конверсію сусідніх локусів, коли по обох з них спостерігаються аномальні співвідношення алелей в тетрадах або октадах, що знаходяться в протифазі, наприклад, у нашому прикладі a + / ab / ab / + b /, причому ймовірність реципрокної конверсії, навпаки, зменшується в міру зближення локусів.

У об'єктів, де тетрадний аналіз неможливий, конверсію спостерігати також практично неможливо, оскільки це вкрай рідкісна подія складається всього лише у відхиленні співвідношення алелей в продуктах одного індивідуального мейозу. Проте свого часу з'явилися дані, що у дрозофіли на дуже близьких рекомбінаційних відстанях спостерігається негативна інтерференеція - різко підвищена частка подвійних кросоверів. Насправді при цьому спостерігався результат не двох кроссоверних подій, а одна подія тієї ж генної конверсії - коли один з алелів «перетворювався» в свого візаві в іншому гомолозі, залишаючись зчепленим з тими ж самими алелями локусів, розташованих неподалік з обох боків.

В 70-х роках минулого століття у дріжджів спостерігався зв'язок між конверсією і кросинговером ,він передбачав, що вони є різними проявами одного й того ж процесу. Ці спостереження істотно просунули розуміння молекулярного механізму кросинговеру, але з'ясований він все ж був досить недавно.

Ми зараз цілком можемо дати пояснення генної конверсії, виходячи зі знання механізму кросинговеру, точніше його початкових етапів. Ми не дарма називали один із шляхів розділення структур Холлідея конверсійним. Коли обидві структури Холлідея однієї проміжної структури розділяються по цьому шляху, цілісність вихідних хроматид відновлюється, але в тому місці, де вона перебувала, залишаються ділянки гетеродуплексів. Подивимося ще раз на рис.5. Розділення двох структур Холідея по конверсійному шляху (тут червоним і синім позначені ланцюги ДНК спочатку однієї несестринскої хроматиди , а пунктиром - ДНК, добудована по матриці відповідного кольору).

Згадаймо ще, що за кадром у нас залишилися дві хроматиди, що не беруть участь в обміні. В ділянці, де відбувалося добудовування другого ланцюга ДНК ми бачимо асиметричне розташування гетеродуплексу: так що в цій ділянці три ланцюги ДНК одного кольору і один - іншого кольору. Додаючи по два ланцюги кожного кольору від необмінних хроматид ми отримуємо розщеплення 5: 3. Якщо гетеродуплекс випадково захопив варіабельний сайт (ділянка, по якому розрізняються алелі) досліджуваного нами локусу, то ми будемо спостерігати октади (продукти одного мітозу, наступного за одним мейозом) саме з таким співвідношенням алелів, як, наприклад, на ось цій фотограціі:

Рис.11.Октади



Рис.12.Тетради

В ділянці, порушеної міграцією гілок, де добудовування не відбувалося, ми спостерігаємо симетричне розташування гетеродуплексів, яке не порушує співвідношення ниток ДНК різного кольору, так що ми будемо мати співвідношення ланцюгів ДНК 4: 4. Хоча співвідношення ниток і не порушено, ми можемо розпізнати отримані октади як аберантні, оскільки внаслідок постмейотичної сегрегеціі порушене звичне нам розташування аскоспор з ідентичним алелем суміжними двійками, як наприклад у випадку з попередньої картинки.

Питання - звідки беруться конверсійні тетради з співвідношеннями 6: 2, як у випадках f і g вище і на наступних фотографіях?

Рис.13,14. Конверсійні тетради з співвідношеннями 6: 2

Розглянуті нами механізми не дають відповіді на це питання, оскільки такі тетради з'являються в результаті ще одного, додаткового процесу. Цей процес - мейотична репарація гетеродуплексів (meiotic mismatch repair). Репарація гетеродуплексів ініціюється однонитчастим розривом і виправляє надрізаний ланцюг по цілому. У нашій системі вона може відбуватися в двох місцях, де утворюються дуплекси з однонитчастих розривів - в ділянці інвазії одночасно з інвазією і біля структур Холідея в момент їхнього розділення.

Біля точки інвазії репарація гетеродуплексів незмінно має місце у одних об'єктів і з невеликою ймовірністю відбувається у інших. Якщо вона відбувається з невеликою ймовірністю, як у сордарії, то переважно виникають конверсійні октади 5:3. Якщо вона має місце завжди, як у дріжджів, то репарація ланцюга, що мав надріз, по матриці нерозрізаного ланцюга ДНК призводить до уніфікації в цьому місці всіх чотирьох ланцюгів ДНК двох хроматид, що беруть участь в проміжній структурі. З урахуванням ланцюгів ДНК двох хроматид, що не беруть в ній участі, - ми отримаємо співвідношення ланцюгів ДНК 6:2. Це можна вивести зі схеми 5 Розділення двох структур Холідея по конверсійному шляху, звернувши увагу, що в ділянці такої проміжної структури репарація гетеродуплексів по матриці нерозрізаних ланцюгів ДНК зробить всі чотири ланцюги ДНК «синіми»:

Рис.

Репарація гетеродуплексів при розділенні структур Холідея і біля них як мінімум у сумчастих грибів йде завжди. При цьому вона ініціюється однонитчастими розривами ДНК, в даному випадку виникнені при розрізанні перехрещених ланцюгів, а матрицею служать неперехрещені ланцюги. Зрозуміти її результати нам допоможе повторення наведеної вище схеми варіантів розділення структур Холідея, де для однієї напівхіазми показаний конверсійний шлях, а для іншої - кросоверний. Ми зараз переконаємося, що в силу асиметрії проміжної структури у дріжджів репарація гетеродуплексів при розділенні «правої» і «лівої» напівхіазми приведуть до різних результатів, незалежно від того, по якому шляху вона розділилась:

Рис.6.Розділення правої і лівої структур Холідея по кросоверному шляху

Отже, беремо дріжджі (зверху), подумки розрізаємо перехрещені ланцюги, знаходимо примикаючі до перехрестя гетеродуплекси і репаруємо їх по нерозрізаному ланцюгу. Зліва маємо тільки один гетеродуплекс у верхній хроматиді, який репаруюється по червоному ланцюгу при розділенні по конверсійному шляху, в результаті чого отримуємо октаду 4: 4 без конверсії, і по синьому ланцюгу при розділенні по кросоверному шляху, з конверсією 6: 2. Праворуч гетеродуплекс розміщений знизу, а результат протилежний: він буде репарований по червоному ланцюгу при розділенні по кросоверному шляху, з результатом 4: 4, та по синьому ланцюгу при розділенні по конверсійному шляху, з результатом 6: 2. Отримуємо, що в половині випадків кросинговер не буде супроводжуватися конверсією, а в половині - буде супроводжуватися конверсією 6:2.

У сордаріі (знизу), внаслідок протяжної міграції гілок краю проміжної структури являють собою симетричні протяжні ділянки гетеродуплексів. Репарація при розділенні структур Холлідея дає тетради 4:4 без конверсії, проте велика частина гетеродуплексів залишаються не порушеними такою репарацією і дають аберантні 4: 4 октади, тобто октади з постмейотичною сегрегацією.

На завершення, враховуючи усі згадані вище можливості, ми можемо розписати повну групу можливих подій у наступній схемі, де колонки по чотири рядки позначають чотири хроматиди, з яких верхня і нижня не взаємодіяли, а дві середні формували проміжні структури. Тут A, a і B, b позначають алелі крайових генетичних маркерів, + і m позначають домінантний або мутантний алель, за яким ми стежимо в аналізі; середні два символи в кожному короткому рядку, розділені косою рискою позначають алелі локусу m в подвійних ланцюгах ДНК, тобто гомо-або гетеродуплекси.

Конверсії нема Конверсія

*Норм. 4:4 абер. 4:4 5:3 6:2

* Кросинговеру нема

*A m/m B A m/m B A m/m B A m/m B

*A m/m B A m/+ B A m/m B A m/m B

*a +/+ b a +/m b a m/+ b a m/m b

*a +/+ b a +/+ b a +/+ b a +/+ b

* Кросинговер є

*A m/m B A m/m B A m/m B A m/m B

*A m/m b A m/+ b A m/m b A m/m b

*a +/+ B a +/m B a m/+ B a m/m B

*a +/+ b a +/+ b a +/+ b a +/+ b

Загадковий другий шлях кросинговеру

У аскоміцетів повного збігу розподілу кросоверів з рахунковою моделлю кроссинговера не спостерігаються. Досить складні дані про конверсії і рекомбінації свідчать, що у них є два шляхи кросинговеру.

1. «Ранній» шлях: msh4-незалежний кросинговер без інтерференції (вірніше зі слабкою негативною інтерференцією), який повністю визначається подіями в момент інвазії однонитого кінця і, можливо, не пов'язаний з утворенням D-петлі і знайомої нам проміжної структури, тобто в чомусь схожий з моделлю Холідея. Які саме при цьому утворюються проміжні структури та яким чином вони вирішуються - поки невідомо. У дріжджів, у яких репарація гетеродуплексів в ділянці інвазії майже облігатна, вона в нормі супроводжується конверсією поблизу точки інвазії за типом 6:2. У сордаріі, у якої репарація тетеродуплексів в районі інвазії відбувається далеко не завжди, він супроводжується конверсією за типом 5:3, рідше 6:2.

2. «Пізній» шлях: msh4-залежний кросинговер з позитивною інтерференцією у відповідності зі лічильної моделлю, який відбувається під час розділення структур Холідея. У дріжджів він в половині випадків пов'язаний з конверсією типу 6:2, у сордаріі - з відсутністю конверсії поблизу точки, де сталося розділення структури Холідея по кроссоверному шляху.

З цим були пов'язані отримані на сордарії результати Кітанова, опубліковані в 1978, який зробив наступний висновок: є два типи кросинговеру:

- Кросинговер з інтерференцією, який не супроводжується конверсією

- Кросинговер без інтерференції, який супроводжується конверсією.

Дійсно, конверсія поблизу точки ініціації обміну спостерігається пов'язаною з подіями раннього неінтерфереруючого кросовера,. У той же час репарація гетеродуплексів поблизу структур Холідея, яка відбувається в момент їхнього розділення за рахунок пізнього інтерферуючого кросинговеру, робить конверсію невидимою у сордаріі, тоді як конверсія поблизу точки ініціації при довгих проміжних структурах сордаріі відбувається досить далеко і не асоціюється з подією кросинговеру.

Зауважимо, що вивчати зв'язок конверсії та кроссинговера можна лише маючи багато відповідних генетичних маркерів, що допускає тетрадний аналіз, і порахувавши астрономічні кількості тетрад. Проте абсолютно надійні і багатозначні результати, отримані Кітановим в 1974 р., по-перше, протягом чотирьох років залишалися неопублікованими, оскільки суперечили результатам, отриманим на дріжджах, які казали, що будь-який кросинговер супроводжується конверсією поблизу від точки свого проходження (ми вже знаємо чому ), і її можна зареєструвати, якщо там є відповідний ген. По-друге, ці результати на тридцять років опинилися на узбіччі генетики, не отримавши ні підтвердження, ні пояснення, ні розвитку. Після закриття його лабораторії в Йокогамі в 1989 р., Кітанов віддався вивченню китайської і англійської поезії і садівництву. І тільки в 2008 році група під керівництвом Френкліна Сталя - того самого, який експериментально встановив напівконсервативний характер реплікації ДНК - повернулася до робіт Кітанова і досліджувала те ж питання на дріжджях, підтвердивши наявність другого типу кросинговеру, якому не властива інтерференція.

У дріжджів, де вся проміжна структура асиметрична, спостерігається конверсія 6:2 і в районі інвазії, і в половині випадків розділення структур Холлідея, і тільки її придушення шляхом введення в досліджуваний локус коротких паліндромів дозволило групі Сталя, працюючи з дріжджами, спостерігати неінтерферуючі кроссоверні події , що супроводжувалися конверсією 5: 3.

У дріжджів другий шлях кроссинговеру відповідальний за 30-50% всіх кросоверів. У нематоди Coenorhabdites elegans виявлений тільки msh4-залежний механізм кросинговеру. У мишей на частку канонічного кроссинговера припадає близько 90% всіх кроссоверного подій, решта 10% відбуваються по якомусь іншому шляху, але чи схожий цей другий шлях на дріжджовий - поки невідомо.



Висновок

Молекулярні механізми кросинговеру вивчалися протягом багатьох років різними вченими. Сформувалося багато уявлень про даний процес, створено різні моделі, але все ж таки на сьогодні ще не знайдено остаточних відповідей на багато питань, які виникають при вивченні цього процесу. Модель Р. Холідея визнали помилковою, хоча там і правда утворюються структури, описані ним раніше.Уже виявлено,що існує декілька щляхів кросинговеру, і всі вони потребують додаткових пояснень.



Список використаних джерел

1. О.Э. Костерин, ИЦиГ СО РАН и ФЕН НГУ, Новосибирск, 2012 г.

2. http://uk.wikipedia.org/wiki/

3. Kathryn P. Kohl, Corbin D. Jones, Jeff Sekelsky. Evolution of an MCM Complex in Flies That Promotes Meiotic Crossovers by Blocking BLM Helicase // Science. 2012. V. 338. P. 1363-1365.

4. Кушев, В.В. Механизмы генетической рекомбинации / В.В. Кушев.- Л.: Наука, 1971.- 247с.

Размещено на Allbest.ru