Использование микросателлитного анализа ДНК для изучения популяций кумжи (Salmo Trutta L.) в реках Абхазии

В целом, выявление противоположных генетических процессов, сопровождающих искусственное разведение, свидетельствует о том, что при этом может нарушаться равновесие между инбридингом и аутбридингом, которые взаимно уравновешивают друг друга в условиях нормального воспроизводства дифференцированного генофонда (т. е. в нативных системах популяций) (Алтухов, 2004).

В мировых масштабах лососевые имеют важное промысловое значение. По данным Г.П. Барача (1960), в Абхазском АССР начало учётов уловов лосося связано с основанием в 1935 году лососевого рыбоводного завода на р. Чёрной (ЧРЗ). В результате искусственного разведения в период с 1935 по 1940 гг. и усиления охраны нерестовых рек запасы и уловы лосося стали быстро возрастать, достигнув в 1939 г. до 90 центнеров (Барач, 1960).

Искусственное разведение лосося было прервано в 1940 году в связи с войной и возобновлено после её окончания в 1945 г. В результате прекращения работ по разведению лосося, ослабления охраны нерестовых рек и развития хищнического браконьерского лова на реках, с применением взрывчатых и отравляющих веществ, запасы лосося сильно сократились; резко снизились промысловые уловы - в среднем до 13 центнеров в год в период 1945-1953 годов (Барач, 1960).

С 1955 года ЧРЗ, временно находясь в ведении Азчеррыбвода (Краснодар), фактически прекратил работы по воспроизводству лососевых запасов, вошёл в состав Чернореченского форелевого хозяйства и превратился в экспериментальную базу для тематических работ кафедры рыбоводства Мосрыбвтуза. В связи с этим численность речного лососевого населения реки Мчишта за эти годы сократилась в 18 раз, сильно сократились и уловы лосося на морских промыслах Грузрыбпрома, практически лосось потерял промысловое значение (Барач, 1960).

Рыбопродуктивную площадь лососево-форелевых рек Абхазии Г.П. Барач (1960) определяет ориентировочно в 18 тысяч гектаров, их возможную, при рациональном рыбохозяйственном использовании на основе широкого развёрнутого лососеводства-форелеводства, рыбопродукцию в 100 тыс. центнеров высококачественной рыбы - лосося и форели (Барач, 1960).

1.8 Охрана вида

Несмотря на активное искусственное воспроизводство кумжи увеличения её запасов не происходит, численность диких популяций продолжает снижаться. Это вызвано как широким распространением и интенсивным проявлением синдрома М-74 на рыбоводных заводах ряда стран, так и нарушением экологического состояния фиордов и заливов, где в течение нескольких лет активно развивалось садковое разведение лососевых, так и утратой нерестовых рек в результате гидростроительства и лесосплава. Во всех странах в текущем столетии сократилось количество нерестовых рек, уменьшились площади нерестилищ. Результатом этого стало значительное сокращение численности смолтов.

Все подвиды кумжи резко сократили свою численность и внесены в Красную книгу Российской Федерации 2001 года.

Обыкновенная кумжа (Salmo trutta trutta) -- как проходная, так и пресноводная (форель) формы из бассейнов Балтийского моря включена по категории 2 как сокращающиеся в численности популяции. Сюда включены проходная форма из Финского залива и Калининградской области, озерная форель из бассейнов Ладожского, Онежского и некоторых озер Карелии, а также речная форель из небольших рек и ручьев Карелии, Ленинградской, Псковской, Новгородской, Вологодской, Тверской и Калининградской областей. В настоящее время численность всех форм и популяций Балтийского моря постоянно сокращается, в некоторых водоемах они исчезли совсем.

Причины падения численности -- строительство гидроэлектростанций, незаконный вылов, дренажные работы, сокращение площадей озер и их загрязнение.

Меры охраны: мелиорация нерестилищ, реконструкция нарушенных мест обитания, искусственное воспроизводство, криоконсервация геномов.

Проходная форма черноморской кумжи (Salmo trutta labrax) относится к категории 1, как находящаяся под угрозой исчезновения. Эта кумжа всегда была немногочисленной, но ценной промысловой рыбой. Ранее ежегодно у берегов Грузии ее добывали по 9 т. Сейчас же она повсеместно редка.

Причины резкого сокращения численности -- нерегулируемый промысел, гидростроительство, загрязнение и браконьерство.

Меры охраны -- искусственное воспроизводство и криоконсервация геномов. При восстановлении запасов особое внимание следует обратить на речную форель, так как в ряде случаев они образуют единое нерестовое стадо.

Проходная форма предкавказской кумжи (Salmo trutta ciscaucasicus) из бассейна

Каспийского моря также проходит по категории 1 как находящаяся под угрозой исчезновения. На территории России это кумжа из рек Терек, Самур и крайне редко Волга и Урал. Если раньше уловы были до 620 т в год, то в 1970 г выловили всего 5 т. В настоящее время ее численность на территории России не определялась.

Причины резкого сокращения численности -- нарушение естественного воспроизводства после строительства плотин, нерациональный промысел и браконьерство.

Меры охраны искусственное воспроизводство с выпуском молоди на стадии смолта и криоконсервация геномов.

Неопределенная по статусу ручьевая форель из верховьев Волги и Урала имеет статус 4 -- неопределенные по статусу жилые формы кумжи в виде ручьевых форелей. В последние годы отмечается повсеместное сокращение численности.

Причины -- изменение экологической ситуации в верховьях рек и ручьев, загрязнение вод и интенсивный вылов. Мер охраны пока нет, кроме тех мест, которые относятся к заповедным.

Эйзенамская форель (Salmo trutta ezenami) относится к категории 2 -- сокращающаяся в численности форма озерной форели, узкоареальный эндемик. Численность ее всегда была невелика, особенно крупной формы. До конца 1960-х годов численность оставалась относительно стабильной. В начале 1970-х в озеро вселили голавля, который стал поедать молодь форели.

Причины резкого сокращения численности -- вселение нового вида и активное освоение озера человеком.

Меры охраны -- сокращение численности голавля, искусственное воспроизводство (особенно крупной формы) и создание зоны особо охраняемой территории на оз. Эйзенам.

Аральская кумжа (Salmo trutta aralensis) относиться к категории 1. Это самая восточная форма проходной кумжи, ныне, по-видимому, исчезнувшая.

Населял Аральское море, встречаясь повсеместно единичными экземплярами, и Амударью. Ранее считали, что выше Турткуля лосось по реке не поднимался. Сейчас известны факты, позволяющие предполагать, что отдельные особи поднимались на нерест в верховья Амударьи и заходили в ее притоки - Кафирниган и Вахш. В Сырдарье не был отмечен.

В 1935-1937 гг. в Аральском море ежегодно вылавливалось до 10 особей. В последующем случаи поимки не известны. Основные лимитирующие факторы - зарегулирование и сокращение стока Амударьи, падение уровня и осоленение

Аральского моря.

Нерестилища аральского лосося в верховьях Амударьи, очевидно, частично совпадали с нерестилищами его жилой формы - амударьинской форели. В связи с этим, а также учитывая тот факт, что проходные и жилые формы кумжи в определенных условиях переходят друг в друга, амударьинская форель может служить резерватом для восстановления популяции проходного аральского лосося.

Вылов данной рыбы запрещен. С 1978 года внесена в Красную книгу Казахстана. Внесена в Красную книгу СССР (1984) по I категории.

Необходимыми мерами охраны являются: организация искусственного разведения, лимитирование любительского лова амударьинской форели.

Форель ручьевая, обитающая в реках Татарстана, внесена в Красную книгу и относится к категории 1. Она редкая, находится на грани исчезновения. На этой территории обитает только пресноводная форма. В конце XIX в. ручьевая форель была обычна в притоках р. Свияги, встречалась в реке Морквашке несколько выше г. Казани. В настоящее время ловиться рыбаками любителями в локальных участках некоторых притоков реки Камы в единичных случаях (Щеповских, 2006).

Лимитирующими факторами для данной формы являются: загрязнение вод малых рек и ручьев промышленными и сельскохозяйственными стоками, различные виды хозяйственной деятельности человека, в результате которых сокращается количество пригодных биотопов для обитания форели.

Меры охраны: охрана и восстановление малых рек и ручьев, прекращение всех видов их загрязнения, восстановление количества рыб за счёт искусственного воспроизводства и прудового рыборазведения.

Ручьевая форель занесена и в Красную книгу Башкортостана; статус - 3 категория - малочисленный вид, имеющий спорадическое распространение.

В Республике Башкортостан обитает в реках горно-лесной зоны: Узяне, Нугуше и Зигане и их притоках; в Зауралье в притоках р. Урал - Малом Кизиле и Янгельке. Изредка в верховьях речек Бугульминско - Белебеевской возвышенности, относящихся к бассейнам рек Демы и Ик.

Никто из исследователей не отмечает значительных по численности стад ручьевой форели. Считается, что на всем Урале обитает не более 10 тысяч экземпляров этого вида. Лимитирующие факторы: загрязнение малых речек, перелов туристами.

Мерами охраны являются: предотвращение загрязнения рек и речек, охрана от браконьеров в период нереста и в особо жаркую погоду.

В реках и ручьях Абхазии ручьевая форель, достаточно часто встречающаяся рыба,

особенно в верхних течениях. Точных научных данных о сокращении численности ручьевой форели в пределах Абхазии нет; можно лишь по косвенным причинам (загрязнение рек, браконьерство, сокращение численности многих других видов рыб и др.) предположить, что численность может иметь тенденцию к сокращению.

Глава 2. Материалы и методы исследований

2.1 Определение возраста рыб по чешуе

Материалом исследования служили форели, выловленные в октябре 2009 года (4 особи) в р.Кодор и выловленные в июне и августе 2010 г.(27 особей) в р.Том (приток р.Ингур).

У многих рыб возраст определяют по чешуе. Данная методика оправдана и для лососёвых рыб. Для определения возраста рыб чешую рыб берут с середины бока рыбы, выше или ниже боковой линии. Чешуя помещается в чешуйную книжку, в которой приводятся биологические данные анализируемой рыбы. Собранную чешую хранят в сухом месте. При определении возраста чешую промывают в разведённом нашатырном спирте в воде и очищают от покрывающей её слизи. Возраст определяют обычно по передней части чешуи при увеличении под микроскопом (Пряхин и др., 2006) (Приложение 2).

Форма склеритов и их расположение у разных рыб неодинаковы. Летом при быстром росте чешуи откладываются более широкие склериты и расстояние между ними больше, чем при медленном росте чешуи в конце лета или осенью. При просмотре чешуи нам представляется картина смены широких раздвинутых склеритов узкими и сближенными. Широкие и узкие склериты, образовавшиеся в течение года, составляют годовую зону роста чешуи. Годовые зоны роста чешуи следуют друг за другом вокруг центра, и их число соответствует количеству лет, прожитых рыбой. Граница между тесно расположенными склеритами осеннего роста и широко раздвинутыми склеритами весенне-летнего роста называется годовым кольцом (Пряхин и др., 2006).

Годовые кольца замкнуты, идут параллельно окружности чешуи и образуются на границе тесно расположенных склеритов осенне-зимнего роста и раздвинутых склеритов весенне-летнего роста. В зависимости от времени определения возраст рыб обозначают по разному. В конце зимы и весной (до начала нереста популяции) возраст обозначают числами по количеству годовых колец с добавлением точки в верхней части цифр или слова «годовики». Летом и осенью цифрами обозначают количество полных колец, добавляя знак «+» или слово «летки». Знаком «+» обозначают прирост последнего сезона нагула.

При обозначении возраста лососей сначала ставится число лет, проведённых в реке, а затем проведённых в море. Например, 2+ + 3+. Иногда обозначение может быть более сложным: 3+ + 1+ SM + 1+. Это значит, что лосось провёл 3 года в реке, затем один год в море, потом нерестился в реке (знак SM) и снова один год провёл в море.

2.2 Изучение морфологических характеристик рыб

Морфометрической обработке были подвергнуты форели, выловленные в октябре 2009 года в р.Кодор, и форели, выловленные летом (в июне и августе) 2010 г. в р.Том (приток р.Ингур).

При промерах лососей обычно пользуются схемой Смитта, который дал богатейший материал по систематике лососёвых.

Для морфометрического исследования изучаемых особей использовали некоторые общепринятые признаки в систематике лососёвых рыб: длина тела абсолютная (L1), длина тела до конца средних лучей (L2), длина тела до корней средних лучей (L3), длина головы (С), длина рыла (R), длина хвостового стебля (Fr), ширина рыла (SR), диаметр глаза (Y), высота головы (HC) (Приложения 3 и 4).

Длина тела абсолютная (L1), или длина всей рыбы, исчисляется от конца рыла до середины линии, соединяющей концы верхней и нижней лопасти хвостового плавника.

Длина тела до конца средних лучей (L2) - расстояние от вершины рыла, т.е. от передней, наиболее удалённой точки тела при закрытом рте, до конца средних лучей хвостового плавника.

Длина тела до корней средних лучей (L3) - расстояние от конца рыла до корней средних лучей хвостового плавника или до конца чешуйного покрова.

Длина головы (С) - расстояние сбоку от вершины рыла (при закрытом рте) до заднего наиболее удалённого края жаберной крышки.

Длина рыла (R) - предглазничный отдел - пространство головы от вершины рыла до переднего (наружного) края глазного яблока.

Длина хвостового стебля (Fr) - расстояние от заднего края анального плавника до основания хвостового плавника или до конца чешуйного покрова.

Ширина рыла (SR) - горизонтальное расстояние между краями рыла.

Диаметр глаза (Y) - собственно диаметр роговицы, обычно берётся горизонтальный.

Высота головы (HC) у затылка - верхняя точка берётся там, где оканчивается череп. Нижняя - противоположная ей по вертикали. Обычно верхняя точка находится там, где оканчивается чешуйчатый покров.

2.3 Микросателлитный анализ ДНК

Значительная часть повторяющейся (сателлитной) ядерной ДНК состоит из тандемно повторенных копий так называемых коровых (от англ. сore ? ядро) последовательностей. В семействах таких тандемных повторов особое внимание исследователей в качестве генетических маркёров получили минисателлиты, состоящие из повторяющихся копий («мотива») длиной от 9-10 до сотни нуклеотидов каждая, и микросателлиты, повторяющиеся копии которых обычно имеют длину от 1 до 4, иногда 6 нуклеотидов. Микросателлиты обозначаются также как SSR (simple sequence repeat) или STR (short tandem repeat). Минисателлитный локус может насчитывать от двух до нескольких сотен повторов, микросателлитный локус ? от 10 до 100 повторов. Предложена гипотеза об эволюционном происхождении минисателлитов из микросателлитов. Индивидуальные аллели этих локусов отличаются друг от друга числом тандемно повторяющихся копий.

Анализ индивидуальных микросателлитных локусов осуществляют с помощью ПЦР-амплификации, используя праймеры, комплементарные уникальным последовательностям (доменам), которыми фланкирован каждый микросателлитный локус. Далее электрофорезом в полиакриламидном геле определяют «размер» его аллелей, сравнивая с набором стандартных фрагментов ДНК известной длины.

Ряд перечисленных ниже свойств делает эти локусы весьма удобными генетическими маркёрами, обладающими большими возможностями (Wright, 1993).

1. Оба типа локусов в очень большом количестве рассеяны по геному; например, грубая оценка числа микросателлитов (GT)n и (CT)n в геноме кумжи Salmo truttaL. составляет 109000 и 33000 соответственно.

2. Эти локусы в основном локализованы в некодирующих регионах генома и, следовательно, должны быть селективно нейтральны. Это общее правило, видимо, имеет и исключения в случае тесного сцепления с адаптивно значимыми генами. Хотя точные функции мини- и микросателлитов неизвестны, ряд фактов говорит о том, что они могут служить кодирующими или регуляторными элементами.

3. Для этих локусов характерна быстрая эволюция. Скорость спонтанного мутирования мини- и микросателлитных локусов составляет около 10?2 ? 10?4 на локус за поколение, что гораздо больше, чем у аллозимных генов ? около 10?5? 10?6. Поэтому, если дивергенция по аллозимным генам обусловлена только дрейфом, то по мини- и микросателлитным локусам ? и дрейфом и мутациями. Гетерозиготность по минисателлитам может более чем на порядок превышать аллозимную, достигая почти 100%, тогда как по микросателлитам встречается разный уровень полиморфизма, хотя, как правило также выше аллозимного.

4. Микро- и «однолокусные» минисателлиты обладают менделевским кодоминантным наследованием.

5. Микросателлиты одинаковы у близких видов, что позволяет использовать одни и те же праймеры и сходные протоколы анализа.

6. Для анализа микросателлитов требуется очень малое количество крови или какой-либо ткани организма, поэтому возможно прижизненное взятие образцов (у рыб, например, пригодны также высохшая чешуя, отолиты).

7. Возможен автоматизированный анализ микросателлитов.

Используются мини - и микросателлитные локусы в самых различных генетических исследованиях в связи с их высокой скоростью мутирования, большим аллельным разнообразием и гетерозиготностью.

Микросателлитные маркёры нередко выявляют генетическую дифференциацию в тех случаях, когда она не обнаруживается по аллозимным маркёрам, например, у организмов с низкой изменчивостью ферментных локусов, у подвижных морских рыб, на микрогеографической шкале, среди близкородственных популяций или экологических групп одного вида. Высокое аллельное разнообразие микросателлитных локусов, которое позволяет идентифицировать с их помощью потомство конкретных родителей не только в первом, но и в последующих поколениях, открывает возможность для исследования репродуктивного успеха и приспособленности среди особей, отличающихся биологическими и экологическими характеристиками.

В то же время следует указать, что микросателлитные локусы непригодны для эволюционных построений (филогении) на межвидовом и более высоких уровнях, так как наблюдаемое при этом сходство в величине аллелей может отражать не идентичность их происхождения, а так называемую гомоплазмию. Это явление возникает из-за высокой скорости мутирования, когда микросателлитные аллели одинакового размера образуются в результате конвергенции от разного числа прямых или обратных мутационных событий. Ещё одна проблема, с которой сталкиваются при анализе микросателлитов, ? наличие нулевых аллелей, появляющихся вследствие мутаций в сайте связывания с праймером, что не позволяет точно идентифицировать генотипы (Алтухов, 2004).

2.3.1 Выделение тотальной ДНК

Чтобы проводить молекулярный анализ нуклеиновых кислот, нужно получить их в относительно чистом виде. Перед выделением ДНК образец ткани (часть хвостового плавника рыбы) извлекали из коллекционной пробирки и ножницами отделяли фрагменты необходимого размера. Мелкие фрагменты исследуемой ткани затем переносили в отдельную чистую пробирку.

Для экстракции ДНК применяли солевой метод (модифицированный) (Приложение 5). Для выделения ДНК этим методом необходимы следующие компоненты:

1. лизирующий буфер.

2. раствор протеиназы К (20 мг/мл)

3. раствор 6М NaCl

4. изопропанол

5. 70% этанол

6. бидистилят

Состав лизирующего буфера следующий: 0,4М NaCl; .01M TrisHCl (pH8.0); 2 mM EDTA (pH 8.0); 2% SDS.

На 100 мл лизирующего буфера приходятся следующие компоненты:

10мкл 4М-ого NaCl

1 мкл 1М-ого TrisHCl (pH 8.0)

400 мкл 0,5М-ого EDTA (pH 8.0)

40 мкл 20%-ого SDS

68,6 мл воды

SDS (додецилсульфат) - поверхностно-активное вещество, создающее на белках сильный отрицательный заряд, вследствие чего происходит их денатурация и отделение от нуклеиновых кислот. Вызывает разрушение структуры мембран, вследствие разрушения её белковых составляющих.

EDTA (этилендиаминтетраацетат) - хелатирующий агент, связывающий ионы металлов переменной валентности; используется для устранения ингибирования катализируемых ферментами реакций следовыми количествами тяжёлых металлов.

Для выделения ДНК данным методом необходимо осуществить следующие процедуры:

1. навеску ткани поместить в 1,5мл-ую пробирку с 400 мкл лизирующего буфера и 2 мкл раствора протеиназы К. Оставить для лизиса на ночь или 2-3 часа при температуре +580С и периодическом перемешивании.

2. к лизату добавить 300 мкл 6М NaCl, перемещать 30с на вортексе и осадить центрифугированием при 10тыс./мин. в течение 30мин.

3. отобрать в чистые пробирки верхнюю фазу (около 600мкл), стараясь не трогать возможную липидную пленку сверху.

4. к верхней фазе прилить 600 мкл изопрапанола для осаждения ДНК. Смешать. Оставить при минус 200С на 20 минут.

5. отцентрифугировать при 10тыс./мин. в течение 20мин.

6. отобрать изопрапаноловый спирт, промыть осадок 70%-ым этанолом, добавляя 500 мкл этанола и центрифугирования при 12тыс./мин. в течение 12мин.

Осадок ДНК должен быть белым или бесцветным, поэтому цветной осадок 70%-ым этанолом можно промыть неоднократно.

7. спирт слить, подсушить осадок в течение 5-10 минут при 370С.

8. растворить осадок в бидистиляте в течение 10 минут при 500С.

2.3.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Принцип метода полимеразной цепной реакции (Polymerase chain reaction) был разработан Кэри Мюллисом (США) в 1983 г. и в настоящее время широко используется как для научных исследований, так и для диагностики в практическом здравоохранении и службе госэпидемнадзора. Метод очень эффективен для изучения полиморфизма ДНК. Он позволяет относительно легко и быстро амплифицировать нужные нуклеотидные последовательности из ничтожных количеств ДНК животного и растительного происхождения, включая ископаемые образцы.

Для реализации ПЦР необходимы следующие компоненты:

? ДНК-матрица (ДНК или её часть, содержащая искомый специфический фрагмент);

? праймеры (синтетические олигонуклеотиды, включающие 20-30 пн, комплементарные последовательностям ДНК на границах определённого специфического фрагмента);

? смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ), т. е. смесь четырёх дНТФ, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК.

? фермент Taq-полимераза (термостабильная ДНК-полимераза, выделенная из термофильных бактерий Thermis aquaticus, катализирующая удлинение цепей праймеров путём последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой ДНК).

? буферный раствор (реакционная среда, содержащая ионы Мg2+, необходимые для поддержания активности фермента).

Нами были использованы пять праймеров для выявления микросателлитных локусов, характеристики которых отображены в таблице 5.

ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка ДНК, катализируемое ферментом Tag-полимеразой. Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающих в различных температурных режимах (Приложение 1):

1. денатурация ДНК (расплетение двойной спирали). Протекает при 93- 95°С в течение 30-40 сек.

2. присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50-65°С. Время отжига ? 20-60 сек.

3. достраивание цепей ДНК (синтез новых цепей). Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5/- конца к 3/- концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Процесс синтеза, катализируемый Taq-полимеразой, проходит при температуре 70-72°С. Время протекания синтеза 20-40 сек.

Таблица 5. Характеристика микросателлитных локусов

Название локусов	Повтор. «мотив»	Праймеры
Str15INRA	СТ	5'-TGCAGGCAGACGGATCAGGC-3' 5'-AATCCTCTACGTAAGGGATTTGC-3'
Str60INRA	GT	5'-CGGTGTGCTTGTCAGGTTTC-3' 5'-GTCAAGTCAGCAAGCCTCAC-3'
Str73INRA	GT	5'-CCTGGAGATCCTCCAGCAGGA-3' 5'-CTATTCTGCTTGTAACTAGACCTA-3
Str85INRA	CT	5'-GGAAGGAGGGGAGAAAGGT-3' 5'-GGAAAATCAATACTAACAA-3'
Ssa197	GTGA	5'-GGGTTGAGTAGGGAGGCTTG-3' 5'-TGGCAGGGATTTGACATAAC-3'

Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона). В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2n, где n ? число циклов амплификации (экспотенциальное увеличение числа цепей). Поэтому, если в исходном растворе первоначально находилась только одна двуцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле.

Процесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате (амплификаторе), который по заданной программе автоматически осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации.

Чтобы уменьшить риск образования неспецифических продуктов реакции амплификации, используют подход, получивший название “горячий старт” (“Hot-start”). Суть его состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения в пробирке условий, обеспечивающих специфический отжиг праймеров. Дело в том, что в зависимости от ГЦ-состава и размера, праймеры имеют определенную температуру плавления (Tm). Если температура системы превышает Тm, праймер не в состоянии удерживаться на цепи ДНК и денатурирует. При соблюдении оптимальных условий, т.е. температуры отжига, близкой к температуре плавления, праймер образует двухцепочечную молекулу только при условии его полной комплементарности и, таким образом, обеспечивает специфичность реакции. Для этого применяется HotTaq полимераза (химически модифицированная), которая неактивна до начала ПЦР.

На отжиг праймеров, кроме температуры, влияет концентрация MgCI2. Высокая концентрация MgCI2 увеличивает образование неспецифических продуктов амплификации, а недостаток концентрации данного компонента снижает выход необходимого количества ПЦР-продуктов. На эффективность использования ПЦР, кроме концентраций необходимых компонентов и температурного режима, влияет и особенность работы конкретного амплификатора.

2.3.3 Электрофорез

Молекулы ДНК представляют собой полианионы, которые в электрическом поле движутся к аноду. ДНК (одно- и двухцепочечные) движутся в геле со скоростью, обратно пропорциональной десятичному логарифму их молекулярной массы. При этом одноцепочечные молекулы движутся быстрее, чем двухцепочечные. Поскольку молекулярная масса нуклеиновых кислот пропорционально их длине. После разделения фракции ДНК визуализировали по интенсивности флуоресценции в ультрафиолетовом свете в присутствии бромистого этидия.

Для постановки электрофореза в полиакриламидном геле продуктов ПЦР необходимы следующие реактивы:

· 3%-ый APS

Аммоний персульфат 0,2г

Дистиллированная вода 5мл

· 30%-ый акриламид:бисакриламид 29:1

Акриламид 29г

N,N'-Метилен-бис-акриламид 1г

· Краска для нанесения проб

Глицерин 30г

Бромфеноловый синий 250мг

Ксиленцианол 250мг

Дистиллированная вода 70мл

· 10-кратный ТВЕ-буфер

Трис-НСl 54г

ЭДТА-натриевая соль 4,65г

Борная кислота 27,5г

Дистиллированная вода до 500мл

Разделяющий 6%-ый ПААГ (заливка стекол). На 100 мл (2 стекла) необходимо:

30%-ый акриламид:бисакриламид 29:1 20мл

10х ТВЕ 10мл

3%-ый APS 4 мл

Н2О 66мл

ТEMED 60мкл

28%-ый ПААГ (пробка). На 8 мл (2 стекла) необходимо:

10х ТВЕ 800мкл

30%-ый акриламид:бисакриламид 29:1 7,2мл

3%-ый APS 400мкл

ТEMED 10мкл

Для постановки электрофореза в полиакриламидном геле осуществляли следующие процедуры.

1. Подготовка камеры для вертикального электрофореза (Приложение 6 и 7).

Собирали камеру для вертикального электрофореза на два геля. Если необходим только один гель, вторую пару стекол заменяли одним квадратным стеклом. Важно, чтобы стекла были чистыми без ворсинок и пятен. На стол плашмя клали остов камеры, накрывали его стеклом с «рогами», совмещая с боковыми и нижним контурами остова. Вдоль боковых сторон стекла помещали по спейсеру и накрывали стеклом без выемки. Совмещали с помощью скальпеля края стекол и спейсеров, так чтобы последние не выглядывали (особо нижний край). Закрепляли стекла на остове прищепами «бульдог» по середине. Переворачивали конструкцию закрепленными стеклами на стол и повторяли процедуру с другой парой стекол. Окончательно выравнивали стекла так, чтобы поставленная на ровную поверхность камера не качалась. После этого закрепляли стекла с каждой стороны еще двумя парами «бульдогов». Камера готова к работе.

2. Проводили пролимеризацию полиакриламидной пробки. Для этого на ровную поверхность (например, нижняя сторона поддона от камеры) наносили по разметке две дорожки 26%-ого ПААГ и вдоль них опускают дно камеры. Гель поднимается между стеклами на высоту около 1 см. Для застывания гелевой пробки камеру оставляли на 20 минут. Затем камеру с пробкой заливали разделяющим 6%-ым ПААГ. Для удобства гель рекомендуется заливать 20 ил 10-кубовым шприцем по внутренней стороне цельного стекла. Верхняя граница геля должна совпадать с верхней границей «рогатого» стекла. Заливали гель равномерно, стараясь не допускать попадания пузырьков воздуха. Сверху между стекол вставляют гребенку, ориентируясь по верхнему краю рогатого стекла, и давали гелю застыть около 1 часа. Камеру с гелем помещали в поддон и заливали её и ёмкость поддона 1-кратным ТВЕ буфером. Гребенки вынимали строго вертикально. Через клеммы камеру подключали к источнику питания.

3. Префорез. Перед нанесением проб на гель проводили префорез при постоянной силе тока 100 мА в течнение 30 минут.

4. Нанесение проб на гель. Во избежание искривления дорожек пробы желательно не наносить в самые крайние слоты.

ПЦР-пробу смешивали с красителем в соотношении примерно 2:0,5, отбирали от общего объёма 15 мкл и вносили в слот.

5. Электрофорез. Режим электрофореза - постоянная сила тока 55-70 мА. Процесс прекращали, когда расстояние от дна слот до середины полосы красителя составит не менее 13 см.

6. Окраска и отмывка геля. После отключения от источника питания сливали

1-кратный ТВЕ, камеру разбирали, гель помещали в поддон с 0,5 л дистиллированной воды (можно оставить гель на нижнем стекле для удобства его перемещения). Добавляли 20 мкл 10 мкг/мл раствора бромистого этидия. Окрашивали гель в течение 30 минут на шейкере. Затем отмывали гель дистиллированной водой в течение 30 минут на шейкере.

После разделения фракции ДНК визуализировали по интенсивности флуоресценции в ультрафиолетовом свете в присутствии бромистого этидия. Получали электрофореграммы, которые позволяют визуализировать исследуемые микросателлитные локусы. Каждому бэнду (тёмной полосе) на электрофореграмме соответствует аллель определённой длины. Аллели разной длины в электрическом поле двигаются с разной скоростью, поэтому на электрофореграмме темные полосы располагаются на разных уровнях: ниже расположены короткие аллели, выше располагаются более длинные аллели. Толщина бенда зависит от количества ДНК в пробе. Аллели одинаковой длины будут располагаться на одном и том же уровне, поэтому толщина бенда увеличивается. Это будет свидетельствовать о гомозиготности исследуемой особи по определённому локусу.

Глава 3. Результаты исследований

3.1 Возрастной состав форелей

Среди изученных особей обнаружены рыбы разного возраста. Возрастной состав форелей отражён в таблице 6 и на рис.1. Преобладающей возрастной группой явились трёхлетки, в меньшем количестве оказались четырёхлетки и пятилетки. Среди исследованных особей только одна особь оказалась двухлеткой.

Таблица 6. Возрастной состав исследуемых форелей.

Общее количество	Возраст
	1+	2+	3+	4+
31	1	16	8	6

Наличие четырёхлеток и пятилеток может свидетельствовать о том, что исследованные рыбы являются представителями жилой расы (форели).

Рис.1. Возрастной состав исследуемых форелей

3.2 Морфологические параметры форелей

Морфометрические показатели исследуемых форелей разных возрастных групп отражены в таблицах 7, 8, 9, 10 и 11.

Таблица 7. Показатели 2-летней (1+) форели из р. Том.

№	Длина (см)	Ширина рыла (см) (SR)	Диаметр глаз (см) (Y)	Высота головы (см) (HC)	Вес (г)
	тела (абсолютная) (L1)	тела (до конца средних лучей) (L2)	тела (до корней средних лучей) (L3)	Головы (С)	рыла (R)	хвост. стебля (Fr)
1	11,3	10,7	9,8	2,3	0,5	1,8	0,7	0,5	1,5	20

В реке Том (приток р.Ингур) на территории с. Саберио нами выловлены: одна рыба в возрасте 1+, шестнадцать в возрасте 2+, восемь в возрасте 3+, две в возрасте 4+. Рыбы из реки Кодор (4 особи) относились к одной возрастной группе 4+.

Таблица 8. Показатели 3-летних (2+) рыб из р. Том

№	Длина (см)	Ширина рыла (см) (SR)	Диаметр глаз (см) (Y)	Высота головы (см) (HC)	Вес (г)
	тела (абсолютная) (L1)	тела (до конца средних лучей) (L2)	тела (до корней средних лучей) (L3)	Головы (С)	рыла (R)	хвост. стебля (Fr)
1	16,6 ±0,1	15,7 ±0,1	14,3 ±0,1	3,7 ±0,5	1,0 ±0,3	2,9 ±0,3	1,2 ±0,2	0,8 ±0,1	2,7±0,2	50±2
2	17,6 ±1,1	16,9 ±1,3	15,7 ±1,3	3,6 ±0,4	0,9 ±0,2	2,4 ±0,2	1,0 0	0,8 ±0,1	2,8±0,3	50±2
3	15,3 ±1,2	14,7 ±0,9	13,6 ±0,8	3,1 ±0,1	0,8 ±0,1	2,5 ±0,1	0,9 ±0,1	0,7 0	2,5 0	40±8
4	18,1 ±1,6	17,2 ±1,6	16,1 ±1,7	3,6 ±0,4	0,8±0,1	3,0 ±0,4	1,1±0,1	0,9 ±0,2	3,1±0,6	60±12
5	18,1 ±1,6	17,0 ±1,4	15,9 ±1,5	3,5 ±0,3	0,9 ±0,2	3,1 ±0,5	1,1 ±0,1	0,8 ±0,1	3,1±0,6	60±12
6	17,6 ±1,1	16,7 ±1,1	15,8 ±1,4	3,4 ±0,2	0,8 ±0,1	2,9 ±0,3	1,1 ±0,1	0,8 ±0,1	3,1±0,6	50±2
7	16,1 ±0,4	14,6 ±1,0	13,8 ±0,6	2,9 ±0,3	0,7 0	2,3 ±0,3	0,9 ±0,1	0,7 0	2,1±0,4	40±8
8	15,1 ±1,4	14,3 ±1,3	13,2 ±1,2	2,8 ±0,4	0,7 0	2,0 ±0,6	0,8 ±0,2	0,6 ±0,1	2,4±0,1	30±18
9	18,8 ±2,3	17,7 ±2,1	15,8 ±1,4	3,7 ±0,5	0,8 ±0,1	2,7 ±0,1	1,2 ±0,2	0,9 ±0,2	2,4±0,1	70±22
10	17,7 ±1,2	16,6 ±1,0	15,7 ±1,3	3,4 ±0,2	0,7 0	2,7 ±0,1	1,1 ±0,1	0,8 ±0,1	2,2±0,3	50±2
11	13,6 ±2,9	13,0 ±2,6	12,0 ±2,2	2,8 ±0,4	0,6 ±0,1	2,6 0	0,9 ±0,1	0,6 ±0,1	1,9±0,6	30±18
12	17,1 ±0,6	16,2 ±0,6	15,0 ±0,6	3,4 ±0,2	0,7 0	2,7 ±0,1	1,1 ±0,1	0,8 ±0,1	2,3±0,2	60±12
13	16,4 ±0,1	15,7 ±0,1	14,6 ±0,2	3,3 ±0,1	0,8 ±0,1	2,5 ±0,1	1,0 0	0,8 ±0,1	2,2±0,3	50±2
14	12,8 ±3,7	12,2 ±3,4	11,2 ±3,2	2,6 ±0,6	0,6 ±0,1	2,1 ±0,5	0,9 ±0,1	0,6 ±0,1	1,9±0,6	25±23
15	13,6 ±2,9	13,0 ±2,6	11,7 ±2,7	2,9 ±0,3	0,6 ±0,1	2,1 ±0,5	0,9 ±0,1	0,7 0	1,9±0,6	30±18
16	19,3 ±2,8	18,2 ±2,6	16,7 ±2,3	3,9 ±0,7	0,9 ±0,2	3,5 ±0,9	1,5 ±0,5	1,0 ±0,3	3,3±0,8	70±22

Таблица 9. Показатели 4-летних (3+) форелей из р. Том.

№	Длина (см)	Ширина рыла (см) (SR)	Диаметр глаз (см) (Y)	Высота головы (см) (HC)	Вес (г)
	тела (абсолютная) (L1)	тела (до конца средних лучей) (L2)	тела (до корней средних лучей) (L3)	головы (С)	рыла (R)	хвост. стебля (Fr)
1	20,6±0,1	19,7 ±0,1	17,4 ±0,7	4,1 ±0,1	0,9 0	3,2 ±0,1	1,4 ±0,2	1,1 ±0,1	3,6±0,5	90±1,0
2	20,1±0,6	19,0 ±0,6	17,3 ±0,8	3,9 ±0,1	0,8 ±0,1	2,7 ±0,4	1,1 ±0,1	0,9 ±0,1	3,2±0,1	70±21
3	21,7±1,0	20,5 ±0,9	18,7 ±0,6	4,6 ±0,6	1,1 ±0,2	3,1 0	1,4 ±0,2	1,0 0	3,9±0,8	120±29
4	20,3±0,4	19,2 ±0,4	18,1 0	3,7 ±0,3	0,8 ±0,1	3,1 0	1,2 0	0,9 ±0,1	3,2±0,1	60±31
5	21,5±0,8	20,5 ±0,9	19,0 ±0,9	4,1 ±0,1	0,9 0	4,0 ±0,9	1,3 ±0,1	0,9 ±0,1	2,7±0,4	100±9
6	20,4±0,3	19,1 ±0,5	18,0 ±0,1	4,1 ±0,1	1,0 ±0,1	2,4 ±0,7	1,4 ±0,2	1,0 0	2,8±0,3	90±1
7	21,3±0,6	20,2 ±0,6	18,7 ±0,6	4,2 ±0,2	1,0 ±0,1	3,0 ±0,1	1,3 ±0,1	0,9 ±0,1	2,8±0,3	100±9
8	19,9±0,8	19,0 ±0,6	17,6 ±0,5	4,0 0	0,9 0	3,5 ±0,4	1,2 0	0,9 ±0,1	2,7±0,4	100±9

Таблица 10. Показатели 5-летних (4+) форелей из р. Том

№	Длина (см)	Ширина рыла (см) (SR)	Диаметр глаз (см) (Y)	Высота головы (см) (HC)	Вес (г)
	тела (абсолютная) (L1)	тела (до конца средних лучей) (L2)	тела (до корней средних лучей) (L3)	головы (С)	рыла (R)	хвост. стебля (Fr)
1	25,0±0,3	24,0 ±0,3	22,5 ±0,2	5,3 ±0,2	1,3 ±0,1	4,4 ±0,1	1,7 ±0,1	1,2 ±0,1	3,9 ±0,1	200±5
2	25,5±0,3	24,7±0,3	22,1 ±0,2	5,7 ±0,2	1,6 ±0,1	4,5 ±0,1	1,9 ±0,1	1,0 ±0,1	4,1 ±0,1	210±5

Таблица 11. Показатели 5-летних (4+) лососевых рыб из р. Кодор.

№	Длина (см)	Ширина рыла (см) (SR)	Диаметр глаз (см) (Y)	Высота головы (см) (HC)	Вес (г)
	тела (абсолютная) (L1)	тела (до конца средних лучей) (L2)	тела (до корней средних лучей) (L3)	головы (С)	Рыла (R)	хвост. стебля (Fr)
1	33,5±3,0	31,5 ±3,0	30,3 ±2,9	7,1 ±1,0	2,1 ±0,3	5,8 ±0,6	1,9 ±0,2	1,2 ±0,1	5,6 ±0,7	390±100
2	27,0±3,5	25,3 ±3,2	24,8 ±2,6	5,6 ±0,5	1,8 0	4,6 ±0,6	1,5 ±0,2	1,1 0	4,6 ±0,3	240±50
3	31,5±1,0	29,2 ±0,7	28,3 ±0,9	6,5 ±0,4	1,8 0	5,3 ±0,1	1,8 ±0,1	1,2 ±0,1	5,1 ±0,2	300±10
4	30,2±0,3	28,1 ±0,4	26,5 ±0,9	5,2 ±0,9	1,6 ±0,2	5,1 ±0,1	1,7 0	1,1 0	4,4 ±0,5	230±60

В таблице 12 отражены средние значения и соответствующие отклонения всех морфометрических показателей исследуемых рыб разного возраста, выловленных в реке Том. Для каждого параметра приведены минимальное и максимальное значение признаков.

Таблица 12. Морфологические параметры рыб, выловленных в р.Том.

Возраст		2+	3+	4+
К-во особей (n)		16	8	2
Длина(см)	тела(абсолют.) (L1)	Х±mx	16,5 ±1,6	20,7 ±0,6	25,2 ±0,3
		min?max	12,8?19,3	19,9?21,7	25,0?25,5
	тела(до кон.ср.лучей)(L2)	Х±mx	15,6 ±1,5	19,6 ±0,6	24,3 ±0,3
		min?max	12,2?18,2	19,0?20,5	24,0?24,7
	тела(до корн. ср. лучей)(L3)	Х±mx	14,4 ±1,3	18,1 ±0,5	22,3 ±0,2
		min?max	11,2?16,7	17,3?19,0	22,1?22,5
	головы (C)	Х±mx	3,2 ±0,4	4,0 ±0,1	5,5 ±0,2
		min?max	2,6?3,9	3,7?4,2	5,3?5,7
	рыла (R)	Х±mx	0,7 ±0,1	0,9 0	1,4 ±0,1
		min?max	0,6?1,0	0,8?1,1	1,3?1,6
	хвостового стебля (Fr)	Х±mx	2,6 ±0,3	3,1 ±0,3	4,4 ±0,1
		min?max	2,1?3,5	2,4?4,0	4,3?4,5
Ширина рыла (см) (SR)	Х±mx	1,0 ±0,1	1,2 ±0,1	1,8 ±0,1
	min?max	0,9?1,5	1,1?1,4	1,7?1,9
Диаметр глаз (см) (Y)	Х±mx	0,7 ±0,1	1,0 0	1,1 ±0,1
	min?max	0,6?1,0	0,9?1,1	1,0?1,2
Высота головы (см) (HC)	Х±mx	2,5 ±0,4	3,1 ±0,3	4,0 ±0,1
	min?max	1,9?3,3	2,8?3,9	3,9?4,1
Вес (г)	Х±mx	48 ± 11	91 ± 14	205±5
	min?max	25 ? 70	60 ? 120	200?210

X - средний параметр, mx - отклонение от ср.параметра, min - минимальный параметр, max - максимальный параметр.

Из таблицы 12 видно, что с увеличением возраста рыб происходит относительное увеличение всех рассматриваемых морфометрических показателей. Для трёхлеток их реки Том наиболее вариабельными признаками являются длина тела абсолютная (от 12,8 до 19,3 см), длина тела до конца средних лучей (12,2 - 18,2 см), вес рыб (25 - 70 г) и длина тела до корней средних лучей (12,2 - 16,7). Константными параметрами являются: длина рыла, диаметр глаз, длина хвостового стебля и др. Для четырёхлеток и пятилеток по нашим данным характерна большая выравненность по длине тела абсолютной, длине тела до конца средних лучей и длине тела до корней средних лучей.

Таблица 13. Сравнительные морфологические показатели пятилеток

Место отлова	Р.Кодор	Р.Том
Возраст		4+	4+
К-во особей (n)		4	2
Длина(см)	тела(абсолют.) (L1)	Х±mx	30,5 ±1,9	25,2 ±0,3
		min?max	27,0?33,5	25,0?25,5
	тела(до кон.ср.лучей)(L2)	Х±mx	28,5 ±1,8	24,3 ±0,3
		min?max	25,3?31,5	24,0?24,7
	тела(до корн. ср. лучей) (L3)	Х±mx	27,4 ±1,8	22,3 ±0,2
		min?max	24,8?30,3	22,1?22,5
	головы (C)	Х±mx	6,1 ±0,7	5,5 ±0,2
		min?max	5,2?7,1	5,3?5,7
	рыла (R)	Х±mx	1,8 ±0,1	1,4 ±0,1
		min?max	1,6?2,1	1,3?1,6
	хвостового стебля (Fr)	Х±mx	5,2 ±0,3	4,4 ±0,1
		min?max	4,6?5,8	4,3?4,5
Ширина рыла (см) (SR)	Х±mx	1,7 ±0,1	1,8 ±0,1
	min?max	1,5?1,9	1,7?1,9
Диаметр глаз (см) (Y)	Х±mx	1,1 0	1,1 ±0,1
	min?max	1,1?1,2	1,0?1,2
Высота головы (см) (HC)	Х±mx	4,9 ±0,4	4,0 ±0,1
	min?max	4,4?5,6	3,9?4,1
Вес (г)	Х±mx	290±55	205±5
	min?max	230?390	200?210

Таблица 13 позволяет сравнить морфометрические показатели пятилеток из р. Том и р. Кодор. Сопоставляя параметры рыб одного возраста из разных рек видно, что особи, обитавшие в Кодор несколько крупнее, чем в реке Том. Однако малая выборка не позволяет нам на говорить о достоверных отличиях между особями из разных рек.

3.3 Результаты микросателлитного анализа ДНК

При исследовании локуса Str73INRA выявлено, что все изучаемые особи (17 особей) являются мономорфными по данному маркеру: они гетерозиготны (Рис.2). На электрофореграмме видно, что каждая исследованная особь в генотипе имеет два разных аллеля, так как тёмные полосы расположены на разных уровнях. Это свидетельствует о гетерозиготности всех исследуемых особей. Все 17 рыб имеют одинаковый генотип АВ, что указывает на их мономорфность по данному микросателлитному локусу. Аллель В длиннее аллелья А.

Рис.2. Электрофореграмма по микросателлитному локусу Str73INRA. Дорожки 2-18 - генотипы исследуемых форелей, дорожка 1- маркер молекулярной массы ДНК 20bp. А,В - аллели разной длины.

По локусу Str15INRA были исследованы 14 особей. На электрофореграмме видно, что на дорожке 2 имеется одна более жирная полоса, что говорит о гомозиготности данной особи. Все остальные рыбы оказались гетерозиготными по данному локусу. Но особи имеют разные генотипы, что указывает на полиморфизм изучаемых форелей по данному микросателлитному маркеру. Первая и шестая особь имеют одинаковый генотип АС, четвёртая и пятая особи имеют генотип ВЕ, а особи под номерами 7-10 и 14 характеризуются наличием генотипа АВ (Рис.3). Среди исследуемых рыб по данному локусу преобладают аллели А и В, реже встречаются аллели С и D. Самый длинный из всех аллелей данного локуса - Е, самый короткий - А.

Рис.3. Электрофореграмма по микросателлитному локусу Str15INRA. Дорожки 1-14 - генотипы исследуемых форелей (A,B,C,D,E - аллели разной длины).

По микросателлитному локусу Str60INRA нами исследовано 18 изучаемых форелей, которые также оказались полиморфными по данному молекулярному маркеру. Выявлено семь разных аллелей этого локуса (Рис.4). Электрофореграмма показывает, что только одна особь оказалась гомозиготной (АА), все остальные гетерозиготны. Не смотря на кривизну геля мы обнаруживаем, что все образцы с 8 по 18 идентичны по генотипу (DG). Большая часть особей имеют в генотипе аллели D и G, реже встречаются аллели Е и В. Самый длинный аллель данного локуса G, короткий - А.

Рис.4. Электрофореграмма по микросателлитному локусу Str60INRA (A,B,C,D,E,F,G - аллели разной длины). Дорожки 1-18 - генотипы исследуемых форелей

По локусу Str85INRA были исследованы 16 особей. Все исследуемые особи гетерозиготны по данному локусу. Особи оказались полиморфными, выявлено девять аллелей данного STR-локуса (Рис.5). В генотипе особей с большей частотой встречаются аллели H, G и D, реже встречаются аллели Е, I и А. Самый длинный аллель I, а самый короткий - А.

Рис.5. Электрофореграмма по микросателлитному локусу Str85INRA Дорожки 1-16 - генотипы исследуемых форелей (A,B,C,D,E,F,G,H,I - аллели разной длины).

По микросателлитному локусу Ssa197 нами исследовано 13 изучаемых форелей, которые также оказались полиморфными по данному молекулярному маркеру. Три особи оказались гомозиготными (DD, DD, BB), остальные исследуемые рыбы гетерозиготны по данному STR-локусу.

Выявлено шесть разных аллелей этого локуса (Рис.6). В генотипе особей преобладают аллели D,E и F, реже В, С и А.



Рис.6. Электрофореграмма по микросателлитному локусу Ssa197 (A,B,C,D,E,F - аллели разной длины). Дорожки 1-13 - генотипы исследуемых форелей.

Итоговые данные микросателлитного анализа ДНК исследуемых рыб по пяти стандартным STR-локусам представлены в таблице 8.

Таблица 8. Аллельное разнообразие исследованных форелей.

Название локусов	Количество аллелей	Число исслед.особей
Str15INRA	5	14
Str60INRA	7	18
Str73INRA	2	17
Str85INRA	9	16
Ssa197	6	13

Итак, в результате данных исследований подобраны микросателлитные маркеры, которые в дальнейшем могут быть успешно использованы для исследования генетического разнообразия речных популяций черноморской кумжи. Локус Str73INRA , проявивший мономорфизм среди исследованных особей, позволяет предложить его для идентификации кумжи, обитающей в реках Абхазии.

Выводы

1. Среди изученных нами особей кумжи обнаружены рыбы в возрасте от 1+ до 4+. Преобладающей возрастной группой явились трёхлетки -52%. Представлены были четырёхлетки (25%) и пятилетки (19%). Такой возрастной состав указывает на то, что исследованные рыбы являются представителями жилой расы (форели).

2. Морфометрические данные свидетельствуют об относительной однородности особей по большинству измеренных параметров в рамках каждой возрастной группы.

3. Подобраны пять микросателлитных локусов (Str15INRA, Str60INRA, Str73INRA, Str85INRA и Ssa197) для изучения генетической структуры популяций кумжи в реках Абхазии.

4. Большая часть исследованных особей являлись гетерозиготными по всем изученным локусам.

5. По четырём локусам Str15INRA, Str60INRA, Str85INRA и Ssa197 выявлен полиморфизм, т. е. установлено наличие 5, 7, 9 и 6 аллелей соответственно.

6. Локус Str73INRA проявил мономорфизм среди исследованных нами особей. Это позволяет предложить этот локус для идентификации кумжи, обитающей в реках Абхазии.

Литература

1. Алтухов Ю. П. Динамика популяционных генофондов при антропогенных воздействиях. М.: Наука, 2004. С. 86-92, 111-112, 151-156, 183-190.

2. Барач Г. П. Внутренние водоёмы Абхазской АССР, их промысловая ихтиофауна и рыбохозяйственное значение. Сухум: Абгосиздат, 1960. С. 88-96, 127-130.

3. Константинов В. М., Наумов С. П., Шаталова С. П. Зоология позвоночных. М.: Академия, 2004. С. 59, 70.

4. Никольский Г. В. Частная ихтиология. М.: «Высшая школа», 1971. С. 151-152.

5. Правдин И. Ф. Руководство по изучению рыб. Ленинград: издательство Ленинградского госуниверситета, 1939 г. С. 79-82, 166-173.

6. Пряхин Ю. В., Шницкий В. А. Методы рыбохозяйственных исследований. Краснодар: Кубанский Гос. Ун-т, 2006. С. 67-70, 141-144.

7. Расс Т. С. Жизнь животных. М.: «Просвещение», 1971. Т.4. С. 171-174.

8. Тимошкина Н. Н., Барминцева А. Е., Усатов А. В., Мюге Н. С. Внутривидовой генетический полиморфизм русского осётра (Acipenser gueldenstaedtii) // Генетика. 2009. Т. 45, №9. С. 1250-1259.

9. Шарвашидзе В. Л. Рыбы внутренних водоёмов грузинской ССР. Тбилиси: « Сабчота сакартвело», 1984. С. 33-40, 47-53.

10. Щеповских А. И. Красная книга республики Татарстан. Казань: «Идеал-пресс», 2006. С. 155.

11. Эланидзе Р. Ф. Ихтиофауна рек и озёр Грузии. Тбилиси: «Мецниереба», 1983. С. 39-45.

12. http://www.redbook.ru/article87.html. Рыбы Красной Книги Башкортостана. Составитель: Биккинин Р. Ф.

13. http://fish-news.teia.org/trutta1.htm. Ручьевая форель и кумжа.

http://www.ecosystema.ru/08natura/fish/025.htm. Экологический центр «Экосистема».

14. http://redbook.minpriroda.by/animalsinfo.html. Красная книга республики Беларусь.

15. http://www.lesder.ru/fish4.html. Туристическая фирма «Лесная Деревня».

Размещено на Allbest.ru