Іммобілізація ферментів та клітин мікроорганізмів

Размещено на http://www.allbest.ru/

Зміст

Вступ

1. Іммобілізація ферментів

1.1 Використання іммобілізованих ферментів

2. Іммобілізація клітин мікроорганізмів

2.1 Застосування іммобілізованих мікроорганізмів

3. Біосенсори та принципи їх роботи

Висновок

Список використаної літератури



Вступ

Методи іммобілізації універсальні для всіх типів біокаталізаторів - індивідуальних ферментів, клітин, субклітинних структур, комбінованих препаратів.

Поряд з іммобілізацією ферментів останнім часом все більшу увагу приділяють іммобілізації клітин, субклітинних структур. Це пояснюється тим, що у разі використання іммобілізованих клітин відпадає потреба у виділенні й очищенні продуктів мікробного синтезу; уможливлюється одержання поліферментних систем, що здійснюють багатостадійні ферментні процеси.

У промислових процесах все частіше використовують клітини у стані спокою. Справді багато високовартісних продуктів синтезуються зазвичай у стаціонарній фазі росту продуцентів. Клітини, що ростуть і розмножуються, порушують структуру носія, вивільняються з нього і забруднюють цільовий продукт. Для пригнічення росту іммобілізованих клітин рослин використовують дефіцит фітогормонів, а ріст клітин бактерій пригнічують додаванням антибіотиків.

Іммобілізовані клітини мікроорганізмів використовують для біотрансформації органічних сполук, поділу рацемічних сумішей, гідролізу ряду складних ефірів, інверсії сахарози, відновлення й гідроксилювання стероїдів. Іммобілізовані хроматофори використовують у лабораторних установках для синтезу АТФ, а пурпурові мембрани ? для створення штучних фотоелектричних перетворювачів - аналогів сонячних батарей. Створюється реактор на основі іммобілізованих клітин дріжджів для одержання етанолу з меляси, у якому дріжджі зберігали б здатність до спиртового бродіння впродовж 1800 год. Із більш як 2000 відомих нині ферментів іммобілізована й використовується в інженерній ензимології приблизно десята частина (переважно оксидоредуктази, гідролази й трансферази).

Для здійснення хімічних процесів за допомогою іммобілізованих ферментів застосовують колонні, трубчасті, пластинчасті й танкерні реактори різного об'єму й продуктивності. Іммобілізовані ферментні системи функціонують у реакторі у вигляді нерухомої фази, через яку проходить середовище із субстратом, що підлягають хімічному перетворенню (гетерогенний каталіз). У таких реакторах поряд з безперервним режимом використовується й періодичний. [5]



1. Іммобілізація ферментів

Як же проходить іммобілізація? Ферменти закріплюють в просторі по-різному, декількома способами. Їх можна адсорбувати на кераміці, склі, силікагелі, оксидах і гідроксидах металів, полісахаридах, органічних смолах і інших носіях. Адсорбція при цьому здійснюється фізичними або іонними силами взаємодії. Поширені також методи механічного включання ферментів в полімерні гелі, в напівпроникні полімерні мікрокапсули, в повні волокна, в рідкі мембрани. Особливий інтерес мають способи, які дозволяють приєднувати ферменти до неорганічних носіїв за допомогою хімічних (ковалентних) зв'язків. Можливе таке прикріплення ферментів до нейлону, полістиролу, поліакриламіду, іонообмінних смол.

Після закріплення на поверхні носія ферменти необхідно стабілізувати. Справа в тому, що вони є поживою для мікроорганізмів. Тому ферменти захищають від них, наприклад стінками мікропористого носія. Існують і інші способи стабілізації ферментів, коли молекули білку попередньо зв'язують „поперечними містками”, а потім вже прикріплюють хімічними зв'язками до твердого матеріалу і механічно включають утворення, що дістали в тісні пори носія. Зафіксований таким чином фермент може працювати в різних умовах, зберігаючи активність при підвищених температурах і в відносно агресивних середовищах.

Також ефективним методом є іммобілізація не тільки ферментів, але й мікроорганізмів. Використання таких іммобілізованих клітин дає ряд переваг: не потрібно виділяти і очищати ферменти, невеликі витрати на виділення і очистку продуктів реакції, можливе створення наполовину безперервних і автоматизованих процесів.[1]

Використання звичайних розчинних ферментів обмежене через високу вартість чистих препаратів, велику лабільність і складність виділення ферментів від реагентів і кінцевих продуктів реакції. А отже, ці дорогі біологічні каталізатори зазвичай знаходять лише одне застосування. Крім того, при використанні розчинних ферментів, неможливо перевести багато періодичних процесів на безперервний технологічний режим і важко припинити ферментативну реакцію на потрібній стадії. У даний час широко застосовують ферментні препарати у харчовій і легкій промисловості використовують іммобілізовані ферменти, які зберігають специфічність і активність типових біокаталізаторів, є більш термостабільними та стійкими до зміни реакції середовища (рН), в якому відбувається модифікація субстрату, і можуть бути застосовані у безперервних процесах.

Історія іммобілізації ферментів бере початок із 1916 р. коли Дж. Нельсон і Е.Гриффін показали, що інвертаза, адсорбована на вугіллі зберігає свою каталітичну активність. Надалі було здійснено адсорбцію на тирсі (деревоопилках) протеолітичних ферментів для обробки шкіри, використання карбоксиметил-целюлози для іммобілізації цілого ряду ферментів, включення холіестерази у крохмальний гель на поліуретановій пластинці для визначення фосфорорганічних сполук у повітрі.

Наймасштабнішим є процес отримання за допомогою іммобілізованої глюкозо-ізомерази глюкозо-фруктозних сиропів з крохмалю, який попередньо гідролізують до глюкози. Важливе промислове значення мають іммобілізовані ферменти і клітини у виробництві амінокислот.

Отже, іммобілізовані, або нерозчинні ферменти - це штучно одержаний комплекс ферменту з нерозчинним у воді носієм. Процес іммобілізації біологічного матеріалу можна визначити як включення біомолекули у певну ізольовану фазу, що відділена від фази вільного розчину, але може обмінюватися з нею молекулами субстрату, ефектора й інгібітору.[4]

Вивченням основ функціонування та застосування іммобілізованих ферментів і ферментних систем займається інженерна ензимологія. Іммобілізовані ферменти мають ряд переваг порівняно з нативними ферментами:

• Гетерогенний каталізатор можна легко відділити від реакційного середовища, що дає змогу у потрібний момент зупинити реакцію, використовувати його повторно й отримати чистий продукт, не забруднений ферментом.

• Використання іммобілізованих каталізаторів дає змогу проводити ферментний процес безперервно, регулювати швидкість реакції і вихід продукту.

• Іммобілізація ферменту дає можливість регулювати їх каталітичну активність за рахунок зміни властивостей носія під дією деяких фізичних факторів, таких, наприклад, як світло чи звук.

• Іммобілізація і модифікація ферментів сприяє цілеспрямованим змінам властивостей каталізатора, у тому числі специфічності, залежності каталітичної активності від рН, іонного складу та інших параметрів середовища

Для створення іммобілізованих ферментів необхідно мати джерело ферменту, носій і спосіб іммобілізації.

Найширше використовують полімерні носії на основі природних (похідні целюлози, агарози, декстрану) і синтетичних (полістирол, акриламід, нейлон, поліамінокислоти) полімерів. При використанні целюлози та її похідних як носіїв були отримані іммобілізовані ферменти: трипсин, папаїн, хімотрипсин, глюкозооксидаза, каталаза, пероксидаза, піруваткіназа, лактатдегідрогеназа. протеаза, амілаза, глюкоамілаза. аспарагіназа, фосфатаза лужна і кисла, аміноамілаза, рибонуклеаза, дезоксирибонуклеаза та ін.

Синтетичні полімерні носії використовуються для отримання ковалентно зв'язаних іммобілізованих ферментів. Перевагами неорганічних носіїв є те, що вони не піддаються біологічній атаці, хімічно інертні до більшості розчинників, механічно міцні, мають жорстку основу, структура якої не залежить від природи розчинника. До такого типу адсорбентів-носіїв належать каолін, кварц, діатоміти, макропористі силікагелі, аеросилогелі (силохроми), макропористе скло та ін. Останнім часом все частіше як носії використовують пористі скла. Із застосуванням пористого скла були отримані такі іммобілізовані ферменти: рибонуклеаза, протеїназа, глюкозооксидаза, каталаза, пероксидаза, глюкоамілаза та ін.[1]

Незалежно від хімічної природи, до носіїв іммобілізованих ферментів ставлять такі вимоги:

• Висока хімічна і біологічна стійкість.

• Висока механічна міцність.

• Велика питома поверхня, висока ємність, пористість і достатня проникливість для ферменту і субстрату.

• Можливість отримання у вигляді зручних у технологічному плані форм.

• Легке переведення в реакційноздату форму.

• Висока гідрофільність, що забезпечу можливість проведення реакції зв'язування ферменту з носієм у водному середовищі.

• Низька собівартість.

Існує п'ять основних способів іммобілізації ферментів. Деякі з них представлені на рис. 1:

1. Адсорбція ферменту на нерозчинному носії, наприклад, на скляних кульках, кераміці, частинках целюлози, активованому вугіллі.

2. Ковалентне приєднання ферменту до нерозчинного носія, наприклад, до гідроксилів металів.

3. Включення ферменту в нерозчинний водопроникний полімер, наприклад, у крохмаль, силікагель, карагінан, поліуретан.

4. Розміщення ферменту на напівпроникній мембрані (мікрокапсулювання).

5. Надання нерозчинності ферментові шляхом його поперечного зв'язування з біфункціональним агентом, наприклад, глутаровим альдегідом.



Рис 1. Способи іммобілізації ферментів (за Й.Ленгелером, Г.Древсом. Г.Шлегелем. 2005)

Загалом, іммобілізація ферментів може бути здійснена двома принципово різними способами: без утворення ковалентних зв'язків між матрицею і білковою молекулою (фізичні методи іммобілізації) і з утворенням ковалентного зв'язку (хімічні методи).

Дав успішної іммобілізації ферментів беруть до уваги такі фактори:

Фермент повинен бути стабільним за умов перебігу реакції, яку він каналізує, і у процесі іммобілізації.

При ковалентному зв'язуванні уникають тих хімічних груп, які присутні в активному центрі ферменту.

Активний центр оберігають від впливу іммобілізації (заблоковують його).

Процедура відмивання «непришитого» ферменту не повинна впливати на іммобілізовані молекули ферменту.

* Враховують механічну міцність носія і його форму.

Стабільність іммобілізованих ферментів при використанні та зберіганні є важливою характеристикою. Найбільш пристосованими до іммобілізації ті ферменти, які працюють із простими водорозчинними низькомолекулярними субстратами, бо в цих випадках полегшується дифузія. До таких ферментів належать глюкозоізомераза, інвертаза, лактаза, пеніцилінацилаза, фумараза, на основі яких працюють промислові виробництва.

З цією метою використовують також і Aspergillus oryzae. Вони вибірково гідролізують лише аци-L-амінокислоти, аци-D-амінокислоти не зачіпають. Іммобілізовану фумаразу застосовують для отримання яблучної кислоти з фумарової. [1]

1.1 Використання іммобілізованих ферментів

Важлива галузь застосування іммобілізованих ферментів - виробництво антибіотиків. Для отримання амінопеніциланової кислоти використовують іммобілізований фермент з E.coli (внутрішньоклітинний) або Bacillus тegaterium (позаклітинний). В аналітичній хімії використовують ферментні та бактеріальні електроди, за допомогою яких можна швидко, з високою чутливістю і специфічністю проводити аналіз речовин у непрозорих розчинах із суспензії частинок, наприклад у їжі.

Лише кілька процесів із використанням іммобілізованих ферментів мають широкомасштабне використання:

1. Одержання 6-амінопеніциланової кислоти за допомогою іммобілізованої пеніцилінамідази (Японія, Фінляндія).

2. Одержання глюкозо-фруктозних сиропів із використанням

іммобілізованої глюкозоізомерази (США, Великобританія, Голландія, Фінляндія, Данія, Японія).

Розділення рацемічних сумішей амінокислот із використанням іммобілізованої аміноацилази (Японія).

Отримання безлактозного молока з використанням іммобілізованої лактази (Чехія, США, Італія).[4]



2. Іммобілізація клітин мікроорганізмів

Крім іммобілізованих ферментів застосовують іммобілізовані клітини мікроорганізмів. Переваги роботи з іммобілізованими клітинами порівняно з ферментами в тому, що мікробна клітина містить усі необхідні кофактори і ферменти, необхідні для їх регенерації; не потрібна стадія виділення й очищення ферментів; можна отримати велику концентрацію клітин, що сприяє продукції вторинних метаболітів. Крім того, внутрішньоклітинні ферменти найстабільніші у своєму звичайному оточенні. Живі іммобілізовані клітини зручні для безперервною культивування, оскільки швидкість перебігу можна регулювати незалежно від росту клітин, що працюють як мультиферментні реакційні системи, залежні від АТФ і коензимів.

Іммобілізовані тим чи іншим способом клітини мікроорганізми часто використовують для проведення трансформації або біосинтезу ряду сполук протягом кількох місяців і навіть років. Слід зауважити, що іммобілізація клітин проходить у природних біотопах. У ґрунті, в мулі, в гірських породах, на поверхні рослин мікроорганізми головно перебувають у закріпленому стані. У 1732 р. Г. Бургаве в Німеччині використав закріплені на буковій стружці бактерії для виробництва оцту. Нині цей спосіб відомий як «метод Шуценбаха».

Іммобілізовані мікроорганізми здійснюють як одностадійні, так і багатостадійні процеси. У 1970 p. К. Мосбах зі співавт. (Швеція) опублікував результати вивчення можливості проведення такого складного, НАД-залежного процесу, як гідроксилювання стероїдів за допомогою іммобілізованого в поліакриламід ний гель міцелію гриба Curvularia lunаta.

Японською фірмою «Танабе Сейяко» здійснено в 1974 р. промисловий синтез аспарагінової кислоти з використанням іммобілізованих клітин Е.coli і показано переваги цього методу над синтезом аспарагінової кислоти за допомогою іммобілізованої аспартази або вільних клітин.

Труднощі при використанні іммобілізованих клітин обумовлені утворенням деяких побічних продуктів, а також виникненням додаткового дифузійного бар'єру для субстрату і продукту, яким є клітинна стінка та цитоплазматична мембрана.[1]

Для іммобілізації використовують мікроорганізми різних таксономічних груп. Це можуть бути живі чи мертві різною мірою пошкоджені (заморожені, висушені оброблені органічними розчинниками та ін.) клітини. Іммобілізованими можуть бути не тільки вегетативні клітини, але й спори. Вибір стану клітин і способу іммобілізації залежить від того, який процес необхідно здійснити - одностадійний чи багатостадійний. Одностадійні процеси у багатьох випадках можуть здійснювати пошкоджені клітини. Часто при цьому виникає необхідність збільшити проникність клітинної стінки і цитоплазматичної мембрани. Саме це обумовлює необхідність дії на такі мікроорганізми токсичних органічних розчинників (толуолу, ацетону) або біфункціональних реагентів (наприклад, глутарового альдегіду). Поліферментні процеси трансформації та біосинтезу більш ефективно здійснюють живі клітини, здатні регенерувати кофактори. Пошкоджені клітини й екзогенні кофактори використовують для цього лише в деяких випадках.

Вибір методу іммобілізації залежить від реакції або процесів, які будуть здійснювати клітини. Загалом для іммобілізації клітин мікроорганізмів використовують ті ж способи, що і для іммобілізації ферментів - адсорбцію, ковалентне і поперечне зв'язування, включення в гелі. Ковалентне і поперечне зв'язування використовують частіше для мертвих або пошкоджених клітин. Клітини мікроорганізмів іммобілізують флокулюванням, приєднанням до поверхні носія, включенням у полімерний матрикс, використовують вільні суспендовані клітини в реакторі з напівпроникною мембраною або у вигляді крапель у двофазній рідкій системі.

Носіями при іммобілізації мікроорганізмів можуть бути природні та синтетичні сполуки, що здатні забезпечувати необхідні процеси і параметри. Серед різних матриць для іммобілізації клітин мікроорганізмів найуживанішими є полімери - похідні акрилової кислоти.

Як адсорбенти використовують різноманітні матеріали - природні та синтетичні, наприклад кераміку, вугілля, пісок, подрібнені черепашки, металеву стружку, капрон, поліуретан (табл.1).

Таблиця 1. Використання адсорбованих клітин мікроорганізмів (за Н.Єгоровим та ін., 1989)

Процес	Мікроорганізм	Адсорбент
Глюкоза > глюконова кислота	Aspergillus niger	Скло, метал, пористі синтетичні матеріали
Холестерин > холестенон	Nocardia erythropolis
Зброджування пивного сусла	Saccharomyces cerevisiae	Скляні кільця Рашига, керамічні кульки
Гідрокортизон > преднізолон	Arthrobacter globiformis	Целюлоза, кераміка
Азотфіксація	Azotobacter vinelandii	Аніонообмінна целюлоза
Синтез метану	Метаноутворюючі бактерії	Вугілля, азбест
Одержання біомаси	Bacillus subtilis	Частинки нержавіючої сталі
Синтез тинаміцину	Streptomices cattleya	Целіт
Очищення стічних вод від барвників	Pseudomonas sp.	Пісок + стулки мідій + активоване вугілля
Очищення морської води від нафти	Pseudomonas sp.	Пінопласт
Органічні відходи > метан	Асоціації бактерій	Великопориста кераміка

Використання великопористих носіїв-адсорбентів (пористого скла, кераміки) дало змогу створити установку для переробки органічних відходів з метою одержання метану (США). Ефективним є використання адсорбованих клітин у процесах очищення стічних промислових вод.

Для іммобілізації окремих видів мікроорганізмів використовують спосіб іммобілізації, заснований на утворенні ковалентних зв'язків молекул білків та інших сполук клітинної оболонки мікроорганізму з носіями, активованими біфункціональними реагентами (табл. 2).



Таблиця 2. Ковалентне зв'язування інтактних клітин мікроорганізмів (за Н.Єгоровим та ін., 1989)

Процес, фермент	Мікроорганізм	Носій
L-Гістидинамоній-ліаза	Bacillus subtilis	Карбодіімід + агароза
в-Галактозидза	Escherichia coli	Глутаровий альдегід
в-Галактозидза	Zygosaccharomyces lactis	Сефарон + гексаметилендіамін
17в-Оксистероїддегідрогеназа	Saccharomyces paradoxus	в-Аланін--сефарон
Спирт > оцтова кислота	Acetobacter aceti	Оксид титану
Окиснення метану	Метанокиснюючі бактерії	Сілохром, модифікований ізоціанатом

Спосіб включення клітин у полімери різноманітної природи є найуживанішим як у лабораторному, так і у промисловому масштабі. Використовують при цьому природні (карагінан, агар, желатин, хітозан, колаген, різноманітні пектини) і синтетичні (поліакриламідний гель, фото чутливі полімери, поліуретани, полівініловий спирт та ін.) полімери. Залежно від їх механічних властивостей і характеру проведеного процесу, полімери використовують у формі гранул, мембран, волокон. Спосіб включення клітин у поліакриламідний гель використовують завдяки таким властивостям, як простота приготування, відносна дешевизна, можливість включення клітин будь-якого розміру і заданої кількості, пружність фіксації клітин, пружність гранул на стирання і розрив (властивість, необхідна для реакторів з перемішуванням). Для промислового виробництва пива, наприклад, аспарагінової кислоти, використовують клітини Е. coli, включені в поліакриламідний гель. Вихід становить 95% від теоретичного.[1]

Ефективним носієм для іммобілізації клітин мікроорганізмів є к-карагінан (каппа-карагінан) - виділений з морських водоростей. Він складається зі структурних одиниць сульфату, в-D-галактози і З,6-ангідро-б-D-галактози. Наприклад, аспартазна активність клітин Е. colі, включених у карагінан, стабілізується (період півжиття збільшується від 50 до 600 діб і більше).

Використання карагінану замість поліакриламідного гелю і клітин Brevibacterium flavum замість B. ammoniagenes дало змогу у п'ять разів знизити вартість одержаної яблучної кислоти. Цей метод із 1980 р. використовують у промисловому масштабі (Японія).

Таблиця 3. Використання клітин мікроорганізмів. включених у карагінан (зa H. Єгоровим та ін., 1989)

Продукт	Мікроорганізм
Етанол(живі клітини)	Saccharomyces cerevisiae
Ізолейцин(живі клітини)	Serratia marctscens
Сорбоза(живі клітини)	Gluconobacter suboxudans
Аспарагінова кислота	Escherichia coli
L-Аланін	Pseudomonas dacunhae + E.coli
L-Аланін	Pseudomonas dacunhae
Фруктоза	Streptomyces phaerochromogenes
Глютамінова кислота	Corynebacterium glutamicum
Глутатіон	Saccharomyces cerevisiae
б,щ-Додекандикарбонова і б, щ- Тридекандикарбонова кислота	Candida tropicalis
Оцтова кислота	Acetobacter aceti

За допомогою живих клітин іммобілізованих у карагінані проводять процеси одержання сорбози, ізолейцину і етанолу (табл.3). Мікроорганізми ростуть у такому гелі з тією ж швидкістю, що і вільні клітини, а іноді з більшою. Ріст зосереджений у приповерхневому шарі гелю, тому дифузійні ефекти незначні, кисень і компоненти живильного середовища добре використовуються.

Включення в альгінатні гелі належить до м'яких методів іммобілізації - клітини залишаються живими і можуть здійснювати поліферментні процеси. Перевагою Са-альгінатного гелю є його хороші дифузні якості. В цей гель можуть бути включені лише мікроорганізми і ферменти з дуже великою молекулярною масою. Кисень, глюкоза, альбумін дифундують у гель з тією ж швидкістю, що і у водному середовищі.

У багатьох випадках, (при синтезі агроклавіну, пеніциліну, гідроксилюванні прогестерону) включення клітин в альгінат дає кращі результати порівняно не тільки з поліакрилмідним гелем, але й із карагінаном та іншими гелями (табл. 4).

Саме Са-альгінатний гель поряд із фоточутливими полімерами використовують у промисловому масштабі для синтезу етанолу. Тривала життєздатність дріжджів у альгінаті забезпечується доброю аерацією в реакторі баштового типу. Альгінатні гранули, що містять дріжджі та виготовлені в асептичних умовах з низьким pН (4.0), забезпечують відсутність сторонніх мікроорганізмів протягом чотирьох місяців.

Клітини мікроорганізмів іммобілізовані в альгінаті, використовують для виробництва моноклональних антитіл (фірма LKB, Швеція). Клітини в гелі залишаються життєздатними 180 діб і синтезують за цей час до 20 кг моноклональних антитіл.

Включення живих вегетативних клітин і спор з подальшим їх розмноженням у гелі, як правило, забезпечує ферментові активність на рівні вільних клітин. Це показано для Rhizopus nigricans (11 б- гідроксилювання) і Curvularia lunata (11в- гідроксилювання). В останньому випадку використання періодичних інкубацій дало змогу зберегти незмінною активність протягом двох місяців (50 трансформацій кортексолону в періодичних умовах). Бактерії роду Arthtobacter включені у такі полімери, почали використовувати для промисловою одержання акриламіду із акрилонітрилу. Акриламід далі може бути використаний для приготування гелів і відбілювання наперу у промисловому масштабі.

Таблиця 4. Використання клітин мікроорганізмів, включених в альгінатні гелі (за Н.Єгоровим та ін.,1898)

Процес	Мікроорганізм
Розкладання фенолу	Candida tropicalis
Одержання етанолу*	Saccharomyces cerevisiae
Одержання суміші спиртів (ізопропанол, бутанол, метанол)	Clostridium beijerinckii
Одержання ацетону й етанолу	Clostridium acetobutylikum
Трансформація гідрокортизону в преднізолон	Arthtobacter globiformis
Трансформація стеринів до -стероїдів	Mycobacterium phlei
Трансформація стеринів -стероїдів	Nocardia erythropolis
Перетворення кортексолону в гідрокортизон	Curvularia lunata
Одержання L-кетокислот	Trigonopsis variabilis
Біосинтез інулази	Kluyveromyces marxianus
Біосинтез пеніциліну	Penicillium chrysogenum
Біосинтез тілозину і нікоміцину	Streptomyces tendae
Біосинтез агроклавіну	Claviceps purpurea
Трансформація гліцерину в діоксиацетон	Gluconobacter suboxudans(+ Chlorella)
Денітрифікація	Pseudomonas denitrificans
Вилучення металів зі стічних вод*	Alcaligenes eutrophus
Азотфіксація	Anabaena sp.
У виноробстві* (яблучна кислота > молочна кислота)	Leuconostos oenus

*? освоєно у промисловому масштабі

Клітини мікроорганізмів, іммобілізовані вказаним способом, використовують для реакцій трансформації, які проводять, у двофазних системах (вода - органічний розчинник). Такі умови використовують для трансформації малорозчинних у воді сполук, наприклад стероїдів і ефірів ментолу.[1]

До параметрів, що характеризують іммобілізовані системи, належать стабільність біокаталізатора, яка вимірюється періодом півжиття (коливається від кількох днів до кількох років) і продуктивність реактора (неживі клітини переважно мають продуктивність від 500 до 2000 молів продукту на 1 л об'єму реактора за період двох півжиттів).

Іммобілізовані клітини використовують при проведенні безперервних та напівбезперервних процесів, що полегшує автоматизацію, дає змогу використовувати реактори різного типу, наприклад, безперервні реактори з витісненням (колонки з подаванням розчину згори без перемішування), реактори з перемішуванням і продуванням повітря (періодичні та безперервні), пластинчасті реактори та ін.[1]



2.1 Застосування іммобілізованих мікроорганізмів

Приєднані до поверхні деревної стружки клітини Acetobacter sp. використовували для отримання оцту ще у 1823 р. На даний час адсорбовані до поверхні твердих тіл клітини працюють у фільтрах для очищення стічних вод. Іммобілізовані бактерії використовують для вилуговування бідних руд.[3]

За допомогою іммобілізованих клітин організмів родів Streptomyces і Chlorella добувають уран із прісної та морської води, Rhizopus arrihizus використовують для адсорбування торію. З 1964 р. оброблені нагріванням клітини мікроорганізмів застосовують для стероїдів.

Іммобілізовані клітини застосовують для здійснення процесів трансформації органічних сполук, наприклад, для розділення рацемічних сумішей на оптичні ізомери, інверсію сахарози, дегідрування, відновлення і гідроксилювання стероїдних сполук та інших процесів.

Технологічні процеси з використанням іммобілізованих клітин застосовують у виробництві харчових продуктів і фармацевтичних препаратів. Так L-аспарагінову кислоту з фумарату амонію отримують за допомогою іммобілізованих у поліакриламідний гель клітин E.coli, цитрулін з аргініну - за допомогою іммобілізованих клітин Pseudomonas putida.

У промисловому масштабі іммобілізовані клітини мікроорганізмів використовують для отримання аспаргінової і яблучної кислот (Японія, Китай, США), фенілаланіну(США), 6-амінопеніцилової кислоти (Японія), фруктози і фруктозо-глюкозних сиропів із різної сировини (США, Італія), у виноробстві (Данія,Голландія, Франція), у пивоварінні (Чехія) і в ряді інших процесів.[3]

Отже, активність і стабільність іммобілізованих систем, які використовують для проведення поліферментних процесів трансформації, які регенерують не тільки необхідні ферменти, але й кофактори, визначаються переважно способом іммобілізації і природою носія, умовами іммобілізації та можливістю збереження клітин у життєздатному стані. Саме життєздатні клітини здійснюють в іммобілізованому стані процеси біосинтезу різних органічних сполук, у тому числі органічних кислот, антибіотиків, ферментів та ін. (табл. 5 і 6).[1]

Таблиця 5. Біосинтез антибіотиків іммобілізованими клітинами (за Н.Єгоровим та ін., 1989)

Антибіотик	Мікроорганізм	Носій
Пеніцилін	Penicillium chrysogenum	Поліакриламідний гель, Са-альгінат
Бацитрацин	Bacillus subtilis	Поліакриламідний гель
Кандицидин	Streptomyces griseus	Колаген
Нікомоцин і тілозин	Streptomyces tendae	Са-альгінат
Нізин	Streptomyces lactis	Поліакриламідний гель
Тинаміцин	Streptomyces cattleya	Адсорбція на целіті
Цефалоспорин	Streptomyces clavuligerus	Поліакриламідний гель

Таблиця 6. Біосинтез ферментів іммобілізованими клітинами (за Н.Єгоровим та ін., 1989)

Фермент	Мікроорганізм	Носій
б-Амілаза	Bacillus subtilis	Поліакриламідний гель
в- Лактамаза	Escherichia coli	Поліакриламідний гель
в- Інулаза	Kluyveromyces marxianus	Альгінат
Протеаза	Streptomyces sp.	Поліакриламідний гель
Целюлоза	Trichoderma reesei	Карагінан



3. Біосенсори та принципи їх роботи

іммобілізація фермент клітина біосенсор

Електрохімічний біосенсор ? це самодостатній інтегральний пристрій, який здатний генерувати селективну кількісну або напівкількісну аналітичну інформацію використовуючи біологічний розпізнавальний елемент (біохімічний рецептор), який перебував у безпосередньому просторовому контакті і електрохімічним перетворюваним елементом (трансдуктором). Функціонально біосенсори можна порівняти з біорецепторами - датчиками живого організму, які перетворюють всі типи сигналів навколишнього середовища в електричні. Роль біоелемента можуть виконувати інтактні органи, шматочки тканин, мікроорганізми, органели, природні біомембрани або ліпосоми, рецептори, ферменти, антитіла й агенти, нуклеїнові кислоти й інші біомолекули, а також біометики, що імітують структурно-функціональні особливості природного біоелемента (рис. 2).

Рис.2 Біосенсор

Біосенсори, створені на основі іммобілізованих ферментів мікроорганізмів, називають ферментними біосенсорами (ферментними електродами, або мембранними біосенсорами), на основі цілих клітин мікроорганізмів ? бактерійними біосенсорами або бактерійними електродами.

Нині створені ферментні електроди для визначення концентрації багатьох речовин: сечовини, етанолу, пеніциліну, амігдаліну, різних амінокислот і багатьох неорганічних іонів.

Бактерійні електроди мають більшу стабільність, ніж відповідні ферменті. Біосенсор для визначення концентрації глюкози був створений одним із перших. Джерелом глюкозооксидази є клітини Pseudomonas fluorescens, які використовують глюкозу. Клітини іммобілізували на колагеновій мембрані. Сенсор складається з подвійної мембрани, в якої один шар - бактерійна колагенова мембрана, а другий ? киснепропускна тефлонова мембрана. Подвійна мембрана перебуває у прямому контакті з платиновим катодом і занурена у досліджену пробу. Під впливом глюкозооксидази відбувається селективне окиснення глюкози і за зменшенням , говорять про її концентрацію. Електрод може стабільно працювати протягом 4 місяців. Наприклад, за допомогою глюкозного електрода можна визначити до ?моль глюкози у зразку. Глюкозні біосенсори є найуживанішими і створені з використанням різних мікроорганізмів (табл. 7).

Таблиця 7. Деякі біосенсорні системи для визначення глюкози

Метод визначення	Носій ферменту	Біологічний агент
Кисневий електрод	Біосинтетична епоксидна колонка	E.coli
Амперметричний	Мембрана	Cellobiase
Амперметричний	Графітова паста з диметилфероценом	S. cerevisiae
Амперметричний	Графітова паста з тетратіофулваленом	Ацидофільні метилотрофні бактерії
Потенціометричний	Іоном елективний електрод	E.coli, S. cerevisiae
Хемілюмінесцентний	Колонка CPG	Penicillium chrysogenum

Ензимні сенсори визначаються високою селективністю і швидкістю за рахунок високої активності та можливості створення високої локальної концентрації ферменту в чутливому шарі. Проте недоліком багатьох ферментних сенсорів є нестабільність і висока ціна ферментів. Клітинні, особливо мікробні, біосенсори мають ряд суттєвих переваг: доступність, низька ціна і простота отримання біоелементів, можливість використання довгих метаболічних шляхів, відсутність потреби у виділенні очищених ферментів і використанні екзогенних кофакторів, можливість конструювання на генетичному та біохімічному рівнях, широкий спектр у виборі трансдуктора, інтегральність клітинної відповіді (це важливо при тестуванні сумарної токсичної та мутагенної дії компонентів довкілля), можливість у деяких випадках зберігати життєздатність сенсорних клітин і навіть забезпечити їхнє розмноження, вища стабільність, ніж у ензимних елементів. Основними недоліками мікробних біосенсорів є повільність розвитку сигналу, з огляду на нижчу концентрацію залучених у клітинну відповідь ферментів, та низька селективність сенсорної відповіді, особливо у випадку мікробних -електродних сенсорів через широку субстратну специфічність процесів клітинного дихання. Нині завдяки прогресові генної інженерії та можливості забезпечення високого рівня внутрішньоклітинної експресії цільового аналітичного ферменту ці дві основні вади мікробних сенсорів можна подолати.[1]

Висока ефективність біологічних каталізаторів і специфічність їхньої дії дає змогу розглядати ферменти, як ідеальні реагенти аналітичної хімії. Нині створено штучні аналітичні системи різних конструкцій, що містять іммобілізовані ферменти й клітини і призначені для автоматичного детектування продуктів ензиматичних реакцій. Наприклад, використання іммобілізованої глюкозооксидази дає змогу визначати концентрацію глюкози за кількістю іонів водню, виділеного під час окиснення глюкози.

Залежно від концентрації аналізованих речовин вибирають той чи інший спосіб їх детекції. Так, кількісний вміст пероксиду водню ммоль/л, можна визначити одним із таких методів:

Полярографічний 0,1

Колориметричний 0,1·

Люмінесцентний 0,1·

Нині розробляються біодатчики нового покоління, принцип дії яких базується на афінних взаємодіях за типом фермент-інгібітор, антитіло-антиген, агоніст (антагоніст)- клітинний рецептор, а також на типи біодатчиків дають можливість створити сенсори, чутливі до газів, що має істотне значення для створення роботів, які реагують на зміни зовнішніх факторів.

Технологічні варіанти реакторів з іммобілізованими ферментами досить різноманітні - колони, трубки, порожнисті волокна тощо. З їхньою допомогою на практиці визначають концентрацію широкого спектра сполук - глюкози, амінокислот, сечовини, пеніциліну, АТФ, НАДН, ФМН, стероїдів, тригліцеридів, жовчних кислот багатьох інших (J.Aylott, R.Kopelman 2000). Так, американськими дослідниками сконструйовано мікродатчик на основі глюкозооксидази і рутенієвого барвника, іммобілізованих у поліакриламідній матриці з використанням субмікронних оптичних волокон. Мікробіосенсор може бути введений в клітину і навіть в її органели для вимірювання вмісту в них глюкози й кисню. Запропоновано датчики для проведення експрес-аналізу похідних діоксину (Nomura et al., 2000) а також оцінювання вмісту біогенних амінів (з допомогою моноамінооксидази) у харчових продуктах методом імунодетекції. Для визначення сечовини ферментним електродом потрібно лише 30 с.

Біосенсори використовують у медичній діагностиці (80% усіх відомих біоприладів, які поділяються на автоаналізатори для клінік і лабораторій, прилади для домашнього використання і системи для вимірювання показників у клінічних умовах). До домашніх приладів, які успішно використовуються у США, належать біосенсори для визначення глюкози із крапельки крові, сечовини і різних іонів у біорідинах.[2]

Використання біосенсорів у харчовій промисловості базується на двох варіантах: безпосереднє використання біосенсорів усередині біореакторів для аналізу глюкози під час ферментації і періодичний контроль концентрації глюкози. Для цього проби періодично відбирають із біореактора й аналізують.

У біотехнологічних виробництвах використовують біосенсори для аналізу глюкози, лактату, етанолу, гліцерину, фосфоліпідів, холестеролу та ін. Контроль і оптимізація біотехнологічних процесів, зокрема у харчовій промисловості, потребує швидкої та достовірної інформації про концентрацію субстратів і продуктів ферментної реакції. Найчастіше різні суміші компонентів, отримані у результаті ферментації, повинні аналізуватися одночасно, постійно і бажано в реальному часі. Для цього тривалий час використовували (на окремих підприємствах використовують і нині) методи газової та рідинної хроматографії, спектрометрії, мас- і ядерну спектроскопію, що вимагають дорогої апаратури, яку важко вводити у технологічний процес, і дають змогу контролювати лише кілька параметрів без будь-яких модифікацій. Використання біосенсорів значно спрощує такий аналіз.

Для екологічного моніторингу використовують мікробні амперметричні сенсори. При аналізі стічних вод визначають біохімічно окиснювані компоненти. Раніше для такого аналізу необхідно було не менше п'яти днів. Сенсори для експрес-визначення, розроблені на основі іммобілізованих клітин B.subtilis і Trichosporon cutaneum визначають такі показники за кілька хвилин.

При синтезі пептидів, стереоізомерів ацильованих амінокислот, лактамних антибіотиків, природних ізомерів амінокислот, органічних кислот використовують в основному ферментні біосенсори.



Висновок

Іммобілізація - поняття досить широке. Воно означає просте зв'язування ферментів з нерозчинними в воді носіями, а також будь-яке обмеження ступенів свободи ферментних молекул і їх фрагментів. Наприклад, лактазу іммобілізують на частках кремнезему, застосовують для конверсії лактози сироватки в глюкозу і галактозу.

В майбутньому будуть використовуватись іммобілізовані ферменти. Їх можна використовувати в наступних цілях:

а) холінестераза може застосовуватись для визначення пестицидів;

б) інші ферменти аналогічним способом можуть застосовуватися для визначення токсичних речовин, наприклад, гексокіназа дуже чутлива до малих концентрацій ліндану;

в)іммобілізована гепариназа може застосовуватись для запобігання тромбоутворень в апаратах штучного кровообігу;

г) іммобілізована білірубіноксидаза може бути застосована для видалення білірубіну із крові новонароджених, які страждають на гепатит;

д) іммобілізовані ферменти знайдуть подальше застосування в молочній промисловості. При виробництві сиру можуть використовуватись іммобілізовані білки, які згортують молоко - ренін, пепсин;

е) можливо, вдасться створити системи із декількох іммобілізованих ферментів. Наприклад якщо заключити в мікрокапсули три ферменти - уреазу, глутаматдегідрогеназу і глюкозодегідрогеназу, то їх можливо використати для видалення сечовини із крові хворих на ниркову недостатність;

є) різноманітні іммобілізовані ферменти з часом знайдуть застосування в датчиках для швидкого аналізу.[6]



Список використаної літератури

1. Г.В. Яворська, С.П. Гудзь, С.О. Гнатуш Промислова мікробіологія:навч. Посібник для студентів ВНЗ. Львів: МО і НУ ЛНУ ім. Ів. Франка, 2008.

2. Т.П. Пирог, О.А. Ігнатова, Загальна біотехнологія: підручник для студентів ВНЗ. Київ: МО і НУ НУ харчових технологій, 2009.

3. Мишустин Е.Н., Емцев В.Т. Микробиология. - М.: Агропромиздат, 1987. - 368 с.

4. Пирог Т.П. Загальна мікробіологія: Підручник-К.: НУХТ, 2004.- 471 с.

5. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. - М.: Элевар, 2000. - 512 с.

6. Splach.narod.ru

Размещено на Allbest.ru