Получение штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae c инактивированным геном NMA111

Размещено на http://www.allbest.ru/

Московская Гимназия на Юго-Западе №1543

Лаборатория Биологии Дрожжей, отдел Биоэнергетики НИИ ФХБ

им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова

Получение штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae c инактивированным геном NMA111

Касацкая Софья

Научный руководитель

к.б.н. Кнорре Дмитрий Алексеевич

Москва, 2008 г.

Список сокращений

1. HtrA - high temperature requirement endoprotease type A;

2. NMA111 - nuclear mediator of apoptosis;

3. FAA - fatty acyl-CoA-synthetases;

4. Fat1 - fatty acid transport protein;

5. ПЦР - полимеразная цепная реакция;

6. YSP2 - yeast suicide protein 2;

7. SDS - додецил сульфат натрия, sodium dodecil sulfate;

8. LR-полимераза - long read polymerase, смесь ферментов Pfu- и Taq- полимераз;

9. Taq-полимераза - термостабильная ДНК-полимераза из термофильной бактерии Thermus аquaticus;

10. ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота.

Введение

Апоптоз - процесс самоубийства клетки, служащий у многоклеточных организмов для поддержания постоянного числа клеток, замены старых клеток новыми и удаления зачаточных органов в эмбриогенезе. У одноклеточных организмов, в частности у дрожжей, так же был обнаружен процесс по ряду признаков напоминающий апоптоз многоклеточных. Апоптоз у дрожжей S. cerevisiae может быть вызван множеством способов: (1) избытком продуктов метаболизма самих дрожжей факторами, определяющими чрезмерную плотность клеток в колонии - уксусной кислотой, этиловым спиртом, (2) стрессорными условиями, приводящими к повреждению ядерной или митохондриальной ДНК, например, окислительным стрессом, (3) экспрессией апопточеских белков многоклеточных эивотных, (4) некоторыми фармакологическими соединениями. В геноме дрожжей есть гены, гомологичные апоптотическим генам многоклеточных животных. Среди них большой интерес для исследователей представляет метакаспаза - гомолог сериновых протеаз человека (каспаз). Другой важный фермент Nma111p - сериновая эндопротеаза - гомолог человеческой Omi протеазы, играющей важную роль в каспазонезависимой клеточной гибели, остается мало изучена. В настоящее время опубликована всего одна работа, свидетельствуещая об участие этого фермента в апоптозе дрожжей, вызванным окислительным стрессом. Мы решили проверить это наблюдение, а также подтвердить участие этой протеазы в апоптозе дрожжей вызванной различными индукторами. Для этого первоочередной задачей было получение штамма с инактивированным геном NMA111 и изогенного ему контрольного штамма. В дальнейшем предполагалось исследование характера генетического взаимодействия генов NMA111 и других генов участников программы самоубийства дрожжей.

Апоптоз - разновидность программируемой клеточной смерти, процесса, необходимого для нормального существования организма. Программируемая клеточная смерть вместе с процессом деления клеток, служит для поддержания постоянного числа клеток в многоклеточных организмах, к примеру, у нематоды Caenorhabditis elegans тело всегда состоит из 945 клеток, и это осуществляется за счет того, что при развитии из 1076 клеток определенные клетки подвергаются апоптозу (по обзору: Агол, 1996).

Гибель клеток может происходить не только посредством апоптоза. Разделяют программируемую клеточную смерть, и некроз. Программируемая клеточная смерть - это активация генетической программы гибели клетки, которая может быть вызвана определенными индукторами. Некроз - это, как правило, гибель клеток от внешнего повреждения, механического, химического или рентгеновского излучения. Программируемая клеточная смерть включает в себя апоптоз и аутофагию. При некрозе содержимое погибшей клетки попадает в межклеточное пространство, вызывая зачастую воспалительный процесс, тогда как при апоптозе и аутофагии этого не происходит. Аутофагия является основным способом элиминации отдельных органоидов клетки, не затрагивая всю клетку. Для процесса аутофагии в клетке характерны такие структурные черты, как образование специальных аутофагических вакуолей, которые последовательно разрушают структуры клетки. В отличие от аутофагии, при апоптозе даже в сильно компактизованнных мертвых клетках органеллы остаются неповрежденными, а клеточные мембраны хорошо сохраняются (Bursch, 2004).

Программируемая клеточная смерть играет важную роль в эмбриогенезе при возникновении и исчезновении зародышевых органов, является ключевым процессом при возникновении иммунной реакции, когда зараженная клетка подвергается апоптозу после сигнала от другой клетки. Апоптоз может быть вызван внутриклеточными измениями, такими, как повреждение ДНК, и внешними факторами - изменениями в условиях среды, наличием определенных сигнальных веществ от других клеток (Raff, 1998).

Апоптоз служит защитным механизмом для уничтожения зараженных или раковых клеток в многоклеточном организме. Слишком слабый или чересчур интенсивный апоптоз может повлечь за собой множество патологий у многоклеточных животных, например, у человека, в том числе заразные болезни, нейродегенеративные процессы и рак. Так, в болезни Паркинсона нейроны могут подвергаться апоптозу в результате накопления мутантного белка. Другим примером нейродегенеративного процесса служит болезнь Хантингтона. При ней нейроны так же подвергаются апоптозу из-за токсичного действия мутантного белка, накапливающегося в ядре клетки. Этот белок - хантингтин имеет в своей последовательности полиглутаминовый фрагмент (25Q в нормальной форме), который удлиняется в мутантном варианте белка (103Q), что приводит к его агрегации в клетке (цит. по Sokolov et al, 2006).

Наравне с многоклеточными организмами, было открыто явление апоптоза у одноклеточных организмов, у которых дефектная клетка может подвергаться апоптозу ради выживания колонии в целом. Объектом нашего исследования были гаплоидные штаммы пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Данный вид одноклеточных аскомицетных грибов широко используется не только в хлебопекарной промышленности, но и в генетических исследованиях. Вначале было показано, что в некоторых случаях гибель дрожжей сопровождается проявлением ряда признаков, характерных для апоптоза многоклечточных животных, затем в геноме был найден ген - аналог каспаз у животных - ген метакаспазы (YCA1 - yeast caspase) (Гордеева и др., 2004).

Процесс активации программы апоптоза клетки многоклеточного организма обычно включает в себя: активацию каскада MAP-киназы, накопление активных форм кислорода, выход из митохондрий цитохрома С, активацию каспаз (цит. по лит.обзору Severin&Hyman, 2002).

Большая часть стереотипных структурных изменений апоптотических клеток вызываются деятельностью каспаз - ферментов-протеаз. Каспазы - это протеазы, содержащие в активном центре аминокислоту цистеин и расщепляющие белки-субстраты по аспарагиновой кислоте. Как правило, они активируются последовательно, то есть одна каспаза активирует другую, отщепляя от нее обширный неактивный участок. Однако существуют формы апоптоза без участия каспаз, поэтому мы можем называть процесс, происходящий в дрожжах, апоптозом, несмотря на то, что в клетках дрожжей нет настоящих каспаз, как и в клетках бактерий, растений (Delhalle et al., 2003). В клетках дрожжей при апоптозе фрагментируются митохондрии, распадаясь из нитевидных на маленькие шаровидные. В лаборатории, где проводилась наша работа, был открыт белок Ysp2p - yeast suicide proteine 2. Это митохондриальный белок, участвующий в апоптотическом каскаде, вызванном амиодароном или уксусной кислотой. Делеция по гену YSP2 повышает устойчивость клеток к апоптозу данного типа, но не препятствует накоплению активных форм кислорода в клетке. При воздействии амиодарона митохондрии в клетках мутантного штамма не фрагментировались, как в контрольных клетках (Sokolov et al., 2006)

У человека имеется протеаза Omi (HtrA2) - митохондриальная сериновая протеаза, участвующая в процессе программируемой клеточной смерти. Она гомологична бактериальной эндопротеазе HtrA, обеспечивающей ответ бактериальной клетки на высокотемпературный шок. В нормальной клетке человека Omi протеаза находится в межмембранном пространстве митохондрий, однако при классическом апоптозе переходит в цитоплазму, где связывается с белками-ингибиторами апоптоза, инактивируя их. При каспазонезависимой гибели клеток человека Omi остается в митохондриях и участвует в процессе апоптоза, проявляя протеазную активность (Маянский и др., 2004). В клетках дрожжей S. cerevisiae была обнаружена ядерная протеаза Nma111p (nuclear mediator of apoptosis, белок с молекулярным весом 111 кДальтон). Nma111p так же принадлежит к семейству сериновых протеаз HtrA, общей структурной чертой которых является наличие активного участка, содержащего серин, и как минимум одного PDZ-домена - домена связывания и распознавания белков. Nma111p - единственный дрожжевой белок - гомолог HtrA (Fahrenkrog et al., 2004).

Nma111p может взаимодействовать с белками FAA1p и FAA4p. FAA1p - белок из семейства ACSL - acyl-CoA-synthetases - ферментов - синтетаз, осуществляющих регуляцию жирового обмена. FAA1p образует с белком Fat1p активный комплекс, а с NMA111 p - неактивный комплекс, таким образом, Nma111p ингибирует импорт жирных кислот в клетку. За счет этого взаимодействия Nma111p в разных концентрациях может регулировать метаболизм жирных кислот и их производных в клетке, при делеции этого гена в клетке дрожжей накапливаются триглицериды и жирные кислоты, (Tong et al., 2006).

По ранее опубликованным данным, для протеазы Nma111p характерна проапоптозная активность за счет противодействия Bir1p - ингибитору апоптоза у дрожжей. При нокаутировании гена nma111 в штамме BY4741 ?nma111 наблюдается повышенная по сравнению с контрольным штаммом дикого типа W303 устойчивость к воздействию высокой температуры (также один из возможных индукторов апоптоза у дрожжей), а так же увеличение уровня выживания при апоптозе, индуцированном перекисью водорода. Гиперэкспрессия NMA111 вела к уменьшению выживаемости при апоптозе, индуцированном перекисью водорода (Fahrenkrog et al., 2004).

Однако, в более поздней работе описано, что в мутантных клетках YB332 ?nma111 после 3-часового воздействия перекисью водорода (3 mM) наблюдалось повышенное содержание активных форм кислорода и увеличение фрагментации ДНК в сравнении с контрольным штаммом, то есть, штамм YB332 ?nma111 более подвержен апоптозу, вызванному H2O2 (Tong et al., 2006). Данное противоречие можно объяснить различным генетическим фоном штаммов дрожжей, на которых изучалось воздействие окислительного стресса. Это означает, что в этих штаммах (BY4741 ?nma111 и YB332 ?nma111), помимо специально вызванной мутации по гену NMA111, есть различные другие мутации, например, нарушен синтез некоторых аминокислот, и общий набор работающих белков, которые могут влиять на результат, различен.

Поэтому прежде всего мы планировали получить в ходе работы штамм дрожжей с инактивированным геном NMA111 на основе штамма без значительных делеций в генотипе и использовать в качестве контрольного штамма изогенный. После этого мы планировали изучить устойчивость полученных штаммов к окислительному стрессу, вызванному перекисью водорода или уксусной кислотой, а также изучить устойчивость этого штамма к другим индукторам апоптоза.

Материалы и методы

Среды для культивации дрожжей

Дрожжи выращивали на стандартной богатой среде YPD:

бактериально-дрожжевой экстракт (1%), бакто-пептон (2%), D-глюкоза (2%). Для того, чтобы избежать карамелизации глюкозы, ее растворяли и автоклавировали отдельно от других компонентов среды. Для приготовления твердых сред добавляли 2% бактериального агара.

Клетки W303 Дnma111 после трансформации высевались на YPD-среду с добавлением антибиотика G418 (генетицин) до конечной концентрации 200 мкг/мл.

Выделение суммарной ДНК из дрожжей

Для проведения полимеразной цепной реакции мы выделили ДНК из клеток дрожжей по следующей схеме:

К клеткам, собранным с твердой среды стерильной петлей и промытым в бидистилированной воде с помощью центрифугирования от остатков среды, добавляли 200 мкл дистиллированной воды

Добавляли 200 мкл зимолиазы для разрушения клеточной стенки дрожжей

Добавляли 2 мкл меркаптоэтанола

Инкубировали клетки при 37 °С 40 минут, периодически встряхивая пробирку

Добавляли 50 мкл 10%-ого раствора SDS для расщепления жиров в компонентах клеток

Инкубировали 30 минут при 65°С, периодически встряхивая пробирку

Добавляли 300 мкл 9М ацетата аммония для связывания и осаждения ДНК

Охлаждали 5 минут на -20°С, затем 30 минут при температуре +4°С.

Центрифугировали 10 минут на скорости 14000 оборотов, отделяли супернатант (650 мкл)

К супернатанту добавляли 455 мкл изопропанола для осаждения ДНК, осаждали 4 минуты при температуре -20°С

Центрифугировали 10 минут на скорости 14500 оборотов.

Отбирали супернатант, осадок дважды промывали 0.5 мл 70%-ого раствора этанола, центрифугируя по 5 минут на 14500 оборотов.

Высушивали осадок ДНК до полного испарения спирта.

Растворяли ДНК в 50 мкл дистиллированной воды mQ с добавлением РНКазы, вортексировали.

Выделенную ДНК хранили при температуре -20°С.

Генотипы использованных штаммов:

Таблица 1. Генотипы использованных штаммов.

№	Название	Генотип	Источник
1	W303	MATa; leu2-3,112; trp1-1; can1-100; ura3-1; ade2-1; his3-11,15	Severin, Hyman, 2002
2	W303 G418	MATa; leu2-3,112; trp1-1; can1-100; ura3-1; ade2-1; his3-11,15; G418	Euroscarf
3	BY4741 ?nma111	Mat a; hisД1; leu2Д0; met15Д0; ura3Д0; NMA111::G418	Euroscarf
4	W303::G418 25Q	MATa; leu2-3,112; trp1-1; can1-100; ura3-1; ade2-1; his3-11,15; G418; p7719/Nhel (His 3)	Sokolov et al., 2006
5	W303::G418 103Q	MATa; leu2-3,112; trp1-1; can1-100; ura3-1; ade2-1; his3-11,15; G418; p7720/Nhel (His3)	Sokolov et al., 2006
6	W303 ?ysp2	MATa; leu2-3,112; trp1-1; can1-100; ura3-1; ade2-1; his3-11,15; ysp2::KanMX4	From Cunningham laboratory
7	W303 ?nma111	MATa; leu2-3,112; trp1-1; can1-100; ura3-1; ade2-1; his3-11,15; NMA111::G418	Получен в данной работе
8	W303 ?nma111 25Q	MATa; leu2-3,112; trp1-1; can1-100; ura3-1; ade2-1; his3-11,15; G418; p7719/Nhel (His 3); NMA111::G418	Получен в данной работе
9	W303 ?nma111 103Q	MATa; leu2-3,112; trp1-1; can1-100; ura3-1; ade2-1; his3-11,15; G418; p7720/Nhel (His3); NMA111::G418	Получен в данной работе
10	W303 ?nma111 ?ysp2	MATa; leu2-3,112; trp1-1; can1-100; ura3-1; ade2-1; his3-11,15; ysp2::KanMX4; NMA111::G418	Получен в данной работе

Полимеразная цепная реакция

Для получения участка ДНК, содержащего маркёрный ген KanMX4 с фланками гена NMA111, мы проводили полимеразную цепную реакцию с выделенной полной ДНК штамма BY4741 Дnma111 (Euroscarf), содержащей на месте гена NMA111 маркёрный ген KanMX4, и праймерами, составленными к гену NMA111 с отступом в 300 пар нуклеотидов.

Полимеразная цепная реакция представляет собой процесс синтеза участков ДНК in vitro на матричной одноцепочечной молекуле. Он включает в себя этапы:

I. Первичной денатурации двуцепочечной ДНК - 2 минуты при температуре 94°С

II. 27 циклов:

a. Денатурация - 30 секунд при температуре 94°С;

b. Отжиг праймеров - присоединение к матрице олигонуклеотидов, комплементарных концам участка цепи ДНК, с которых будет начинаться синтез этого участка - 30 секунд при температуре 57°С;

c. Элонгация - синтез комплементарной матричной цепи ДНК с праймеров - 2 минуты 30 секунд при температуре 72°С.

III. Завершающий этап элонгации - 5 минут при темперауре 72°С и переход в режим хранения при температуре +10°С.

Мы использовали LR-(long read)-полимеразу для получения гена KanMX4 с фланками гена NMA111, поскольку эта смесь ферментов отличается повышенной точностью при матричном синтезе при меньшей скорости работы. При проведении полимеразной цепной реакции для проверки прохождения трансформации на выделенной из штаммов-трансформантов ДНК мы использовали Taq-полимеразу. Taq-полимераза обладает большей скоростью работы, причем скорость зависит от температуры работы - стандартная температура 72°С, для большей точности используют температуру 55-60°С.

Состав ПЦР-реакции на 100 мкл:

Для LR-полимеразы:

· LR-полимераза (1 мкл)

· LR-буфер для полимеразы (10x, 10 мкл)

· Нуклеотиды (2,5 мМоль, 2 мкл)

· Матричная ДНК (1 мкл)

· Праймеры (10x, 10 мкл )

· Вода (76 мкл)

Для Taq-полимеразы:

· Taq-полимераза (1 мкл)

· Буфер для полимеразы (10 мкл)

· MgCl2 (10 мкл)

· Праймеры (10 мкл)

· Нуклеотиды (2,5 мкл)

· Матричная ДНК (2,5 мкл)

· Вода (64 мкл)

Мы составили праймеры к NMA111:

Прямой праймер:5'-GAACCTAGAGTCACGATTGA-3'

Обратный праймер:5'-ATTGCCACGCAAACCAAATC-3'

Мы также проводили полимеразную цепную реакцию для проверки прохождения трансформации с заменой NMA111 на KanMX4. Для этого мы составили обратный праймер к гену NMA111, взятый с отступом от предыдущего в 100 пар нуклеотидов, и взяли готовый прямой праймер к кассете KanMX4 1361:

Прямой праймер:5'- CTCGACATCATCTGCCCAGA -3'

Обратный праймер:5'- AGGCTGGTCCCATAGATCAT-3'

Рис.1 Электрофорез ПЦР-продукта, полученного после ПЦР-реакции с ДНК, которую мы выделили из штамма BY4741 Дnma111. 1 - маркёрная дорожка с участками ДНК известной длины, 2 и 3 - две пробы с ПЦР-продуктом.

Аналитический электрофорез ДНК в агарозном геле.

Метод электрофореза заключается в разделении участков ДНК в геле.

Под воздействием электрического поля отрицательно заряженные молекулы ДНК движутся от - к +, причем чем короче молекула, тем быстрее она движется через гель.

Фрагменты ДНК, полученные в результате ПЦР, и геномную ДНК разделяли в горизонтальных гелях, содержащих 1% агарозы, в присутствии бромистого этидия (концентрация 1мкг/мл).

Разделение вели в пластинах длиной 15 см в течение 3-4 часов при напряженности поля 5 В/см. Агарозный гель готовили на 60 мл 1%-ого трисацетатного буфера (концентрация 0,04 М Tris-Cl, 1мМ ЭДТА, 0,14% по объему уксусной кислоты (pH 8).

Перед нанесением на гель к раствору ДНК добавляли буфер, содержащий сахарозу (8-10%).

ДНК в геле выявляли по люминесценции в проходящем ультрафиолетовом свете (длина волны 240-360 нм).

Трансформация дрожжей

Для получения штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae W303 Дnma111, с заменой гена NMA111 на кассету KanMX4, мы проводили трансформацию дрожжей W303 с ПЦР-продуктом, содержащим KanMX4 с фланками NMA111. Дрожжи штамма W303 промывали в 200 мкл раствора, содержащего 0,1 М литий-ацетата, 1 mМ ЭДТА, 10 mМ Tris-HCl (pH=8).

К осадку добавляли 100 мкл вышеописанного раствора, 10 мкл ДНК спермы лосося для связывания потенциальных неспецифических мишеней, 10 мкл ДНК для трансформации, 240 мкл ПЭГ-4000 (раствор 50%) - до концентрации 30% в общем объеме 360 мкл. Затем дрожжи инкубировали 30 минут при температуре 30°С, подвергали тепловому шоку на 15-20 минут при температуре 42°С, добавляли 1,2 мл жидкой среды YPD и инкубировали дрожжи 3-4 часа, после чего высаживали на селективную среду, содержащую антибиотик генетицин.

Результаты

Для того, чтобы получить штамм W303 Дnma111, мы выделили ДНК из штамма BY4741 Дnma111, провели полимеразную цепную реакцию с выделенной ДНК и праймерами, составленными к гену NMA111 с отступами по 300 пар нуклеотидов.

С полученным фрагментом, содержащим ген KanMX4, мы провели трансформацию на штамме W303. В результате трансформации мы получили штамм W303 Дnma111.

апоптоз клетка генотип дрожжи

Рис. 2 Схема первой части эксперимента - получения штамма W303 ?nma111.

Поскольку инактивация гена, кодирующего белок, ответственный за программируемую клеточную смерть, не должна сильно влиять на нормальный метаболизм клеток, мы измерили скорость роста клеток мутантных штаммов W303 ?nma111 по сравнению со штаммом дикого типа (W303) и штаммом дикого типа, имеющим устойчивость к генетицину (W303 KanMX4), так же, как и мутантный штамм. Для этого мы измерили оптическую плотность клеток данных штаммов в жидкой среде YPD при помощи спектрофотометра через определные промежутки времени. Оптическая плотность - показатель того, какая часть света, пропущенного через кювету с суспензией клеток, проходит через нее, а сколько поглощается и рассеивается. Чем больше клеток в суспензии, тем она менее прозрачна и больше света рассеивает. Поэтому, измеряя через одинаковые промежутки времени оптическую плотность суспензии из клеток, инкубируемых в жидкой среде, можно установить, насколько больше стало клеток. В результате измерений не было выявлено достоверного отличия в скорости роста клеток разных штаммов.

Затем, используя штаммы W303 25Q, W303 103Q, W303 ДYSP2, мы провели параллельную трансформацию с ПЦР-продуктом - участком ДНК с заменой NMA111 на KanMX4, получив штамм двойного мутанта W303 ?nma111 ?ysp2 с двумя инактивированными генами и два штамма с инактивированным геном nma111, синтезирующие нормальную и мутантную формы белка хантингтина. На таких штаммах можно будет изучить участие сериновой протеазы Nma111p в апоптозе, вызванном накоплением мутантной формы хантингтина в клетке.

Рис.3 Схема проведения параллельной трансформации с тремя штаммами дрожжей для получения штаммов W303 ?nma111 25Q, W303 ?nma111 103Q и W303 ?nma111 ?ysp2.

Мы также проверили, успешно ли прошла трансформация: встроился ли ген KanMX4 на место гена NMA111 в четырёх полученных штаммах. Для этого мы провели ПЦР с ДНК, выделенной из каждого из полученных штаммов, и праймерами, один из которых составлен к участку маркёрного гена KanMX4, а второй - к фланку гена NMA111. Если трансформация прошла успешно, в ПЦР-реакции мы получили бы участок ДНК, содержащий часть маркёрного гена и часть фланка гена NMA111, длиной около 630 пар нуклеотидов.



Рис.4 Схема полимеразной цепной реакции для проверки трансформации. Масштаб не соблюден.

Полученный ПЦР-продукт мы анализировали при помощи электрофореза в агарозном геле.

Рис.5 Электрофореграмма с ПЦР-продуктами разных штаммов. 0 - дорожка с ДНК, содержащей участки известной длины, 1 - ПЦР-продукт пробы с ДНК штамма W303 ?nma111 25Q, 2 - ПЦР-продукт контрольного штамма W303 ?nma111, 3 - ПЦР-продукт штамма W303 ?nma111 103Q, 4 - ПЦР-продукт штамма W303 ?nma111 ?ysp2.

На рисунке 5 видно, что продукты полимеразной цепной реакции, проведенной для проверки прохождения трансформации, находятся у всех полученных штаммов в диапазоне от 550 до 750 пар нуклеотидов. Это доказывает, что в полученных штаммах ген NMA111 заменен на маркерный ген KanMX4.

В перспективе развития и продолжения данной работы на полученных нами штаммах можно изучить влияние инактивации гена nma111 на подверженность клеток апоптозу, вызванному разными индукторами: уксусной кислотой, амиодароном, сильно кислотной средой (pH=3), половым феромоном, этиловым спиртом. Используя полученные штаммы W303 ?nma111 25Q и W303 ?nma111 103Q, можно изучить влияние активности протеазы Nma111p на программируемую клеточную смерть, вызываемую накоплением мутантной формы хантингтина в клетке. На полученном штамме W303 ?nma111 ?ysp2 можно изучить, участвуют ли белки Nma111p и Ysp2p в одном апоптотическом каскаде реакций.

Выводы

I. Освоены следующие методы:

1. полимеразной цепной реакции с LR-полимеразой и Taq-полимеразой;

2. метод электрофореза в агарозном геле;

3. методика трансформации дрожжей.

II. Получен штамм W303 ?nma111, штаммы, синтезирующие полиглутаминовые последовательности W303 ?nma111 25Q и W303 ?nma111 103Q, и штамм двойного мутанта, W303 ?nma111 ?ysp2.

III. В отличие от исходного штамма BY4741 ?nma111, скорость роста полученного нами штамма W303 ?nma111 не отличается от скорости роста клеток дикого типа W303.

Благодарности

Я выражаю благодарность моему научному руководителю Д.А. Кнорре, Н. Бочаровой и другим сотрудникам лаборатории за помощь в освоении методов, и С.М. Глаголеву за организацию практикума.

Список литературы

1. В.И. Агол, Генетически запрограммированная смерть клетки, Соросовский образовательный журнал, №6, 1996.

2. Martin Raff, Cell suicide for beginners, Nature, vol. 396, 12.11.1998.

3. S. Sokolov, A. Pozniakovsky, N. Bocharova, D. Knorre, F. Severin, Expression of an expanded polyglutamine domain in yeast causes death with apoptotic markers, Biochimica and Biophysica Acta, 1757, 660-666, 2006.

4. Гордеева А.В., Лабас Ю.А., Звягильская Р.А., Апоптоз одноклеточных организмов: механизмы и эволюция. Биохимия, 69(10):1301-1313; 2004.

5. Wilfried Bursch, Multiple cell death programs: Charon's lifts to Hades, FEMS yeast research 5, 101-110, 2004.

6. Ф.Ф. Северин, A.A. Hyman, Pheromone induces Programmed Cell Death in Saccharomyces cerevisiae, Current Biology, Vol.12, №7, 233-235, 2002.

7. Sylvie Delhalle, Annelyse Duvoix, Michael Schnekenburger, Franck Morceau, Mario Dicato and Marc Diederich, An introduction to the molecular mechanisms of apoptosis, Annals of the New York Academy of Sciences, 1010: 1-8, 2003.

8. S. Sokolov, D. Knorre, E. Smirnova, O. Markova, A. Pozniakovsky, V.Skulachev, F. Severin, Ysp2 mediates death of yeast induced by amiodarone or intracellular acidification, Biochimica and Biophysica Acta, 1757, 1366-1370, 2006.

9. Н.А. Маянский, Э. Блинк, Д. Роос, Т. Кайперс, Роль OMI/HTRA2 в каспазонезависимой клеточной гибели нейтрофилов человека, Цитокины и воспаление, Т. 3, № 2. С. 47-51, 2004.

10. Birthe Fahrenkrog, Ursula Sauder and Ueli Aebi, The S. cerevisiae HtrA-like protein Nma111p is a nuclear serine protease that mediates yeast apoptosis, Journal of Cell Science, 117, 115-126, 2003.

11. Fumin Tong, Paul N. Black, Lori Bivins, Steven Quackenbush, Vlasta Ctrnacta, Concetta C. DiRusso, Direct interaction of Saccharomyces cerevisiae Faa1p with the Omi/HtrA protease orthologue Ynm3p alterslipid homeostasis, Mol Gen Genomics 275: 330-343, 2006.

Использованные интернет-ресурсы:

1. www.yeastgenome.org

2. www.molbiol.ru

Размещено на Allbest.ru