Молекулярно-генетическая характеристика рекомбинантных форм вируса иммунодефицита человека 1 типа, выявленных на территории Республики Беларусь

Происхождение варианта ВИЧ-1 AFSU

Вариант AFSUпредставляет одну из самых больших групп ВИЧ, идентифицированных в глобальной пандемии, что привело к одной из самых быстро растущих эпидемий ВИЧ-1 в мире. Происхождение этого варианта до сих пор вызывало вопросы из-за противоречивых предложенныхгипотез. В 2007 г. М. Томсон с соавторами филогенетически выявили сиквенсы из Демократической Республики Конго (ДРК), которые формировали кластер вместе с образцами ВИЧ-1 из Санкт-Петербурга, Россия, полученными в 1992-1994 гг. от пациентов, заразившихся ВИЧ-1 гетеросексуальным путем. Образцы из ДРК находились в основании кластера, что свидетельствовало об их анцестральности по отношению к AFSU[151].

Годом позже, в 2008-м, Ч. Рива с соавторами выдвинул гипотезу о том, что AFSUпроизошел из Гвинеи. Они выявили ВИЧ-1 А1 (под именем 60 000), который был генетически очень близок кAFSU. Вирус был найден у пациента из г. Конакри, столицы Республики Гвинея, который иммигрировал в Италию. Данный изолят также находился в основании кластера, сформированного вариантами AFSU[162].

В 2015 г. Франциско Диез-Ферте с соавторами[163] повторили исследования о происхождении AFSU с использованием байесовских филодинамических подходов, основанных на теории коалесценции, и вывели наиболее вероятную эволюционную гипотезу о происхождении AIDU. Согласно их исследованиям, AFSUимеет достоверное происхождение из Демократической Республики Конго, постериорная достоверность байесовской статистки составила 0,84 по анализу фрагмента C2-V2-V3. Гипотеза, предложенная Ч. Ривой в 2008 г., не нашла подтверждения. Так, постериорная достоверность кластера с изолятом 60 000 из Республики Гвинея составила всего 0,0003.

Филогеографический анализ фрагмента p24gag выявил, что AFSU-вариант появился в Одессе приблизительно в 1984 г. (1982-1987гг.), то есть приблизительно за 10 лет до начала распространения среди инъекционных наркоманов. Изначально распространение вируса происходило преимущественно половым путем, о чем свидетельствуют образцы, расположенные у основания кластера и принадлежащие пациентам, которые были инфицированы гетеросексуально не позже 1993 г. Анализ фрагмента C2-V2-V3 гена env также указал на появление AFSUв г. Одессе в 1984 г. Комбинированные результаты обоих анализов указывают интервал для tMRCA (время наиболее близкого общего предка) AFSU- 1982-1987 гг.

Таким образом, вариант AFSUпоявился в украинском городе Одессе приблизительно в 1984 г., за 10 лет до начала эпидемии на территории стран бывшего СССР.

1.10 Эпидемия ВИЧ-1 на территории Беларуси

Первый случай ВИЧ-инфекции на территории Беларусибыл выявлен в РНПЦ эпидемиологии и микробиологии в 1986 г. у студента из Бурунди. В 1990 г. был зарегистрирован первый случай СПИДа в стране у женщины - жительницы Беларуси [164]. С 1986 по 1996 гг. количество случаев ВИЧ/СПИД, выявляемых ежегодно в Беларуси, варьировало от 12 до 14, и на 1 января 1996 г. было официально зарегистрировано 113 случаев ВИЧ-инфекции. 66% всех случаев ассоциировано с половым путем передачи вируса.Молекулярно-эпидемиологические исследования показали доминирование генетически гетерогенного ВИЧ-1, главным образом, субтипа С [140]. Летом 1996 г. в г. Светлогорске Гомельской области был зафиксирован резкий рост случаев выявления ВИЧ-инфекции у лиц, являвшихся потребителями инъекционных наркотиков. Так, в июле 1996-го было зафиксировано 60 случаев ВИЧ-инфекции, а на 1 ноября 1997 г. общее число случаев ВИЧ-инфекции составило уже 1728, 85% из которых выявлено у ПИН. В отличие от Украины и России, где эпидемия ВИЧ-1 поразила различные географические регионы, в Беларуси эпидемия была ограничена в основном г. Светлогорском, на долю которого приходилось более 70%всех случаев ВИЧ-инфекции среди ПИН. В Светлогорске с населением в 72 000 человек ВИЧ-1 был диагностирован у более чем 1200 из 14 000 инъекционных наркоманов, из которых 88% являлись лицами в возрасте 18-29 лет. Молекулярные исследования показали, что вспышка была вызвана ВИЧ-1 субтипа А1, который генетически идентичен вирусам у ПИН в Южной Украине и Центральной и Южной России [140].

По состоянию на 1 декабря 2015г. в Республике Беларусь зарегистрировано 19 605 случаев ВИЧ-инфекции, количество людей, живущих с ВИЧ-1 - 15 069, показатель распространенности составил 158,9 на 100 тысяч населения[165].

За период 1996-2008 гг. на территории Беларуси по-прежнему доминирующим оставался ВИЧ-1 субтипа А1, вариант AFSU, на долю которого приходилось около 95% от всех случаев ВИЧ-инфекции. В четырех случаяхбыло выявлено инфицирование ВИЧ-1 субтипом В. Данные изоляты при филогенетическом анализе не были близкими между собой и, вероятно, явились результатом четырех эпидемиологически независимыхзаносов[166]. Помимо субтипов А1 и B, выявлены варианты ВИЧ-1 субтипов С, G, CRF02_AG, CRF03_AB, CRF06_cpx, а также уникальная рекомбинантная форма ВИЧ-1 AFSU/BFSU.

Филогенетическая систематика

Филогенетическая систематика, или филогенетика - наука, изучающая эволюционные отношения между разными видами на Земле. Эволюционный процесс можно рассматривать как процесс ветвления, и результаты обычно представлены в форме бифуркационного филогенетического дерева (phylogenetic tree), на котором ветви от двух любых таксонов соединены в одном узле. Порядок узлов и ветвление дерева составляют топологию филогенетического дерева, длины ветвей дерева соответствуют генетическому расстоянию между таксонами. Высокая скорость эволюционной изменчивости ВИЧделает его идеальной моделью для изучения эволюционного процесса и позволяет проследить эволюцию в режиме «реального времени» [167].

Эволюционный процесс включает в себя изменения генома в виде инсерций, делеций, замен нуклеотидов и рекомбинационные события. Эволюционные отношения изучаются методом попарного сравнения, поэтому первым и важным этапом филогенетического анализа является создание алаймента сиквенсов (sequence alignment) нуклеотидов или аминокислот. Далее выводы о филогенетических отношениях будут зависеть от выбранной модели нуклеотидных замен (substitution model) для данного алаймента, модели реконструкции дерева и, в конечном счете, от оценки статистической достоверности отношений на филогенетическом дереве.

Модели нуклеотидных замен

Два сиквенса (таксона), у которых один общий предок (узел), могут развиваться независимо друг от друга. Наиболее простой подход к измерению дивергенции между сиквенсами - расчет числа различий в сайте, обозначаемых генетической дистанцией, или p-дистанцией (p-distance). К сожалению, когда дивергенция очень высокая, p-дистанция не точно оценивает количество замен, произошедших на самом деле. Например, параллельная замена, при которой оба связанных таксона приобрели одну и ту же замену в одном и том же сайте, таким образом скрывая эволюционное событие, на самом деле произошедшее. Подобным образом влияют на недостоверный расчетp-дистанции и обратные мутации, например, А > С >А, в случае которых замена, на самом деле произошедшая, не учитывается. И, наконец, в сайте может произойти несколько замен: A > G > T, но только одна замена, A > T, будет учитываться. С целью более точного вычисления эволюционных изменений было предложено несколько моделей нуклеотидных замен. Все эти модели относятся к классу цепей Маркова с дискретным и непрерывным временем, в которых используется матрица интенсивностей Q для указания относительной скорости замены каждого нуклеотида на протяжении всей длинысиквенса.

Более того, все модели принимают во внимание следующие положения:

1. скорость замены основания i на основание j не зависит от основания, которое находилось в данном сайте до i;

2. скорость замен неизменна во времени;

3. относительная скорость изменений нуклеотидов A,G,T,C - одинаковая.

Наиболее простая модель нуклеотидных замен - модельJC69(Jukes and Cantor, 1969), которая предполагает, что все нуклеотиды имеют одинаковую частоту появления (25% каждый): рA= рG= рT= рC= ј, где р - частота появления каждого нуклеотида, и каждый нуклеотид имеет равную вероятность быть замененным любым другим (рисунок 1.8)[168].

В модели JC69 частота замены всех нуклеотидов равна 1:a=b=c=d=e=
= f=1. Q-матрица данной модели имеет вид, показанный на рисунке 1.9.

Эта модель быстро стала усложняться, так какначало увеличиваться количество расчетных параметров в Q-матрице. Появились другие модели замен, такие как K80 (Kimura 2-parameter, Kimura, 1980), F81 (Felsenstein, 1981), HKY85 (Hasegawa, Kishino and Yano, 1985), T92 (Tamura 1992), T93 (Tamura and Nei, 1993) и GTR: Generalised time-reversible (Tavarй, 1986)[169-172].



GTR-модель является наиболее сложной моделью нуклеотидных замен и включает 8 свободных расчетных параметров [173, 174]. В этой модели каждый нуклеотид имеет свою собственную частоту замен: рA + рG + рT + рC = 1 и различную скорость замены основания i на основание j: a+b+c+d+e+f=1(рисунок 1.10).

Промежуточные модели, такие как HKY85, рассчитывают индивидуальную частоту появления каждого нуклеотида и различные скорости замены нуклеотидов для транзиций (А > G, C > T) и трансверсий (А > С, G > T). Предположение, что частота нуклеотидных замен одинакова на протяжении всего сиквенса и в каждом сайте с равной вероятностью может произойти мутация, с биологической точки зрения часто не верно. Например, хорошо известно, что третья позиция в кодоне, кодирующем аминокислоту, изменяется чаще, чем первая и вторая позиции кодона. Чтобы учесть этот факт, обычно используется модель нуклеотидных замен, позволяющая рассчитать гетерогенность между сайтами и предполагать, что некоторые сайты являются инвариантными. Было обнаружено, что расчет гетерогенности сайтов хорошо описывается гамма-распределением (G), при котором каждый сайт имеет свою степень изменения нуклеотидов.

Модели реконструкции филогенетических деревьев

Следующим шагом определения филогенетических отношений является выбор соответствующей модели реконструкции филогенетического дерева. Наиболее ранние и простые модели - дистанционные, в основном модель «минимальной эволюции» (minimum evolution, ME) и кластерный анализ. Обе модели реконструируют дерево, используя матрицу попарных генетических дистанций. Методы кластеризации, как, например, UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean), предполагают постоянную скорость эволюции во времени и реконструируют деревья, поэтапно группируя сиквенсы с наименьшей дистанцией между ними. Сиквенсы кластрируются, основываясь на усреднении расстояний, то есть глубина дивергенции - это дистанция между сиквенсами А и В, деленная на 2. Методы, рассчитывающие минимальную эволюцию, как, например, neighbor-joining (NJ), сходны с методами кластерного анализа, но они не предполагают постоянную скорость эволюции всей «родословной» филогенетического дерева. Более того, методы минимальной эволюции основываются на данных, обратных средним дистанциям. Так, дистанция между двумя сиквенсами равна сумме длин ветвей между ними, а не средним дистанциям. Метод NJ работает следующим образом: он конвертирует алаймент сиквенсов в матрицу дистанций, которая отображает расчетную эволюционную дистанцию между всеми сиквенсами в алайменте. Когда матрица построена, алгоритм находит пару таксонов с наибольшей схожестью и соединяет их с так называемым наиболее близким общим предком (MRCA, most resent common ancestor), представляющим собой узел, соединяющий эти два таксона. Далее дистанции от них до MRCA рассчитываются в зависимости от выбранной модели нуклеотидных замен и, в конечном итоге, определяются расстояния от MRCA до всех таксонов в алайменте. В результате образуется новая матрица, где два первых таксона представляют один наиболее близкий общий предок, MRCA и алгоритм начинает заново рассчитывать расстояния до оставшихся таксонов. Этот процесс повторяется до тех пор, пока все таксоны не будут включены в филогенетическое дерево.

Метод максимального правдоподобия (Maximum Likelihood, ML) позволяет вычислить условную вероятность параметров относительно данных и модели [175]. Метод заключается в следующем: на основе выборки данных и предполагаемой модели (нормальное распределение) алгоритм случайным образом предлагает значения параметров (среднего значения и дисперсии). Затем эти два значения параметров, а также сами наблюдаемые данные подставляются в формулу функции правдоподобия. После расчета получается число - значение правдоподобности. Затем алгоритм ML предлагает новые два значения среднего и дисперсии (или одно из них), опять вычисляет правдоподобность и проверяется, как изменилось ее значение - если оно возросло, алгоритм считает, что он движется в правильном направлении, и предложенные новые параметры более точно описывают данные. Полученные значения принимаются как текущие, и алгоритм продолжает вычисления. Если же значение правдоподобности уменьшилось, то параметры эти считаются неверными, и алгоритм продолжает поиск от тех параметров, что были до этого. Такой поиск идет до тех пор, пока не будет найден так называемый пик функции правдоподобия - такое ее состояние, когда изменение параметров в любом направлении будет приводить к уменьшению значения правдоподобности. Однако число возможных деревьев значительно возрастает с ростом числа таксонов в алайменте, и при их количестве более 10 осуществить поиск всех вероятных деревьев целиком - задача практически невозможная из-за лимита вычислительных возможностей.Для решения этой проблемы в ML были предложены несколько стратегий, которые исследуют части филогенетических деревьев. Таковымиявляются SPR - subtree pruning and regrafting, NNI - nearest neighbor interchange и TBR - tree bisection and reconnection. Все три метода используют специальные правила для генерации нового «переделанного» дерева из заданного стартового дерева. Для каждого нового дерева вычисляется значение максимального правдоподобия, и дерево с наибольшим значением используется для повторения процесса.

Оценка достоверности филогенетического анализа

Недостатком обоих моделей NJ и ML является то, что они производят только расчеты филогенетических дистанций, без какого-либо статистического расчета филогенетических связей в дереве. В начале эта проблема решилась путем использования метода, называемого «статистический бутстрэп» (bootstrapping) [176]. Данный метод относится к классу методов генерации повторной выборки. Суть его заключается в многократной генерации серий образцов (псевдорепликатов), в которых заменены местами сайты в алайменте, включая замены (то есть позиция в алайменте может быть использована несколько раз). Псевдорепликаты при этом имеют длину, равную исходному алайменту. Далее с каждым алайментом псевдорепликатов строится филогенетическое дерево и вычисляется количество кластеров с каждым сиквенсом. Значение бутстрэпа показывает, сколько раз сиквенсы в алайменте кластрируются вместе. Например, если алаймент состоит из 4 образцов A, B, C и D, алгоритм бутстрэп построит 4 псевдофилогенетических дерева. И если в 3 из 4 случаев на этих деревьях образцы A и B будут кластрироваться вместе, то значение бутстрэпа для данных образцов составит 75.

Другим классом методов вычисления достоверности филогенетического дерева являются методы, основанные на длине ветви (branch length methods). К ним относятся:

· zero-branch length test (тестнулевойдлиныветви);

· aLRT (approximately likelihood ratio test, тест приблизительного правдоподобия);

· SH-aLRT (Shimodaira-Hasegawa +approximately likelihood ratio test, тест Шимодаира-Хасегава + тест приблизительного правдоподобия).

Среди данных методов наиболее совершенным является SH-aLRT. aLRT очень близок к LRT (тест отношения правдоподобия), используемому для проверки ограничений на параметры статистических моделей, оцененных на основе выборочных данных. aLRT имеет «нулевую гипотезу», то есть тестируемая ветвь филогенетического дерева имеет нулевую длину. Изначально этот тест базировался на критерии хи-квадрат [177]. Внедрение в aLRT теста Шимодариа-Хасегавы (SH) оптимизировало процедуру тестирования статистики «нулевой гипотезы» филогенетической ветви [178]. Кроме этого, SH-aLRT надежный даже для коротких ветвей филогенетического дерева, в отличие от метода бутстрэп [179].

Таким образом, для изучения генетического разнообразия, распространения и молекулярной эпидемиологии ВИЧ филогенетический анализ ВИЧ является наиболее эффективным методом [180, 181].

Анализ литературных данных показывает, что проблема ВИЧ-инфекции остается актуальной. Высокая скорость репликации вируса, низкая точность обратной транскрипции, интегративный механизм взаимодействия с чувствительной клеткой, многократное проникновение разных вариантов вируса в популяцию человекапривели к высокому генетическому разнообразию ВИЧ, что значительно усложнило лечение ВИЧ-инфицированных пациентов и разработку эффективной вакцины.

Определение субтипов ВИЧ, направлений их заноса и распространения на территории страны дает возможность расшифровывать вспышки ВИЧ-инфекции, заражение через кровь и ее продукты, умышленные случаи инфицирования. Рекомбинантные формы ВИЧ представляют отдельную проблему, поскольку наследуют гено- и фенотипические признаки от родительских вариантов ВИЧ различных субтипов. Такие эволюционные события, как рекомбинация, могут привести к появлению вариантов вируса с новыми биологическими свойствами.В этой связи определение субтипов и рекомбинантных форм ВИЧ в разных странах, в том числе и на территории Республики Беларусь, остается весьма значимым и актуальным направлением научных исследований.

Не менее важны контроль за эффективностью лечения ВИЧ-инфицированных пациентов и своевременное определение мутаций резистентности в геноме ВИЧ к препаратам антиретровирусной терапии. Применяемые в настоящее время на территории Республики Беларусь зарубежные тест-системы для генотипирования и выявления мутаций резистентности ВИЧ к антиретровирусным препаратам весьма дорогостоящие, и создание отечественного набора даст возможность сэкономить значительные валютные средства.

Обозначенные проблемы составили предмет нашего научного интереса при проведении настоящих диссертационных исследований.



ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Характеристика образцов

В работе использовались образцы сыворотки/плазмы крови, полученные от ВИЧ-инфицированных пациентов, состоящих на учете в лечебно-профилактических учреждениях (ЛПУ) Республики Беларусь, а также от пациентов, у которых впервые выявлена ВИЧ-инфекция в лаборатории диагностики ВИЧи сопутствующих инфекций РНПЦ эпидемиологии и микробиологии. Образцы были получены в рамках исследований на определение резистентности ВИЧ-1 к антиретровирусным препаратам, молекулярно-генетического скрининга, количества вируса (вирусной нагрузки) и маркеров ВИЧ-инфекции. Всего проанализировано более 2000 образцов сыворотки/плазмы крови, поступивших в лабораторию в 2008-2015 гг., для исследования на наличие маркеров ВИЧ-инфекции и определения вирусной нагрузки. С целью выявления рекомбинантных форм вработе было использовано 302сиквенса участка гена polВИЧ-1, полученных в лаборатории диагностики ВИЧи сопутствующих инфекций начиная с 1996 г.и зарегистрированных в Genbank. Один сиквенс, изолят 98BY10443, был взят из Genbank (AF414006.1). Данный сиквенс получен А. Е. Машарским от ВИЧ-инфицированного пациента из г. Могилева, который заразился парентеральным путем в г. Калининграде, Россия[182].

Таким образом, в диссертационной работе использовано 303 сиквенса участка гена pol и полноразмерного генома ВИЧ-1.Основные данные по пациентам, от которых получены образцы крови, представлены вприложении А.

Получение сыворотки/плазмы крови

Плазма/сыворотка крови для проведения вирусологических и молекулярно-генетических исследований была поучена путем центрифугирования цельной крови, содержащей/не содержащей ЭДТА, при 3000 об/мин в течение 15 минут. Хранение сыворотки/плазмы осуществлялось в завинчивающихся одноразовых пробирках объемом 1,5-2,0 мл при температуре минус 70 ЃЋ.

2.2 Скрининг сыворотки/плазмы крови на наличие маркеров ВИЧ-инфекции

Скрининг сыворотки/плазмы крови методом иммуноферментного анализа использовался для первичной диагностики ВИЧ-инфекции в поступивших образцах при условии, что диагноз ВИЧ-инфекции не был предварительно установлен в других ЛПУ Республики Беларусь.

Для выявления серологических маркеров ВИЧ-инфекции использовались наборы реагентов для иммуноферментного выявления антител к ВИЧ-1,2 и антигена р24 ВИЧ: КомбиБест ВИЧ-1,2 АГ/АТ (ЗАО «Вектор-Бест», Россия) и набор реагентов для иммуноферментного выявления и подтверждения наличия антигена р24 ВИЧ: ВИЧ р24-антиген-ИФА-БЕСТ (ЗАО «Вектор-Бест», Россия), согласно прилагаемым к наборам инструкциям.

Количественное определение РНК ВИЧ

В исследуемых образцах при наличии подтвержденной ВИЧ-инфекции и/или серологических маркеров ВИЧ-инфекции определялось количество РНК ВИЧ(вирусная нагрузка) с использованием набора реагентов для выявления и количественного определения РНК вируса иммунодефицита человека методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени: РеалБест РНК ВИЧколичественный (ЗАО «Вектор-Бест», Россия) на амплификаторе CFX96 (BioRad, США), согласно прилагаемой к набору инструкции.

Для экстракции РНК и последующего синтеза ДНК ВИЧиспользовались образцы с вирусной нагрузкой не менее 2000 копий РНК ВИЧна 1 мл сыворотки/плазмы крови.

Выделение РНК ВИЧ

Выделение РНК ВИЧпроводилось с использованием коммерческих наборов различных производителей, согласно прилагаемым к ним инструкциям:

1. ViroSeq Sample Preparation Module (Abbott Molecular, США). Объем плазмы крови - 0,5 мл;

2. Рибо-Сорб (АмплиСенс, Россия). Объем сыворотки/плазмы крови - 0,1 мл;

3. Рибо-Преп (АмплиСенс, Россия). Объем сыворотки/плазмы крови - 0,1 мл.

Полученная РНК хранилась в пробирках объемом 0,6 мл при температуре минус (20-70) ЃЋ.

Определение участка генома ВИЧдля секвенирования
и филогенетического анализа

С целью определения участка секвенирования генома ВИЧдля последующего генотипирования и филогенетического анализа был осуществлен анализ всех имеющихся референсных последовательностей ВИЧв международной базе данных сиквенсов ВИЧHIV sequence database(http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/mainpage.html). Это необходимо для максимально эффективного поиска генетически близкихреференсных сиквенсовВИЧ-1. Используя интерфейс программы, был задан поиск всех сиквенсов ВИЧ-1, относящихся к региону стран бывшего СССР. На основании результатов поиска сгенерирована гистограмма, на которой показано наличие сиквенсов в зависимости от участка генома ВИЧ-1.

Согласно данным, представленным на рисунке 2.1, наибольшее количество референсных последовательностей ВИЧ-1 в HIVsequencedatabase с территории стран бывшего СССР относятся к сегменту гена polВИЧ, кодирующему белки протеазы и часть обратной транскриптазы (координаты относительно референсного изолята ВИЧ-1 HXB2~2150-3200). Вторым сегментом с наибольшим количеством референсных последовательностей является участок гена envВИЧ, для которого в базе данных имеется около 800 референсов. В этом участке можно увидеть небольшой «пик» - до ~2000 референсов, относящийся к участку, кодирующему V3-петлю. Однако длина таких последовательностей не превышает 300-400 п.н., что не позволяет проводить филогенетический анализ с высокой статистической достоверностью из-за малого количества генетической информации, содержащейся в таких коротких фрагментах.

Участок гена pol ВИЧ, кодирующий протеазу и часть обратной транскриптазы, ответственный за возникновение мутаций резистентности к трем группам препаратов ВААРТ, применяемых на территории Республики Беларусь. Секвенирование данного участка ВИЧпозволяет выявить такие мутации и при их наличиикорректировать схему лечения ВИЧ-инфицированного пациента.

Исходя из вышеизложенного, в качестве основного исследуемого фрагмента генома ВИЧ-1был выбран участок от 3'-конца (начала) гена pol длиной не менее 1300 п.н.

Синтез кДНК ВИЧ

Комплементарная ДНК ВИЧ-1 синтезировалась с помощью реакции, обратной транскрипции с использованием РНК- и ДНК-зависимой ДНК полимеразы (обратной транскриптазы) M-MuLV Reverse Transcriptase (Thermo Scientific), ингибитора рибонуклеазы RiboLock RNase Inhibitor (Thermo Scientific), дНТФ (Thermo Scientific), специфических праймеров, указанных в разделах 2.9 и 2.10данной работы. Условия проведения реакции обратной транскрипции соответствовали инструкции производителя реагентов. Реакция осуществлялась в пробирках объемом 0,2 мл на амлификаторах GeneAmp® PCR System 2700 (Applied Biosystems), Gradient Palm-Cycler™ (Corbett Research), C1000 Touch™ Thermal Cycler (BioRad).

Условия проведения ПЦР

Специфические фрагменты генома ВИЧ-1 синтезировались методом двухраундовой полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием термостабильной taq-ДНК полимеразы и двух пар праймеров: внешних и внутренних. В качестве матрицы в первом раунде ПЦР использовалась кДНК ВИЧ, полученная в реакции обратной транскрипции, во втором - ДНК, синтезированная в первом раунде ПЦР.

При проведении ПЦР использовались ДНК-полимеразы следующих производителей:

· Taq DNA Polymerase (Thermo® Scientific);

· Taq DNA Polymerase with Standart Taq Buffer (BioLabs®)

Реакционная смесь содержала следующие компоненты: ПЦР буфер (1х), Mg2+(1,5 ммоль), дНТФ (0,2 ммоль каждого нуклеотида), по 0,2 ммоль прямого и обратного праймеров и 0,25 Е taq-ДНК полимеразы. Объем ДНК-матрицы -1 мкл (1-500 нг), общий объем реакционной смеси -25 мкл в первом и 40 мкл во втором раундах ПЦР. Реакция осуществлялась в пробирках объемом 0,2 мл на амлификаторах GeneAmp® PCR System 2700 (Applied Biosystems), C1000 Touch™ Thermal Cycler (BioRad). Режим проведения ПЦР указан в таблице 2.1.

Таблица 2.1.-Программа амплификации ДНК

Этап	Температура, єС	Время	Количество повторов
Первичная денатурация	95	3 мин	1
Денатурация	95	30 с	35
Отжиг	45-651	30 с
Элонгация	68-722	1,5-3 мин
Финальная элонгация	68-722	5 мин	1

1 Температура отжига пары праймеров (Tm) рассчитывалась с помощью Tm-калькулятора на сайтах производителей ДНК-полимеразы.

2 Температура элонгации выбиралась согласно инструкции к используемой ДНК-полимеразе.

Синтез фрагмента гена pol ВИЧ

Для синтеза фрагментов гена pol были использованы:

- диагностическая тест-система для выявления мутаций резистентности ВИЧ-1 к препаратам ВААРТViroSeq™ HIV-1 Genotyping System (Abbott Molecular);

- собственные пары праймеров, подобранные для диагностической тест-системы для выявления мутаций резистентности ВИЧ-1 к препаратам ВААРТ«Бел ВИЧ-1-резистентность-генотип», производство РНПЦ эпидемиологии и микробиологии.

Тест-система ViroSeq™ HIV-1 Genotyping System позволяет синтезировать полный сегмент гена pol ВИЧ, кодирующий протеазу ВИЧ-1 с 1 по 99 кодоны (297 п.н.) и 1/3 обратной транскриптазы ВИЧ-1 с 1 по 335 кодоны (1005 п.н.). Таким образом, длина синтезируемого фрагмента составляет порядка 1300 п.н.

Для амплификацииучастка гена polсобственными праймерами были подобраны пары праймеров, позволяющие синтезировать участок, кодирующий протеазу и 2/3 участка, кодирующего обратную транскриптазу ВИЧ. Размер амплифицируемого фрагмента генома ВИЧ-1 составил порядка 1500 п.н. (рисунок 2.2).

Таблица 2.2.- Пары праймеров для амплификации фрагмента гена pol ВИЧ

Праймер	Нуклеотидная последовательность праймера	Координата относительно HXB2
PR1S1	GAAAAAGGGCTGTTGGAAATGTGGAA	2016 > 2038
P1AOT,1	AAATTTAGGAGTCTTTCCCCATATTACTATGC	3685 < 3716
PROS-22	GCTAATTTTTTAGGGAAGATCTGGCCTT	2080 >2102
RTOA2	TGCCTCTGTTAATTGTTTTACATCATTAGTGTG	3630 < 3662

OT Праймер для обратной транскрипции.

1Праймер для первого раунда ПЦР.

2Праймер для второго раунда ПЦР.

Синтез полноразмерного генома ВИЧ

Для амплификации полноразмерного генома ВИЧ-1 были использованы пары праймеров, позволяющие амплифицировать все структурные гены вируса, а также часть 5'- и 3'-LTR ВИЧ. Данные пары праймеров условно делят геном ВИЧ-1 на 4 перекрывающихся фрагмента, обозначенных A, B, C и D(рисунок 2.3).

Нуклеотидные последовательности праймеров для амплификации полноразмерного генома ВИЧ-1 и их координаты относительно HXB2 указаны в таблице 2.3.

Таблица 2.3. - Пары праймеров, использованные для амплификации полноразмерного генома ВИЧ

Фраг-мент	Праймер	Нуклеотидная последовательность праймера	Координата в HXB2
A	5'R11	AGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGG	473 > 497
	PROAOT,1	TTTATGGCAAATACTGGAGTATTGTATGGA	2740 < 2711
	5'RU5S2	GCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTG	546 > 570
	PRTA2	CTTTTGGGCCATCCATTCCTG	2590 < 2610
B	PROS2b1	GCTAATTTTTTAGGGAARATYTGGCCTT	2080 > 2107
	Pol OA1OT,1	TCTCCTGTATGCAGACCCCAATATGT	5242 < 5267
	PRTS2	AGCCCCACCAGAAGAGAGCTT	2157 > 2177
	5'HIV-NA2	CCCTAGTGGGATGTGTACTTCTGAACTTA	5192 < 5220
C	3'HIV-OS31	TACAGTGCAGGGGAAAGAATAATAGACATAATA	4809 > 4841
	gp120-OAOT,1	TGTCTGGCCTGTACCGTCAGCG	7831 < 7852
	3'HIV-OS2	CAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACA	4890 > 4917
	gp41-AS2	GCTTCCTGCTGCTCCCAAGAACC	7786 < 7808
D	gp41-nefOS-21	TTGAACCAYTAGGAGTAGCACCCAC	7696 > 7720
	Nef-AS4OT,1	AGAGAGACCCAGTACAGGCAAAAAGC	9523 < 9548
	gp120-S2	ACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTG	7719 > 7742
	3'Nef 32	GTACAGGCAAAAAGCAGCTGCTTATATG	9510 < 9537

OT Праймер для обратной транскрипции.

1 Праймер для первого раунда ПЦР.

2 Праймер для второго раунда ПЦР.

Обозначения:

> - прямой праймер.

< - обратный праймер.

Регистрация продуктов амплификации

Детекция продуктов амплификации проводилась методом горизонтального электрофореза в 1,7%-ном агарозном геле (Sigma, США). Буфер для нанесения использовался DNA Gel Loading Dye (6X) (Thermo Fisher, США). Электрофорез проводился в горизонтальной камере для электрофореза.Электрофоретический буфер - 0,5 TAE (20 ммоль Трис, 10 ммоль уксусная к-та, 0,5 ммоль ЭДТА), напряжение электрического поля - 10 В/см расстояния между электродами, время проведения электрофореза - 18 минут. В качестве интеркалирующего красителя ДНК использовался бромистый этидий. Регистрация ДНК проводилась в проходящем УФ-свете (312 нм) трансиллюминатора UVT-1 (Россия). Длина амплифицированных фрагментов определялась относительно маркера молекулярного веса - 100-1500 п.н. с шагом 100 п.н. (различных производителей). Положительными считались образцы, которые имели полосу на геле на уровне, соответствующем размеру амплифицируемого фрагмента.

Очистка продуктов амплификации после ПЦР

Для проведения секвенирующей ПЦР положительные образцы очищались от остатков праймеров, дНТФ и ДНК-полимеразы с использованием наборов QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, США) и Clean Up Enzyme Mix (Abbott Molecular, США), согласно инструкциям к применению наборов.

Секвенирующая ПЦР

Реакция секвенирования проводилась по методу Сэнгера [183]с использованием терминаторов BigDye Termination Cycle Sequencing Kit v.3.1 (Applied Biosystems®, США), а также специфических праймеров для амплификации ДНК ВИЧ,согласно инструкции к применению набора.

Очистка продуктов амплификации после секвенирующей ПЦР

Амликоны после секвенирующей ПЦР очищались методом преципитации ДНК с ацетатом натрия. Для этого готовилась смесь холодного (-20 єС) 96%-ного этанола и 3-молярного ацетата натрия объемом 50 мкл и 2 мкл на образец соответственно. К смеси добавлялось 20 мкл продукта амплификации, после чего смесь центрифугировалась при следующих условиях: время 30 мин, температура +4 єС, скорость 13 000 g. Супернатант удалялся и осадок промывался холодным (-20 єС) 70%-ным этанолом с последующим центрифугированием: время 5 мин, температура +20 єС, скорость 13 000 g. Далее супернатант удалялся и осадок высушивался при 95 єС в течение 2 мин. Высушенный осадок растворялся в 20 мкл формамида Hi-Di™ Formamide (Applied Biosystems®), после чего прогревался при 95 єС в течение 2 мин.

Получение электрофореграмм и сборка контига

Электрофореграммы исследуемых образцов были получены на автоматическом генетическом анализаторе ABI PRISM® 3100-Avant™ Genetic Analyzer (Applied Biosystems®).Анализ электрофореграмм и сборка контига осуществлялись с помощью программного обеспечения Sequencing Analysis Software™ (Applied Biosystems®) и Geneious® v8 (Biomatters Ltd.).

Выравнивание последовательностей нуклеотидов

Множественное выравнивание последовательностей нуклеотидов (multiple sequence alignment) проводилось с помощью алгоритма ClustalW alignment [184] и MAFFT [185, 186].

Получение референсных сиквенсов

Поиск генетически близких референсных сиквенсов ВИЧосуществлялсяс помощьюBLAST (Basic Local Alignment Search Tool, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Стратегия поиска заключалась в нахождении участка генома ВИЧ, для которого в базах данных Genbank и LosAlamos HIV sequence database было наибольшее количество референсных сиквенсов. Далее определялась длина генома исследуемых образцов, на основании которой осуществлялся поиск BLAST в зависимости от длины генома доступных референсов. После поиска BLAST номера доступа найденных референсов использовались для получения всего генома референсов, загруженных в базы данных. Далее эти последовательности нуклеотидов объединялись с полными нуклеотидными последовательностями исследуемых образцов и выравнивались в один алаймент для филогенетического анализа.

Филогенетический анализ

Филогенетические деревья строились с применением алгоритма ML (maximum likelihood) в программах PHYML (Phylogenetic maximum likelihood) [187] и GARLI (Genetic Algorithm for Rapid Likelihood Inference) [188], с моделью замены нуклеотидов GTR + I + G (I -proportionofinvariablesites, G - Gammashapeparameter). Оптимизация топологии дерева -BestofNNIsandSPRs.

Для расчета статистической достоверности кластеров использовался тест SH-aLRT. Достоверными считались кластеры филогенетического дерева, корневая ветвь которых имела значение 0,9 [189]. Визуализация филогенетических деревьев проводилась в программе FigTree v.4.2.

Расчет генетических дистанций

Патристические дистанции между исследуемыми сиквенсами в алайменте рассчитывались с помощью программы PATRISTIC [190] на основании ML-деревьев.

Генотипирование и анализ рекомбинаций ВИЧ

Генотипирование нуклеотидных последовательностей осуществлялось несколькими методами:

1) методом филогенетического анализа с использованием готовых референсных сиквенсов для генотипирования ВИЧ-1 из HIV sequence database;

2) спомощьюпрограммионлайн-программ для автоматического генотипирования ВИЧ:jpHMM (jumpingprofileHiddenMarkovModel) [191], [192], SimPlotv.3.5.1 [193], COMET (COntext-based Modeling for Expeditious Typing)[194], REGA HIV-1 Subtyping Tool [195].

Выявление мутаций резистентности

Для определения мутаций резистентностиВИЧ-1 к АРП использовалась онлайн-база данных мутаций резистентности Стэнфордского университета [196].

Статистическая обработка

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием программыMicrosoftExcel (MicrosoftCorporation).



ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА СУБТИПОВ ВИЧ, ВЫЯВЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

На первом этапе исследований предстояло дать молекулярно-генетическую характеристику ВИЧ-1 и определить субтипы вируса в разных группах пациентов с ВИЧ/СПИД, выявленных на территории Республики Беларусь за период с 2008 по 2015 годы, а также частоту встречаемости рекомбинантных форм вируса.Для решения поставленных задач были собраны 303 образца сыворотки/плазмы крови, из которых выделили РНК ВИЧ-1. Полученные образцы нуклеиновых кислот были амплифицированы, секвенированы и проанализированы по участку гена pol ВИЧ-1. Данные по пациентам представлены в приложении А.

Характеристика ВИЧ-инфицированных пациентов

Из 303 исследованных образцов сыворотки/плазмы крови наибольшее количество было получено из Минской области и г. Минска - 109 (36,0%) и 51 (16,8%) соответственно. Меньше всего - из г. Витебска и Витебской области - 14 образцов (4,6%)(таблица 3.1).

Таблица 3.1. - Количество образцов сыворотки/плазмы крови, полученных из различных регионов Беларуси

Регион	n	%
г. Брест и Брестская обл.	42	13,9
г. Витебск и Витебская обл.	14	4,6
г. Гомель и Гомельская обл.	50	16,5
г. Гродно и Гродненская обл.	17	5,6
Минская обл.	109	36,0
г. Минск	51	16,8
г. Могилев и Могилевская	20	6,6

Гендерное соотношение полученных образцов составило 1:1,24. 168 образцов (55,4%) было получено от мужчин и 135 (44,6%) - от женщин.

Средний возраст групп среди женщин из разных областей составил от 23,8±14,4 лет в г. Минске до 41,8±24,1 лет в Витебской области(рисунок 3.1). Увеличение среднего возраста у женщин Витебской области обусловлено наличием единичного случая ВИЧ-инфекции у женщины 1929 г.р. и общим небольшим числом образцов в данной группе (n=6). Средний возраст среди мужчин составил от 29,5±12,4 лет в Гомельской области до 33,2±12,3 лет в Брестской.

Из 303образцов 125 (41,3%) было получено от ПИН, из которых 81,6% (102 образца) составили мужчины, 18,4% - женщины(23 образца).

Количество образцов сыворотки/плазмы крови, полученных от детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, составило 45 (14,9%), из них мужского пола - 23 (48,9%), женского - 22 (51,1%). В двух случаях (0,7%) кровь была получена от реципиентов ВИЧ-инфицированной крови и в 12 случаях (4%) путь инфицирования не был установлен.

Определение субтипов ВИЧ-1

Для определения субтипов и выявления рекомбинантных форм ВИЧ-1 было проведено генотипирование 303 образцов ДНК ВИЧ-1. Генотипирование осуществлялось методом филогенетического анализа с субтип-референсами ВИЧ-1 группы М, взятыми из базы данных Los Alomos HIV sequence database, включая ЦРФ ВИЧ-1. Для выявления наличия рекомбинаций и подтверждения результатов генотипирования использовались онлайн-утилиты для автоматического генотипирования ВИЧ: jpHMM, COMET и REGA.

Генотипирование методом филогенетического анализа

Проведенный филогенетический анализ показал, что на территории Республики Беларусьза анализируемый период времени по-прежнему доминировал ВИЧ-1 субтипа А1, на который приходилось91,1% от всех 303 взятых в работу образцов (таблица 3.2). Субтип В выявлялся в 3% случаев, С - в 0,7%, G и G-like- в 0,6% и, наконец, 4,6%приходилось на рекомбинантные формы ВИЧ-1: 2,6% - CRF03_AB, 1,3% - CRF02_AG и 0,7% - CRF06_cpx. Филогенетическое дерево с исследуемыми образцами показано в Приложении Б. Результаты генотипирования методомфилогенетического анализа представлены в таблице 3.2.

Таблица 3.2.-Распространенность субтипов ВИЧ-1 на территории Беларуси по результатам генотипирования методом филогенетического анализа

Субтип ВИЧ-1	n	%
A1	276	91,1
B	9	3,0
C	2	0,7
G	1	0,3
G-like	1	0,3
02_AG	4	1,3
03_AB	8	2,6
06_cpx	2	0,7

Генотипирование с помощью онлайн-программ

Генотипирование исследуемых образцов в программе REGAпоказало схожие с филогенетическим анализом результаты. Однако в трех случаях программа ложно определила наличие рекомбинаций, которые не были подтверждены ни одним из других используемых методов анализа. Результаты генотипирования программой REGA показаны в таблице 3.3.

Таблица 3.3. - Распространенность субтипов ВИЧ-1 на территории Беларуси по результатам генотипирования с помощью программы REGA

Субтип ВИЧ-1	n	%
A1	275	90,7
B	7	2,3
03_AB	5	1,7
02_AG	4	1,3
C	2	0,7
G	2	0,7

Генотипирование последовательностей ДНК с использованиемпрограмм COMET и jpHMMдало практически идентичные результаты, за исключением двух образцов(таблица 3.4). В обоих случаях программа COMET не смогла определить субтип образцов MnObl_61 и Mn_21.

Таблица 3.4. - Распространенность субтипов ВИЧ-1 на территории Беларуси по результатам генотипирования с помощью программ COMETи jpHMM

Субтип ВИЧ-1	n	%
A1	275	90,7
B	9	3,0
C	2	0,7
G	2	0,7
02_AG	4	1,3
03_AB	8 (7 + 1*)	2,6
06_cpx	2	0,7
URF_AB	1*	0,3

Анализ различий результатов генотипирования

В большинстве случаев (296 из 303) различные методы генотипирования показали одинаковые результаты. В семи случаях генотипирование показало различные результаты(таблица 3.5).

Таблица 3.5. - Различия в результатах генотипирования при использовании различных программ и методов генотипирования ВИЧ

Образец	REGA	COMET	jpHMM	PhyML	Результат
Mg_15	Recombinant of 03_AB, A1	03_AB	03_AB	03_AB	03_AB
Mn_21	Recombinant of A1, B	unassigned	URF_AB	A1	URF_AB
Mn_8	Recombinant of B, D	B	B	B	B
MnObl_61	Recombinant of 03_AB, A1	unassigned	03_AB	03_AB	03_AB
PV_29	Recombinant of B, D	B	B	B	B
RES_634	03_AB-like	03_AB	03_AB	03_AB	03_AB
Mg_3	G	G	G	G-like	G



Образцы Mg_15 и MnObl_61 при генотипировании программой REGA оказались рекомбинантными формами между CRF03_AB и анцестральным ВИЧ-1 субтипа А1 в начале гена pol(рисунок 3.2).

С целью проверки внутрисубтипной рекомбинации для первых 400 нуклеотидов всех исследуемых CRF03_AB, относящихся к субтипу А ВИЧ, были найдены 10 наиболее генетически близких референсов онлайн-программой BLAST. Результаты поиска показали, что все найденные референсы относятся к варианту ВИЧ-1 AFSU, получившему распространение на территории стран бывшего СССР, включая Беларусь. Не было выявлено ни одного анцестрального референсного сиквенса, с которым могла быть внутрисубтипная рекомбинация, как это было установлено программой REGA. Такой результат может быть обусловлен некоторыми заменами нуклеотидов в сиквенсах исследуемых образцов, что делает их генетически ближе к консенсусному сиквенсу субтипа А1, генетически отличного от варианта ВИЧ-1 АFSU, из генома которого состоят сегменты субтипа А1 в CRF03_AB. Таким образом,исследуемые образцы Mg_15 и MnObl_61 являются «чистыми» CRF03_AB.

Образцы Mn_8 и PV_29 были идентифицированы программой REGA как рекомбинантные формы между субтипами B и D ВИЧ, однако другие методы генотипирования не подтвердили наличия вставки генома субтипа D. Как и в случае с образцами Mg_15 и MnObl_61, такой результат получился из-за единичных изменений в геноме исследуемых образцов, что сделало их генетически ближе к ВИЧ-1 субтипа D в середине генома. При визуальном анализе нуклеотидных и аминокислотных последовательностей референсных сиквенсов субтипов B и D ВИЧ-1 и исследуемых образцов в участке рекомбинации не было выявлено существенных отличий Mn_8 и PV_29 от консенсусных сиквенсов субтипа В.

При филогенетическом анализе образец Mn_21 кластрировался вместе с образцами ВИЧ-1 субтипа А1 варианта AFSU, однако программы REGA и jpHMM показали наличие вставок ВИЧ-1 субтипа B, отличных от CRF03_AB, идентифицировав, таким образом, уникальную рекомбинантную форму ВИЧ. Подробнее о ней написано в главе 5 данной работы.

При генотипировании образца Mg_3 с использованием программ COMET, REGA и jpHMM было определено, что данный образец является субтипом G ВИЧ. Однако при построении филогенетического дерева образец Mg_3 оказалсяв субкластере с циркулирующей рекомбинантной формой CRF43_02G. В то же время варианты циркулирующей рекомбинантной формы CRF43_02G, находящиеся в Genbank, формировали между собой отдельный суб-субкластер (Приложение Б). Анализ точек рекомбинации показал, что точка разрыва генома CRF43_02G находится в позиции 3325, то есть начиная с нуклеотида 3325 начинается последовательность генома циркулирующей рекомбинантной формы CRF02_AG.

В свою очередь, CRF02_AG имеет разрыв генома в координате 3275, начиная с которой геном ВИЧ-1 представлен субтипом А(рисунок 3.4).

С целью проверки, содержит ли образец Mg_3 геном субтипа А, был проведен визуальный анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей Mg_3 в алайменте с референсными сиквенсами ВИЧ-1 субтипов A и G. В результате выявлен только один нуклеотид А в позиции 3439, который характерен для субтипа А (А1 и А2), в то время как у ВИЧ-1 субтипа G в данной позиции находится нуклеотид С(рисунок 3.5).

Данная позиция является второй в триплетном коде аминокислоты, и в случае нахождения нуклеотида С образуется триплет GCR, кодирующий аминокислоту аланин. Нуклеотид А в триплете RAR кодирует аминокислоты лизин или глутаминовую кислоту, являющиеся консенсусными для субтипа А. Все остальные нуклеотидные и аминокислотные последовательности образца Mg_3 относились к субтипу G. Таким образом, образецMg_3 был определен как ВИЧ-1 субтипа G.

В большинстве случаев все различные методы генотипирования ВИЧ-1 дают одинаковые результаты.Различиярезультатов, вероятнее всего, обусловлены различными алгоритмами генотипирования образцовВИЧ-1 (филогенетический анализ, бутскан-анализ) и/или различными консенсусными сиквенсами, с которыми сравнивается исследуемый образец.

Распространенность субтипов ВИЧ-1 на территории Беларуси

Проведенные исследования по генотипированию показали, что ВИЧ-1 субтипа А1 в анализируемый период оставался доминирующим на территории Беларуси. На его долю среди всех исследованных 303 образцов ДНК приходилось 275 случаев, что составляло 90,7%. Кроме субтипа А1, было выявлено 9 случаев инфицирования ВИЧ-1 субтипа В (3,0%), по 2 случая приходилось на инфицирование субтипами ВИЧ-1 С и G (по 0,7%). В 15 (4,9%) образцах были выявлены рекомбинантные формы ВИЧ. Более половины случаев от всех обнаруженных рекомбинантных форм приходилось на CRF03_AB - 8 (2,6%), на CRF02_AG - 4 (1,3%), на CRF06_cpx - 2 (0,7%) и в одном случае выявлена уникальная рекомбинантная форма (УРФ) ВИЧ-1 между субтипами A1 и B(таблица 3.6).



Таблица 3.6. - Распределение субтипов и рекомбинантных форм ВИЧ-1 по сумме результатов генотипирования различными методами

Субтип ВИЧ-1	n	%
A1	275	90,7
B	9	3,0
C	2	0,7
G	2	0,7
CRF02_AG	4	1,3
CRF03_AB	8	2,6
CRF06_cpx	2	0,7
URF_AB	1	0,3

Наибольшее распространение ВИЧ-1 субтипа А1 было выявлено у ПИН - 119 из 275 (43,2%), средний возраст данной группы пациентов составил 33,7±5,8 лет. На втором месте - лица, инфицированные половым путем - 102 пациента (33,7%), средний возраст составил 31,4±8,0 лет. В 42 случаях материал был получен от детей в возрасте до 18 лет, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей. Не удалось установить путь инфицирования в 12 случаях.

ВИЧ-1 субтипа Bвыявлялся, главным образом, у лиц, инфицированных половым путем - 6 из 9 случаев, включая 2 МСМ. Средний возраст пациентов в данной группе составил 32,5±8,0 лет. В одном случае субтип В был выявлен у ПИН, мужчины 1976 г.р. из г. Орши Витебской области. В двух случаях образцы крови были получены от лиц, явившихся реципиентами крови от ВИЧ-инфицированного пациента. Это женщина 1929 г.р. и мужчина 1947 г.р., (образцы PV_31 и PV_30 соответственно), проживающие в г. Витебске.

ВИЧ-1 субтипа С выявлен у семейной пары - образцы Mn_22 и Mn_39. Оба партнера были инфицированы половым путем, один из которых явился источником вируса для другого партнера.

Субтип Gбыл определен в образцах Mg_3 - женщины 1986 г.р. из г. Могилева и RES_646 - мужчины 1983 г.р. из г. Барановичи, который был инфицирован половым путем.

Рекомбинантные формы ВИЧ-1 были выявлены у пациентов с различным путем инфицирования. УРФ Mosи 2 ЦРФ CRF02_AGбыли определены у детей, рожденных ВИЧ-инфицированными матерями, у ПИНв 3 случаях были выявлены CRF03_ABи в 2 - CRF06_cpx. Наибольшее количество случаев ВИЧ-инфекции рекомбинантными формами ВИЧ-1 было определено среди лиц, инфицированных половым путем - 5 случаев инфицирования CRF03_ABи 2 случая - CRF02_AG.

Таким образом, по проведенным в данной главе молекулярно-генетическим исследованиям можно сделать следующие выводы:

- на территории Республики Беларусь в популяции пациентов с ВИЧ/СПИД за анализируемый период 2008-2015 гг. доминировал ВИЧ-1 субтипа А1, на который приходилось 90,7% от 303 проанализированных сиквенсов ДНК по участку гена pol. Данный субтип передавался как парентерально при внутривенном введении наркотиков (43,2%), так и половым путем (33,7%). Средний возраст этих групп пациентов составил 33,7 и 31,4 лет соответственно;

-рекомбинантные формы ВИЧ-1 по частоте встречаемости находись на втором месте - 4,9% (15) от всех проанализированных последовательностей ДНК. Более половины случаев от всех обнаруженных рекомбинантных форм приходилось на CRF03_AB - 8 (2,6%), на CRF02_AG - 4 (1,3%), на CRF06_cpx - 2 (0,7%) и в одном случае выявлена уникальная рекомбинантная форма ВИЧ-1 между субтипами A1 и B;

- субтип В был выявлен в 9 (3%) случаях ВИЧ-1-инфекции, субтипы Cи G - в двух случаях каждый (по 0,7% каждый).



ГЛАВА 4. РЕКОМБИНАНТНЫЕ ФОРМЫ ВИЧ-1, ВЫЯВЛЕННЫЕ НА ТЕРРИТОРИИ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

На следующем этапе исследований предстояло выяснить происхождение рекомбинантных форм ВИЧ-1. Являются ли они результатом заноса из-за пределов страны, либо рекомбинантные события в геноме вируса произошли на территории Республики Беларусь.

На основании сиквенсов гена pol, а также секвенирования полноразмерного генома было выявлено 15 случаев ВИЧ-инфекции, вызванных рекомбинантными формами ВИЧ-1. Более половины всех случаев (8 из 15) приходилось на CRF03_AB, четыре случая вызваны CRF02_AG, два случая - CRF06_cpx. В одном случае выявлена уникальная рекомбинантная форма ВИЧ-1 между субтипами А1 и В, данные по выявленным рекомбинантным формам представлены в таблице 4.1.

Таблица 4.1. - Рекомбинантные формы ВИЧ-1, выявленные в Беларуси

Образец	Рекомбинантная форма	Город	Область	Путь инфицирования
FN995208	CRF02_AG	Чаусы	Могилевская	Вертикальный
Mn_59		Минск	Минская	Вертикальный
Mn_60		Минск	Минская	Половой
RES_649		Минск	Минская	Половой
Gr_3	CRF03_AB	Лида	Гродненская	Половой
Gr_8		Лида	Гродненская	Половой
Mg_8		Могилев	Могилевская	Половой
Mg_15		Осиповичи	Могилевская	Половой
MnObl_15			Минская	Половой
MnObl_61			Минская	ПИН
RES_634		Дзержинск	Минская	ПИН
98BY10443		Могилев	Могилевская	ПИН
MnObl_27	CRF06_cpx	Логойск	Минская	ПИН
MnObl_28		Логойск	Минская	ПИН
Mn_21	URF_AB	Минск	Минская	Вертикальный

Циркулирующая рекомбинантная форма CRF02_AG

Первый случай инфицирования рекомбинантной формой CRF02_AG был выявлен в 2003 г. в Могилевской области у ребенка, рожденного ВИЧ-инфицированной матерью. Материал от матери и отца ребенка в лабораторию диагностики ВИЧи сопутствующих инфекций не поступал, поэтому можно предположить, что как минимум еще два случая ВИЧ-инфекции CRF02_AGв настоящее время остаются не зарегистрированными - у матери и отца ребенка. В 2014 г. в г. Минске были выявлены еще 2 случая ВИЧ-инфекции, связанные с рекомбинантной формой CRF02_AG, - у матери 1986 г.р. и ее ребенка 2012 г.р. Последний, на начало 2016 г., случай инфицирования CRF02_AGвыявлен также в г. Минске у мужчины 1966 г.р.