Молекулярно-генетическая характеристикаCRF02_AG

Структуры геномов рекомбинантных форм CRF03_AB, выявленных на территории Беларуси, показаны на рисунке 4.1. В качестве эталонного образца использован референснойштамм IbNG (Genbank: L39106).

Как видно из рисунка 4.1, структуры геномов исследуемых образцов совпадают с референсной CRF02_AG. Все образцы содержат фрагменты субтипа G в начале гена polдлинойпорядка 1000 п.н., за которым следует фрагмент субтипаA. Стоит отметить, что из-за короткой длины нуклеотидов в начале анализируемого участка перед фрагментом субтипа GпрограммаjpHMM не всегда смогла установить, к какому субтипу принадлежат первые 40-60 нуклеотидов(таблица 4.2).

Таблица 4.2. - Координаты фрагментов субтипов исследуемых образцов CRF02_AG, полученных с помощью программы jpHMM. Координаты указаны относительно HXB2

Образец	Координа-та начала фрагмента	Неопреде-ленный участок	Интервал рекомби-нации	Координа-та конца фрагмента	Субтип
FN995208	2160	-	2206-2247	2208	A1
	2209	-	3126-3235	3197	G
	3198	-	-	3582	A1
Mn_60	2160	2160-2229	-	2229	A2
	2230	2230-2254	3199-3269	3233	G
	3234	-	-	3582	A1
Mn_59	2160	2160-2212	-	2212	K
	2213	2213-2221	3127-3268	3194	G
	3195	-	-	3582	A1
RES_649	2160	2160-2208	-	2208	A1
	2209	2209-2221	3208-3284	3209	G
	3210	-	-	3582	A1

Для сравнительного анализа между собой и консенсусным сиквенсом CRF02_AGIbNGчетыресиквенса были объединены в один алаймент относительно IbNG и выравнены по длине.Длина алаймента составила 1422 нуклеотида, из которых 1212(85,2%)былиидентичнымиреференсу сайта.Попарная идентичность (pairwise identity) между сиквенсами составила 93,1%.геном вирус иммунодефицит кровь

Для установления происхождения рекомбинантной формы CRF02_AG методом филогенетического анализа был осуществлен поиск 10 генетически близких сиквенсов с применением программы BLAST для каждого из исследуемых образцов, при этом их сиквенсы были укорочены до 1011 п.н. После удаления повторяющихся референсов создали алаймент, содержащий 39 референсных последовательностей и четыре исследуемых образца. Длина алаймента составила 1011 п.н.

Как видно из данных, представленных на рисунке 4.3, на филогенетическом дереве исследуемые образцы образовали 3 независимых достоверных кластера, что говорит о трех разных событиях заноса данной рекомбинантной формы на территорию Беларуси.Образец RES_649 сформировал кластер с референсами из Нигерии, Буркина-Фасо, Сенегала и Великобритании (рисунок 4.3, кластер 1). Топология таксонов внутри данного кластера указывает на то, что сиквенсы RES_649 и 66051 из Великобритании произошли от референса ORAV232 из Буркина-Фасо, однако значение SH-aLRTэтой группы сиквенсов составляет всего 0,789, поэтому с уверенностью данное предположение утверждать нельзя. Если обратиться к географии данных стран, то можно обнаружить, что Нигерия, Буркина-Фасо и Сенегал географически расположены рядом, на северо-западе африканского континента, а принимая во внимание, что значение SH-aLRTкластера 1 составляет 0,946, можно утверждать, что образец RES_649 был занесен на территорию Беларуси с северо-запада африканского континента.

Что касается референса из Великобритании, то эпидемические данные в Genbankпо данному сиквенсу отсутствуют и, вероятнее всего, сиквенс был получен из образца крови, взятого у мигранта с африканского континента.

Образец FN995208 на филогенетическом дереве сформировалидостоверный кластер с референсами из Камеруна(рисунок 4.3, кластер 2), значение SH-aLRTсоставило0,966. В данный кластер также входит один референс из Демократической Республики Конго. По результатам филогенетического анализа можно достоверно утверждать, что FN995208 имеет «африканского» предка из Камеруна и не связан с рекомбинантными формами A/G, получившими распространение на территории стран бывшего СССР.

Образцы Mn_59 и Mn_60 находятся в кластере, сформированномреференсными сиквенсами ВИЧ-1 из Узбекистана(рисунок 4.3, кластер 3), которые, в свою очередь, были изолированы и секвенированы от ВИЧ-инфицированных пациентов, вовлеченных во вспышку в этой стране, связанной с Западно-Африканской рекомбинантной формой CRF02_AG [197]. Кластрирование образцов Mn_59 и Mn_60 с данными референсами достоверно указывает на то, что данный вирус был занесен в Беларусь с территории Узбекистана. Кроме этого,изоляты Mn_59 и Mn_60 образуют кластер между собой со значением SH-aLRT - 0,998, патристическая дистанция между этими образцами составляет всего 0,005, что свидетельствует об их крайне высокой генетической гомогенности и происхождении из одного источника. Результаты филогенетического анализа подтверждают и эпидемиологические данные, что ребенок,Mn_59, был рожден своей ВИЧ-инфицированной матерью, Mn_60.

Циркулирующая рекомбинантная форма CRF03_AB

Впервые CRF03_AB на территории Беларуси была идентифицирована в 2000 г. Данный образец получили от ВИЧ-инфицированного пациента из г. Могилева, который заразился парентеральным путем в г. Калининграде, Россия. Первоначально данный образец был идентифицирован как ВИЧ-1 субтипа B, однако дальнейшие исследования А. Е. Машарского совместно с В. Ф. Ереминым достоверно показали, что образец 98BY10443 представляет собой рекомбинантную форму ВИЧ-1 CRF03_AB [182].Другой случай, связанный с рекомбинантной формой CRF03_AB, был выявлен в 2008 г. в г. Жодино Минской области у пациента 33 лет. Данный случай также был связан с внутривенным употреблением наркотиков. В 2010 г. выявлено сразу 4 случая инфицирования CRF03_AB, и все были обусловлены половым путем передачи вируса. Два из этих случаев были выявлены в г. Лиде Гродненской области - у мужчины 29 лет и женщины 27 лет, один случай выявили в г. Любани Минской области у женщины 29 лет и еще один- в г. Бобруйске Могилевской области, так же у женщины в возрасте 31 года. В 2013 г.CRF03 была выявлена у 41-летней женщины из г. Осиповичи Могилевской обл., и последний случай инфицирования CRF03_ABвыявлен в августе 2015 г. у 38-летнего мужчины из г. Дзержинска Минской области.

Молекулярно-генетическая характеристика CRF03_AB

Структура геномов рекомбинантных форм CRF03_AB, выявленных на территории Беларуси, показана на рисунке 4.4. Координаты точек рекомбинации получены с помощью программы jpHMM, в качестве референсногообразца использован штамм Kal153 (Genbank: AF193276).

Как видно из рисунка 4.4, все выявленные на территории Беларуси CRF03_AB имели структуру, идентичную референсному штаммуKal153, полученному от пациента, проживавшего в г. Калининграде, Россия. Координаты точек рекомбинации у всех образцов находились в диапазоне координат 2667-2773, у референсного штаммаKal153 - в точке с координатой 2688, относительно HXB2. Не было выявлено вставок фрагментов геномов других субтипов ВИЧ-1.Координаты фрагментов субтипов исследуемых образцов CRF03_AB, полученных с помощью программы jpHMM приведены в таблице 4.3.

Таблица 4.3 - Координаты фрагментов субтипов исследуемых образцов CRF03_AB, полученных с помощью программы jpHMM. Координаты указаны относительно HXB2

Образец	Координата начала фрагмента	Интервал рекомбинации	Координата конца фрагмента	Субтип
98BY10443	2160	2670-2733	2687	A1
	2688	-	3583	B
RES_634	2160	2670-2733	2687	A1
	2688	-	3521	B
MnObl_15	2160	2670-2733	2687	A1
	2688	-	3521	B
Gr_8	2160	2667-2732	2668	A1
	2669	-	3521	B
Gr_3	2160	2667-2732	2668	A1
	2669	-	3521	B
Mg_8	2160	2670-2733	2687	A1
	2688	-	3521	B
Mg_15	2160	2671-2778	2744	A1
	2745	-	3521	B
MnObl_61	2160	2667-2752	2702	A1
	2703	-	3521	B

Для сравнительного анализа между собой и консенсусным сиквенсом CRF03_ABKal153все сиквенсы были объединены в один алаймент относительно Kal153и выравнены по длине. Длина алаймента составила 1437 нуклеотидов, из которых 1258 (87,5%) являлись идентичными сайту референса. Попарная идентичность (pairwise identity) между сиквенсами составила 96,4% (рисунок 4.5).

Определение направлений заноса и распространения CRF03_AB на территории Беларуси

Для определения направления заносов и распространения вируса на территории Беларуси путем поиска наиболее оптимального числа референсов для филогенетического анализа по результатам поиска методом BLAST были получены 25 референсных последовательностей ВИЧ-1 по участку гена pol. Длина алаймента вместе с исследуемыми образцами составила 1029 п.н., в референс-изоляте DQ328559 из Азербайджана 17 недостающих нуклеотидов 3'-конца были заменены на «N» с целью сохранения генетической информации в алайменте. Результаты филогенетического анализа рекомбинантной формы CRF03_AB представлены на рисунке 4.6.

На филогенетическом дереве не было выявлено ни одного достоверного кластера, сформированного как исследуемыми образцами, так и референсными последовательностями ВИЧ, со значением SH-aLRT0,9. Два кластера со значением SH-aLRT 0,996 и 1 были сформированы исследуемыми образцами из Беларуси - Gr_3/Gr_8 и MnObl_15/Mg_8 соответственно. Это достоверно указывает на одного общего предка для каждой пары в кластере и на внутреннее распространении CRF03_AB на территории Беларуси. Отсутствие связей остальных исследуемых образцов между собой говорит об их независимом проникновении на территорию страны. Таким образом, рекомбинантная форма CRF03_AB была занесена в результате пяти независимых событий, два из которых привели к передаче вируса уже на территории Беларуси.

Достоверно установить пути заноса циркулирующей рекомбинантной формы CRF03_ABна территорию Беларуси не удалось. Вероятно, это связано с лимитом референс-сиквенсов CRF03_ABв Genbankи HIVSequenceDatabase по участку гена pol. Проведенный анализ сиквенсов в HIVsequencedatabase показал, что общее количество референсных сиквенсов CRF03_AB составило 366, однако большинство данных сиквенсов относилось к фрагментам генов ВИЧ-1 gag (100) и env(172)(рисунок 4.7).

По гену gagпрактическивсе найденные референсы, обозначенные в базах данных как CRF02_AG, оказались из Литвы (75) и Беларуси (21), обладающие крайне низкой генетической разнородностью. Стоит также отметить, что в базах данных субтипы сиквенсов не всегда установлены верно. Так, при поиске референсных сиквенсов для филогенетического анализа исследуемых CRF03_ABбыли найдены сиквенсы, которые обозначили как субтип B. Однако в ходе определения структурыгеномов данных референсных сиквенсов установлено, что они являются CRF03_AB.

По фрагменту gp120 гена envдлина референсов максимально достигала 378 п.н., а алаймент из всех референсов для данного сегмента генома составил всего 225 п.н., что не достаточно для установления достоверных филогенетических связей между вирусами.

Стоит обратить внимание на патристические дистанции между образцами Gr_3/Gr_8 и MnObl_15/Mg_8. Так, дистанция между Gr_3 и Gr_8 составила 0,002, в то время как между MnObl_15 и Mg_8 - 0,034, кроме того, между MnObl_15 и Mg_8 не обнаружено никаких эпидемиологических связей. Все это дает основание утверждать, что в Беларуси циркулирует еще как минимум один вариант CRF03_AB, генетически близкий к сиквенсам и, вероятно, имеющий эпидемические связи с образцами MnObl_15 и Mg_8.

Как было отмечено в данном разделе, субтип ВИЧ-1 уреференсных сиквенсов установлен не всегда верно. Все найденные референсные сиквенсы в данном исследовании являются CRF03_AB.Однако, как видно на филогенетическом дереве(рисунок 4.6),в базы данных многие из них загружены как ВИЧ-1субтипаB.

Циркулирующая рекомбинантная форма CRF06_cpx

Два случая инфицирования рекомбинантной формойCRF06_cpxвыявлены в 2008 г. у близких родственников, брата и сестры - 28 и 30 лет соответственно, проживавших в г. Логойске Минской области.Оба пациента, MnObl_27 и MnObl_28, были инфицированы парентеральным путем.

Молекулярно-генетическаяхарактеристикаCRF06_cpx

Для сравнения структуры геномов выявленных CRF06_cpx был взят референсный штамм BFP90 (Genbank: AF064699). Координаты рекомбинаций образцов MnObl_26, MnObl_27 и BFP90 получены с помощью программы jpHMM. Дополнительно структура генома BFP90, установленная в 2002 г., была взята из HIV sequence database (BFP90*). Структуры геномов данных сиквенсов показаны на рисунке 4.8. Программа jpHMMпоказала, что в структуре генома образца MnObl_26 содержатся фрагменты геномов ВИЧ-1 субтипов G, Bи C. Образец MnObl_27 содержит фрагменты геномов ВИЧ-1 субтипов Gи C, как и у референсного сиквенса BFP90, и не содержит фрагментов субтипа B. Стоит отметить, что часть геномов у всех образцов является неопределяемой (N/A), то естьв данном участке генома программа не смогла установить родительский субтип ВИЧ.

Дополнительно был проведен сравнительный анализ нуклеотидных и их транслированных аминокислотных последовательностей образцов MnObl_26 и MnObl_27 cреференсными сиквенсами, полученными с помощью программы BLASTдля филогенетического анализа. Замечено, что генетической особенностью выявленных рекомбинантных форм CRF06_cpx, а также CRF06_cpx, получивших распространение в Эстонии, является инсерция аминокислот серина или аспарагина в положении 38 гена polВИЧ-1 по сравнению с другими референсными сиквенсами CRF06_cpx(рисунок 4.9).

Определение направлений заноса и распространения CRF06_cpxна территории Беларуси

Для проведения филогенетического анализа выявленных на территории Беларуси двух CRF06_cpx с помощью программы BLASTосуществлен поиск 20 генетически близких референсных сиквенсов для каждого из исследуемых образцов. После удаления повторяющихся все сиквенсы были объединены в алаймент, содержащий 19референс-сиквенсов и 2 выявленных CRF06_cpx. Длина алаймента составила 1417 п.н. Результат филогенетического анализа показан на рисунке 4.10.

Как видно изрисунка 4.10, исследуемые образцы MnObl_27 и MnObl_28 сформировали кластерс референсными сиквенсами из Эстонии, значение SH-aLRTкластера составило 1. Кроме этого, оба исследуемых образца сформировали субкластер между собой, значение SHкоторого 0,904, что свидетельствует об одном источнике их происхождения. Таким образом, по результатам филогенетического анализа, занос CRF06_cpxна территорию Беларуси следует считать единичным событием. Дальнейшей передачи вируса внутри страны в ходе молекулярно-эпидемиологического скринига выявлено не было.

Мутации резистентности и чувствительность к АРП
выявленных рекомбинантных форм ВИЧ-1

Путем анализа нуклеотидных последовательностей участка гена pol исследуемые образцы были проанализированы на наличие мутаций резистентности и чувствительности к трем группам АРП: ИП, НИОТ и ННИОТ.

Мутации резистентности к АРП

Среди 15 рекомбинантных форм ВИЧ-1 мутации резистентности выявлены у 7 образцов(таблица 4.4).

Таблица 4.4. - Мутации резистентности к АРП, выявленные в рекомбинантных формах ВИЧ-1 на территории Беларуси

Имя	Рекомбинантная форма	Мутации кИП	МутациикНИОТ	Мутации кННИОТ
RES_649	CRF02_AG	M46I, L76V L10V, K20I	M41L, D67E, V75M, M184V, L210W, T215Y	V90I, K103N, E138Q, K238T
98BY10443	CRF03_AB	-	-	-
FN995208	CRF02_AG	L10I, K20I*	M41L, D67N, T69N, K70R, V75M, M184V, T215F, K219Q	K103S, G190A
Mn_59	CRF02_AG	K20I*	-	-
Mn_60	CRF02_AG	K20I*	-	-
Gr_8	CRF03_AB	-	-	-
Mg_8	CRF03_AB	-	-	-
MnObl_15	CRF03_AB	-	-	-
RES_634	CRF03_AB	-	M184V	-
Gr_3	CRF03_AB	-	-	-
MnObl_61	CRF03_AB	L10LV	-	K103S, G190A
Mg_15	CRF03_AB	T74S	-	K103N, V179T, G190A
MnObl_27	CRF06_cpx	K20I*	M184V	K103N
MnObl_28	CRF06_cpx	K20I*	-	K103N, K238T
Mn_21	URF_AB	-	-	-

* K20I - не является мутацией резистентности у ВИЧ-1 субтипа G и рекомбинантных формах, содержащих фрагмент ВИЧ-1 G в сегменте, кодирующем протеазу, поскольку изолейцин (I) - консенсусная аминокислота в данном положении.

Образец RES_649содержал мутации резистентности ко всем трем группам АРП. Мутации ИП M46I, L76V привели к высокому уровню резистентности к фосампренавиру, к индинавиру, лопинавиру и нелфинавиру выявлен средний уровень резистентности и низкий - к дарунавиру. Мутации M41L, D67E, V75M, M184V, L210W, T215Y привели к высокому уровню резистентности ко всем препаратам группы НИОТ, а мутации V90I, K103N, E138Q, K238T - к различному уровню резистентности ко всем препаратам группы ННИОТ. Так, к препаратам эфавиренцу и невирапину выявлен высокий уровень резистентности, к рилпивирину - низкий уровень, к этравирину - потенциальный низкий уровень резистентности.

В геноме изолята FN995208 не было выявлено мутаций резистентности высокого уровня к ИП. Мутации M184V, K103S и G190A, определенные в участке гена pol, кодирующем фермент обратную транскриптазу, ведут к высокому уровню резистентности ко всем ингибиторам обратной транскриптазы, за исключением двух ННИОТ: этравирина и рилпивирина, к которым наблюдается низкий уровень устойчивости вируса. Таким образом, для данного пациента была необходима корректировка схемы лечения с включением других групп препаратов, таких как ингибиторы интегразы и/или ингибиторы слияния ВИЧ.

Изолят MnObl_27 оказался чувствителен ко всем препаратам из класса ИП, а также к зидовудину, ставудину и тенофовиру (НИОТ) и этравирину и рилпивирину (ННИОТ), но имел мутацию высокого уровня в положении M184V,ведущую к устойчивости к ламивудину и эмтрицитабину (НИОТ) и мутацию в положении K103N, ведущую к устойчивости к невирапину, делавирдину и эфавиренцу (ННИОТ).

MnObl_28 содержал 2 мутации, обе из которых привели к высокому уровню резистентности к препаратам ННИОТ эфавиренцу, делавирдину и невирапину.

Изолят RES_634 содержал только мутацию в положении M184V, которая приводит к высокому уровню резистентности к ламивудину и эмтрицитабину.

Высокий уровень резистентности к эфавиренцу/невирапину и низкий - к этравирину/рилпивирину группы ННИОТ, связанный с мутациями в положенииK103S и G190A,выявлен у изолята MnObl_61. К препаратам групп ИП и НИОТ данный изолят чувствителен.

В геноме изолята Mg_15 наблюдается такой же уровень резистентности к ННИОТ, связанный с мутациями K103N и G190A, как и у изолята MnObl_61, кроме этого, наличие мутации T74S в участке, кодирующем протеазу, приводит к низкому уровню резистентности к нелфинавиру.

Таким образом, в исследуемых образцах, за исключением RES_649, не наблюдается высокого уровня резистентности к препаратам ИП. Среди мутаций резистентности к НИОТ у всех резистентных форм выявляется мутация M184I, которая встречается у 64,4% пациентов с резистентностью к НИОТ в Беларуси. У двух пациентовRES_649 и FN995208 (CRF02_AG) диагностирована резистентность ко всем препаратам группы ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ. У всех пациентов, резистентных к ННИОТ и инфицированных ЦРФ ВИЧ, встречается мутация K103N/S, которая выявляетя в 45% случаев всех резистентных к ННИОТ пациентов в Беларуси.

Чувствительностьк АРП

Чувствительность исследуемых рекомбинантных форм к АРПгрупп ИП, НИОТ и ННИОТ указана в таблице 4.5.

Уровень чувствительности/резистентности к АРП определялся путем сравнения аминокислотных последовательностей исследуемого образца и дикого штамма ВИЧс известным уровнем чувствительности к АРП. Различают пять степеней резистентности к АРП.

Чувствителен - нет признаков снижения чувствительности к ВААРТ по сравнению с диким типом вируса.

Потенциальный низкий уровень резистентности - вирус, вероятно, полностью чувствителен к АРП, однако геном содержит мутации, которые могут указывать на предыдущие воздействия АРП.

Низкий уровень резистентности - вирус содержит мутации, которые могут приводить к снижению чувствительности вируса к АРП в условиях invitroи/или у пациентов при наличии таких мутаций может быть не оптимальный вирусологический ответ на лечение ВААРТ.

Средний уровень резистентности - чувствительность вируса к АРП ниже, чем при низком уровне резистентности, однако выше, чем при высоком уровне резистентности. АРП, к которым вирус имеет средний уровень резистентности, следует применять только в том случае, если АРП имеют высокий генетический барьер к резистентности (напр., некоторые ингибиторы в комбинации с ритонавиром) или при лимите других АРП.

Высокий уровень резистентности - мутации, выявляемые в сиквенсе вируса аналогичны тем, которые наблюдаются у вирусов с наиболее высоким уровнем лекарственной устойчивости invitro. Клинические данные показывают, что у пациентов, инфицированных вирусами, имеющими такие мутации, как правило, низкий уровень ответа или вообще нет вирусологического ответа на лечение АРП.

Таблица 4.5. - Уровень чувствительности выявленных рекомбинантных форм ВИЧ-1 к АРП

URFMos

98BY10443

RES 634

Mn Obl 15

Gr 8

Gr 3

Mg 8

Mg 15

Mn Obl 61

FN995208

Mn 60

Mn 59

RES 649

Mn Obl 27

Mn Obl 28

ИП

atazanavir/r (ATV/r)

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

darunavir/r (DRV/r)

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

LLR

S

S

fosamprenavir/r (FPV/r)

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

HLR

S

S

indinavir/r (IDV/r)

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

IR

S

S

lopinavir/r (LPV/r)

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

IR

S

S

nelfinavir (NFV)

S

S

S

S

S

S

S

LLR

LLR

PLLR*

PLLR*

PLLR*

IR

PLLR*

PLLR*

saquinavir/r (SQV/r)

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

tipranavir/r (TPV/r)

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

НИОТ

lamivudine (3TC)

S

S

HLR

S

S

S

S

S

S

HLR

S

S

HLR

HLR

S

abacavir (ABC)

S

S

LLR

S

S

S

S

S

S

HLR

S

S

HLR

LLR

S

zidovudine (AZT)

S

S

S

S

S

S

S

S

S

HLR

S

S

HLR

S

S

stavudine (D4T)

S

S

S

S

S

S

S

S

S

HLR

S

S

HLR

S

S

didanosine (DDI)

S

S

PLLR

S

S

S

S

S

S

HLR

S

S

HLR

PLLR

S

emtricitabine (FTC)

S

S

HLR

S

S

S

S

S

S

HLR

S

S

HLR

HLR

S

tenofovir (TDF)

S

S

S

S

S

S

S

S

S

HLR

S

S

HLR

S

S

ННИОТ

efavirenz (EFV)

S

S

S

S

S

S

S

HLR

HLR

HLR

S

S

HLR

HLR

HLR

etravirine (ETR)

S

S

S

S

S

S

S

LLR

LLR

LLR

S

S

PLLR

S

S

nevirapine (NVP)

S

S

S

S

S

S

S

HLR

HLR

HLR

S

S

HLR

HLR

HLR

rilpivirine (RPV)

S

S

S

S

S

S

S

LLR

LLR

LLR

S

S

LLR

S

S

Обозначения:

S Susceptible Чувствителен

PLLR Potential low-level resistance Потенциальный низкий уровень резистентности

LLR Low-level resistance Низкий уровень резистентности

IR Intermediate resistance Средний уровень резистентности

HLR High-level resistance Высокий уровень резистентности

* В данном случае нет снижения уровня резистентности, поскольку снижение чувствительности в этом случае обусловлено заменой аминокислот Kна Iв положении 20 (мутация K20I), однако в геноме ВИЧ-1 субтипа G и рекомбинантных формах, содержащих фрагмент генома ВИЧ-1 субтипа Gв сегменте, кодирующем протеазу,изолейцин (I) является консенсусной аминокислотой в данном положении.

Таким образом, на основании проведенных в данной главе исследований можно сделать следующие выводы:

- у пациентов с ВИЧ/СПИД, проживающих на территории Республики Беларусь, среди рекомбинантных форм ВИЧ-1 наиболее часто (53,3%) встречается CRF03_AB;

- методом филогенетического анализа установлено шесть независимых событий заносаCRF03_AB на территорию Беларуси, два из которых привели к дальнейшему распространению данной рекомбинантной формыВИЧ-1 уже на территории страны. Первых два случая ВИЧ-инфекции CRF03_AB были связаны с потреблением инъекционных наркотиков на начальном этапе эпидемии ВИЧ-1 в 1996-1997 гг. (образцы 98BY10443 и MnObl_61). Последующие случаи инфицирования CRF03_AB обусловлены гетеросексуальным путем передачи;

- отсутствие достоверных кластеров с тремя и более таксонами при филогенетическом анализе CRF03_AB свидетельствует о не связанных между собой событий заноса вируса на территорию страны, не приведших к локальным вспышкам ВИЧ-инфекции. Два выявленных случая CRF_03ABв г. Лиде были связаны с умышленным случаем гетеросексуальной передачи вируса ВИЧ-инфицированным партнером;

-в четырех случаях (26,7%) ВИЧ-инфекции, вызванной рекомбинантными формами,выявлена CRF02_AG.Методом филогенетического анализа установлено три независимых события заноса данной ЦРФ на территорию страны: в двух случаях CRF02_AGбыла занесена в Беларусь с территории Западной Африки (образцы FN995208 и RES_649), в одном случае (Mn_59 и Mn_60, ВИЧ-инфицированные мать и ее ребенок) CRF02_AG- с территории Узбекистана;

- в двух случаях ВИЧ-инфекции рекомбинантными формами (13,3%) выявлена CRF06_cpx. Методом филогенетического анализа установлено, что CRF06_cpxбыла занесена на территорию Беларуси из Эстонии из среды потребителей инъекционных наркотиков;

- анализ генома на наличие мутаций, приводящих к лекарственной резистентности, показал, что в большинстве случаев резистентность возникает к ингибиторам обратной транскриптазы ВИЧ. Среди мутаций резистентности к НИОТ во всех случаях выявляется мутация M184V, ведущая к устойчивости к ламивудину и эмтрицитабину. Кроме этого, выявлена ЦРФ (RES_649), имеющая высокий уровень резистентности ко всем трем группам препаратов.



ГЛАВА 5. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА УНИКАЛЬНОЙ РЕКОМБИНАНТНОЙ ФОРМЫ ВИЧ-1 MOS

В результате проведенных исследований по генотипированию и филогенетическому анализуобнаружена новая уникальная рекомбинантная форма ВИЧ-1 (изолят Mos), имеющая в составе генома вставки последовательностей субтипов А1 и В вируса, но отличающаяся от известной циркулирующей рекомбинантной формы CRF03_AB. На описанную автором уникальную рекомбинантную форму - изолят Mos- получен патент № 18124, начало действия - 29.04.2011.

Молекулярно-генетическая характеристика УРФMos по участкам генов gag, polиenv

В 2010 г. в лабораторию диагностики ВИЧи сопутствующих инфекций из дома ребенка от девочки 6 лет, находящейся на ВААРТ, поступил образец крови для определения мутаций резистентности ВИЧ-1 к АРП.

При определении субтипа ВИЧ-1 методом филогенетического анализа сегмента гена pol образец кластрировался с субтипом А1, но отличался от других анализируемых образцов консенсуса IDU-A(AFSU) и референс-последовательности (AF004885). Среднее значение p-дистанций между референсными сиквенсами субтипа А1 из России, Украины, консенсусом IDU-Aи изолятом Mosсоставило 0,068, в то время как между референсными сиквенсами субтипа В - 0,094. По сегменту гена polизолят Mosбыл наиболее близок к референсу AF413987 (субтип А1 из Украины), p-дистанция составила 0,066(рисунок 5.1, А).

Анализ участка p17/p24гена gag показал, что средниеp-дистанции по данному участку с референсами субтипа А1 составили 0,129, в то время как с референсами субтипа В - 0,075(рисунок 5.1, Б).Эволюционная дистанция по сегменту гена env между ВИЧ-1 Mos и референс-последовательностями CRF03_AB (AF414006, Беларусь и AF193276.1, Россия, Калининград) составила 0,121, в то время как между самими референс-последовательностями - 0,013. По этому же сегменту средние p-дистанции между ВИЧ-1 Mos и референс-последовательностями ВИЧ-1 субтипов А1 и В составили 0,155 и 0,323 соответственно(рисунок 5.1, В).

Таким образом, изолят Mosбыл отнесен к уникальной рекомбинантной форме ВИЧ-1 со структурой BgagApolAenv. Сиквенсы сегментов генов gag, pol и env данной рекомбинантной формы были загружены в EMBL/Genbank/DDBJ под номерами FR775442.1, FN995656.1 и FR775443.1 соответственно.

Структура полноразмерного геномаУРФMos

Для установления точной структуры уникальной рекомбинантной формы ВИЧ-1 Mos и выявления точек разрыва генома была получена последовательность нуклеотидов полноразмерного генома данного изолята. Амплифицированныйфрагмент, равный 8968 п.н., охватывает последовательности, кодирующие все белки ВИЧ-1 и частично LTR. Координаты относительно референс-типа ВИЧ-1 HXB2 соответствовали последовательностям 556-9517.

С использованием программы jpHMMустановлены структура генома и координаты рекомбинационных событий изолята Mos.Геном уникальной рекомбинантной формы ВИЧ-1 Mos представляет собой ВИЧ-1 субтипа А1 со встроенными в четырех местах сегментами генома ВИЧ-1 субтипа В, встраивание фрагментов ВИЧ-1 субтипаВ произошло в структурных генах gag и pol(рисунок 5.2).

Доминирующим в структуре генома Mosявляется ВИЧ-1 субтипа А1, занимающий порядка 80% генома - 7214 п.н. На долю ВИЧ-1 субтипа В приходится около 20% - 1965 п.н.

Сравнительный анализ генома Mosс уже известной рекомбинантной формой CRF03_ABпоказал, что Mosне является результатом рекомбинации с CRF03_AB, и в геноме Mosотсутствуют фрагменты данной ЦРФ. Об этом свидетельствуют различные структуры геномов рекомбинантных форм и не совпадение ни одной из точек разрыва генома, показанные на рисунке 5.3.Так, у рекомбинантной формы CRF03_AB первая точка рекомбинациинаходится в координате 2688 относительно HXB2, в то время как у УРФMosв данном участке генома находится сегмент субтипа А1, координаты которого 2449±7 ? 2990±41, что исключает совпадение рекомбинационных точек в этом участке генома. Вторая координата рекомбинации у CRF03_AB - переход генома ВИЧ-1 субтипа Bв субтип А1 - находится в точке с координатой 8650. В геноме УРФ Mosсегмент субтипа A1на 3'-конце начинается в координатах 4819±70. Таким образом, геном УРФ Mos является результатом рекомбинации геномов ВИЧ-1 «чистых» субтипов A1и B и не содержит фрагмента генома CRF03_AB.

Происхождение УРФ Mos

С целью определения происхождения уникальной рекомбинантной формы, ее геном был разделен на 9 сегментов, относящихся к различным субтипам ВИЧ-1 (рисунок 5.4), согласно координатам точек разрыва генома(таблица 5.1).

Таблица 5.1. - Координаты сегментов изолята Mos, их размер и соответствующий субтип ВИЧ-1. Координаты указаны относительно референсного сиквенса HXB2

Сегмент	Координата	Длина сегмента, п.н.	Субтип ВИЧ-1
A_1	556-994	438	A1
B_2	995-1813	818	B
A_3	1814-2174	360	A1
B_4	2175-2443	268	B
A_5	2444-2975	531	A1
B_6	2976-3185	209	B
A_7	3186-4205	1019	A1
B_8	4206-4806	600	B
A_9	6225-8795	2570	A1

Первым этапом наших исследований являлось определение участков генома Mos, наиболее подходящих для поиска референсов и проведения филогенетического анализа. С этой целью был применен поиск с помощью программы BLAST для выявления географического распределения генетически близких изолятов. Как показали результаты поиска, все найденные референсы ВИЧ-1 с совпадением нуклеотидов не менее 98% относились к странам бывшего СССР. Следующим шагом стало определение участков, наиболее подходящих для филогенетического анализа. Критерием отбора являлось наличие наибольшего количества референсов для конкретного исследуемого сегмента. С этой целью были загружены все имеющиеся в базе данных Genbank референс-последовательности ВИЧ-1 субтипов А1 (4476 сиквенсов) и В (479 сиквенсов), с которыми построено два алаймента относительно УРФ Mos. Визуализация алаймента помогла определить, какие сегменты изолята Mosнаиболее целесообразно использовать для филогенетического анализа(рисунок 5.5).

Изрисунка 5.5 видно, что наибольшее количество референсов ВИЧ-1 обоих субтипов, А1и B, имеется для фрагмента гена pol, кодирующего протеазу и часть обратной транскриптазы ВИЧ. Это соответствует сегментам А5, небольшой части сегмента А9,B4 и B6 генома Mos. Ввиду того, что для анализа сегментов субтипа Вреференсов оказалось почти в 10 раз меньше, чем для субтипа А1 (286 и 2530 соответственно), для анализа был взятсегментB8 субтипа B - от начала участка, кодирующего интегразу ВИЧ-1 (таблица 5.2). Сегмент B6 был исключен из анализа, поскольку референсы для филогенетического анализа, найденные с помощью BLAST, оказались идентичными, как для сегмента B4.

Таблица 5.2. - Сегменты изолята Mos, их длина, координаты относительнореференс-типа ВИЧ-1 HXB2 и субтип ВИЧ, к которому сегмент относится, взятые для филогенетического анализа

Сегмент	Длина, п.н.	Координата	Субтип ВИЧ
А5	548	2445 > 2992	A1
А9	575	6856 > 7438	A1
В2	844	995 > 1838	B
В4	301	2156 > 2456	B
В8	545	4230 > 4774	B

Для построения филогенетических деревьев с исследуемыми сегментами с помощью BLASTбыл произведен повторный поиск 20наиболее генетически близких референс-последовательностей ВИЧ-1 для сегментов А5, А9, В2, В4 и В8. Готовые алайменты с субтип-референсами ВИЧ-1, включая рекомбинантные формы, получены из базы данных LosAlamosHIVSequenceDatabase. Все сиквенсы были выравнены и отредактированы вручную. Референс-сиквенсы группы Pудалены из алайментов.Референс-субтипы ВИЧ, а также некоторые кластеры сгруппированы для более наглядного изображения филогенетического дерева.

Филогенетический анализ сегментов генома субтипа A1

Алаймент сиквенсов ВИЧ-1 для филогенетического анализа сегмента А1 изолята Mosсодержал 171 сиквенс, длина которого составила 548 п.н. На основании алаймента было построено ML-филогенетическое дерево, показанное на рисунке 5.6.

Как видно из данных, представленных на филогенетическом дереве на рисунке 5.7,референсные сиквенсы, полученные встранах бывшего СССР, сформировали кластер, значение SH-aLRT которого составило 0,986. Исследуемый фрагмент Mos_A5 располагался внутри данного кластера, однако не формировал субкластер ни с одним из референсов.



Все референсные сиквенсы, найденные с помощью программы BLAST, сформировали большой кластер с высоким уровнем генетической гомогенности, значение SH-aLRTкластера составило 0,996. Исследуемый фрагмент изолята Mosнаходился внутри данного кластера, однако субкластер одним из референсных сиквенсов выявлен не был. Высокое значение SH-aLRT кластера с референсными сиквенсами, в основном из стран бывшего СССР, свидетельствует о том, что данные сиквенсы являются вариантами ВИЧ-1 AFSU, к которому относится и исследуемый сегмент генома изолята Mos.

Таким образом, по результатам филогенетического анализа двухсегментов генома, относящихся к субтипу А1 ВИЧ-1, не было найдено генетически близких референсных сиквенсов ВИЧ, с которыми изолят Mosсформировал кластер со значением SH-aLRT ?0,85. На основании результатов анализа невозможно сказать, принадлежат ли фрагменты генома, относящиеся к субтипу А1, к штаммам, циркулирующим на территории Республики Беларусь. Достоверно можно утверждать, что сегменты субтипа А1 в геноме УРФ Mosпринадлежат варианту ВИЧ-1 AFSU, распространенному на территории стран бывшего СССР.

Филогенетический анализ сегментов генома субтипа B

По результатам филогенетического анализа сегмента B2 генома Mosустановлена достоверная генетическая близость с референсными сиквенсами из Грузии (98GEMZ003), России (11RU21n)и США (E6574TOB8U), которые сформировали кластер со значением SH-aLRT - 0,999(рисунок 5.8).

Анализ сегмента B4 выявил генетическую близость с референсными сиквенсами из Грузии, России, Беларуси и группы референсов из Таиланда (сгруппированы на филогенетическом дереве) и формировал с ними кластер (выделен синим), значение SH-aLRT которого составило 0,942(рисунок 5.9).

В ходе филогенетического анализа установлено, что сегментB8изолята Mosсформировал кластер с референсными сиквенсами, представляющими рекомбинантную формуCRF03_ABиз Калининграда (KAL153_2), России (RU9800), Беларуси (98BY10443), а также с сиквенсами «чистого» субтипа B из США (E6574TOB8U) и Грузии (98GEMZ003)(рисунок 5.10). Значение SH-aLRTкластера с образцом Mosсоставило 0,979.

По результатам филогенетического анализа сегментов субтипа B изолята Mosнайдены генетически близкие сиквенсы изГрузии98GEMZ003 и России11RU21n.С референсом из США E6574TOB8U исследуемые сегменты кластрировались при анализе сегментов B2 и B8, а при анализе сегмента B4 выявлены также генетически близкие референсы из Беларуси и Таиланда.

Какие-либо эпидемиологические данные по референсам из США (E6574TOB8U, Genbank: GQ371853, GU728194) и России (11RU21n, Genbank: JX500708) в базе данных Genbankотсутствуют. Про референс 98GEMZ003 в Genbank (DQ207943) указано, что данный пациент, вероятно, инфицирован на Украине на раннем этапе эпидемии ВИЧ-1 в бывшем СССР (год сбора образца - 1998).

Стоит обратить внимание на размеры генетически близких референсных сиквенсов ВИЧ, найденных методом филогенетического анализа. Так, сиквенсы 98GEMZ003, E6574TOB8U и 11RU21n представляют собой полноразмерные геномы ВИЧ-1 субтипа B, сиквенсы KAL153_2 и 98BY10443 являются полноразмерными сиквенсами ЦРФ CRF03_AB, а сиквенс Mn_9 и группа сиквенсов из Таиланда содержат только последовательно относящиеся лишь к фрагменту гена pol, кодирующего протеазу и часть обратной транскриптазы ВИЧ.С референсными сиквенсами98GEMZ003 и 11RU21n участки генома Mosобразуют кластеры при филогенетическом анализе всех трех исследуемых фрагментов субтипа B, в то время как с референсом E6574TOB8U кластеры были образованы только по сегментам B2 и B8, кодирующимp17/p24 гена gagи интегразу гена pol соответственно. При этом не было обнаружено генетической близости с E6574TOB8U в участке гена pol, кодирующего протеазу ВИЧ.

Таким образом, по результатам филогенетического анализа сегментов, относящихся к субтипу BВИЧ, выявлено только два референсных сиквенса, имеющих генетическую близость c Mosна протяжении всего исследуемого генома -98GEMZ003 и 11RU21n. Однако принимая во внимание, что два этих сиквенса были получены от пациентов, проживающих в разных регионах, невозможно точно установить географическое происхождение УРФ Mosпо субтипу В. Можно лишь достоверно утверждать, что фрагменты субтипа Bгенома Mosпринадлежат варианту ВИЧ-1 субтипа B, получившего распространение на территории бывшего СССР - BFSU.

По результатам филогенетического анализа сегментов генома изолята Mos, относящихся к различным субтипам ВИЧ, достоверно можно лишь утверждать, что геном изолята состоит из субтипов ВИЧ-1 А1 и В, вызвавших эпидемию ВИЧ-1 на территории стран бывшего СССР (таблица 5.3). Установить,в каких географических регионах распространены эти изоляты ВИЧ-1,не удалось.

Таблица 5.3. - Сумма результатов филогенетического анализа сегментов генома УРФ Mos, относящихся к разным субтипам ВИЧ

Сегмент	Субтип ВИЧ	Генетически близкий референс	Регион	SH-aLRT
A5	A1	AFSU	Страны бывшего СССР	0,986
А9	A1	AFSU	Страны бывшего СССР	0,996
В2	B	98GEMZ003 E6574TOB8U 11RU21n	Грузия США Россия	0,999
В4	B	98GEMZ003 Mn_9 11RU21n -	Грузия Беларусь Россия Таиланд	0,942
В8	B, CRF03_AB	98GEMZ003 E6574TOB8U 11RU21n KAL153_2 98BY10443	Грузия США Россия Россия Беларусь	0,979



Таким образом, на основании проведенных исследований в данной главе можно сделать следующие выводы:

- уникальная рекомбинантная форма ВИЧ-1 Mos является результатом рекомбинации ВИЧ-1 субтипов А1 и В;

- встраивание фрагментов генома субтипа В произошло в структурных генах ВИЧ-1 gag и pol;

- в геноме Mos не выявлено фрагментов рекомбинантной формы CRF03_AB;

- на долю ВИЧ-1 субтипа А1 приходится порядка 80% генома УРФ Mos, на субтип B - 20%;

- методом филогенетического анализа определено, что геном Mos состоит из фрагментов геномов ВИЧ, получивших распространение на территории стран бывшего СССР. Более точную географическую локализацию на данный момент времени установить не удалось.



ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основные научные результаты диссертации

1. На протяжении 2008-2015 гг. субтип А1 оставался доминирующим в эпидемии ВИЧ-инфекции на территории Республики Беларусь во всех группах населения: потребителей инъекционных наркотиков; лиц, инфицированных половым путем; а также у детей, рожденных ВИЧ-инфицированными матерями. На долю данного субтипа пришлось 90,7% (275 из 303) проанализированных случаев ВИЧ-инфекции. При филогенетическом анализе все образцы субтипа А1 формировали кластер с высоким уровнем генетической однородности, значение SH-aLRT данного кластера составило 1, что свидетельствует о том, что все образцы ВИЧ-1 данного субтипа, циркулировавшие на территории Беларуси в популяции ВИЧ-инфицированных пациентов, являлись вариантом AFSU, вызвавшим эпидемию ВИЧ-инфекции на территории других стран бывшего СССР. Кроме субтипа А1, на территории Беларуси были выявлены ВИЧ-1 субтипов B, C, G, ЦРФ CRF02_AG, CRF03_AB, CRF06_cpx, УРФ ВИЧ-1, названная Mos [2-А, 3-А, 4-А, 5-А, 6-А, 7-А, 9-А, 10-А, 12-А, 13-А, 15-А, 16-А, 17-А, 22-А, 23-А, 27-А].

2. Выявлено 15 случаев ВИЧ-инфекции, вызванных рекомбинантными формами ВИЧ-1, что составляет 4,9% от всех случаев ВИЧ-инфекции на территории Беларуси. Более половины всех случаев (8 из 15) приходится на CRF03_AB, четыре случая вызваны CRF02_AG, два случая - CRF06_cpx. Уникальная рекомбинантная форма ВИЧ-1 между субтипами А1 и В определена у одного пациента [12-А].

3. Установлено 6 независимых событий заноса CRF03_AB на территорию Беларуси, вероятнее всего из России и Литвы, 2 из которых привели к распространению CRF03_AB внутри страны. Обнаружено 2 достоверных кластера, содержащих по 2 выявленных CRF03_AB в каждом. В первом случае в кластере было 2 образца из г. Лиды (Gr_3 и Gr_8), второй кластер содержал сиквенсы от двух ВИЧ-инфицированных пациентов женского пола (Mg_8 и MnObl_15), не имеющих между собой эпидемических связей. Это дает право предположить, что на территории Беларуси остается не выявленным еще как минимум один случай ВИЧ-инфекции CRF03_AB, имеющий связи с Mg_8 и/или MnObl_15. Найдено 3 независимых кластера CRF02_AG с референсными сиквенсами, что указывало на три независимых события заноса CRF02_AG на территорию Беларуси. В двух случаях исследуемые образцы кластрировались с референсными сиквенсами из Западной Африки и в одном (ВИЧ-инфицированные мать и ее ребенок) - с референсами из Узбекистана. Поскольку мать и ребенок - близкие родственники, два этих случая ВИЧ-инфекции являются одним событием заноса CRF02_AG. Основываясь на эпидемиологических данных, еще как минимум 2 случая инфицирования CRF02_AG остаются не выявленными - ВИЧ-инфекция обоих родителей ребенка (образец FN995208). Две CRF06_cpx, выявленные у близких родственников, - брата и сестры, являющихся ПИН, при филогенетическом анализе формировали достоверный кластер с референсными сиквенсами из Эстонии, что указывает на происхождение данной ЦРФ из Эстонии [12-А].

4. Мутации резистентности у рекомбинантных форм ВИЧ-1 в большинстве случаев возникали к ингибиторам обратной транскриптазы: НИОТ и ННИОТ. В участке гена pol всех изолятов, имеющих резистентность к НИОТ, установлена мутация M184V, вызывающая снижение чувствительности к ламивудину и эмтрицитабину. Выявлен штамм ВИЧ-1, имеющий резистентность к препаратам трех классов - ИП, НИОТ и ННИОТ, применяемых в Беларуси, а также установлены случаи инфицирования резистентными формами ВИЧ-1 [1-А, 8-А, 11-А, 14-А, 19-А, 20-А, 21-А, 24-А, 25-А, 26-А, 28-А].

5. Новая уникальная рекомбинантная форма ВИЧ-1 Mos, выявленная у ребенка, рожденного ВИЧ-инфицированной матерью, состоит из генома ВИЧ-1 субтипа А1, на который приходится порядка 80%, и фрагментов генома ВИЧ-1 субтипа В (~20% генома Mos). Встраивание фрагментов субтипа В произошло в структурных генах gag и pol. Сравнительный анализ УРФ Mos с CRF03_AB показал, что геном Mos не является CRF03_AB и не содержит ее фрагментов в своем геноме. Методом филогенетического анализа установлено, что геном Mos состоит из геномов ВИЧ-1 вариантов AFSU и BFSU, получивших распространение на территории стран бывшего СССР. Однако не было выявлено достоверных кластеров с референсными сиквенсами ВИЧ-1 из одного географического региона [3-А, 4-А, 5-А, 12-А, 18-А].

Рекомендации по практическому использованию результатов

Результаты диссертационного исследования использованы для усовершенствования диагностики и молекулярно-эпидемиологического мониторинга ВИЧ-1, что нашло отражение в нормативно-правовых актах Министерства здравоохранения Республики Беларусь:

- метод определения подтипа ВИЧ-1: инструкция по применению № 251-1213 : утв. М-вом здравоохранения Респ. Беларусь 11.07.2014 [29-А];

- метод определения мутаций резистентности ВИЧ-1 к лекарственным средствам антиретровирусной терапии: инструкция по применению № 163-1214, утв. М-вом здравоохранения Респ. Беларусь 07.05.2015 [30-А].

Получен патент «Новая уникальная рекомбинантная форма ВИЧ-1», № 18124 от 30.04.2014 [31-А].

На основании проведенных исследований разработана диагностическая тест-система для генотипирования и определения мутаций резистентности ВИЧ-1 «Бел-ВИЧ-1 резистентность-генотип» (№ ИМ-7.103886). Данная тест-система выявляет мутации в участке гена polВИЧ-1, ответственные за возникновение резистентности вируса к АРП. Результатом использования тест-системы станет адекватная антиретровирусная терапия, что позволит улучшить качество жизни ВИЧ-инфицированных пациентов и предотвратить дальнейшее распространение ВИЧ-1 на территории Республики Беларусь.

Созданная «Контрольная панель сывороток крови, содержащих и не содержащих антитела к специфическим белкам ВИЧ-1 и ВИЧ-2 и антигены ВИЧ-1» (№ ИМ-7.102188) позволят проводить контроль за качеством скрининга ВИЧ-1 на территории Беларуси серологическими методами.

В международную базу данных Genbank внесен 241 сиквенс по участку геновgag-polВИЧ-1, из них ВИЧ-1 субтипов A1 - 223, B - 6, C - 2, G - 1, CRF02_AG - 1, CRF03_AB - 5, CRF06_cpx - 2, УРФ ВИЧ-1 и один полноразмерный геном ВИЧ-1 субтипа А1, образец PV_85. Данные сиквенсы могут быть использованы в качестве референсных сиквенсов при проведении филогенетического анализа с целью определения динамики распространения ВИЧ-1 как на территориях стран бывшего СССР, так и во всем мире, а также молекулярно-эпидемиологического мониторинга ВИЧ-1 на территории Республики Беларусь. На основании полноразмерного сиквенса возможно создание кандидатных вакцин против ВИЧ-1, распространенных в определенном географическом регионе.



СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

Cohen, M.S. The spread, treatment, and prevention of HIV-1: evolution of a global pandemic. / M.S. Cohen [et al.] // The Journal of clinical investigation. - 2008. - Vol. 118. - № 4. - P. 1244-1254.

Sharp, P.M. Origins of HIV and the AIDS pandemic. / P.M. Sharp, B.H. Hahn // Cold Spring Harb Perspect Med. - 2011. - Vol. 1. - № 1. - P. a006841-a006841.

Secretary-General, U.N. UN Millenium Development Report /. U.N. Secretary-General. - UN Department of Public In, 2010.

Gottlieb, M.S. Pneumocystis carinii pneumonia and mucosal candidiasis in previously healthy homosexual men: evidence of a new acquired cellular immunodeficiency. / M.S. Gottlieb [et al.] // The New England journal of medicine. - 1981. - Vol. 305. - № 24. - P. 1425-1431.

Centers for Disease Control (CDC). A cluster of Kaposi's sarcoma and Pneumocystis carinii pneumonia among homosexual male residents of Los Angeles and Orange Counties, California. / Centers for Disease Control (CDC) // MMWR. Morbidity and mortality weekly report. - 1982. - Vol. 31. - № 23. - P. 305-307.

Centers for Disease Control (CDC). Kaposi's sarcoma and Pneumocystis pneumonia among homosexual men--New York City and California. / Centers for Disease Control (CDC) // MMWR. Morbidity and mortality weekly report. - 1981. - Vol. 30. - № 25. - P. 305-308.

Friedman-Kien, A.E. Disseminated Kaposi's sarcoma syndrome in young homosexual men. / A.E. Friedman-Kien // Journal of the American Academy of Dermatology. - 1981. - Vol. 5. - № 4. - P. 468-471.

Barrй-Sinoussi, F. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS). / F. Barrй-Sinoussi [et al.] // Science (New York, N.Y.). - 1983. - Vol. 220. - № 4599. - P. 868-871.

Gallo, R.C. Isolation of human T-cell leukemia virus in acquired immune deficiency syndrome (AIDS). / R.C. Gallo [et al.] // Science (New York, N.Y.). - 1983. - Vol. 220. - № 4599. - P. 865-867.

Coffin, J. What to call the AIDS virus? / J. Coffin [et al.] // Nature. - 1986. - Vol. 321. - № 6065. - P. 10.

Nobelfцrsamlingen PRESS RELEASE 2008-10-06. - Stockholm, 2008. - 4 p.

Turner, B.G. Structural biology of HIV. / B.G. Turner, M.F. Summers // Journal of Molecular Biology. - 1999. - Vol. 285. - № 1. - P. 1-32.

Vicenzi, E. Novel factors interfering with human immunodeficiency virus-type 1 replication in vivo and in vitro. / E. Vicenzi, G. Poli // Tissue antigens. - 2013. - Vol. 81. - № 2. - P. 61-71.

Frankel, A.D. HIV-1: fifteen proteins and an RNA. / A.D. Frankel, J.A. Young // Annual review of biochemistry. - 1998. - Vol. 67. - № 1. - P. 1-25.

Zhu, P. Distribution and three-dimensional structure of AIDS virus envelope spikes. / P. Zhu [et al.] // Nature. - 2006. - Vol. 441. - № 7095. - P. 847-852.

Chan, D.C. HIV entry and its inhibition. / D.C. Chan, P.S. Kim // Cell. - 1998. - Vol. 93. - № 5. - P. 681-684.

Wyatt, R. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. / R. Wyatt, J. Sodroski // Science (New York, N.Y.). - 1998. - Vol. 280. - № 5371. - P. 1884-1888.

Hendrickson, W.A. Structure of an HIV gp120 envelope glycoprotein in complex with the CD4 receptor and a neutralizing human antibody / W.A. Hendrickson [et al.] // Nature. - 1998. - Vol. 393. - № 6686. - P. 648-659.

Eckert, D.M. Mechanisms of viral membrane fusion and its inhibition. / D.M. Eckert, P.S. Kim // Annual review of biochemistry. - 2001. - Vol. 70. - № 1. - P. 777-810.

Melikyan, G.B. Evidence that the transition of HIV-1 gp41 into a six-helix bundle, not the bundle configuration, induces membrane fusion. / G.B. Melikyan [et al.] // The Journal of cell biology. - 2000. - Vol. 151. - № 2. - P. 413-423.

Cohen, P.S. The critical role of p38 MAP kinase in T cell HIV-1 replication. / P.S. Cohen [et al.] // Molecular medicine (Cambridge, Mass.). - 1997. - Vol. 3. - № 5. - P. 339-346.

Hatziioannou, T. Cyclophilin Interactions with Incoming Human Immunodeficiency Virus Type 1 Capsids with Opposing Effects on Infectivity in Human Cells / T. Hatziioannou [et al.] // Journal of virology. - 2004. - Vol. 79. - № 1. - P. 176-183.

Zhang, H. Reverse transcription takes place within extracellular HIV-1 virions: potential biological significance. / H. Zhang [et al.] // AIDS research and human retroviruses. - 1993. - Vol. 9. - № 12. - P. 1287-1296.

Jonckheere, H. The HIV-1 reverse transcription (RT) process as target for RT inhibitors. / H. Jonckheere, J. Annй, E. De Clercq // Medicinal research reviews. - 2000. - Vol. 20. - № 2. - P. 129-154.

Kleiman, L. tRNA(Lys3): the primer tRNA for reverse transcription in HIV-1. / L. Kleiman // IUBMB Life. - 2002. - Vol. 53. - № 2. - P. 107-114.

Hu, W. Retroviral recombination and reverse transcription / W. Hu, H. Temin // Science. - 1990. - Vol. 250. - № 4985. - P. 1227-1233.

Yu, H. The Nature of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Strand Transfers / H. Yu [et al.] // The Journal of biological chemistry. - 1998. - Vol. 273. - № 43. - P. 28384-28391.

Smith, J.S. Specificity of human immunodeficiency virus-1 reverse transcriptase-associated ribonuclease H in removal of the minus-strand primer, tRNA(Lys3). / J.S. Smith, M.J. Roth // The Journal of biological chemistry. - 1992. - Vol. 267. - № 21. - P. 15071-15079.

Fouchier, R.A. Nuclear import of human immunodeficiency virus type-1 preintegration complexes. / R.A. Fouchier, M.H. Malim // Adv Virus Res. - 1999. - Vol. 52. - P. 275-299.

Bukrinskaya, A.G. Phosphorylation-dependent human immunodeficiency virus type 1 infection and nuclear targeting of viral DNA. / A.G. Bukrinskaya [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1996. - Vol. 93. - № 1. - P. 367-371.

Bushman, F.D. Retroviral DNA integration directed by HIV integration protein in vitro. / F.D. Bushman, T. Fujiwara, R. Craigie // Science (New York, N.Y.). - 1990. - Vol. 249. - № 4976. - P. 1555-1558.