Дезинтеграция как инструмент для направленного разрушения клеток и клеточных структур

Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

Введение

1. Структура клетки

1.1 Устройство и функции клеточной мембраны

2. Понятие дезинтеграции клеток и её цели

3. Методы дезинтеграции клеток

3.1 Физические методы

3.2 Химические методы

3.3 Химико-ферментативные методы

Заключение

Список литературы



Введение

Для получения метаболита, не накапливающегося в среде в обычных условиях в заметных количествах, часто требуются особые приемы радикального воздействия на клетки. Сущность этих приемов заключается в "дезорганизации" нормально функционирующих систем клетки с целью вычленения их отдельных участков. Одним из способов такой дезорганизации является повреждение в той или иной степени клеток микроорганизмов, от простого высушивания до глубокой дезинтеграции клеточных структур.

Дезинтеграция - это процесс необратимого нарушения анатомической целостности клеток. С практической точки зрения необходимым и достаточным является разрыв клеточной оболочки, который может быть вызван различными повреждающими факторами: физическими, механическими, химическими, энзиматическими, биологическими. В природных условиях дезинтеграция клеток и клеточных систем вызывается внутриклеточными (внутренними) и внешними причинами. К внутренним причинам можно отнести факторы генетической природы. К различным внешним воздействиям можно отнести физические, физико-химические, химические и биологические факторы. Причем любой из этих факторов при достаточной интенсивности и продолжительности может стать дезинтегрирующим. Вызванную действием внутренних факторов дезинтеграцию обычно определяют как естественную.

Наряду с естественной дезинтеграцией бывает искусственная (насильственная) дезинтеграция. Последняя целенаправленно применяется человеком и часто используется в научной и производственной деятельности.

При этом основной задачей дезинтеграции является извлечение функционально активных структур и биополимеров.

В настоящее время можно определить три направления практического применения методов искусственной дезинтеграции клеточных систем:

1. Дезинтеграция биомассы (животной, растительной, микробной) для производства продуктов пищевого, кормового и технического назначения.

2. Дезинтеграция как способ стерилизации и инактивации живых систем.

3. Дезинтеграция как инструмент для направленного разрушения клеток и клеточных структур.



1. Структура клетки

Бактериальная клетка (рис. 1) состоит из клеточной стенки, цитоплазматической мембраны, цитоплазмы с включениями и ядерного аппарата, называемого нуклеоидом. Имеются другие структуры: мезосома, хроматофоры, тилакоиды, вакуоли, включения полисахаридов, жировые капельки, капсула (микрокапсула, слизь), жгутики, пили. Некоторые бактерии способны образовывать споры.

Рис. 1.Схема строения бактериальной клетки

1 - клеточная оболочка; 2 - цитоплазма; 3 - цитоплазматическая мембрана; 4 - ядерное вещество; 5 - рибосомы; 6 - жировые капельки; 7 - мезосома; 8 - капсула; 9 - гранулы полисахарида; 10 - жгутики.

Структуру и морфологию бактерий изучают с помощью различных методов микроскопии: световой, фазово-контрастной, интерференционной, темнопольной, люминесцентной и электронной. Рассмотрим подробнее основные структуры клетки:

· Клеточная стенка

В клеточной стенки грамположительных бактерий содержится небольшое количество полисахаридов, липидов, белков. Основным компонентом клеточной стенки этих бактерий является многослойный пептидогликан (муреин, мукопептид), составляющий 40--90% массы клеточной стенки. С пептидогликаном клеточной стенки грамположительных бактерий ковалентно связаны тейхоевые кислоты (от греч. teichos -- стенка).

В состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий входит наружная мембрана, связанная посредством липопротеина с подлежащим слоем пептидогликана. На ультратонких срезах бактерий наружная мембрана имеет вид волнообразной трехслойной структуры, сходной с внутренней мембраной, которую называют цитоплазматической. Основным компонентом этих мембран является бимолекулярный (двойной) слой липидов. Внутренний слой наружной мембраны представлен фосфолипидами, а в наружном слое расположен липополисахарид (ЛПС). Белки матрикса наружной мембраны пронизывают ее таким образом, что молекулы белка, окаймляют гидрофильные поры, через которые проходят вода и мелкие гидрофильные молекулы.

При нарушении синтеза клеточной стенки бактерий, в них образуются клетки с измененной (часто шаровидной) формой: протопласты -- бактерии, полностью лишенные клеточной стенки; сферопласты - бактерии с частично сохранившейся клеточной стенкой. Бактерии сферо- или протопластного типа, утратившие способность к синтезу пептидогликана под влиянием антибиотиков или других факторов и способные размножаться, называются L-формами. Они представляют собой осмотически чувствительные, шаровидные, колбовидные клетки различной величины, в том числе и проходящие через бактериальные фильтры. Некоторые L-формы (нестабильные) при удалении фактора, приведшего к изменениям бактерий, могут реверсировать, "возвращаясь" в исходную бактериальную клетку.

Между наружной и цитоплазматической мембранами находится периплазматическое пространство, или периплазма, содержащая ферменты (протеазы, липазы, фосфатазы, нуклеазы, бета-лактомазы) и компоненты транспортных систем.

· Цитоплазматическая мембрана

Цитоплазматическая мембрана при электронной микроскопии ультратонких срезов представляет собой трехслойную мембрану (2 темных слоя толщиной по 2,5 нм разделены светлым - промежуточным). По структуре она похожа на плазмалемму клеток животных и состоит из двойного слоя фосфолипидов с внедренными поверхностными, а также интегральными белками, как бы пронизывающими насквозь структуру мембраны. При избыточном росте (по сравнению с ростом клеточной стенки) цитоплазматическая мембрана образует инвагинаты -- впячивания в виде сложно закрученных мембранных структур, называемые мезосомами. Менее сложно закрученные структуры называются внутрицитоплазматическими мембранами.

· Цитоплазма

Цитоплазма состоит из растворимых белков, рибонуклеиновых кислот, включений и многочисленных мелких гранул -- рибосом, ответственных за синтез (трансляцию) белков. Рибосомы бактерий имеют размер около 20. Рибосомные РНК (рРНК) - консервативные элементы бактерий ("молекулярные часы" эволюции).

В цитоплазме имеются различные включения в виде гранул гликогена, полисахаридов, бета-оксимасляной кислоты и полифосфатов (волютин). Они являются запасными веществами для питания и энергетических потребностей бактерий. Волютин обладает сродством к основным красителям и легко выявляется с помощью специальных методов окраски (например, по Нейссеру) в виде метахроматических гранул. Характерное расположение гранул волютина выявляется у дифтерийной палочки в виде интенсивно прокрашивающихся полюсов клетки.

· Нуклеоид

Нуклеоид -- эквивалент ядра у бактерий. Он расположен в центральной зоне бактерий в виде двунитевой ДНК, замкнутой в кольцо и плотно уложенной наподобие клубка. Ядро бактерий, в отличие от эукариот, не имеет ядерной оболочки, ядрышка и основных белков (гистонов). Обычно в бактериальной клетке содержится одна хромосома, представленная замкнутой в кольцо молекулой ДНК.

Кроме нуклеоида, представленного одной хромосомой, в бактериальной клетке имеются внехромосомные факторы наследственности - плазмиды, представляющие собой ковалентно замкнутые кольца ДНК.

· Капсула, микрокапсула, слизь

Капсула - слизистая структура толщиной более 0,2 мкм, прочно связанная с клеточной стенкой бактерий и имеющая четко очерченные внешние границы. Капсула различима в мазках-отпечатках из патологического материала. В чистых культурах бактерий капсула образуется реже. Она выявляется при специальных методах окраски мазка (например, по Бурри-Гинсу), создающих негативное контрастирование веществ капсулы: тушь создает темный фон вокруг капсулы. Капсула состоит из полисахаридов (экзополисахаридов), иногда из полипептидов, например, у сибиреязвенной бациллы она состоит из полимеров D-глутаминовой кислоты. Капсула гидрофильна, препятствует фагоцитозу бактерий. Капсула антигенна: антитела против капсулы вызывают ее увеличение (реакция набухания капсулы). Многие бактерии образуют микрокапсулу - слизистое образование толщиной менее 0,2 мкм, выявляемое лишь при электронной микроскопии. От капсулы следует отличать слизь - мукоидные экзополисахариды, не имеющие четких границ. Слизь растворима в воде. Бактериальные экзополисахариды участвуют в адгезии (прилипании к субстратам), их еще называют гликокаликсом.

Кроме синтеза экзополисахаридов бактериями, существует и другой механизм их образования: путем действия внеклеточных ферментов бактерий на дисахариды.

· Жгутики

Жгутики бактерий определяют подвижность бактериальной клетки. Жгутики представляют собой тонкие нити, берущие начало от цитоплазматической мембраны, имеют большую длину, чем сама клетка. Толщина жгутиков 12-20 нм, длина 3-15 мкм. Они состоят из 3 частей: спиралевидной нити, крюка и базального тельца, содержащего стержень со специальными дисками (1 пара дисков - у грамположительных и 2 пары дисков - у грамотрицательных бактерий). Дисками жгутики прикреплены к цитоплазматической мембране и клеточной стенке. При этом создается эффект электромотора со стержнем-мотором, вращающим жгутик. Жгутики состоят из белка - флагеллина (от flagellum - жгутик). Субъединицы флагеллина закручены в виде спирали.

Число жгутиков у бактерий различных видов варьирует от одного (монотрих) у холерного вибриона до десятка и сотен жгутиков, отходящих по периметру бактерии (перитрих) у кишечной палочки, протея и др. Лофотрихи имеют пучок жгутиков на одном из концов клетки. Амфитрихи имеют по одному жгутику или пучку жгутиков на противоположных концах клетки.

· Пили

Пили (фимбрии, ворсинки) - нитевидные образования, более тонкие и короткие (3-10нм х 0, 3-10мкм) , чем жгутики. Пили отходят от поверхности клетки и состоят из белка пилина, обладающего антигенной активностью. Различают пили, ответственные за адгезию, то есть за прикрепление бактерий к поражаемой клетке, а также пили, ответственные за питание, водносолевой обмен и половые (F-пили), или конъюгационные пили. Отличительной особенностью половых пилей является взаимодействие с особыми "мужскими" сферическими бактериофагами, которые интенсивно адсорбируются на половых пилях.

· Споры

Споры - своеобразная форма покоящихся фирмикутных бактерий, т.е. бактерий с грамположительным типом строения клеточной стенки. Споры образуются при неблагоприятных условиях существования бактерий (высушивание, дефицит питательных веществ и др.. Внутри бактериальной клетки образуется одна спора (эндоспора). Образование спор способствует сохранению вида и не является способом размножения, как у грибов. Спорообразующие бактерии рода Bacillus имеют споры, не превышающие диаметр клетки. Бактерии, у которых размер споры превышает диаметр клетки, называются клостридиями, например, бактерии рода Clostridium (лат. Clostridium - веретено). Споры кислотоустойчивы, поэтому окрашиваются по методу Ауески или по методу Циля-Нильсена в красный, а вегетативная клетка в синий цвет.

1.1 Устройство и функции клеточной мембраны

Бактерии подразделяются на две естественные группы, что обусловлено различиями в строении их клеточной стенки. Одни бактерии, окрашивающиеся по Граму, получили название грамположительных, другие, не окрашивающиеся, - грамотрицательных.

У грамположительных бактерий, таких как Staphylococcus, Bacillus и Lactobacillus в муреиновую сетку встроены другие компоненты, в основном полисахариды и белки, что делает клеточную стенку сравнительно толстой. У грамотрицательных бактерий, таких как Salmonella, E. coli и Azotobacter, клеточная стенка тоньше и имеет более сложное строение. Муреиновый слой у этих бактерий снаружи покрыт гладким тонким мембраноподобным слоем липидов и полисахаридов, защищающим клетки от лизоцима - антибактериального фермента, содержащегося в слезах, слюне и других биологических жидкостях, а также в белке куриного яйца. Лизоцим расщепляет полисахаридный каркас муреина, что приводит к продырявливанию клеточной стенки и лизису клетки, т.е. к ее осмотическому набуханию и разрыву. Клеточные стенки микроорганизмов состоят из разных полимеров , по этому универсального метода их разрущения не существуют.

У грамположительных микроорганизмов клеточная стенка состоит из толстого пептидогликанового слоя N -ацетилглюкозамина и остатков N - ацетилмурамовой кислоты, соединенных пептидными мостиками. У грамотрицательных бактерии клеточная стенка тоньше и покрыты снаружи слоем липидов. Стенка дрожжевых клеток состоит из плотного слоя частично фосфорилированных маннатов и в - глюканов. Низшие грибы имеют многослойные клеточные стенки, состоящие из б и в глюканов, гликопротеидов и хитина.

Основные функции клеточной стенки следующие.

* Клеточная стенка защищает бактерии от внешних воздействий, придаёт им характерную форму, поддерживает постоянство внутренней среды и участвует в делении.

* Через клеточную стенку бактерий осуществляется транспорт питательных веществ и выделение метаболитов.

* На поверхности клеточной стенки располагаются рецепторы для бактериофагов, бактериоцинов и различных химических веществ.

* Структура и состав элементов клеточной стенки определяет антигенную характеристику бактерий (по структуре О- и Vi-Аг).

* Клеточная стенка способна по-разному воспринимать красители; на этом основаны тинкториальные свойства бактерий.

* Нарушение синтеза компонентов клеточной стенки приводит к гибели бактерии или образованию 1-форм.



2. Понятие дезинтеграции клеток и её цели

Дезинтеграция - разрушение клеток с помощью механического, физического, химического или иного воздействия с целью выделения их содержимого (напр., экстрагирования нуклеиновых кислот, белков и др.)

Дезинтеграция клеток применяется во многих сферах жизни человека, в частности в биотехнологии, для извлечения целевого продукта синтеза из биомассы.

Если продукт локализован внутри клеток, их разрушают, удаляют клеточные осколки и выделяют продукты из осветленной среды; секретируемый продукт выделяют непосредственно из среды.

Для отделения биомассы клеток или культуральной жидкости используют сепараторы, осадительные центрифуги, фильтр - прессы, вакуум - барабанные фильтры, ротационно-вакуумные фильтры, отстойники. Выбор оборудования зависит от масштаба культирования, типа клеток, свойства культуральной жидкости.

Для выделения клеток из больших объемов культуральной среды (в промышленных масштабах) используют высокоскоростное центрифугирование с помощью соответствующих центрифуг полунепрерывного действия. Суспензию клеток непрерывно подают в барабан центрифуги, клетки концентрируются в нем, осветленная жидкость удаляется. Когда барабан заполняется осажденными клетками, центрифугу останавливают и клетки собирают. Неудобства этого способа - необходимость остановки процесса, вероятность утечки микроорганизмов окружающих среду, невозможность полного удаления клеток и среды.

Альтернативный метод выделения клеток из культуральной среды - фильтрация через мембрану. Но процесс фильтрации быстро замедляются за счет накопления клеток на поверхность фильтра. Увеличение давления фильтруемой среды дает временный эффект, так как клетки забивают поры, образуя менее проницаемый слой.

Завершающие стадии биотехнологических процессов - выделение целевого продукта - существенно различаются в зависимости от того, накапливается продукт в клетке или он выделяется в культуральную жидкость, или же продуктом является клеточная биомасса. Наиболее сложным является выделение внутриклеточного продукта. При этом клетки необходимо отделить от среды культивирования, подвергнуть их разрушению, а затем целевой продукт очистить от остатков разрушенных клеток.

Выделение продукта существенно облегчается, если он экскретируется продуцентом в культуральную жидкость. Поэтому одной из насущных задач биотехнологии является создание промышленных штаммов микроорганизмов, секретирующих возможно большее число ценных продуктов в значительных количествах.

Технология выделения и очистки в значительной степени определяется природой целевого продукта. В ряде случаев существует возможность не использовать тщательную очистку продукта, если он обладает требуемыми активностями в неочищенном состоянии и если примесь посторонних веществ не оказывает каких-либо нежелательных влияний при его использовании. Некоторые традиционные биотехнологические процессы вообще исключают этап отделения продукта.



3. Методы дезинтеграции клеток

Для дезинтеграции клеток применяют разнообразные методы. Все процедуры должны быть одновременно достаточно жесткими, чтобы разрушить клеточную стенку, и достаточно мягкими для исключения денатурации белка (изменения структуры конечного продукта).

Все методы дезинтеграции можно поделить на физические, химические и химико-ферментативные.

3.1 Физические методы

бактериальный клетка мембрана дезинтеграция

К физическим методам дезинтеграции относятся: обработка ультразвуком, вращение лопасти или вибратора, баллистическое разрушение, продавливание с помощью пресса, измельчение твердой замороженной клеточной массы, осмотический шок, замораживание-оттаивание, декомпрессия (сжатие с последующим резким снижением давления).

· Обработка ультразвуком

Обработка ультразвуком является эффективным средством для разрушения клеточных структур. Этот эффект может быть использован для извлечения внутриклеточных материалов, например, крахмала из матричной клетки.

Ультразвуковая обработка попеременно генерирует волны высокого и низкого давления в обрабатываемой жидкости. Во время цикла низкого давления ультразвуковые волны создают мелкие вакуумные пузырьки, которые с силой лопаются во время цикла высокого давления. Данное явление носит название кавитации. Внутренний взрыв кавитационных пузырьков вызывает возникновение сильных гидродинамических сил сдвига.

Силы сдвига разделяют волокнистый клеточный материал на мелкие частицы и разрушают стенки клеточной структуры, высвобождая, тем самым, много внутриклеточного материала. Помимо этого, материал стенок клетки разрушается на мелкие осколки.

Данный эффект может быть использован для ферментации, выщелачивания и других процессов преобразования органических веществ. После размола и измельчения ультразвуковая обработка создаёт больше внутриклеточного материала; при этом в ферментах образуется осколки стенок клеток, которые преобразуют крахмал в сахарозу. Он также увеличивает площадь поверхности, подвергаемую воздействию ферментов во время разжижения или сахарообразования. Обычно это увеличивает скорость и выход дрожжевого брожения и других преобразовательных процессов.

· Вращение лопасти или поршня

Блендеры, как правило, имеют режущие лопасти, вращающиеся с большой скоростью. Количество и конструкция этих лопастей бывают разными, но все они обычно заострены под прямым углом друг к другу, а форма их обеспечивает хорошее перемешивание содержимого сосуда. Суспензию клеток помещают в специальный стакан, который имеет по всей высоте раструбы и в поперечном сечении выглядит как клеверный лист. Для поддержания низкой температуры в процессе гомогенизации стакан помещают в лед. Благодаря особому расположению лопастей и конструкции стакана в ходе фракционирования возникают гидродинамические силы. Метод достаточно универсален и широко применяется для фракционирования клеток, однако следует иметь в виду, что при быстром вращении лопастей гомогенизаторов возникают некоторые нежелательные эффекты.

Большинство гомогенизаторов преставляют собой прибор, состоящий из пестика с ручным (гомогенизаторы Даунса и Тёнбрэка) или механическим (гомогенизатор Поттера-Эльвегёйма) приводом, который вращается или движется вверх и вниз в стеклянном цилиндрическом сосуде. Необходимо следить за тем, чтобы зазор между пестиком и стенками сосуда оставался постоянным, так как скорость разрушения клеток зависит не только от скорости вращения пестика, но и от соотношения между радиусами пестика и сосуда. Сосуд закрепляется неподвижно, поэтому скорость вращения суспензии изменяется от минимальной у его стенок до максимальной у поверхности пестика. Следовательно, чем меньше расстояние между этими поверхностями, тем выше градиент скорости. Возникающие при высоких скоростях силы достаточны для разрушения довольно тонких мембран животных клеток. Растительные и бактериальные клетки при этом не разрушаются.

· Баллистическое разрушение

Термином "баллистическое разрушение" обозначают разнообразный набор методов, в которых бактерии разрушаются силами сдвига, развивающимися, когда суспензия клеток очень сильно встряхивается или перемешивается вместе с маленькими стеклянными или пластмассовыми шариками

Ранее широко применялись два устройства - аппарат Микля для встряхивания и аппарат для встряхивания, насаживаемый на ось центрифуги типа International. Ни в одном из них не обеспечивалось поддержание низкой температуры во время встряхивания, и поэтому приходилось часто прерывать процесс для охлаждения пробы. Эти устройства больше не выпускаются промышленностью, они заменены тканевым дезинтегратором Брауна (Braun MSK; В. Braun Melsungen Apparatebau, Melsungen, Federal Republic of Germany), который поставляется в США многими фирмами, специализирующимися на выпуске лабораторного оборудования. Дезинтегратор Брауна имеет контейнер для пробы объемом 65 мл, который качается в горизонтальной плоскости с частотой 2000--4000 колебаний/мин. Охлаждение обеспечивается струей жидкого СО2, направляемой к контейнеру с пробой. В большинстве случаев клетки разрушаются за 3-6 мин при температуре ниже 4 °С.

Дезинтегратор Брауна применяют, если требуется выделить клеточные стенки и отдельные ферменты из грамположительных бактерий. Как правило, при этом пользуются методикой Ворка: суспензию клеток (30 мл с содержанием сухого вещества 20-50 мг/мл) в подходящем буфере смешивают с 20 мл шариков Ballotini №12 в соответствующем контейнере (для воздуха важно оставить не меньше 20% объема емкости) и в течение 0,5 мин для охлаждения контейнера через аппарат пропускают СО2. Затем в течение 3,5-5 мин в зависимости от типа клеток пробу встряхивают с частотой 3000 движений в минуту. Шарики удаляют низкоскоростным центрифугированием или пропусканием смеси через грубый стеклянный фильтр. Некоторые исследователи предпочитают использовать вместо стеклянных шариков пластмассовые, чтобы свести к минимуму денатурацию ферментов. Если описанную выше методику применяют для выделения клеточных стенок, то пробу после встряхивания немедленно подвергают обработке, обеспечивающей инактивацию автолитических ферментов.

· Замораживание--оттаивание

Замораживание - оттаивание используют для того, чтобы сделать грамотрицательные клетки чувствительными к лизоциму или детергентам. Этот метод можно применять при выделении мембран или внутриклеточных органелл в больших количествах.

Для выделения больших количеств мембран полезна следующая методика. Густую суспензию отмытых клеток (клетки составляют около 30% объема суспензии) в 0,02 М трис-буфере, pH 7,8, содержащем 5 мМ ЭДТА, 0,25 М сахарозы и 0,5 мг/мл лизоцима, помещают в колбу и замораживают в виде тонкого слоя, вращая колбу в ацетоновой бане с сухим льдом. Затем суспензию размораживают, погружая колбу в теплую воду, и, как только все растает, выливают содержимое в 20 объемов холодного буфера, имеющего состав: 0,02 М трис, 0,5 мМ MgCl2, 0,1 мг/мл дезоксирибонуклеазы, pH 7,8. Смесь немедленно обрабатывают около 20 с в ножевом микроизмельчителе, чтобы измельчить ДНК и разрушить клетки.

Неразрушившиеся клетки удаляют центрифугированием в течение 5 мин при 5000 g. Если осадка много, его вновь суспендируют в указанном выше растворе трис-ЭДТА-сахарозы и повторяют цикл замораживания - оттаивания с последующим разведением.

· Продавливание с помощью пресса

Продавливание с помощью пресса представляет собой, вероятно, самый распространенный и самый полезный метод разрушения клеток. Некоторое количество бактериальной суспензии (объемом 5-40 мл с содержанием клеток до 30 об. %) помещают в стальной цилиндр с плотно пригнанным поршнем, имеющим маленький выпускной клапан с узким отверстием; с клапаном соединена выводящая трубка. Цилиндр с поршнем ставят под 10-тонный гидравлический пресс. По мере того как поршень опускается, клетки разрушаются большими гидродинамическими силами, возникающими при прохождении клеточной суспензии через отверстие выпускного клапана. У этого метода есть ряд преимуществ.

Во-первых, нет проблемы с охлаждением, так как цилиндр и поршень пресса охлаждают заранее, а нагрев происходит только при прохождении клеток через отверстие клапана. Температура вытекающей жидкости повышается на 5--10°С, но эту жидкость можно быстро охлаждать, если собирать в металлическую пробирку или стакан, помещенные в ледяную баню.

Во-вторых, разрушение происходит практически мгновенно, и суспензия разрушенных клеток не подвергается дополнительным гидродинамическим воздействиям, которые могли бы повредить субклеточные частицы.

В-третьих, при использовании гидравлического пресса удовлетворительного качества можно проводить эксперименты в хорошо воспроизводимых условиях. К тому же на степень разрушения не влияет плотность клеточной суспензии, фаза роста, в которой были собраны клетки, или среда, в которой клетки суспендированы.

Установка типа пресса Френча состоит из цилиндра, поршня, выпускного клапана и подающей нагрузку станины (American Instrument Co. [Aminco], Rockville, MD.). В старых моделях этого пресса использовали быстро изнашивающийся клапан со стальной иглой, который часто повреждался во время работы. Вместо него можно использовать выпускаемый сейчас клапан с подогнанным по размеру нейлоновым шариком (Aminco). Он позволяет поршню доходить до дна цилиндра, не вызывая повреждений, и обеспечивает более однородное разрушение. Удобен также гидравлический пресс с приводом от мотора; пресс можно устанавливать на постоянное усилие в диапазоне скоростей движения поршня (Aminco; или Enerpac, Inc., Butler, Wis.).

Клеточную суспензию загружают в цилиндрическую ячейку и помещают под гидравлический пресс. Поршень пресса опускается на поршень ячейки, пока не разовьется максимальное усилие. До этого момента выпускной клапан закрыт, а затем его медленно открывают до тех пор, пока поршень не пойдет медленно вниз. Перед разрушением клетки собирают, отмывают один раз и суспендируют в объеме буфера [0,01 м HEPES (М-2-гидроксиэтилпиперазин-М'-2-этансульфоновая кислота), pH 7,4 при 0°С], составляющем 0,1 объема взятой культуры. Добавляют немного панкреатической рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы (0,1 мг/мл) и разрушают суспензию на прессе Френча под давлением 14-107 Па. После разрушения добавляют MgCl2 до конечной концентрации 1 мМ и удаляют неразрушившиеся клетки центрифугированием при 5000 g в течение 5 мин. Mg2+ нужен для того, чтобы функционировала дезоксирибонуклеаза; его добавляют после разрушения, чтобы предотвратить стабилизацию рибосом.

· Осмотический шок.

Осмотический шок - это повреждение или распад клеток, вызванные помещением их в гипотоническую или гипертоническую среду. Применяется для дезинтеграции клеток, имеющих малопрочную и высокопроницаемую клеточную оболочку. При этом происходит солевой шок, оболочка клеток, органелл, вирусов разрывается давлением воды, проникающей внутрь клетки. Клетки суспендируют в буферной гипертонической среде, содержащей ЭДТА, затем быстро переносят в охлажденную гипотоническую среду (на льду), центрифугируют, надосадок сливают. ЭДТА добавляют с целью разрушить липополисахариды клеточной стенки. Осмотический шок у некоторых бактерий наступает при переносе теплой культуры в холодный разбавитель.

· Декомпрессия

Для непрерывной дезинтеграции микроорганизмов предложены способы, основанные на принципе декомпрессионной дезинтеграции. Сущность способа состоит в том, что клетки микроорганизмов предварительно насыщают газом под давлением до выравнивания парциального давления с обеих сторон оболочечного барьера, а затем переводят клетки в зону нормального давления. В результате возникает градиент давления, направленный во внешнюю среду, что и приводит к разрушению клеточной оболочки.

3.2 Химические методы

Химические методы дезинтеграции основаны на разрушении клеточной оболочки под воздействием щелочей, кислот, детергентов, ингибиторов синтеза оболочки клетки.

Разрушение клеточных стенок таким методом включают обработку щелочью, органическими растворителями или детергентами. Если белковый продукт не разрушается при pH от 10,5 до 12,5, то можно без труда и дешево лизировать большие количества бактериальных клеток. Например, рекомбинантный гормон роста человека очень просто выделить из клеток?? E. coli обработкой гидроксидом натрия. После обработки щелочью не остается практически ни одной жизнеспособной клетки, что автоматически решает проблему утечки рекомбинантных микроорганизмов. Обработка органическими растворителями - это простой и недорогой способ разрушения клеток, который используется для выделения ферментов из дрожжей. Однако чтобы убедиться в том, что в подобранных условиях белковый продукт не денатурирует, необходимо провести предварительное тестирование. Под действием детергентов в мембранах бактериальных клеток образуются поры, через которые белки и другие молекулы выходят из клетки. Недостатком детергентов является их дороговизна, в большинстве случаев в их присутствии белки денатурируют, а кроме того, они могут загрязнять конечный продукт

3.3 Химико-ферментативные методы

К химико-ферментативным методам относятся использование антибиотиков, ферментов, ионогенные ПАВы.

1) Эффективный лизис клеток вызывают антибиотики полимиксины, тироцидины, новобиоцин, нистатин и другие, некоторые поверхностно-активные вещества, а также глицин.

Можно использовать автолиз клеток при лимитированном по определенному субстрату росте или их лизис при заражении бактериофагами. Последний вариант сопряжен с риском неконтролируемого распространения фага в промышленных установках и поэтому не получил применения.

При относительно низких концентрациях пенициллина подавляется активность эндопептидазы, что приводит к образованию поперечных перегородок в клетках, деление последних подавляется, происходит их удлинение и образование нитеобразных форм. Под воздействием более высоких концентраций пенициллина подавляется активность и другого фермента -- гликозидазы, образование нитеобразных форм прекращается, синтез клеточной стенки полностью блокируется. При одновременном воздействии антибиотика на оба энзима происходит образование сферопластов, что приводит к классическому бактерицидному эффекту бензил-пенициллина.

Действие цефалексина и ампициллина на микробную клетку связано с подавлением эндопептидазы и проявляется в образовании удлиненных форм. Амоксициллин приводит к быстрому образованию сферопластов и лизису микробных клеток, что в целом определяет его быстрый бактерицидный эффект. Амидинопенициллины (в частности, мецииллинам) отличаются по механизму действия от других природных и полусинтетических пенициллинов: бактериальные клетки под их влиянием приобретают форму больших сферических образований. Этот эффект условлен не воздействием на энзимы клеточной стенки, а связан со специфическим белком, который определяет форму бактериальной клетки.

Антибиотики группы ванкомицина быстро и необратимо связываются с клеточной стенкой чувствительных бактерий, тем самым подавляя синтез клеточной стенки. Ванкомицин в отличие от пенициллина образует комплекс с ацил-D-аланил-D-аланином мукопептида клеточной стенки, другим отличием от действия беталактамов является подавление образования сферопластов за счет воздействия на цитоплазматическую мембрану. Иные молекулярные мишени действия ванкомицина в сравнении с пенициллинами и цефалоспоринами обусловливают его активность в отношении так называемых метициллиноустойчивых стафилококков.

Полимиксины повреждают цитоплазматическую мембрану чувствительных бактериальных клеток и необратимо связываются с ней. Молекулы полимиксинов реагируют с анионным фосфолипидным слоем мембраны. Наступающее при этом нарушение осмотических барьеров клетки приводит к выходу из нее внутриклеточных компонентов и к ее лизису. Токсичность полимиксинов также обусловлена их связыванием с мембранами животных клеток.

Полимиксины как катионные детергенты способны разрушать поверхностные структуры грамотрицательных бактерий, проникать внутрь клеток и взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами и рибосомами. Двухвалентные ионы Са++ и Mg++ являются антагонистами бактерицидного эффекта полимиксинов. Снижение активности полимиксинов в присутствии физиологических концентраций двухвалентных катионов (в особенности кальция) объясняет иногда наблюдаемые несоответствия между высокой активностью антибиотика при определении чувствительности и его эффективностью в клинике.

2) Еще один наиболее распространенный метод разрушения клеток микроорганизмов - лизис с помощью ферментов.

Так, лизоцим яичного белка легко гидролизует клеточные стенки грамположительных бактерий. Для разрушения клеток грамотрицательных бактерий используют лизоцим и ЭДТА. Клеточные стенки дрожжей и плесневых грибов гидролизуют одним или несколькими ферментами: фосфоманназой, 1,3- и 1,6-глюканазой, хитиназой - или комплексным дрожжелитическим препаратом. Ферментативная обработка высокоспецифична, а лизис происходит в мягких условиях.

Автолизины (ферменты, расщепляющие клеточную стенку) существуют в клетке в латентной и активной форме. Активная возникает в результате процессингового протеолиза. В латентной форме автолизины рассеяны в области ЦПМ, активируясь, они приобретают сродство к субстрату и перемещаются в материал клеточной стенки. У клеток бактерий местом локализации активных форм автолизинов является район образования септы, у дрожжей - почки, у апикально растущих микроорганизмов - конец гифы. Именно поэтому при индукции автолиза первичные повреждения клеточных стенок наблюдаются в местах образования перегородок, перетяжек. Автолизины в активной форме перемещаются от одного участка клеточной стенки к другому в продольном (от ЦПМ наружу) и поперечном (от экватора к полюсам) направлениях, невидимому, вследствие образования новых слоев и наращивания новых поперечных участков в местах деления клетки.



Заключение

Физические способы разрушения более экономичны, чем химические и химико-ферментативные. Они осуществляются без применения дорогостоящих и дефицитных реактивов и ферментных препаратов. В то же время этим способам дезинтеграции клеток присуща определенная неизбирательность: обработка может отрицательно влиять на качество получаемого продукта.

Осторожное и избирательное разрушение клеточной стенки возможно при использовании химических и химико-ферментативных методов.

Самым мягким из всех механических способов разрушения клеток является разрушение клеточной мембраны под действием осмотического давления. Для большинства бактерий этот метод неприменим, если не обрабатывать предварительно клеточные стенки ферментами или не изменять их структуру другими способами.

Ультразвуковая обработка - наиболее быстрый и легкий способ разрушения клеток. Еще одно его достоинство заключается в том, что с его помощью эффективно разрушаются самые различные бактерии. Все это позволяет широко применять этот способ в бактериологических исследованиях.

В общем, наиболее распространенные физические методы разрушения клеток можно классифицировать следующим образом в порядке уменьшения их дезинтегрирующего действия: пресс Френча > вибрационные мельницы > пресс Френча > ультразвук > растирание с окисью алюминия. По устойчивости к разрушению клетки различных микроорганизмов можно расположить в последовательности (в порядке уменьшения): дрожжи >мицелий грибов > грамположительные кокки > грамположительные палочки > грамотрицательные палочки.



Список литературы

1. Общая биотехнология: Учеб. Пособие / О.Н. Чечина - Самара: Самар. гос. техн. ун-т, 2010. - 232 с.

2. Методы общей бактериологии: Учеб. Пособие / Ф. Герхардт и др.. Пер. с англ. Т-1 -- М.: Мир, 1983. -- 536 с.

3. Патент РФ №2216595 Тонева - Давидова Е.Г // Способ получения бета-глюканов клеточной стенки дрожжей

4. Биология: В 3 т. Тейлор Д., Грин Н., Стаут У. 3-е изд. - М.: 2004. Том 1 - 454 с., Том 2 - 436 с., Том 3 - 451 с.

5. Биохимия человека: Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В.Б Пер. с англ. - М.: Мир, 1993; Т1 - 384 с.

6. Основы фармацевтической биотехнологии: Прищеп Т.П., Чучалин B.C., Зайков К.Л., Михалева Л.К., Белова Л.С.-- Ростов н/Д.: Феникс, 2006. -- 256c.

7. Современные проблемы и методы биотехнологии [Электронный ресурс]: лаб. Практикум / Н.А. Войнов, Т.Г. Волова, Н.В. Зобова и др. - Электрон. дан. (12 Мб). - Красноярск: ИПКСФУ, 2009. - 418 с.

8. Дезинтеграция клеток в биотехнологии: Шапхаев Э.Г., Цыренов В.Ж., Чебунина Е.И. Учеб. пособие / ВСГТУ. - Улан-Удэ.: 2001. - 96 с

9. http://chem21.info/index/

10. http://www.ultrazvuc.ru/processe/processes_area_id/1/processes_id/4

11. http://medbe.ru/materials/problemy-i-metody-biotekhnologii/

Размещено на Allbest.ru