Инсерционный мутагенез – основной метод идентификации генов

Эти праймеры расположены последовательно со сдвигом (шагом) на 50 или более нуклеотидов (рис. 12а, праймеры ЛБ1, ЛБ2, ЛБ3), что позволяет регулировать на величину шага размер фрагмента в процессе его амплификации. В результате искомый фрагмент синтезируется как набор из трех (или более) фрагментов, размеры которых различаются между собой на величину используемого шага, что позволяет легко отличить его от неспецифически амплифицирующихся фрагментов ДНК генома.

На первом этапе TAIL-PCR в качестве матрицы используется геномная ДНК исследуемого мутанта. Один из специфических праймеров, комплементарный наиболее далеко удаленному от фланкирующей последовательности участку ДНК инсерции (на рис. 12а - это праймер ЛБ3), берется в паре с каждым из взятых вырожденных праймеровAD. Сначала проводится отжиг специфического праймера (5 высокотемпературных циклов), затем - отжиг вырожденного праймера (1 низкотемпературный цикл). Далее, на этапе наработки искомого фрагмента, проводится 15 (до 25 по данным разных авторов) суперциклов амплификации, каждый из которых включает в себя 2 высокоспецифичных и 1 низкотемпературный цикл.

На втором этапе TAIL-PCR в качестве матричной ДНК используется смесь фрагментов ДНК, полученных на первом этапе. При этом с каждой смесью фрагментов ДНК, полученной на первом этапе при использовании определенного случайного праймера из взятого набора, проводятся по две реакции с парой праймеров, одним из которых является тот же случайный праймер, а второй - ЛБ2 или ЛБ1 (рис. 12б).

На втором этапе реакции гомогенность продуктов ПЦР значительно выше, и среди них можно обнаружить фрагменты, отличающиеся на величину, заданную шагом между ЛБ2 и ЛБ1 (рис. 12б - дорожки 7-8, рис. 12в). Эти фрагменты включают растительную ДНК, фланкирующую инсерцию. Выделение и секвенирование этих фрагментов позволяет осуществлять компьютерный поиск в геноме A. thaliana интересующего гена.

5-й подход предназначен для массового скрининга маркированных инсерциями генов и может использоваться как при анализе пулов ДНК из многих трансформированных растений, так и при анализе линий со множественными инсерциями ДНК. Геномная ДНК инсерционного мутанта подвергается рестрикции и лигированию с адаптерами - фрагментами ДНК известного нуклеотидного состава. Продукты реакции используются для ПЦР с праймерами к ДНК инсерции и адаптеру (Tissieretal., 1999). Такой подход, в отличие от TAIL-PCR, позволяет избежать амплификации неспецифических фрагментов (все праймеры специфичны), благодаря чему его можно использовать для скрининга больших пулов. В то же время, при этом подходе некоторые инсерции не обнаруживаются, поскольку сайты рестрикции для используемой в эксперименте рестриктазы не всегда присутствуют вблизи всех имеющихся инсерций.

Работа по клонированию гена, маркированного Т-ДНК, считается завершенной, если показана способность клонированного продукта комплементировать мутантный фенотип. Для этого проводят трансформацию инсерционных мутантов участками ДНК, в состав которых входит клонированная нуклеотидная последовательность из растений дикого типа. Восстановление нормального фенотипа у трансформированных мутантов служит окончательным доказательством того, что клонирован нужный ген. Для доказательства клонирования маркированного транспозоном гена комплементационный анализ обычно не проводится. Вместо этого сравнивают результаты блот-гибридизации геномных ДНК растений дикого типа, транспозонных мутантов и ревертантов (мозаиков) с пробами клонированной ДНК. У ревертантов восстановление фенотипа должно сопровождаться выходом транспозона из исследуемого гена и, как следствие этого, появлением фрагментов ДНК с молекулярным весом, характерным для растений дикого типа.

Литература

1. Чемерилова В.И., Секерина О.А. Разрешающая способность генетического анализа и его особенности у бактерий. Уч. пособие для самостоятельной работыстудентов, обучающихся на специализациях «Генетика» и «Микробиология».- Иркутск:ГОУ ВПО Иркут.гос.ун-та, 2005.- 167 с.

2. Секерина О.А. Генетика микроорганизмов. - Иркутск: Изд-во ИГУ, 2007.

3. Глазер В.М., Ким А.И., Орлов Н.Н. Задачи по современной генетике, 2006.

4. Жимулёв И.Ф. Общая и молекулярная генетика /И.Ф. Жимулёв. - 2-е изд. - Новосибирск: Сибирское Университетское издание, 2003. - 480 с.Захаров И.А. Курсгенетики микроорганизмов. - Мн.: Выш.шк., 1978.- 192 с.

5. Захаров И.А., Мацелюх В.П. Генетические карты микроорганизмов.- Киев: Наукова думка, 1986.- 250 с.

6. Чемерилова В.И. Транскрипционная регуляция активности генов у бактерий. Механизмы и генетический контроль системной регуляции. Уч. пособие длясамостоятельной работы студентов, Иркутск: ГОУ ВПО Иркут.гос.ун-та, 2005.- 167 с.

7. Чемерилова В.И. Способы обмена генетической информацией у бактерий и их использование в гибридологическом анализе. Метод.указание. - Иркутск: Изд-во ИГУ,1995. - 52 с.

8. Генетика промышленных микроорганизмов и биотехнология. - М.: Наука, 1990. - 278 с.

9. Прозоров А.А. Конъюгация у бацилл /А.А. Прозоров //Микробиология. - 2003. - Т. 72, №5. - С. 581-593.

10. Хесин Р.Б. Непостоянство генома. М., 1984.

11. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия: Учеб. пособие для студ. вузов,обуч. по напр. "Биология" и спец. "Биотехнология", "Биохимия", "Генетика", "Микробиология"/

12. С.Н. Щелкунов. -2-е изд., испр. и доп.. -Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2014. - 496 с.13Иванов В. И. Генетика. Изд.: Издательско-книготорговый центр Академкнига, 2006.

14.Генетика / Жученко А. А., Гужков Ю. Л., Пухальский В.А. и др. Изд.: КОЛОСС, 2006.

15.Генетика / Бакай А. В., Кочиш И. И., Скрипниченко Г. Г. Серия: «Учебники и учебные пособия для высших учебных заведений». Изд.: Колос, 2007.

16.Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия: учеб. -справ. пособие. Изд.: Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, Сиб.унив.изд., 2008.

Размещено на Allbest.ru