Инсерционный мутагенез – основной метод идентификации генов

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Контрольная работа

Инсерционный мутагенез - основной метод идентификации генов



Содержание

Введение

1. Генетические последствия инсерционного мутагенеза

2. Инсерционный мутагенез как метод прямой и обратной генетики

3.Особенности инсерционного мутагенеза растений

4. Типы инсерционных мутагенов и их особенности

5. Т-ДНК мутагенез.

6. Транспозонный мутагенез.

7. Использование инсерционного мутагенеза для инактивации генов на основе явления РНК-интерференции

8. Методы трансформации A. thaliana с помощью Agrobacteriumtumefaciens

9. Выделение генов, маркированных инсерцией

Литература

инсерционный мутагенез идентификация ген



Введение

Инсерционный мутагенез - это изменение последовательности ДНК, вызванное встраиванием в геном фрагментов чужеродной ДНК. В последнее десятилетие инсерционный мутагенез, в основе которого лежат методы трансформации растений, получил широкое распространение и стал одним из основных методов идентификации генов. Это связано с тем, что участки чужеродной ДНК могут вызывать появление мутантного фенотипа у инсерционных мутантов, что позволяет проводить мутационный анализ морфологических, физиологических и биохимических признаков, выявлять новые гены и определять их функцию. Кроме того, участки чужеродной ДНК, содержащие в своем составе селективные гены, маркируют мутантные гены, облегчая их картирование и клонирование. Таким образом, инсерционный мутагенез, позволяющий исследовать как функцию гена (на уровне целого растения и на уровне клетки), так и его структуру, является эффективным методом идентификации генов. Отметим также, что более простая процедура клонирования маркированных инсерцией генов по сравнению с генами, маркированными точковыми мутациями, является основным преимуществом инсерционного мутагенеза по сравнению с методами традиционного мутагенеза.

Теоретически, задачу идентификации всех генов можно решить, если маркировать инсерцией каждый ген. В случае A. thaliana, обладающего маленьким геномом, получение инсерционных мутаций по всем генам является вполне реальной задачей. Подсчитано, что для обнаружения с вероятностью >95%инсерций в любом из 25 000 генов этого модельного объекта необходимо получить 100 000 трансформированных линий (Feldmann, 1991; Azpiroz-Leehan, Feldmann, 1997). В настоящее время общее число инсерционных мутантов, полученных в разных лабораториях, уже в несколько раз превосходит запланированное (Panetal., 2003). Сейчас интенсивно создаются представительные коллекции инсерционных мутантови для других видов высших растений, наприме, для риса.



1. Генетические последствияинсерционного мутагенеза

В зависимости от места встраивания инсерции чужеродной ДНК могут вызывать разные генетические последствия:

1) при встраивании в незначащие участки генома инсерции не приводят к изменениям работы генов и поэтому не имеют фенотипического выражения на уровне целого растения; в то же время, такие инсерции могут служить генетическими маркерами при картировании генома и выделении маркированных инсерцией генов;

2) при встраивании в регуляторные участки генома (промоторные области генов, области с 5' конца от промоторной и с 3' конца после сайта полиаденилирования, интроны), которые содержат так называемые цис-элементы (участки связывания транскрипционных факторов, т.е. регуляторных белков) инсерции могут приводить к изменению экспрессии генов - вызвать нарушение уровня транскрипции гена (от полного прекращения до суперэкспрессии), изменение времени и специфичности транскрипции;

3) при встраивании внутрь гена инсерции приводят к полному нарушению работы генов, т.к. инсерция, имеющая обычно размер от 1 до нескольких тпн, приводит к нарушению образованию нормального транскрипта. Необходимо отметить, что способность вызывать полную инактивацию гена является одновременно и достоинством, и недостатком инсерционного мутагенеза по сравнению с химическим. Это связано с тем, что при полной инактивации гена достигается более выраженное фенотипическое проявление мутации, что позволяет судить о функции гена и тех стадиях развития, для которых эта функция является критической. В то же время, с помощью инсерционного мутагенеза у растений не возможно пока решить задачу по изучению функции отдельных доменов генного продукта, которые могут участвовать в разных биологических процессах. Химический мутагенез, позволяющий получать точковые замены в разных по функциональному значению участках гена, более эффективен в изучении структурно-функциональных особенностей гена.

Генетические последствия инсерций определяются и особенностями строения чужеродной ДНК. Существуют специальные разновидности инсерционных последовательностей, которые независимо от мест встраивания способны вызывать "замолкание" определенных генов (см. раздел РНК-интерференция).

2. Инсерционный мутагенез как метод прямой и обратной генетики

Инсерционный мутагенез является важнейшим инструментом идентификации генов, причем его можно рассматривать, одновременно как метод "прямой" и "обратной" генетики.

Действительно, инсерции, приводящие к полному нарушению работы гена, могут вызывать фенотипические изменения у растений, что позволяет судить о функции гена на уровне организма. Дальнейший анализ, направленный на "вытягивание" маркированного инсерцией гена позволяет изучить структуру и молекулярную функцию гена (этот метод подробно описан ниже). Отметим, что при использовании инсерционных мутантов в целях идентификации генов методами "прямой" генетики важно, чтобы линии содержали единичные инсерции в геноме.

В то же время при наличии представительных коллекций инсерционных мутантов можно осуществлять поиск инсерций в генах с известной нуклеотидной последовательностью, следуя стратегии "обратной" генетики. Этот поиск осуществляют с помощью ПЦР-скрининга объединенных пулов линий инсерционных мутантов со специфическими праймерами к ДНК инсерции (Т-ДНК или транспозон) и к ДНК интересующего гена или генного семейства (рис. 1).



LBRB

P1 P2

P3 P4

Рисунок 1. Выделение генов, кодирующих известную последовательность ДНК с помощью ПЦР - скрининга маркированных Т-ДНК линий растений (Azpiroz-Leehan, Feldmann, 1997). Стрелками обозначены праймеры (Р1, Р2, Р3, Р4), гомологичные концам Т-ДНК (LB, RB - левая и правая границы Т-ДНК), и участкам интересующего гена. Ориентация Т-ДНК и ее положение в гене может быть различным, поэтому для гарантированного выделения гена в отдельных процедурах ПЦР используют разные комбинации праймеров.

Международные банки могут предоставить не только пулы семян, но и пулы ДНК из растений, специально структурированные для более экономичного и эффективного скрининга генов по наличию ПЦР-продукта. На рис.2 представлена схема выявления маркированных инсерцией генов среди 60480 трансформированных растений, с помощью ПЦР с использованием 30 «суперпулов» ДНК, каждый из которых представляет информацию о 2025 растениях. Сейчас этот подход, базирующийся на высокой чувствительности метода ПЦР, и позволяющий сводить к минимуму материальные и временные затраты, широко используется для поиска генов A. thaliana, маркированных инсерциями Т-ДНК или транспозонов(Winkleretal., 1998; Krysanetal., 1999; Meissneretal., 1999; Speulmanetal., 1999; Tissieretal., 1999).



Рисунок 2. Принцип организации пулов семян и ДНК (слева) и этапы (справа) выявления инсерций Т-ДНК в гене (Krysanetal., 1999). 5' и 3' - обозначение специфических праймеров к интересующему гену; T-ДНК L и T-ДНК R -праймеры к разным концам Т-ДНК.

Для выявления маркированных инсерцией генов с помощью ПЦР-скрининга очень удобны коллекции линий, содержащих в геноме множественные инсерции. Так, например, у A. thaliana получены линии, содержащие множественные инсерциитранспозонов кукурузы En/I(по 20-25 инсерций в каждой линии(Speulmanetal., 1999). Линии с множественнымиинсерциями сложно использовать для мутационного анализа, но они позволяют сводить к минимуму усилия по выявлению интересующих семейств генов.

Новые возможности для экспериментальной реализации идей "обратной" генетики связаны с открытием и исследованием механизма РНК - интерференции - направленного замолкания генов.

3. Особенности инсерционного мутагенеза растений

У микроорганизмов и животных для инактивации генов также используется инсерционный мутагенез. После встраивания инсерции в клонированную копию гена, благодаря гомологичной рекомбинации, удается заместить интактный ген мутантным. Поэтому под термином инсерционный мутагенез чаще всего подразумевают направленнуюинактивациюинсерцией любого интересующего исследователя гена (это так называемые «knock-out» мутации). У высших растений метод замещения интактного гена его мутантной копией имеет низкую эффективность, поскольку в этом случае преобладают события незаконной рекомбинации. Поэтому под инсерционным мутагенезом у растений, как правило, понимают не мутагенез известных последовательностей, а случайную (или частично направленную, см. ниже) индукцию мутаций в геноме клеток растений.

Направленнаяинактивация генов или внесение требуемых изменений в любой ген растения путем замещения его исходной копии инсерцией, содержащей его модифицированную версию, пока осуществляется с очень низкой эффективностью. Очевидно, что работы по созданию у растений возможностей направленной инактивации генов чрезвычайно актуальны для создания новых сортов высокопродуктивных и устойчивых к стрессовым факторам видов хозяйственно ценных растений. В настоящее наметилось несколько направлений решения этой важной задачи.

Во-первых, опробованы способы создания более эффективного отбора трансгенных растений с инсерциями за счет гомологичной рекомбинации. С этой целью используются специальные негативные маркерные системы, которые вызывают гибель растений, включивших инсерции в негомологичные районы генома. Эффективность такой стратегии опробована на рисе.

Во-вторых, созданы специальные рекомбинантные гены, продукты которых содержат эндонуклеазныйдомен слитый с доменом "цинковые пальцы", который обеспечивает специфическое связывание с определенными нуклеотидными последовательностями длиной в 9 пн. Такие слитые гены после их передачи путем трансформации в растения способны увеличить частоту двунитевых разрывов ДНК в нуклеотидных последовательностях, граничащих с сайтами связывания "цинковых пальцев". Это приводит к активации рекомбинации и репарационных процессов в этих последовательностях, которые могут приводить к замене исходной копии гена на модифицированную, также привнесенную путем трансформации.

Третьим подходом для решения задачи направленного изменения активности определенных генов является так называемая РНК-интерференция (замолкание генов). Этот подход в отличие от вышеупомянутых не приводит к увеличению частоты гомологичной рекомбинации или облегчению поиска инсерций в гомологичные районы, но используется для "выключения" любых генов по желанию экспериментатора. Таким образом, РНК-интерференция может приводить только к "замолканию" (инактивации) генов, но не способна вызывать направленную модификацию за счет замещения растительного гена на его модифицированную трансгенную копию.

В основе РНК-интерференции также лежит трансформация растений и получение инсерций специально сконструированных последовательностей чужеродной ДНК в растительный геном. Поэтому РНК-интерференцию можно рассматривать как одну из особых разновидностей инсерционного мутагенеза, которая сегодня используется для "выключения" любых генов как у растений, так и у животных. Более подробно этот метод будет рассмотрен в разделе 7.

4. Типы инсерционных мутагенов и их особенности

Инсерционный мутагенезсвязан со встраиванием в геном растений любых протяженных последовательностей ДНК, как правило, имеющих известную структуру. Наибольшие успехи достигнуты при использовании природных инсерционных агентов (Bouchez, Hofte, 1998). У высших растений известны следующие типы природных инсерционных мутагенов:

Т-область (Т-ДНК) Ti- и Ri-плазмид почвенной агробактерии Agrobacteriumtumefaciens, природная система переноса генов которой получила чрезвычайно широкое распространение при создании векторов для трансформации двудольных растений, таких как петуния, табак, томат, горох, фасоль и многие др. (Feldmann, Marks, 1987; Пирузян, 1988; Azpiroz-Leehan, Feldmann, 1997; Krysanetal., 1999; Филипенко и др., 2000). Мутагенез, вызванный внедрением в растительный геном участков ДНК Ti-плазмиды агробактерии, называют инсерционным или Т-ДНК-мутагенезом.

Подвижные генетические элементы (растительные транспозоны). У кукурузы и других растительных объектов, имеющих активные транспозоны, возникновение мутаций в результате инсерциитранспозонов в новые участки генома, происходит постоянно (McClintok, 1948). Хорошо изученные транспозоны кукурузы, львиного зева и петунии могут использоваться для индукции мутаций в геноме растений, у которых нет активно перемещающихся собственных транспозонов, или они мало изучены, как в случае A. thaliana (Speulmanetal., 1999). Передача транспозонов кукурузы в растения других видов, как правило, осуществляют с помощью векторов на основе Ti - плазмидAgrobacteriumtumefaciens. После встраивания Т-ДНК в геном растения-реципиента транспозон может выйти из состава Т-ДНК и начать собственные перемещения по новому геному.

Транспозоны как и Т-ДНК могут встраиваться в кодирующие участки генов, полностью нарушая экспрессию гена или функцию его продукта. При встраивании в регуляторные области гена может наблюдаться ослабление или усиление уровня генной экспрессии. Но нередко сами мобильные элементы содержат регуляторные элементы. В таких случаях экспрессия генов, соседствующих со вставкой, может претерпевать сложные изменения, в том числе с переходом на новые способы регуляции.

При экспериментальном получении инсерционных мутантов в настоящее время используются как Т-ДНК, так и транспозоны. Особенности протекания процесса получения инсерционных мутантов зависит от типа использующихся инсерций (транспозоны или Т-ДНК).

Известно, что при химическом мутагенезе в геноме обнаруживаются «горячие точки», где мутации возникают чаще, чем в других местах генома. Инсерции Т-ДНК распределяются по геному растений равномерно, без выраженных «горячих точек» (Azpiroz-Leehan, Feldman, 1997), хотя выявлено предпочтительное встраивание Т-ДНК в А-Т богатые районы интронов и межгенных областей (Speulmanetal., 1999; Brunaudetal., 2002), транспозонный мутагенез на этапе внедрения Т-ДНК, в составе которой находится транспозон, является таким же случайным процессом, как и Т-ДНК - мутагенез, однако дальнейшие перемещения транспозона по геному не случайны. Транспозоны, как правило, перемещаются на небольшие расстояния (например, в 2 случаях из 3х элемент Ds перемещается на расстояние не более 10сМ, а в 1 случае из 3х - на расстояние 1сМ). Эта неслучайность позволяет планировать эксперименты по поиску инсерциитранспозона в конкретный ген. Для этого среди многих полученных трансформированных растений нужно отобрать трансформант, содержащий Т-ДНК именно в том районе хромосомы, где локализован исследуемый ген. Существует достаточно большая вероятность того, что среди потомков этого трансформанта будет обнаружен инсерционный мутант по интересующему гену.

Инсерционный Т-ДНК мутагенез включает в себя процедуру трансформации растений агробактерией, во время которой и происходит передача Т-ДНК, входящей в состав плазмиды бактерии. Благодаря разработке эффективных методов трансформации inplanta этот метод может использоваться для массового получения трансформированных растений, в семенном поколении которых (в Т2 и Т3) выявляют инсерционные мутации (т.е. по технике выявления мутантов он сравним с традиционными методами мутагенеза). Для получения новых инсерционных мутаций необходимо проводить новый этап трансформации. В отличие от Т-ДНК, транспозоны способны постоянно перемещаться по геному, поэтому, однажды полученная линия с транспозоном может использоваться для выявления все новых мутаций в последующих семенных поколениях. Таким образом, транспозонный мутагенез обычно более растянут по времени, редко используется для массового получения инсерционных мутантов, а для его проведения можно обойтись без трансформации (достаточно выписать из банка семян ранее полученные линии с транспозонами).

При Т-ДНК мутагенезе в геном растения обычно встраиваются несколько копий Т-ДНК, что затрудняет анализ инсерционных мутантов и дальнейшее клонирование генов без проведения сегрегационного анализа. Передвижение транспозона по геному с помощью нерепликативной транспозиции обеспечивает его присутствие в геноме в единичной копии.

Поскольку транспозонный мутагенез чаще используют для получения мутаций в определенном участке хромосомы, то для достижения этой цели проводят специальные скрещивания и отбор растений, у которых транспозон сцеплен с интересующим участком генома. Необходимость временных затрат на этот этап компенсируется тем, что при транспозонном мутагенезе отпадает необходимость проведения генетического анализа инсерционных мутантов, которые при Т-ДНК мутагенезе необходимы для доказательства наличия сцепления места инсерции с фенотипическими изменениями (т.е. для доказательства инсерционной природы мутации). Продолжающиеся транспозиции мобильныхэлеменов приводят к появлению мозаиков. Мозаицизм потомков транспозонного мутанта доказывает инсерционную природу мутантных секторов, что дает возможность клонировать ген без дальнейшего анализа на совместное наследование инсерции и мутации (как при Т-ДНК-мутагенезе). Возникновение мозаиков открывает также возможность для клонального анализа и позволяет судить о возможностях перемещения продукта гена в другие клетки.

5.Т-ДНК мутагенез

Получение инсерционных мутантов основано на генетической трансформации растений с использованием почвенной бактерии Agrobacteriumtumefaciens. Трансформация растений осуществляется с помощью Ti (tumorinducing) - плазмиды. Плазмида имеет размер около 23 тпн и содержит гены, необходимые для поддержания плазмиды в бактериальной клетке (ori - сайт инициации репликации), участок, непосредственно встраивающийся в геном растений (Т-ДНК - трансформирующая область), и участки, помогающие осуществить перенос Т-ДНК в растительный геном (vir - область). В естественных условиях трансформация приводит к возникновению опухолей (корончатых галлов) на растениях за счет экспрессии в клетках растений агробактериальных генов синтеза ауксина и цитокинина (эти гены располагаются в так называемой онкогенной области Ti-плазмиды). Помимо генов синтеза гормонов в Т-ДНК имеются гены синтеза необычных аминокислот - опинов (нопалинов, октопинов и др.). В экспериментах по трансформации и инсерционному мутагенезуиспользуют «разоруженные» Ti - плазмиды, из которых удалены



Таблица 1. Маркерные гены, экспрессирующиеся в растениях.

Ген (другие его обозначения), источник гена	Фермент	Признак
Селективные гены
NptII (kanR) транспозонТ5	NPTII-неомицин-фосфотрансфераза	устойчивость к неомицину и канамицину
hpt(hygR) E.coli	гигромицин-фосфотрансфераза	устойчивость к гигромицину
catтранспозонTn9	CAT -хлорамфеникол-ацетил трансфераза	устойчивость к хлорамфениколу
ALSтабак	ацетолактатсинтаза	устойчивость к хлорсульфурону
spt (sptR)	стрептомицин-фосфотрансфераза	устойчивость к стрептимицину
bar (BASTA) Streptomyces hygroscopicus	фосфинотрицинацетил-трансфераза	устойчивость к фосфино-трицину (гербициду BASTA)
Репортерные гены
uidA(GUS) E.coli	GUS - Я-глюкуронидаза	расщепление глюкуронидов (выявляют калорометрически и флюорометрически)
Gfp медуза	GFP- зеленый флуорес-цирующий белок	флуоресценция в УФ
Lux Vibrioharvey, светлячок	люцифераза	окисление флавинмоно-нуклеотида и алифатических альдегидов, вызывающее биолюминесценцию
NosA.tumefaciens	нопалинсинтаза	образование нопалинов
OcsA.tumefaciens	октопинсинтаза	образование октопинов

гены синтеза гормонов. Гены синтеза опинов, которые раньше использовались как маркерные, в настоящее время также обычно удаляются. Вместо них в Т-ДНК встраивают маркерные гены (табл. 1).

Используются как коинтегративные, так и бинарные системы векторов (Рыбчин, 1999). В бинарной системе Т-ДНК и vir-область находятся в агробактериях на разных совместимых плазмидах, эти векторы более компактны, но они содержат селективные, маркерные или репортерные гены и обладают всеми необходимыми качествами для проведения инсерционного мутагенеза (Hellensetal., 2000).

Бинарные векторы более просты и поэтому наиболее часто используются при получении трансгенных растений.

Интеграция в геном растений Т-ДНК, как правило, вызывает так называемые «nul» мутации, связанные с потерей функции гена, что в случае летальности гомозигот по инсерции значительно затрудняет идентификацию этого конкретного гена. Наряду с этим созданы векторы, Т-область которых содержит сильный конститутивный промотор (энхансер). Энхансеры эукариот обладают особенностями, отличающими их от других последовательностей, участвующих в регуляции транскрипции. Это дискретные элементы - протяженные последовательности, которые содержат сайты связывания нескольких факторов транскрипции (Blackwood, Kadonaga, 1998). Использование энхансерных векторов (их также называют векторами-активаторами), инсерция Т-ДНК которых может вызывать увеличение в десятки и сотни раз уровня экспрессии как близлежащих генов, так и генов, отдаленных на несколько десятков тысяч пар нуклеотидов, значительно увеличивает долю доминантных инсерционных мутаций (Weigeletal., 2000). В настоящее время широко используются повторы энхансеров промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35S). Пример таких векторов, созданных в лаборатории D. Weigel, приведен на рис. 3.

Сведения о векторах, используемых для получения инсерционных мутантов в лаборатории изменчивости генома проф. В.А. Тарасова (ИОГен РАН), приведены в модуле 3. Там же будут рассмотрены более подробно все этапы экспериментов по инсерционному Т-ДНК - мутагенезу.

6.Транспозонный мутагенез

Используют однокомпонентную и двухкомпонентную системы транспозонного мутагенеза. В однокомпонентной системе транспозонный мутагенез вызывается перемещением по геному автономного мобильного элемента (например, Ac элемента кукурузы), который содержит в своем составе ген транспозазы под контролем конститутивного промотора CaMV 35S и необходимые для транспозиции инвертированные повторы на 5' и 3' концах (Рис.4). О присутствии автономного элемента в геноме судят по проявлению маркерных генов, введенных в состав транспозона (например, генов hpt, bar и др., см. Табл.1). Как правило, сам Ac элемент встраивают в ген spt (Табл.1) или другой ген устойчивости к антибиотикам или гербицидам, входящий в состав Т-ДНК вектора, с помощью которого мобильный элемент был перенесен в растения A. thaliana. Это приводит к инактивации маркерного гена. В результате эксцизии Ас из состава Т-ДНК, происходит восстановление функции маркерного гена и растения становятся устойчивыми к стрептомицину. Контроль за дальнейшими перемещениями автономного элемента по геному не проводится, однако частоту транспозиций автономного элемента можно контролировать, если входящий в его состав ген транспозазы подставить под контроль индуцибельного промотора (например, промотора гена теплового шока).

При появлении в линии с автономным элементом растений с морфологическими изменениями об инсерционной природе изменений судят по наличию мозаицизма (соматических реверсий к исходному фенотипу) у потомков. При необходимости, для этой же цели можно провести анализ совместного наследования мутантного фенотипа и маркерных генов, входящих в состав самого транспозона (например, гена гигромицин-устойчивости).

Духкомпонентнаясистематранспозонного мутагенеза основана на совместном использовании двух элементов - модифицированного автономного элемента - источника транспозазы и неавтономного элемента (рис. 5). Для транспозонного мутагенеза A. thaliana чаще всего используют транспозоны кукурузы.

Перемещение неавтономного элемента (Ds или dSpm), не имеющего гена транспозазы в своем составе, происходит благодаря присутствию второго элемента (модифицированного Ac или Spm), который является источником транспозазы, но утрачивает способность к выходу из состава Т-ДНК и самостоятельным перемещениям. Это может достигаться с помощью делеции важных для транспозиции участков автономных элементов - например, делецией фланкирующих повторов.

Работа по транспозонному мутагенезу с двухкомпонентной системой состоит из нескольких этапов:

1. С помощью трансформации A.tumefaciens в составе Т-ДНК раздельно (в независимых экспериментах) передаются источник транспозазы (модифицированный автономный элемент) и неавтономный элемент. В результате получают две линии A. thaliana: линию, содержащую в составе Т-ДНК источник транспозазы, и линию, имеющую в области Т-ДНК неавтономный элемент. О наличии в геноме инсерций Т-ДНК судят по проявлению генов устойчивости к антибиотикам, маркирующих Т-ДНК. Для дальнейшей работы отбирают те линии трансформантов, которые содержат только одну инсерцию Т-ДНК в геноме.

2. Скрещивая растения двух линий (имеющей в геноме источник транспозазы и имеющей неавтономный элемент), получают гибриды F1, в геноме которых имеются оба элемента. В клетках полученных гибридов под влиянием транспозазы неавтономный элемент начинает перемещаться по геному. Поскольку большинство возникающих мутаций являются рецессивными, их можно обнаружить только в следующем семенном поколении (при условии, что мутации возникли в инициальных клетках). Чтобы убедиться в том, что транспозиции неавтономного элемента действительно происходят, автономный элемент вводят в ген устойчивости к антибиотику, что нарушает его работу (например, ген spt, определяющий устойчивость к стрептомицину, рис. 9). При эксцизии автономного элемента из Т-ДНК работа маркерного гена восстанавливается и по устойчивости к антибиотику можно убедиться в наличии эксцизий. Для контроля за присутствием в геноме неавтономного элемента и его выходом из Т-ДНК судят по проявлению дополнительных маркерных генов, которые входят в состав самого элемента.

3. Поиск видимых мутаций, вызванных инсерциейтранспозона. Их можно обнаружить, начиная с F2 поколения.

4. По наличию соматических реверсий, связанных с выходом транспозона из интересующего гена (вторичной транспозицией), подтверждают, что полученная мутация имеет инсерционную природу.

5. После обнаружения инсерционной мутации для дальнейших экспериментов по клонированию гена «вытягиванием гена за транспозон» следует выбрать растение, в котором транспозон прекращает дальнейшие перемещения и постоянно находится в исследуемом гене (маркирует его). С этой целью в той же семье, где был обнаружен мутант, или в его семенном потомстве, отбирают растения, которые не имеют маркеров Т-ДНК области, в состав которой входит источник транспозазы. В качестве негативных условных селективных маркеров Т-ДНК используют гены цитозиндеаминазы (codA) и цитохромаP450 (SU1), вызывающие чувствительность растений к 5-флуорцитозину и фотодинамическому гербициду R7402, соответственно. Часто применяется генIAAH, кодирующий гидролазу индолацетамида, который делает растения чувствительными к аналогу гербицида - нафтален-ацетоамину (NAM). При выращивании проростков в присутствии NAM выживают только те, которые не содержат в геноме ген IAAH, а следовательно и Т-ДНК. В таких растениях инсерция неавтономного элемента оказывается закрепленной в определенном месте.

Если маркировать негативным селективным маркером не только Т-ДНК, в состав которой включен источник транспозазы (модифицированный автономный элемент), но и неавтономный элемент, то с помощью NAMможно отбирать проростки cинсерцией неавтономного элемента в область, не сцепленную с первоначальным местом его локализации в геноме в составе Т-ДНК (рис. 6). Как уже отмечалось, частота перемещений транспозона в области, удаленные на расстояние >10 сМ от первоначальной локализации, или в другие хромосомы невелика. Тем не менее, растения, в которых произошли эти редкие события, можно отобрать на селективной среде. Такой прием позволяет использовать транспозонный мутагенез для получения мутаций в разных областях генома.

Рисунок 6. Контроль за эксцизией транспозона из области Т-ДНК (Parinovetal., 1999). Только после перемещения транспозона в удаленный район той же (1) или другой хромосомы (2) в семенном потомстве можно найти растения, устойчивые к NAM. При перемещении в сцепленные участки хромосомы (3) рекомбинация между геном IAAH и транспозоном маловероятна и потомки не проявят устойчивости к NAM. Исключением являются случаи транспозиции внутрь самого гена IAAH (4), которые могут нарушить его работу и привести к появлению устойчивости к NAM у потомства

Возможность управлять активностью перемещений Ds элемента с помощью отбора растений с геном транспозазы или без него является важнейшим преимуществом двукомпонентной системы транспозонного мутагенеза в сравнении с однокомпонентной. Скрестив растение со стабилизированным транспозоном с растением, имеющим источник транспозазы, можно вновь вызвать перемещения неавтономного элемента. В то же время однокомпонентная система значительно проще двукомпонентной системы в методическом отношении.

В настоящее время в международных банках семян содержатся линии A. thaliana, которые могут быть использованы дляодно- и двухкомпонентного транспозонного мутагенеза. Если задача заключается в насыщении мутациями определенного района хромосомы, то заранее можно выбрать линию, содержащую инсерцию Т-ДНК с транспозоном в интересующем районе хромосомы. Сведения о локализации инсерций имеются в базах данных.

Транспозонный мутагенез используется и для получения мутаций в конкретном гене (для получения дополнительных аллелей, для клонирования методом «вытягивания за транспозон»). С этой целью также используются линии с транспозонами, локализованными близко от интересующего гена. Если в распоряжении исследователя уже имеется рецессивная мутация, полученная в результате химического или радиационного мутагенеза, то для маркирования гена целесообразно вводить транспозон в растение, гетерозиготное по ранее полученной мутации. В этом случае инсерция в аллель дикого типа будет приводить к появлению мутантных секторов уже у гибридов F1 поколения.

При введении в состав транспозонаэнхансеров получают возможность увеличить выход доминантных мутаций, связанных с усилением экспрессии генов (как и в случае энхансерных векторов для проведения Т-ДНК-мутагенеза, см. выше).

7. Использование инсерционного мутагенеза для инактивации генов на основе явления РНК-интерференции

Явление замолкания генов. Открытие процесса замолкания генов является одним из самых удивительных и значительных открытий в генетике, произошедших на рубеже 20 и 21-го веков. Эффект замолкания генов, в основе которого лежит распознавание нуклеотидных последовательностей РНК или ДНК, был обнаружен в растениях, грибах и животных (Fagard, Vaucheret, 2000; Ding, 2000; Faugeron, 2000; Birchleretal., 2000). Этот процесс, протекающий в клетках эукариот, играет существенную роль в защите растений от вирусов и защите генома от массового перемещения мобильных элементов.

В растениях обнаружены два процесса, приводящие к подавлению функции индивидуальных генов. Это, во-первых, посттранскрипционное замолкание гена (PTGS), которое обусловлено направленной деградацией гомологичной РНК в цитоплазме. Во-вторых, замолкание гена в результате процесса РНК - направленного метилирования ДНК (RdDM), при котором РНК индуцирует эпигенетические модификации гомологичной последовательности ДНК (Wassenegger, 2000).

Впервые данные о существовании явления посттранскрипционного замолкания гена (PTGS) были получены в 1990 году в опытах с петуньей, когда Рич Йоргенсен с коллегами интродуцировал в геном этого растения ген халкон-синтазы (ключевой ген биосинтеза антоцианов) с целью усиления пурпурной окраски цветков. При этом структурная часть этого гена вводилась в смысловой (sense) и в качестве контроля в обратной (antisense) ориентации. Результат оказался неожиданным - в трансгенных растениях окраска цветков вне зависимости от ориентации интродуцированного гена не усиливалась, а исчезала (Napolietal., 1990). Оказалось, что исчезновение окраски было связано с тем, что в трансгенных растениях подавлялась функция не только интродуцированного гена, но и собственного гена петуньи, гомологичного трансгену. Это явление получило название косупрессии. Аналогичное явление описано у гриба Neurosporacrassa(Romano, Macino, 1992) и нематоды Caenorhabditiselegans. В исследованиях на нематоде был сделан существенный шаг в понимании механизмов, лежащих в основе явления замолкания генов. Именно в опытах с нематодой обнаружено, что индуктором этого процесса, получившего название «РНК - интерференция» (RNAi), является не однонитевая, а двунитевая РНК (dsRNA) (Rocheleauetal., 1997; Fireetal., 1998).

Механизм посттранскрипционного замолкания генов. Основой для запуска РНК - обусловленного замолкания генов является наличие в клетке двунитевой РНК (dsRNA). Эта двунитевая РНК распознается и связывается с ферментом, получившим название «игрок в кости» (Dicer). Этот фермент имеет несколько функционально значимых доменов - АТФ - зависимую РНК - хеликазу, два расположенных тандемно домена РНКазы III и домен связывания с двунитевой РНК (Bernsteinetal., 2001). Фермента расщепляет двунитевую РНК на фрагменты размером 21-25 пн с двумя свободными нуклеотидами на 3-ОН концах образовавшихся коротких двунитевых структур. Таким образом, приблизительно двадцать молекул малых интерферирующих РНК (siRNA или smallinterferingRNAs) возникают при деградации одной двунитевой РНК размером 500 пн (рис. 7) (Hammondetal., 2000).

Каждая молекула dsRNA связывается с полибелковым комплексом RISC. В последние несколько лет установлено, что только одна из двух нитей siRNAфункционально активна. Эта нить получила название «guidestrand» (направляющая нить), противоположная нить функционально пассивна и она подвергается деградации в процессе активации комплекса RISC.

Рисунок 7. Схема РНК - обусловленного посттранскрипционного замолкания генов (по Hammondetal., 2000)

После связывания с короткими однонитевыми siRNA комплекс RISC связывается с информационной РНК, имеющей участки гомологии с siRNA и расщепляет ее. Деградация информационной РНК вызывает посттранскрипционное замолкание гена.

В клетках растений обнаружен и дополнительный механизм, усиливающий эффективность процесса посттранскрипционного замолкания. Этот механизм связан с образованием дополнительных вторичных siRNA. Показано, что siRNA (Sijenetal., 2001) или даже короткие антисмысловые РНК (Tijstermanetal., 2002) могут выступать в качестве праймеров для специфической РНК - зависимой РНК-полимеразы (RdDP) (рис. 8). Возникающие при этом протяженные dsRNA - молекулы служат субстратом для белка Dicer и затем для полибелкового комплекса RISC.

Рисунок 8. Образование двунитевой РНК при действии РНК - зависимой РНК-полимеразы. Информационная РНК при этом выступает в качестве матрицы, в то время как возникающие короткие антисенс РНК служат праймерами при протекании этого процесса. В дальнейшем возникшая двунитевая РНК подвергантся расщеплению при действии фермента Dicer

РНК - направленное метилирование ДНК. Впервые это явление было обнаружено в случае инфекции табака РНК - содержащими вирусами (Jonesetal., 1998), а затем при интродукции в геном растений трансгенов (Metteetal., 1999). В настоящее время установлена связь между наличием dsRNA и метилированием ДНК, обусловленная взаимодействием между гомологичными последовательностями РНК и ДНК (Wassenegger, 2000; Beclinetal., 2002). РНК - направленноеметилирование ДНК реализуется либо в посттранскрипционноезамолкание (PTGS), либо в транскрипционное замолкание (TGS) генов. В последнем случае метилированию подвергается промотерная, а не структурная часть генов (Aufrsatzetal., 2002). Хотя сам факт существования процесса РНК - направленного метилирования ДНК не вызывает сомнений, механизм этого явления остается до конца не выясненным. Существует ряд данных, указывающих на связь между процессом РНК - направленного метилирования ДНК и функцией РНК - зависимой РНК - полимеразы (Beclinetal., 2002; Elmayanetal., 1998).

МикроРНК (miRNA) и ее функции. Явления замолкания генов под влиянием малых двунитевыхdsRNA возникают не только при попадании в геном эукариот чужеродной ДНК (вирусной, привнесенной путем трансгенеза). Оказалось, что dsRNA и связанное с ними явление РНК-интерференции являются важнейшим механизмом регуляции экспрессии генов. Эти dsRNA кодируются в геноме растений и животных специальными генами (их часто называют MIR-генами), имеющими специфическую нуклеотидную структуру. В составе MIR-генов имеются пространственно разделенные инвертированные последовательности. Транскрипция MIR-генов приводят к образованию шпилькообразного транскрипта и участка двунитевых РНК за счет взаимодействия гомологичных инвертированных повторов. Появление в клетке двунитевых РНК запускает механизмы, подобные выше описанным. На первом этапе первичный шпилькообразный транскрипт подвергается деградации ферментом Dicer. У Arabidopsis обнаружены четыре Dicer - подобных фермента (DCL1-DCL4) (Bartel, 2004). Показано, что один из этих ферментов (DCL1) непосредственно катализирует несколько последовательных этапов превращения шпилькообразной структуры информационной РНК в короткие 21 - 26 п.н. фрагменты miRNA (Bartel, 2004; Kurihara, Watanabe, 2004).

MiRNA не обнаружены у одноклеточных организмов, таких как почкующиеся и делящиеся дрожжи, тогда как у животных и растений количество высоко экспрессирующихсяmiРНК может достигать более чем 104 копий на клетку.miRNA весьма разнообразны по нуклеотидному составу, при этом гомологий между сотнями растительных и животных miРНК не выявлено.

Основной биологической функций miRNA является негативная регуляция транскрипции генов. Возможность такой регуляции обусловлена гомологией между нуклеотидной последовательностью miRNA и участками информационной РНК и ДНК генома эукариотической клетки. Механизмы замолкания генов под влиянием miRNA похожи на те, которые лежат в основе действия siRNA и рассмотрены выше. Отметим также, что в ряде случаев нуклеотидные последовательности miRNA и siRNA, гомологичные части промоторов, могут увеличивать транскрипцию соответствующих генов, возможно за счет деметилирования гистонов.

Интерференция РНК как инструмент идентификации функции генов. Открытие механизмов РНК-интерференции открыло возможности экспериментально контролируемого направленного подавления функции отдельных генов у широкого круга организмов, в том числе и у высших растений.

В настоящее время показано, что введение в геном генно-инженерных конструкций, кодирующих синтез РНК, структура которых содержит шпильки (hpRNA), с высокой эффективностью приводит к подавлению функций как эндо- , так и трансгенов, а также сопровождается увеличением резистентности к вирусам у высших растений (Sijenetal., 2001). На примере плазмидыpKannibal представлена схема экспериментально индуцированного замолкания генов у растений (рис. 9).

В случае двудольных растений введение в геном трансгенов, при транскрипции которых образуются hpRNA, осуществляется как правило с помощью агробактериальной трансформации, когда эти трансгены находятся в структуре Т-ДНК. Поскольку вызывающие интерференцию последовательности ДНК входят в состав инсерции, экспериментально вызванную интерференцию РНК можно рассматривать как разновидность инсерционного мутагенеза. Примером векторов такого рода могут являться pHannibal и pKannibal. Такое специфическое подавление функции генов с использованием механизмов РНК-интерференции получило название «нокдаун» («knockdown»), в отличие от термина «нокаут» («knockout»), который используется для полного подавления функции гена ), например, в случае инсерционных мутантов.

Рисунок 9. Схема экспериментально индуцированного замолкания генов у растений с использованием вектора pKannibal. 1ый этап заключается в амплификации фрагмента ДНК исследуемого гена; 2ой этап связан с клонированием амплифицированного фрагмента ДНК в прямой и обратной ориентации в плазмидуpKannibal; 3ий этап заключается в переклонировании созданной конструкции, содержащей амплифицированные фрагменты ДНК исследуемого гена в бинарный вектор, с помощью которого затем осуществляется агробактериальная трансформация растений.

Обнаружение РНК - направленного специфического подавления функции конкретных генов и разработка методов экспериментального получения «нокдаун» - мутаций открыла широчайшие возможности для идентификации функции генов методами «обратной» генетики.

8. Методы трансформации A. thaliana с помощью Agrobacteriumtumefaciens

Молекулярно-генетические механизмы агробактериальной трансформации подробно описаны в целом ряде публикаций (Пирузян, 1988; Дрейпер и др., 1991; Лутова и др., 1998;Чумаков, 2001). В связи с этим мы ограничимся лишь кратким рассмотрением методов трансформации.

Для A. thaliana разработано большое число эффективных методов трансформации с помощью A. tumefaciens, в том числе методов, которые неприменимы для других растительных объектов.



Рисунок 10. Классификация основных методов трансформации растений A. thaliana.

При трансформации тканей insitu(другое его название - трансформация invitro) проводят сокультивирование с агробактерией различных органов растений: корней,листьев, семядолей и стеблей. Затем органы помещают на среду для индукции каллусогенеза, в состав которой входят и антибиотики, препятствующие развитию агробактерии. Кроме того, в среду вводят селективный агент (канамицин, гигромицин), создающий условия для преимущественного развития трансформированных клеток (маркерные гены устойчивости к этому агенту интегрированы в область Т-ДНК). Полученные каллусные ткани пересаживают на среду побегообразования (также с селективным агентом). После укоренения побегов получают трансформированные растения.

Метод трансформации insitu, как правило, позволяет получить очень высокую долю (40-90%) трансформированных растений среди всех полученных регенерантов. Однако этот метод имеет ряд существенных недостатков: (1) требует больших временных и материальных затрат, связанных с работой с культивируемыми тканями; (2) не пригоден для массового получения трансформированных растений; (3) в процессе культивирования invitro возникают сомаклональные мутации, эпигенетические изменения и морфозы, которые существенно осложняют дальнейшую работу с трансформированными растениями - регенерантами (приводят к развитию стерильности, делают необходимым проведение генетического анализа и возвратных скрещиваний для освобождения от большого числа не связанных с инсерцией мутаций, возникших в результате сомаклональной изменчивости).

Трансформация incellклеток и протопластов пригодна для массового получения трансформантов, однако не лишена всех других недостатков первого подхода, так как получение растений-регенерантов из клеток и протопластов неизбежно включает в себя этапы работы с культурой invitro. Подавляющее большинство мутаций у растений-регенерантов при трансформации incell имеет неинсерционную природу (Feldmann, Marks, 1987; Konczetal., 1992).

Наибольшее распространение при получении инсерционных мутантов приобрели методы трансформации inplanta: (1) метод трансформации семян; (2) метод инокуляции агробактериальной суспензии в срезы стеблей (см. следующий раздел); (3) метод трансформации целых растений с помощью вакуумной инфильтрации, когда растения на стадии бутонизации помещают в жидкую культуру агробактерии и после кратковременного применения вакуума вновь высаживают в почву.Сейчас используют модификацию данного метода, которая получила название «floraldip»: в жидкую культуру агробактерии на несколько секунд погружают не все растение, а только цветоносы растущих в горшочках растений (вакуум не используют), после чего растения доращивают до созревания семян (протокол этого метода имеется на сайте http://www.arabidopsis.org /info/transformation.jsp).

Именно методы трансформации inplanta позволили провести крупномасштабные эксперименты по инсерционному мутагенезу, направленные на насыщение инсерциями генома A. thaliana.

Необходимо подчеркнуть, что при использовании трансформации inplanta независимо от того, обрабатываются ли суспензией агробактерий семена, срез стебля или целое цветущее растение поколения Т1 выявляются лишь инсерционные мутации, возникающие в клетках генеративного пути. Это связано с тем, что отбор трансформированных растений начинается лишь в следующих после трансформации поколениях растений Т2 и Т3. В отличие от традиционных методов мутагенеза, большинство рецессивных инсерционных мутаций удается выявить лишь в Т3 поколении. Это объясняется способностью агробактерий долгое время находиться в тканях растения, но осуществлять трансформацию после прохождения мейоза в клетках цветка. Интеграция Т-ДНК в геном растений происходит в подавляющем большинстве случаев в яйцеклетках (cм. обзор Bent, 2000). Это доказано с помощью изучения потомков, полученных после реципрокных скрещиваний обработанных культурой агробактерии и контрольных растений.



При опылении контрольных растений пыльцой с трансформированных растений среди потомства не было обнаружено трансформантов, но они выявлялись среди потомков, полученных от опыления материнских трансформированных растений пыльцой контрольных растений (рис. 11).

Яйцеклетки, развивающиеся в одном цветке, могут служить мишенями для независимых инсерций Т-ДНК, что согласуется с фактом обнаружения независимых инсерций в потомстве одного растения. Таким образом, в отличие от химического и радиационного мутагенеза, при котором наследуемые потомками мутации возникают в нескольких (обычно двух) инициальных клетках, мишенями для инсерционного мутагенеза являются сотни клеток (яйцеклеток) одного растения. Ограничением для возникновения в них мутаций являются только временные параметры: инсерции Т-ДНК в геном яйцеклеток наблюдаются только в том случае, если после инокуляции до момента опадания органов цветка проходит не менее 5 дней (рис. 11).



9. Выделение генов, маркированных инсерцией

Чужеродная ДНК не только вызывает мутации в геноме растений, но и служит зондом для последующего выделения участков растительной ДНК, фланкирующих сайт инсерции. Данный метод выделения генов, основанный на использовании инсерционных мутантов, получил название метода “вытягивания генов за транспозон (Т-ДНК)” или метода “маркирования генов с помощью транспозона или Т-ДНК” (“genetagging”).

Для выделения генов, маркированных инсерцией ДНК, используют несколько подходов.

1-й подход основан на скрининге геномной библиотеки из инсерционных мутантов с использованием в качестве зонда участка Т-ДНК агробактерии или транспозона. Такой скрининг позволяет находить клоны, где наряду с Т-ДНК или транспозоном содержатся участки тех растительных генов, в которые встроена инсерция чужеродной ДНК. После субклонирования выделенные фрагменты растительной ДНК используются в качестве зонда для поиска полномерной копии гена в библиотеках кДНК или геномных библиотеках из растений дикого типа. Сейчас, благодаря наличию информации о последовательности всего генома A. thaliana, достаточно определить последовательность нуклеотидов клонированного фрагмента растительной ДНК для компьютерного поиска в геноме A. thaliana гомологичных последовательностей ДНК и интересующего гена.

2-ой подход. В том случае, если в область Т-ДНК включены гены устойчивости к антибиотикам, экспрессирующиеся в Escherihiacoli, используют так называемый метод «спасения плазмид». Его суть заключается в клонировании в E.coli фрагментов, образующихся при расщеплении определенной рестриктазой ДНК из инсерционных мутантов. Последующий отбор на устойчивость к антибиотику приводит к «спасению» только тех клонов бактерий, где есть участок Т-ДНК, несущий ген устойчивости к данному антибиотику. Вместе с этим участком может быть «спасен» и участок растительной ДНК, прилегающий к сайту инсерции. Далее следуют те же процедуры, что и в 1-м подходе.

3-й подход для выделения участков растительной ДНК, фланкирующей инсерцию, основан на использовании метода «инвертированной» полимеразной цепной реакции (рис. 12). На первом этапе проводят рестрикционноефрагментирование геномной ДНК мутантного растения и лигирование фрагментов с получением кольцевых молекул ДНК (Kuboetal., 1999). Затем в пределах инсерции подбираются двунаправленные праймеры для амплификации такой кольцевой структуры. Полученные фрагменты растительной ДНК используют так же, как и в первом подходе.

4-й подход. В последние годы для идентификации маркированных инсерцией генов широко используется другой подход, основанный на амплификации неизвестных последовательностей ДНК вблизи инсерции. Этотметодполучилназвание TAIL-PCR (thermalasymmetric interlaced, Liu et al., 1995).Для проведения TAIL-PCR применяют как специфические для инсерции ДНК транспозона или Т-ДНК праймеры, так и случайные вырожденные праймеры. В результате, интересующий исследователя фрагмент ДНК оказывается окаймленным специфическим для известной нуклеотидной последовательности инсерции праймером, с одной стороны, и случайным праймером, расположенным в пределах растительной ДНК, примыкающей к инсерции, с другой стороны.

Рисунок 12. Использование TAIL-PCR для амплификации последовательностей, фланкирующих инсерциютранспозона или Т-ДНК:

(а) - схема расположения праймеров в TAIL-PCR;

(б) - второй этап TAIL-PCR с использованием следующихпраймеров:

3 - ЛБ2, AD1; 4 - ЛБ1, AD1; 5 - ЛБ2, AD2; 6 - ЛБ1, AD2; 7 - ЛБ2, AD3; 8 - ЛБ1, AD3; 1 - лPstI , 2 - лEcoRI;

(в) - варианты 7 и 8 при большем увеличении (на 8-ой дорожке выделен фрагмент, отличающийся от предыдущего на 7-ой дорожке, на величину, равную шагу между специфическими праймерами ЛБ2 и ЛБ1).



Специально для TAIL-PCR с помощью компьютерного анализа нуклеотидной последовательности геномов различных видов разработаны и синтезированы серии эффективных стандартных наборов таких вырожденных праймеров(Liu, Whittier, 1995).Каждый набор серии содержит семейство коротких (10-12 пн) нуклеотидных последовательностей, по крайней мере одна из которых с высокой степенью вероятности присутствует в любом участке генома размером в несколько сотен нуклеотидов. Условия постановки и проведения TAIL-PCR подбираются с помощью общепринятых подходов.

В связи с использованием наряду со специфическим праймером короткого вырожденного праймера, для которого в геноме может быть несколько сайтов отжига, в реакционной смеси образуется много продуктов ПЦР разного молекулярного веса. Для исключения неспецифической амплификации применяется специальный прием, который заключается в использовании не одного, а трех (и более) специфических протяженных праймеров, комплементарных ДНК инсерции.