Проведение экспериментов по инсерционному мутагенезу на практических занятиях

Размещено на http://www.allbest.ru/

Контрольная работа

Проведение экспериментов по инсерционному мутагенезу на практических занятиях

Содержание

1. Трансформация Arabidopsis thaliana с помощью векторов на основе Ti- плазмиды Agrobacterium tumefaciens

2. Выявление трансформантов среди растений Т2 поколения

3. Выявление инсерционных мутантов, имеющих фенотипические изменения

4. Использование ПЦР-анализа для идентификации трансгенной природы трансформированных растений A. thaliana

Литература

1. Трансформация Arabidopsis thaliana с помощью векторов на основе Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens

Исходный растительный материал. В экспериментах по трансформации используются семена или растения расы Dijon или Kцln. Для трансформации семян необходимы свежие семена с 95-100% всхожестью. Обычно в эксперименте используют 4-5 тыс. семян, что составляет навеску в 80-100 мг (1000 семян A. thaliana весит 20 мг). В случае применения методов, вызывающих появление микротрещин в семенах с целью повышения эффективности трансформации (обработка ультразвуком, серной кислотой или хромпиком), необходимо увеличить выборку семян пропорционально неизбежной потере всхожести (ее определяют экспериментально до проведения эксперимента).

Для трансформации методом инокуляции in planta (Chang et al., 1994; Katavic et al., 1994) к началу практических занятий необходимо вырастить заранее 3-4-х недельные растения расы Dijon в почве.

Условия выращивания растений. Для посева трансформированных семян готовят ящики или кюветы со стерильной смесью 2 частей просеянной через сито почвы и 1 части песка. Общий размер посевной площади определяю исходя из выборки семян и плотности посева - 1 растение на 1 см².

Растения для трансформации методом инокуляции выращиваются в маленьких горшках диаметром 6-8 см по 4-5 растений на горшок. При проведении практикума в зимний период можно выращивать растения в установках с лампами дневного света при интенсивности освещения 3-5 тыс. люкс и 16-часовом фотопериоде. Оптимальной для выращивания A.thaliana является температура 21-24 °С. В весенний и осенний период растения выращивают в условиях теплицы.

Агробактериальные культуры и векторы для проведения трансформации. Для получения инсерционных мутантов семена или растения A. thaliana трансформируют почвенной агробактерией A. tumefaciens, содержащей векторные плазмиды. В работе на практикуме используются два штамма агробактерий - штамм LBA4404 и штамм GV3101, содержащие бинарные векторы двух типов (табл. 2):

1) бинарные векторы на основе плазмиды pBI121 (см. Гапеева и др., 1995), схема получения которых представлена на рис. 1, содержат в Т-области маркерные гены nptII и uidA (табл. 1).

Рисунок 1. Схема конструирования бинарных векторов pLD3 и pLD4.

Ген nptII находится под контролем промотора гена нопалинсинтазы, а ген uidA - под контролем промотора CaMV35S (Дрейпер и др., 1991). Оба гена экспрессируются в растениях и служат удобными маркерами для отбора трансформантов. Об активности гена nptII судят по появлению у растений устойчивости к канамицину, вызывающему обесцвечивание и гибель нетрансформированных растений. Активность гена uidA оценивают по способности b-глюкуронидазы катализировать расщепление b-глюкуронидов (см. дальше). Поскольку ген nptII экспрессируется и в клетках A. tumefaciens, канамицин добавляют также в среду для культивирования агробактерий. В Т-области плазмид pLD3 и pLD4 содержатся также гены cat (ген устойчивости к хлорамфениколу) и tet (ген устойчивости к тетрациклину), которые экспрессируются в клетках E. coli, что существенно облегчает последующую процедуру клонирования мутантных генов. На рис. 1 представлена схема конструирования этих векторов. При использовании векторов pLD3 и pLD4 в агробактериальную среду добавляют хлорамфеникол и тетрациклин, соответственно. В качестве вирулентной плазмиды - помощника используют плазмиду pAL4404. Агробактериальный штамм LBA4404, содержащий эту плазмиду, имеет хромосомный ген устойчивости к рифампицину (Rif), поэтому рифампицин также включают в состав среды роста в качестве селективного агента.

2) бинарный вектор pPCVRN4 (Koncz et al., 1994) содержит в области Т-ДНК ген bla устойчивости бактериальных клеток к карбенициллину и ампициллину и ген hpt, который экспрессируется в растениях и служит маркером для отбора трансформированных растений (табл.2). Главной особенностью вектора pPCVRN4 является присутствие в Т-ДНК четырех копий энхансерного домена (в районе от -90 до -440) промотора 35S РНК CAMV (p35S-4nCAMV). Встраивание такого вектора в промоторные участки растительных генов может активировать их экспрессию и приводить к появлению доминантных мутаций уже в Т2 или даже в Т1 поколении (Koncz et al., 1994). Ген nptII в данной бинарной системе располагается в вирулентной плазмиде - помощнике pMP90RK. По признаку канамицин - устойчивости можно судить о наличии в агробактериальном штамме GV3101 плазмиды pMP90RK. Данный штамм, также как и штамм LBA4404, содержит в хромосоме ген устойчивости к рифампицину.

До проведения опытов необходимо убедиться в стабильности векторов и проверить способность штаммов расти на соответствующих селективных средах. Для этого клетки агробактерий штамма LBA4404, содержащего одну из бинарных плазмид pBI121, pLD3, pLD4, или штамма GV3101 с бинарным вектором pPCVRN4 высевают на агаризованную среду TY или YEB (для штамма GV3101 среда YEB более предпочтительна) без антибиотиков и с антибиотиками для проверки генотипа вектора и получения отдельных колоний. Если хранящиеся в глицерине при -70°С культуры агробактерии не проявят устойчивости по всем маркерам, следует проверить свойства векторов: выделить ДНК и проанализировать рестрикционные карты плазмид.

Состав питательных сред для культивирования растений и агробактерий. Для асептического выращивания A. thaliana может быть использована среда Квитко. Лучше заранее приготовить маточные растворы указанной концентрации, хранить которые следует в холодильнике. На их основе приготовить среду, которую затем следует автоклавировать 30 мин. при 0.7 атмосфер.

Таблица 1

Основные соли	Концентрация (%)	К-во р-ра на 1 л среды (мл)
1. Ca(NO3)2 x 4 H 2O	5	10
2. ЭДТА	1	5
3. KNO3	5	20
4. MgSO4 x 7 H2O	1	15
5. KH2PO4	1	15
Микроэлементы		1
	мг/ 500 мл маточного р-ра
1. Н3BO3	750
2. MnSO4 x 7 H2O	500
3. ZnSO4 x 7 H2O	15
4. CuSO4 x 5 H2O	15
5. AlCl3	15
6. Na2MoO4	15
7. KI	15
8. Co(NO3)2	15
9. NiCl3	15
FeSO4 (закисное) добавляют в среду перед автоклавированием.	70 мг/ л
Агар-агар	7 - 9 г/л

Для метода трансформации семян используют жидкую среду Квитко, в которую добавляют сахарозу (2%) и витамины по Гамборгу.

Таблица 2. Для культивирования агробактерий используют Среды TY и YEB:

Состав среды TY:	Содержание антибиотиков в среде TY:
Бакто-триптон 8 г/л	канамицин (Km) 50 мкг/мл
Бакто-дрожжевой экстракт 5 г/л	рифампицин (Rif) 50 мкг/мл
NaCl 5 г/л	хлорамфеникол (Cm) 40 мкг/мл
Агар-агар 2%	тетрациклин (Tc) 15 мкг/мл
Состав среды YEB:	Содержание антибиотиков в среде YEB :
Мясной экстракт 5 г/л	карбенициллин (Cab) 100 мкг/мл
Дрожжевой экстракт 1г/л	рифампицин (Rif) 100 мкг/мл
Пептон 5 г/л	канамицин (Km) 25 мкг/мл
Сахароза 5 г/л
Агар-агар 2%	После автоклавирования добавляют 2 мл/л 1М р-ра MgCl2

Трансформация A. thaliana при инкубации семян с клетками агробактерии. Основными достоинствами данного метода является возможность получения большого количества трансформированных растений и техническая простота процедуры. Недостатком метода является низкая частота трансформации (около 0.1%). Все процедуры выполняются в стерильных условиях в ламинарном боксе. Общая схема эксперимента представлена на рис. 3.

1. Высев агробактерии на агаризованную среду TY или YEB с антибиотиками и без них (контроль) (рис. 2). На первом этапе работы студенты проверяют генотип вектора, оценивая способность агробактериальных клеток расти на соответствующих селективных средах. 100-200 мкл жидкой глицериновой культуры агробактерии, хранящейся в музее культур при -70 ?С, высевают на агаризованную среду и растирают стерильным стеклянным шпатылем для получения сплошного газона. Для получения отдельных колоний агробактерий стерильной микробиологической петлей проводят штриховку по поверхности агаризованной среды, как показано на рис. 2. Чашки с приоткрытыми крышками слегка подсушивают в ламинарном боксе (2-5 мин), края чашек закрывают парафильмом и инкубируют в перевернутом положении при 26-28 °С на рассеянном свету. Обычно для появления колоний на агаризованной среде с антибиотиками требуется 5 - 7 дней.

2. Получение жидкой культуры агробактерии из отдельных колоний. Стерильными картонными палочками делают укол в единичные колонии, выросшие на селективных средах. Палочку помещают в стерильную пробирку с жидкой средой с антибиотиками. Пробирку закрывают ватной пробкой и парафильмом, устанавливают на качалку (100 об/мин) и инкубируют в течение 16- 24 часов.

Рисунок 2. Рассев агробактерий на чашки для получения отдельных колоний. Штрихи наносят в указанном цифрами порядке. Между штрихами 1 и 2 петля проносится над пламенем и охлаждается (Дрейпер и др., 1991).

3. Стерилизация семян. Перед процедурой стерилизации семян необходимо убедиться, что приготовленная навеска семян не содержит посторонних примесей (комочков почвы, сухих тканей растений и т. д.). При их наличии используемые методы стерилизации не дадут ожидаемого результата. Поэтому до стерилизации семена просматривают под микроскопом и примеси удаляют смоченной в воде препаровальной иглой. Навеску чистых семян высыпают на фильтровальную бумагу. Сверху с помощью капельницы наносят стерилизующий раствор (5% перекись водорода в 70% спирте). Через 5 минут подсохшие семена высыпают в стерильный стакан (на 150 -200 мл), куда сверху наливают серную кислоту или хромпик (3-5 мл достаточно, чтобы простерилизовать 5 тыс. семян). Через 15 секунд в стакан вливают стерильную воду, и все содержимое стакана сливают на стерильный нейлоновый фильтр, семена на фильтре промывают водой (всего для промывки 5 тыс. семян нужен 1л стерильной воды).

4. Инкубация семян в питательной среде. Фильтр с семенами выкладывают на стерильную фильтровальную бумагу. Слегка подсохшие стерильные семена собирают стерильным скальпелем и переносят в колбы (на 200-250 мл) со средой Квитко, содержащей 2% сахарозу и витамины по Гамборгу. В каждую колбу добавляют по 1 -2 тыс. семян и не более 25 мл среды для обеспечения лучшей аэрации семян. Колбы устанавливают на роллерную качалку (скорость вращения 120 об/мин) и инкубируют на рассеянном свету при комнатной температуре. Оптимальное время для набухания семян составляет 16 часов.

5. Сокультивирование семян с агробактерией. В колбы с набухшими семенами приливают по 1.5 мл ночной агробактериальной культуры. Колбы инкубируют на качалке при тех же условиях еще 24 часа.

6. Промывка семян. Эту и все последующие процедуры можно делать в нестерильных условиях. Содержимое колб сливают на воронки с нейлоновыми фильтрами и промывают водой. Фильтры выкладывают на фильтровальную бумагу, семена собирают скальпелем и переносят в колбу с полужидкой агаризованной средой (0.13%).

7. Высев семян в почву. Суспензию семян в полужидкой среде, приготовленную из расчета 20 семян в 1 мл жидкости, высевается рядками в ящики с почвой (одно семя на 1 см²). Ящики закрывают полиэтиленовой пленкой или специальным укрывным материалом (например, «Агротекс») до появления всходов.

8. Сбор семян. Проводят сбор семян по мере созревания стручков. С 1 м² площади (т.е. с 1 тыс. растений) сбор проводят в один пакет. В результате должны получиться 4-5 партий (пакетов) семян Т2 поколения собранных с 4 -5 тысяч растений, выросших из семян, инкубированных с агробактерией.

9. Предосторожности в работе с агробактериями. Посуда и инструменты, использованные в работе с агробактерией опускают в раствор гипохлорита кальция на несколько часов. Чашки с колониями автоклавируют. Почва после сбора семян стерилизуют сухим жаром или в автоклаве. Эти предосторожности позволяют избежать загрязнения лаборатории бактериями и плазмидами.

Трансформация A. thaliana инокуляцией агробактерии в срезы стебля in planta. Достоинством метода является высокая частота трансформации. Данный метод позволяет получить до 16.5% трансформированных растений Т1 поколения (Chang et al., 1994).

1. Получение растений для проведения трансформации. Семена расы Дижон высевают в горшочки (примерно по 10 семян на горшок). Двухнедельные всходы выравнивают, оставляя в горшочках по 4-5 растений. К началу эксперимента по трансформации in planta растения должны иметь молодые цветоносы высотой от 2 до 3 см. Перед началом инокуляции растения не поливают в течение 2-4 дней.

2. Проверка агробактериальных штаммов и приготовление жидкой ночной культуры агробактерии. Используют те же среды и методы, что и в предыдущей задаче.

3. Первая инокуляция. Острым скальпелем или бритвой отрезают несколько верхних листьев розетки вместе со стеблем. Срез стебля промакивают салфеткой. На него наносят 10-20 мкл суспензии клеток агробактерии. Растения не поливают еще 1-2 дня для эффективной инфильтрации нанесенной суспензии.

4. Вторая инокуляция. Через 7-10 дней растения формируют новые побеги. Их вновь отрезают и наносят свежую суспензию агробактерий на срезы.

5. Третья инокуляция. Проводится также как вторая.

6. Сбор семян. Выросшие после третьей инокуляции побеги маркируют. Поскольку для каждого из формирующихся боковых побегов трансформация может проходить независимо, семена собирают с каждого побега отдельно.

7. Оставшуюся почву, а также всю посуду тщательно обеззараживают.

Рисунок 3. Трансформация A.thaliana инокуляцией агробактерий в срезы стебля in planta

2. Выявление трансформантов среди растений Т2 поколения

Выявление трансформированных растений основано на отборе растений, экспрессирующих маркерные гены Т-ДНК, обеспечивающие устойчивость растений к антибиотикам. При работе с векторами ряда рBI121, несущими ген nptII, трансформанты отбирают по устойчивости к антибиотику канамицину. При работе с вектором рPCVRN4, несущим ген hpt, трансформанты отбирают по устойчивости к антибиотику гигромицину. Оба антибиотика вызывают замедление роста, обесцвечивание зеленых тканей и гибель проростков через 10-15 дней после посадки семян.

Для выявления устойчивых растений готовится агаризованная (0.7% агара) среда Квитко, содержащая 70 - 100 мг/л канамицина или 15 мг/л гигромицина. Антибиотики (стерильные водные растворы) добавляют в среду после ее автоклавирования. Семена Т2 поколения стерилизуют спиртом и перекисью водорода, смешивают с полужидким агаром (0.13%) и рассевают пипеткой по поверхности среды в чашках Петри из расчета 500 семян на чашку.

При посемейном анализе Т2 поколения на поверхность агаризованной среды укладывают расчерченные секторами (сектора нумеруются) стерильные фильтры. Стерильные семена с отдельных побегов (по 30 семян с каждого) высаживают на разные сектора. В протоколах отмечают номера секторов и побегов. Для синхронизации прорастания семян чашки инкубируют 2 дня в темноте при 4 °С, а затем помещают в люминостат с интенсивностью света 3000-5000 люкс (16-часовой фотопериод) при температуре 24-26 °С. Через 10-12 дней учитывают число семей, содержащих устойчивые к антибиотикам проростки, а также число и процент выживших зеленых проростков. Полученные данные оформляют в виде таблицы. На основании суммарных результатов оценивают:

· эффективность трансформации в данном опыте; проводится ее сравнение с данными других исследователей,

· частоту устойчивых к антибиотику растений в семьях с расщеплением по этому признаку; обсуждают причины отклонения от ожидаемого расщепления,

· при трансформации методом инокуляции in planta сравнивается частота трансформации в побегах разного происхождения; обсуждают причины различий.

Устойчивые проростки пересаживают в пробирки со свежей агаризованной средой Квитко без антибиотиков для сбора семян Т3 поколения.

Удобным маркером для выявления трансформантов является также ген uidA, кодирующий b-глюкуронидазу (GUS). Для анализа GUS активности разработан ряд эффективных методов (Дрейпер и др., 1991). Достаточно простым и информативным методом определения GUS активности является метод окрашивания in situ (гистохимический метод). В качестве субстрата для определения используют X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-B-D-glucuronide) (Маниатис и др., 1984). 20мМ раствор X-gluc в диметилформамиде можно приготовить заранее и хранить при -20 ?С. Рабочий раствор, содержащий 1 мМ X-gluc; 50мМ фосфатный буфер Na₂HPO₄+ NaH₂PO₄ - pH 7.0-7.2; 0.01 объемных % Tween-20, каждый раз готовят заново. Для усиления окрашивания в рабочий раствор можно добавить 1мМ ферроцианида Na и 1мМ феррицианида Na.

Перед окрашиванием целые проростки или отдельные части растений помещают в раствор X-gluc в пробирки Eppendorf, следя за тем, чтобы растительный материал был полностью погружен в раствор. При необходимости используют вакуумную инфильтрацию. Пробирки закрывают и инкубируют в темноте в термостате при 37 ^оС от 5 до 48 часов. О наличии GUS-активности судят по появлению яркого синего окрашивания. Образцы помещают в 70% этанол для удаления хлорофилла, который затрудняет анализ, после чего ткани анализируют с помощью микроскопа. Необходимо отметить, что в связи с высокой стоимостью X-gluc этот метод, как правило, используют только для подтверждения трансгенной природы растений, показавших устойчивость к антибиотику.

3. Выявление инсерционных мутантов, имеющих фенотипические изменения

Далеко не все инсерции Т-ДНК в геном растений вызывают фенотипические изменения. Это связано с тем, что Т-ДНК может встраиваться в межгенные участки и интроны. Кроме того, в связи с наличием большого числа дуплицированных генов, вызванное инсерцией нарушение активности одного гена, может компенсироваться работой других генов этого семейства. Все растения с инсерциями Т-ДНК (или транспозонов) представляют ценность для структурно-функционального изучения генома, однако только инсерции, вызывающие изменения фенотипа, дают информацию о функции поврежденных инсерцией генов на организменном уровне. Для выявления инсерционных мутантов с фенотипическими изменениями можно использовать два подхода.

1) Поиск видимых мутантов (хлорофильных, морфологических, эмбриональных леталей) проводится в Т3 поколении, полученном от растений, показавших устойчивость к антибиотику в Т2. Этот подход является оптимальным, если конечной целью исследований является создание коллекции инсерционных мутантов разнообразных типов. Поиск мутантов в Т3, а не в Т2 поколении оправдан также тем, что по литературным данным большинство растений Т2 поколения являются гемизиготами по Т-ДНК, что связано со способностью агробактерии долгое время находиться в тканях растений, но осуществлять трансформацию уже после прохождения мейоза в клетках цветка (см. выше). Следовательно, большинство инсерционных видимых мутантов можно выявить только в Т3 поколении.

2) При наличии хороших селективных систем для выявления мутантов нужного типа (например, устойчивых к гербицидам) растения Т₂ поколения можно сначала проанализировать на наличие селективного признака, а уже затем определять трансгенную природу отобранных мутантов. Этот подход оправдан в том случае, если исследователя интересуют редко возникающие доминантные мутанты определенного типа. Кроме того, его можно использовать при трансформации с вектором, содержащим энхансер. При встраивании такого вектора в промоторную область растительных генов можно ожидать появления видимых доминантных мутантов уже в Т₂ поколении. Химерные растения с мутантными секторами можно обнаружить и при анализе трансформантов Т₁ поколения.

Семена, собранные с индивидуальных трансформантов Т₂ поколения, целесообразно высевать в почву и на чашки с селективной средой (Рис. 2). При росте в почве легче выявить морфологически измененные растения. При росте на чашках анализ расщепления по устойчивости растений Т₃ поколения к антибиотику позволяет определить число инсерций Т-ДНК в геном трансформированных растений. Это важно, так как выявление инсерционных мутантов и их дальнейший анализ будут затруднены, если произойдет несколько независимых инсерций. Моногенное расщепление (3 части устойчивых и 1 часть неустойчивых растений) наблюдается при встраивании одной копии Т-ДНК или при тандемном встраивании нескольких копий в один сайт; расщепление 15:1 свидетельствует о наличие двух инсерций, 63:1 - трех инсерций и т.д. Как правило, для дальнейшего изучения используют семьи, где наблюдается моногенное расщепление по признаку устойчивости к антибиотику.

Среди растений Т₃ поколения, высаженных в почву, выявляют морфологические изменения, анализируя растения на всех стадиях онтогенеза. Для доказательства инсерционной природы выделенных мутантов необходимо убедиться в совместном наследовании мутантного фенотипа и маркерных генов из Т-ДНК. С этой целью в Т3 поколении проводят изучение GUS-активности с срезах листьев растений разных генотипов. Генотип растений нормальной морфологии устанавливают по анализу Т₄ поколения (рис. 4).

Рисунок 4. Выявление и изучение инсерционных мутантов.

Анализ расщеплений по устойчивости к антибиотику проводят также среди индивидуальных семей поколения Т4. При совместном наследовании мутантного фенотипа и устойчивости к антибиотику делается вывод о инсерционной природе мутантов (рис. 4). Для подтверждения наличия Т-ДНК в геноме мутантов используют также молекулярно-генетические методы.

4. Использование ПЦР-анализа для идентификации трансгенной природы трансформированных растений A. thaliana

растение мутант инсерционный трансформант

В настоящее время в исследованиях по инсерционному мутагенезу, для клонирования геномных последовательностей ДНК, прямого секвенирования ДНК и др. успешно используется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Этот более быстрый, удобный и эффективный метод позволяет установить наличие интегрированной в растительный геном инсерции, а также определять число копий этой инсерции.

Предложенный в 1983 г. Карри Мулисом, удостоенным за это изобретение Нобелевской премии 1993 г., метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) - явился важнейшим открытием нашего века в области молекулярной биологии. Метод ПЦР, или специфической амплификации ДНК, позволяет избирательно синтезировать in vitro относительно небольшие участки ДНК длиной от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов, используя в качестве матрицы любые пробы ДНК, содержащие амплифицируемую последовательность. Необходимым условием для проведения ПЦР является знание нуклеотидной последовательности амплифицируемой области ДНК, так как реакция осуществляется путем гибридизации матричной ДНК с двумя искусственно синтезированными праймерами - олигонуклеотидными последовательностями ДНК длиной обычно до 30 п.н., комплементарными 3-концам амплифицируемого участка на смысловой и антисмысловой нитях ДНК, соответственно. Таким образом, расстояние между праймерами определяет длину синтезируемых молекул. Для проведения специфической амплификации не требуется больших количеств матричной ДНК и, в принципе, достаточно даже одной молекулы для запуска реакции.

На первом этапе ПЦР двухнитевая матричная ДНК переводится в однонитевую форму путем ее нагревания в течение нескольких минут до температуры 95-98 °С. Дальнейшая схема проведения ПЦР заключается в чередовании циклов:

1 - гибридизация ДНК с праймерами;

2 - синтез последовательности, комплементарной матричной ДНК;

3 - денатурация образовавшихся двухнитевых структур.



Рисунок 5. Принципы метода ПЦР.

При гибридизации, достигаемой за счет понижения температуры реакционной смеси до 30-50 °С, происходит образование двухнитевого участка ДНК в строго специфичных областях, комплементарных праймерам. При температуре, оптимальной для работы Taq-полимеразы (60-70 °С), начинается синтез в направлении 5ў-3ў с двухнитевого участка, образованного праймерами. Затем при нагревании реакционной смеси до 80-90 °С синтез прекращается и двухнитевой участок между матричными и вновь синтезированными молекулами ДНК денатурируется. В первом цикле олигопраймеры гибридизуются с исходной матричной ДНК, а в последующих циклах - и с вновь синтезированными молекулами ДНК по мере их накопления в реакционной смеси (рис. 5).

Таким образом, при каждом цикле происходит двухкратное увеличение числа копий амплифицируемого участка ДНК, и содержание продуктов амплификации в растворе нарастает в геометрической прогрессии. За 25-30 циклов число синтезированных копий ДНК достигает нескольких миллионов. ПЦР проводят обычно в автоматическом режиме, используя для этого специальный прибор - термоциклер или амплификатор ДНК. Этот прибор позволяет задавать нужное количество циклов и выбирать оптимальные параметры времени и температуры для каждой конкретной реакции. Выбор оптимального режима реакции определяется длиной и специфичностью амплифицируемого участка ДНК (для каждой полимеразной реакции) в зависимости от типа праймеров, длины фрагмента, особенностей его первичной структуры, а также от типа используемой Taq-полимеразы. Оптимальные режимы реакции существенно варьируют и подбираются экспериментально.

В течение последних нескольких лет ПЦР успешно используется в исследованиях по инсерционному мутагенезу, для клонирования геномных последовательностей ДНК, прямого секвенирования ДНК и др. Одним из применений метода ПЦР является тестирование растений, получаемых в ходе проведения тем или иным способом трансформации.

Этот метод позволяет установить наличие интегрированной в растительный геном инсерции, а некоторые его модификации дают возможность определять также и число копий этой инсерции.

Однако применение ПЦР для тестирования трансгенных растений связано с определенными трудностями. Одна из них состоит в том, что наиболее популярным методом трансформации растений является агробактериальная трансформация, а рядом авторов показано (Ревенкова и др., 1990), что эксплантаты растений после трансформации могут оставаться зараженными агробактериями в течение более чем двух месяцев. Даже при использовании метода агробактериальной трансформации прорастающих семян А. thaliana не исключено, что агробактерии продолжают существовать в межклетных пространствах растений Т1 и даже Т2- поколений. Понятно, что растения, зараженные агробактериями, могут давать ложные положительные сигналы при тестировании с помощью ПЦР.

Другая трудность состоит в том, что для проведения ПЦР нужно получать растительную геномную ДНК определенного качества, т.к. эффективность амплификации исследуемой ДНК непосредственно связана со степенью ее очистки. Поэтому неудачный метод выделения растительной ДНК, недостаточно высокое качество ферментов или термоциклера мотут свести на нет все усилия исследователя. Изложенный ниже подход позволяет проводить скрининг полученных после трансформации прорастающих семян A. thaliana агробактериальными векторами растений Т2 поколения, выращенных на среде с канамицином в качестве селекционного маркера.

Первая пара праймеров (GUS-1 , GUS-2) определяет синтез фрагмента длиной 608 п.н. uidA - гена и позволяет тестировать растения на присутствие в его геноме инсерции Т-области, в состав которой этот ген входит.

Вторая пара праймеров (NPTIII-1 , NPTIII-2) определяет синтез 399 п.н. гена nptIII из Streptococcus. Она вводится в реакцию для того, чтобы тестировать плазмидную ДНК агробактериального вектора, так как в состав Т-области этот ген не входит.

Таким образом, наличие обоих генов в образцах растительной ДНК указывает на то, что это - трансгенные растения, зараженные агробактериями, присутствие только одного растительного селективного маркера свидетельствует о том, что растение имеет трансгенные природу, но не заражено агробактериями.



Рисунок 6. Стратегия ПЦР анализа с помощью двух праймеров

Поскольку вышеупомянутые гены не обладают заметной гомологией, то возможно проведение двух ПЦР в одной реакционной смеси на одном образце ДНК и в одинаковых условиях. В этом случае исключаются ошибки, связанные с загрязнением одного из двух образцов или с разной температурой в лунках термоциклера. Кроме того, вдвое уменьшается потребление всех компонентов реакционной смеси, за исключением праймеров. Вышеизложенный подход, разработанный в Институте общей генетике им. Н.И. Вавилова РАН (лаб. профессора Тарасова В.А.), позволяет проводить скрининг растений A. thaliana Т2 поколения, полученных после трансформации прорастающих семян агробактериями, несущими бинарную систему pLD3 или pLD4 и определять возможное заражение их агробактериями.

Выделение геномной ДНК растения для ПЦР

1. 100-300 мкг свежей зеленой массы поместить в стерильную пробирку типа Eppendorf и быстро заморозить в жидком азоте.

2. Растереть растительную ткань в той же пробирке стеклянной палочкой до состояния мелкого порошка.

3. Добавить 400 мкл экстракционного буфера (0,5% SDS; 250 мM NaCl; 100 мM Трис-HCl pH 8,0; 25 мM ЭДТА) и интенсивно перемешать.

4. Центрифугировать при максимальной скорости на микроцентрифуге в течение 5 минут.

5. Перенести 300 мкл супернатанта в новую пробирку и добавить равный объем изопропанола, перемешать.

6. Инкубировать 5 минут при комнатной температуре.

7. Центрифугировать на максимальных оборотах 5 минут.

8. Высушить осадок ДНК и ресуспендировать его в 50 мкл стерильной Н₂О.

На одну ПЦР-реакцию требуется 1 мкл выделенной ДНК.

ПЦР - реакция

Перед началом любых расширенных опытов, при смене олигонуклеотидов, полимеразы, трифосфатов необходимо выполнить технический опыт по оптимизации условий, а именно:

1) протитровать по Mg буфер (имеются KCl-серия с диапазоном от 10 до 50 мМ Mg и (NH)₄SO₄-серия с диапазоном от 20 до 80 мМ Mg);

2) проверить на опыте рассчитанные теоретически температуру отжига олигонуклеотидов и время элонгации.

При выбранных условиях провести первую геномную амплификацию серии образцов, обязательно поставив контроли: положительный - реперная ДНК и отрицательный - без ДНК.

Матричная ДНК добавляется в реакционную смесь в концентрации не более 30 нг. Концентрация трифосфатов в реакции 2,5 мМ/1 мкл каждого.

Использовать 10хбуфер для ПЦР следующего состава: 100 мМ Трис-HCl, рН 8,3; 500 мМ KCl; 10-50 мМ MgCl₂; 0,5% Tween 20.

Ход эксперимента:

1. Разлить в каждую реакционную пробирку по 24 мкл смеси указанного состава без матричной ДНК.

2. Добавить раствор ДНК.

3. Наслоить на реакционную смесь вазелиновое масло и запустить реакцию.

4. Провести реакцию по следующей схеме:

1) 95 °С - 1 минута

2) 95 °С - 1 минута

3) 55 °С - 1 минута

4) 72 °С - 1 минута 30 секунд

5) повторение шагов 2 - 4 34 раза

6. 72 °С - 7 минут

5. Провести анализ проб в 1% агарозном геле.

Литература

1. Chang S.S., Park S.K., Kim B.C. et al. 1994. Stable genetic transformation of Arabidopsis thaliana by Agrobacterium inoculation in planta // The Plant J. 5, 4: 551- 558.

2. Desfeux C., Clough S.J., Bent A.F. 2000. Female reproductive tissues are the primary target of Agrobacterium-mediated transformation by the Arabidopsis floral-dip method // Plant Physiol. 123: 895-904.

3. Ding S.W. 2000. RNAsilencing. // Curr.Opin Biotechnol. 11: 152-156.

4. Elmayan T., Balzergue S., Beon F., Bourdon V., Daubremet J., Guenet Y., Mourrain P., Palauqui J.C., Vernhettes S., Vialle T. et al. 1998. Arabidopsis mutant simpaired in cosuppression // Plant Cell. 10: 1447-1457.

5. Fagard M., Vaucheret H. 2000. (Trans)gene silencing in plants: how manu mechanisms? // Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 51: 167-194.

6. Faugeron G. 2000. Diversity of homology-dependent gene silencing strategies in fungi // Curr Opin Microbiol. 3: 144-148.

7. Feldmann K.A. 1991. T-DNA insertion mutagenesis in Arabidopsis: mutational spectrum // The Plant J. 1: 71-82.

8. Feldmann K.A., Marks M.D. 1987.Agrobacterium- mediated transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana // Mol. Gen. Genet. 208: 1-9.

9. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. 1998. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans // Nature. 391: 806-811.

10. Gamborg O.L., Miller R.A., Ojima K. 1968. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cell // Exp. Cell Res. 50: 151 - 158.

11. Hammond S., Bernstein E., Beach D., Hannon G. 2000. An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells // Nature. 404 (6775): 293-6.

12. Hammond S.M., Bernstein E., Beach D., Hannon G.J. 2000. An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells // Nature. 404. 293-296.

13. Hellens R.P., Edwards E.A., Leyland N.R. et al. 2000. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium - mediated plant transformation // Plant Mol Biol. 42: 819-832.

14. Jones A.L., Thomas C.L., Maule A.J. 1998. De novo methylation and cosupression induced by cytoplasmically replicating plant RNA virus // EMBO J. 17: 6385-6393.

15. Katavic V., Haughn G.W., Reed D. et al. 1994. In planta transformation of Arabidopsis thaliana // Mol. Gen. Genet. 245: 363-370.

16. Koncz C., Martini N., Szabados L., et al. 1994. Specialized vectors for gene tagging and expression studies// In: Plant Molecular Biology Manual. Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Press. 2 : 1-22.

17. Koncz C., Nemeth K., Redei G.P., Schell J. 1992. T-DNA insertional mutagenesis in Arabidopsis // Plant Mol. Biol. 20: 963-976.

18. Krysan P.J., Young J.C., Sussman M.R. 1999. T-DNA as an Insertional Mutagen in Arabidopsis // Plant Cell. 11: 2283-2290.

19. Kubo H., Peeters A.J.M., Aarts M.J.M. et al. 1999. ANTHOCYANINLESS 2, a homeobox gene affecting anthocyanin distribution and root development in Arabidopsis // Plant Cell. 11: 1217-1226.

Размещено на Allbest.ru