Определение способности почвенных бактерий к разложению синтетических моющих средств
Поверхностно-активные вещества как компоненты синтетических моющих средств, их химические свойства и применение, негативное действие на экосистемы и здоровье человека. Исследование способности микроорганизмов разлагать ПАВ, определение их активности.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | курсовая работа |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 26.05.2009 |
| Размер файла | 114,0 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
2. Объекты и методы исследований
Объектом исследования являются чистые культуры микроорганизмов, выделенные из почв. В работе использовано 13 культур микроорганизмов, большинство из которых является Г+ спорообразующими аэробными палочками. Чистые культуры хранились в холодильнике в пробирках со скошенным питательном агаром. Перед началом исследований было произведено обновление штаммов, путем подращивания их на МПБ с последующим пересевом на ПА.
2.1 Методы исследований
2.1.1 Исследование физиолого-биохимических свойств
Для исследования физиолого-биохимических свойств микроорганизмов использовались дифференцировочные пластины. Пластина представляет собой панель с 20 конусообразными лунками, на дно которых нанесены соответствующие субстраты с индикаторами, стабилизированные поливиниловым спиртом. Панель закрывается крышкой. Панель и крышка изготовлены из полистирола. Субстрат с индикаторами вносят в лунки в жидком виде, затем высушивают и стерилизуют.
Специфическое действие препарата заключается в возможности дифференцировать бактерии на основе определения ферментативных систем по их действию на соответствующие субстраты.
Биохимические дифференцировочные пластины предназначены для определения ферментативной активности бактерий, выделяемых в ходе микробиологических исследований. Это может помочь при дальнейшей идентификации до рода и возможно вида.
Подготовка исследуемых образцов
Перед проведением исследования выделенные культуры подлежат изучению на чистоту.
Идентификацию культур, непосредственно из нативного материала, производят со скошенного мясо-пептонного агара (МПА). Используют культуры выращенных в течение 18-24 часов при температуре при температуре 37 оС, без предварительного подращивания их на МПБ (мясо-пептонном бульоне).
Если выделенная культура микроорганизма находилась какое-либо время на хранении при комнатной температуре или в холодильнике, производят предварительный посев ее на МПБ на 2-4 часа при температуре 37 оС, затеи осуществляют пересев культуры на скошенный МПА. Посевы инкубируют в течение 18-24 часов при температуре 37 оС.
Культуру с МПА используют для приготовления суспензии в стерильной 1% пептонной воде рH 7,2-7,4 и доводят мутность суспензии до 10 единиц по отраслевому стандартному образцу мутности бактериальных взвесей, стеклянному. При отсутствии отраслевого стандартного образца в 4,0 мл стерильной 1% пептонной воды вносят 2-3 петли исследуемой культуры до образования видимой мутности.
Проведение исследования
1. Вскрывают упаковку пластин.
2. Регистрируют на крышке панели номер засеваемого штамма.
3. Открывают крышку и располагают панель на столе.
4. Добавляют пипеткой по 0,15 мл микробной суспензии в стерильной 1% пептонной воде во все лунки панели, кроме 17,18,19 которые оставляют свободными.
5. Для создания анаэробных условий добавляют 1-2 капли стерильного вазелинового масла в лунки для определения аргининдегидрогеназы и уреазы (№№11,20).
6. Закрывают крышку панели.
7. Выдерживают пластины в течение 18-24 часов при температуре 37 оС.
Учет результатов
Учет результатов производят визуально в соответствии с цветовым указателем, приложенным к пластинам, 18-24 часа инкубации при 37 оС.
После окончания инкубации открывают крышку панели и в лунки для выявления ацетилметилкарбинола (№10) добавляют 1 каплю 6%-го раствора альфа нафтола и затем 1 каплю 40% раствора гидроокиси калия; для определения фосфатазы (№8) - 1 каплю 20% раствора гидроокиси натрия; для выявления нитратредуктазы (№9) добавляют 1 каплю реактива Грисса. Реакции учитывают немедленно в лунках №8,9, выявление ацетилметилкарбинола (№10) осуществляют через 15-20 минут после закапывания реактивов.
2.1.2 Определение способности роста на средах с добавлением поверхностно-активных веществ
Для определения способности роста на средах с добавлением различных ПАВ использовался чашечный метод. Производился глубинный посев по 1 мл бактериальной суспензии. Использовалось 2 среды: питательный агар и среда М9 (рецепты сред см. в приложении). В качестве селективных агентов использовались СМС на основе АПАВ и КПАВ, а также полиакриламид (ПАА) (НПАВ). ПАВ в количестве 1 мл вносились в среды перед стерилизацией (Турковская, 1997).
2.1.3 Определение активности
Определение способности штаммов подвергать деградации ПАВ определяли с помощью модифицированного нами метода лунок Турковской (Турковская, 1997,): в центре застывшей среды ПА/10 в чашках Петри стерильным пробочным сверлом вырезали лунку. Микроорганизмы высевались штрихом по радиусу от лунки к периферии чашки (посев производится секторами). Затем в лунку стерильно вносили исследуемое ПАВ. Контролем служили чашки с посевами без субстратов. Инкубирование проводили в термостате при 34 оС в течении 3 сут.
Результаты оцениваются через 2-3 суток. Отмечается рост от края чашки к центру, к лунке с ПАВ. Степень активности характеризуется количеством баллов по сравнению с контролем.
2.2 Материалы и оборудование
Культуры микроорганизмов, пробирки, колбы, чашки Петри, шпатели, штативы, предметные и покровные стекла, красители, спиртовка.
При любой микробиологической работе: при посевах, пересевах, выделении, сохранении чистых культур используются стерильные среды, стерильная посуда, стерильные инструменты, чтобы предотвратить возможность попадания посторонней микрофлоры. Посевы производятся в стерильных боксах.
Для обработки посуды применяется стерилизация сухим жаром. Она производится нагреванием в течении 2 часов, при температуре 170 0С в электросушильных шкафах.
Вся посуда перед стерилизацией должна быть вымыта, высушена и завернута в бумагу. Для заворачивания посуды используют газетную бумагу (которая не размокает).
Большинство питательных сред стерилизуют насыщенным паром под давлением в автоклавах. Повышение давления в автоклаве повышает температуру пара, образуемого внутри автоклава и, следовательно, температуру стерилизации (Теппер, 2004).
Среды. В работе использованы полноценные питательные среды: МПА, МПБ. В качестве селективной среды использовалась среда М9 (состав см. в приложении). В качестве селективных агентов использовались СМС на основе АПАВ и КПАВ, а также ПАА (НПАВ).
3. Экспериментальная часть
3.1 Культурально-морфологическая характеристика микроорганизмов
В работе использовалось 13 культур микроорганизмов. Культуральные и морфологические признаки исследуемых микроорганизмов представлены в таблице 1.
Таблица 1. Культурально-морфологичесие признаки микроорганизмов
|
№ штамма |
Признаки |
Окраска по Граму |
||
|
культуральные |
морфологические |
|||
|
1 |
гладкая, светло-фиолетового цвета, полусухая, блеск слабый, полупрозрачная |
мелкие, толстые палочки и споры |
+ |
|
|
3 |
полупрозрачная, светло-фиолетового цвета, шершавая, с блеском, слизистая |
толстые споровые палочки, прямые и изогнутые, одиночные, по 2, цепочками, с овальными концами |
+ |
|
|
4 |
светло-фиолетового цвета, шершавая, с блеском, слизистая |
толстые споровые палочки, одиночные, по 2, цепочками, с овальными концами |
+ |
|
|
5 |
слизистая, гладкая, с блеском, сероватого цвета, выделяет черный пигмент |
мелкие, споровые палочки, одиночные и по 2 |
+ |
|
|
14 |
молочного цвета, бугорчатая, с блеском, гладкая, слизистая |
очень длинные споровые палочки, изогнутые, овальные концы |
+ |
|
|
15 |
полупрозрачная, с блеском, шершавая, светло-фиолетового цвета, слизистая |
короткие споровые палочки |
+ |
|
|
17 |
светло-малинового цвета, гладкая, блестящая, полусухая |
крупные палочки, неравномерно прокрашенные, фрагментированные палочки, споры |
+ |
|
|
19 |
культура желтоватого цвета, слизистая консистенция, гладкая |
мелкие, неспоровые палочки, тонкие, овальные концы |
+ (-) |
|
|
ХХ |
серовато-бежевая колония, блестящая, прозрачная, точечный рост, слизистая консистенция, очень слабый |
очень длинные палочки, неспоровые, прямые и изогнутые, с чехлами |
+ |
|
|
с |
кремового цвета, гладкая, слизистая, с блеском |
кокки, разные |
+ |
|
|
b |
кремового цвета, бугорчатая, блестящая, слизистая |
мелкие палочки, одиночные, по 2, слабо прокрашенные |
+ |
|
|
а1 |
сероватого цвета, гладкая, слизистая, с блеском |
мелкие, короткие палочки |
+ |
|
|
а2 |
полупрозрачная, с блеском, ризоидная поверхность, слизистая |
очень мелкие палочки, неярко прокрашенные |
+ |
Из таблицы видно, что большинство из исследуемых микроорганизмов являются Г+ спорообразующими аэробными палочками, за исключением штаммов b, а1, а2 которые являются Г+ неспоровыми аэробными палочками.
Штамм «с» это Г+ кокки. Однако в более молодой культуре он был представлен Г+ палочками. Также можно отметить, что штамм 19 это грамвариабельные неспоровые палочки.
3.2 Физиолого-биохимическая характеристика микроорганизмов
В работе использовано 13 культур микроорганизмов. Были исследованы физиолого-биохимические свойства по 17 тестам. Результаты приведены в таблице 2.
Таблица 2. Физиолого-биохимические свойства микроорганизмов
|
№ штамма |
1 |
3 |
хх |
5 |
4 |
14 |
15 |
17 |
19 |
а1 |
а2 |
b |
с |
|
|
тест |
||||||||||||||
|
утилизация глюкозы |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
- |
+ |
- |
- |
+ |
- |
|
|
утилизация фруктозы |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
+ |
+ |
- |
|
|
утилизация маннозы |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
|
|
утилизация мальтозы |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
|
|
утилизация лактозы |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
|
утилизация трегалозы |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
|
|
утилизация маннита |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
|
|
наличие фосфатазы |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
наличие нитратредуктазы |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
- |
- |
|
|
образование ацетилметилкарбинола |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
|
|
наличие аргининдегидролазы |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
+ |
- |
- |
|
|
утилизация ксилозы |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
+ |
- |
- |
|
|
утилизация сахарозы |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
|
|
утилизация арабинозы |
+ |
+ |
-+ |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
-+ |
+ |
+ |
- |
|
|
утилизация галактозы |
+- |
- |
-+ |
- |
- |
+ |
- |
- |
+ |
-+ |
+ |
+ |
- |
|
|
утилизация салицина |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
+ |
- |
|
|
наличие уреазы |
-+ |
- |
+ |
- |
- |
- |
+ |
+ |
- |
- |
+ |
- |
+ |
Примечания: «+» - реакция положительная, «-» - реакция отрицательная, «-+», «+-» - цвет не полностью соответствует стандарту.
Все исследованные штаммы микроорганизмов обладают фосфатазой, аргининдегидролаза обнаружена только у одного штамма (с), утилизируют маннозу все штаммы за исключением штамма с. Утилизирует ксилозу только штамм с. Утилизация лактоза не обнаружена ни у одного из исследованных штаммов.
По итогам проведения микроскопических исследований можно предположить, что большинство из исследованных культур микроорганизмов относится к р. Bacillus.
3.3 Определение активности микроорганизмов-деструкторов ПАВ
Определение способности штаммов подвергать деградации различные ПАВ осуществляли с помощью метода лунок (Турковская, 1997).
В ходе эксперимента установлено, что выделенные штаммы характеризуются большей активностью по отношению к НПАВ (оценка не менее 4). Менее интенсивный рост отмечался в экспериментах с АПАВ и КПАВ (оценки от 2 до 5). Несмотря на это, отмечаются штаммы, имеющие высокую активность (оценка 4,5) в каждом варианте эксперимента (1,4,15, а2, а1) (см. приложение 2).
Таблица 3. Оценка активности штаммов-деструкторов ПАВ методом лунок
|
№ штамма |
НПАВ |
АПАВ |
КПАВ |
|
|
Оценка |
||||
|
1 |
5 |
4 |
5 |
|
|
3 |
5 |
4 |
3 |
|
|
4 |
5 |
4 |
5 |
|
|
5 |
5 |
4 |
3 |
|
|
14 |
4 |
5 |
3 |
|
|
15 |
5 |
4 |
5 |
|
|
17 |
5 |
5 |
3 |
|
|
19 |
4 |
- |
- |
|
|
а1 |
5 |
4 |
4 |
|
|
а2 |
5 |
4 |
5 |
|
|
b |
5 |
4 |
4 |
|
|
с |
5 |
2 |
3 |
|
|
хх |
5 |
4 |
3 |
Примечание: 5 баллов - очень хороший рост; 4 балла - хороший рост; 3 балла - рост средней интенсивности; 2 - слабый рост.
Микроорганизмы, характеризующиеся высокой активностью в присутствии ПАВ всех классов могут иметь большое значение в процессах очистки окружающей среды от загрязнения синтетическими моющими средствами.
3.4 Определение способности роста микроорганизмов на средах с добавлением различных ПАВ
Определение способности роста исследуемых штаммов микроорганизмов на питательном агаре (ПА) с добавлением СМС на основе АПАВ и КПАВ, а также с добавлением ПАА (НПАВ) производилось чашечным методом. Учет результатов производился через 2 суток. Результаты приведены в таблице 4.
Таблица 4. Результаты роста микроорганизмов на среде с различными ПАВ
|
№ штамма |
Наличие роста, КОЕ/мл |
|||
|
КПАВ |
АПАВ |
НПАВ |
||
|
1 |
- |
+ |
+ |
|
|
3 |
- |
+ |
+ |
|
|
4 |
- |
+ |
+ |
|
|
5 |
+ |
+ |
+ |
|
|
14 |
- |
+ |
+ |
|
|
15 |
- |
+ |
+ |
|
|
17 |
- |
+ |
+ |
|
|
19 |
- |
+ |
+ |
|
|
хх |
- |
+ |
+ |
|
|
а1 |
+ |
+ |
+ |
|
|
а2 |
+ |
+ |
+ |
|
|
b |
+ |
+ |
+ |
|
|
с |
+ |
+ |
+ |
В ходе эксперимента рост микроорганизмов отмечался на средах с добавлением АПАВ и НПАВ. На среде с добавлением КПАВ только 5 штаммов обнаружили рост.
При микроскопии было установлено, что штаммы микроорганизмов выросшие на среде с добавлением АПАВ не образуют спор. А также не пигментированы. Штаммы, выросшие на среде с добавлением НПАВ ничем не отличались от исходных культур. Штамм №5 на среде с добавлением КПАВ так же не образовывал спор, однако пигментация не изменилась (выделяет черный пигмент).
Выводы
1. В ходе работы исследовано 13 культур микроорганизмов. Все культуры способны расти на средах с добавлением НПАВ и АПАВ. В эксперименте с использованием КПАВ обнаружен рост только 5_ти культур (а1, а2, b, с, 5).
2. Наибольшей активностью исследуемые штаммы обладают по отношению к НПАВ.
3. Все исследуемые штаммы обладают фосфатазой, не утилизируют лактозу. Только штамм а2 обладает аргининдегидролазой. Большинство исследованных штаммов являются аэробными Г+ споровыми палочками. Это позволяет отнести их к роду Bacillus.
Литература
1. Абрамзон А.А. Поверхностно-активные вещества. Свойства и применение. - 2 изд. - Л., 1981. - 330 с.
2. Алексеева А.В. Коллоидная химия. - СПб: «Наука», 1998 - 290 с.
3. Аналитический обзор Комитета по природопользованию за 2005 год. / под ред. Голубева Д.В. и др. / - М.: «Сезам», 2006 - 25 с.
4. Вербина Н.М. Деградация микроорганизмами неприродных органических соединений в окружающей среде. - М.: Микробиология, 1978. - т. 7.
5. Глазовская М.А. Способность окружающей среды к самоочищению // Природа, 1979. - №3.
6. Градова Н.Б., Бабусенко Е.С. Лабораторный практикум по общей микробиологии. - М.: ДеЛи принт, 2001. - 232 с.
7. Елинов М.Н. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии. - М.: Медицина, 1998. - 190 с.
8. Королев В.А. Очистка грунтов от загрязнений. - М.: МАИК Наука // Интерпериодика, 2001. - 365 с.
9. Никитин Д.П., Новиков Ю.В. Окружающая среда и человек: Учеб. пособие для студентов вузов. - М.: Высш. школа, 1980. - 424 с.
10. Новиков Ю.В. Экология, окружающая среда и человек: Учеб. пособие для вузов, средних школ и колледжей. - М.: Фаир-пресс, 2002. - 560 с.
11. Поликарпов Н. Действие ПАГов на микро- и макроорганизмы. Аналитический обзор. 2005 г.
12. Ротмистров М.Н., Ставская С.С. Микробиология очистки воды. - К.: Наук. думка, 1978 г. - 268 с.
13. Рубан Е.Л. Физиология и биохимия представителей р. Pseudomonas. - М.: Наука, 1986 г. - 352 с.
14. Савицкая М.Н., Холодова Ю.Д. Полиакриламид. - Киев: Техника, 1969. -188 с.
15. Ставская С.С. Биологическое разрушение АПАВ. - К.: Наук. думка, 1981 г. - 116 с.
16. Таубман А.Б., Маркина 3. H. Коллоидные поверхностно-активные вещества. / пер. с англ. / - M. - 1966 г. - 199 с.
17. Теппер Е.З. и др. Практикум по микробиологии / Шильникова В.К., Переверзева Г.И. - М.: Агропромиздат, 2004. - 233 с.
18. Турковская О.В. Биологические и технологические аспекты микробной очистки сточных вод и природных объектов от поверхностно-активных веществ и нефтепродуктов: Авт. дис. д.б.н. - Саратов, 2000. - 360 с.
19. Успехи коллоидной химии / под ред. И.В. Петрянова-Соколова, К.С. Ахмедова. - Ташкент, 1987.
20. Хотько Н.И., Дмитриев А.П. Водный фактор в передаче инфекций. / Материалы странички ПАВ. - М. - 2006 г.
21. Яковлев С.В. и др. Охрана окружающей среды: Учебник / С.В. Яковлев и др. - М.: Изд-во АСВ, 1998. - 180 с.
22. ГОСТ 17.4.4.02-84. Охрана природы. Почва. Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического и гельминтологического исследования. - М.:Изд-во стандартов, 1981. - 6 с.
23. www.aquaria.com.ua/coretra.html
24. www.ecocoop.ru
Приложение
Среда М9 (г/л):
Na2HPO3 - 6,0
KH2PO4 - 3,0
NaCl - 0,5
NH4Cl - 1,0
НПАВ - 0,2-1,0
рН - 7,0-7,2
Питательный агар (ПА) (г/л):
Панкреатический гидролизат рыбной муки - 24
Агар-агар - 12-14
NaCl - 4
Дистиллированная вода - 1 л
рН среды 7,3 - 7,5
Способ приготовления
38,0 г порошка размешать в 1 л дистиллированной воды, кипятить 2 мин. До полного расплавления агара, фильтровать через ватно - марлевый фильтр, разлить в стерильные флаконы и стерилизовать при температуре 121 °С в течение 15 мин.
Среду охладить до температуры 45-50 °С, разлить в стерильные чашки Петри слоем 4-6 мм. После застывания среды чашки подсушить при температуре 37-38 °С в течение 40-60 мин (Теппер, 2004).
Подобные документы
Изучение способности некоторых микроорганизмов деструктировать жировые вещества различной химической природы. Исследование морфолого-культуральных и физиологических свойств аборигенных микроорганизмов, анализ и особенности их деструктивной активности.
дипломная работа [410,7 K], добавлен 11.10.2010Исследование морфологических признаков бактерий, микроскопических грибов и дрожжей. Изучение внешнего вида, формы, особенностей строения, способности к движению, спорообразованию, способов размножения микроорганизмов. Форма и строение дрожжевой клетки.
реферат [28,8 K], добавлен 05.03.2016Анализ закономерностей динамики численности отдельных физиологических групп почвенных микроорганизмов в зависимости от антропогенной нагрузки на примере серой лесной почвы и чернозема выщелоченного. Определение соотношения аэробных и анаэробных бактерий.
курсовая работа [452,1 K], добавлен 23.01.2011Изучение предмета, основных задач и истории развития медицинской микробиологии. Систематика и классификация микроорганизмов. Основы морфологии бактерий. Исследование особенностей строения бактериальной клетки. Значение микроорганизмов в жизни человека.
лекция [1,3 M], добавлен 12.10.2013Общие бактериальные болезни насекомых, энтомопатогенные бактерии. Негативное влияние бактерий на здоровье человека. Характеристика и механизм действия бактерий Bacillus thuringiensis. Бактериальные препараты: применение и методы повышения эффективности.
курсовая работа [48,4 K], добавлен 02.12.2010Капли микроэмульсии как микрореакторы для химических реакций, растворители для органического синтеза, среды для ферментативных реакций; их применение для получения наноразмерных латексов. Поверхностно-активные вещества в реакциях мицеллярного катализа.
реферат [783,6 K], добавлен 17.09.2009Здоровье - индивидуальное психосоматическое (душевнотелесное) состояние, выражающееся в способности человека оптимально удовлетворять основные жизненные потребности. Индивидуальное и популяционное здоровье, основные принципы здорового образа жизни.
контрольная работа [20,7 K], добавлен 02.09.2010Свойства прокариотных микроорганизмов. Методы определения подвижности у бактерий. Участие микроорганизмов в круговороте азота в природе. Нормальная и анормальная микрофлора молока. Культивирование анаэробных микроорганизмов в условиях лаборатории.
шпаргалка [50,2 K], добавлен 04.05.2009Адсорбция жирных кислот на угле из водных растворов. Ионные и неионные поверхностно-активные вещества (ПАВ). Адсорбция ПАВ на гидрофобных и гидрофильных поверхностях. Конкурентная адсорбция: смеси анионных ПАВ с катионными, неионными и полимерами.
контрольная работа [779,5 K], добавлен 17.09.2009Характеристика условий Крайнего Севера. Воздействие метеорологических, геофизических и гелиофизических факторов региона на здоровье человека. Сравнение способности к адаптации и акклиматизации к условиям Крайнего Севера у пришлого и коренного населения.
презентация [1,5 M], добавлен 28.10.2016
