Мутационная изменчивость микроорганизмов – производителей антибиотиков

15

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ УКРАИНЫ

ЗАПОРОЖСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Реферат

«Мутационная изменчивость микроорганизмов - производителей антибиотиков»

Подготовил студент

Снижко Евгений

Запорожье

2010

План

Введение

1. Способы увеличения продуктивности штаммов

1.1 Мутагенез и отбор

1.2. Гибридизация путем скрещивания

1.3 Конъюгация у бактерий

1.4 Системы скрещивания у грибов

2. Мутагенез и методы выделения мутантов

Вывод

Литература

Введение

Разнообразные антибиотики синтезируются множеством самых разных микроорганизмов, однако таксономическое распределение штаммов-продуцентов не является ни непрерывным, ни случайным. Примерно 80% известных антибиотиков синтезируется штаммами, принадлежащими только к одному порядку бактерий -- актиномицетам, причем главным образом к одному из родов этого порядка -- Streptomyces. Очень редко образуют антибиотики представители эубактерии; исключение составляют лишь некоторые спорогенные бациллы, продуцирующие полипептидные антибиотики определенного класса. Антибиотики синтезируются многими грибами, но их структура менее разнообразна, чем структура антибиотиков, образуемых актиномицетами.

Способность к синтезу антибиотиков не является строго видоспецифичным признаком. Один и тот же антибиотик может образовываться организмами, относящимися к разным видам, родам и даже порядкам. Справедливо и обратное: штаммы, относящиеся к одному виду, могут синтезировать разные антибиотики. Однако, как правило, чем дальше отстоят друг от друга организмы в таксономическом отношении, тем меньше вероятность, что они образуют один и тот же антибиотик.

При оптимизации любого промышленного процесса, протекающего с участием живых организмов, основные усилия бывают направлены на улучшение их генетически обусловленных свойств. Традиционно для повышения продуктивности штаммов использовали мутагенез с последующим скринингом и отбором подходящих вариантов. В «допастеровский период» отбор при проведении наиболее «древних» процессов ферментации (например, в пивоварении или сыроделии) осуществлялся, очевидно, бессознательно. В последнее время для объединения желаемых свойств разных штаммов в одном организме стали использовать гибридизацию.

Необходимой предпосылкой создания более продуктивных штаммов путем отбора мутантов и рекомбинации является глубокое знание биохимии и физиологии процесса ферментации. Нам нужна также информация о том, какие стадии метаболизма являются лимитирующими, каковы термодинамические пределы повышения выхода продукта. Обычно эффективность процесса удается поднять, используя приемы как физиологии, так и генетики: при этом возможности двух наук дополняют друг друга, а не противопоставляются.

1. Способы увеличения продуктивности штаммов

1.1 Мутагенез и отбор

В прошлом для увеличения продуктивности штаммов обычно использовали мутагенез и отбор: именно таким путем удалось повысить выход антибиотиков, синтезируемых грибами и актиномицетами. Было последовательно отобрано свыше двадцати штаммов, продуцирующих все больше пенициллина, и, в конечном счете, продуктивность увеличилась в 55 раз. Как в этом случае, так и во многих других прямого отбора не происходило, поскольку не удавалось создать условия, при которых росли бы только искомые штаммы. Вместо этого пришлось применять метод скрининга: клетки, выжившие после воздействия больших доз мутагенов, размножали в колбах на качалках, после чего в фильтратах культуральной среды определяли количество антибиотика.

Скрининг требует много времени и напряженного труда. Часто штаммы, для которых был получен большой выход при выращивании в колбах, оказывались непродуктивными в условиях роста в ферментере большого объема. Нередко успеху способствовало знание «секретов мастерства»: так, оказывается, что большая продуктивность обычно свойственна особым морфологическим вариантам.

Скрининг с использованием чашек с агаром вместо колб на качалках позволяет обследовать гораздо больше мутантов. Образование антибиотиков или метаболитов нередко оценивается методом биопроб, когда в агар вводят индикаторные организмы. Разработаны устройства для автоматического скрининга чашек. В них используются механические приспособления для инокуляции и производится периодическое фотографирование и последующий компьютерный анализ изображений. Можно создать особые условия, при которых мутанты с нужными свойствами не растут. В этом случае применяется так называемый метод обогащения, когда активно растущие клетки дикого типа погибают, а нерастущие мутантные выживают. Так, например, пенициллин или нистатин вызывает гибель растущих клеток бактерий или грибов соответственно. При работе с грибами недостаток в среде инозитола приводит к автолизу растущих, но не покоящихся клеток.

Наиболее подходящим способом является, конечно, прямой отбор, когда создаются условия для роста только мутантных клеток. Этот подход применялся для выделения штаммов -- сверхпродуцентов некоторых метаболитов, например аминокислот или цитрата. Обработанную мутагеном культуру выращивают в присутствии ингибитора (например, аналога аминокислоты), в результате чего отбираются мутанты, преодолевающие нарушение обмена за счет образования избытка желаемого соединения.

Отбор на чашках с агаром основан на том, что часть организмов отвечает на воздействие по принципу «все или ничего». Колонии мутантов растут, а диких клеток -- нет. Однако при получении промышленных штаммов, особенно предназначенных для использования в длительных процессах ферментации, нередко стремятся получить для конкретных условий относительно небольшие различия в скорости роста. В этом случае отбор происходит при непрерывном культивировании. В хемостатах при длительном выращивании культура все время находится в экспоненциальной фазе роста, и это позволяет выделять даже те мутанты, у которых сродство к субстрату, удельная скорость роста или устойчивость к токсическому действию высоких концентраций субстрата или продукта лишь немного превышает исходный уровень.

1.2 Гибридизация путем скрещивания

Наиболее простой путь создания организмов с желаемым комплексом генетически обусловленных признаков -- это скрещивание штаммов, принадлежащих к противоположным половым типам. Как про-, так и эукариотические микроорганизмы скрещиваются при контакте клеток, и этот процесс используется для получения рекомбинантов.

1.3 Конъюгация у бактерий

У бактерий половой процесс называют конъюгацией. Контакт между двумя клетками осуществляется за счет образования длинного конъюгационного мостика, который служит для переноса ДНК из одной клетки в другую. Способность к формированию мостика закодирована во многих плазмидах (см. далее); по нему они переносят свои гены, а в некоторых случаях и гены клетки-хозяина в клетку-реципиент. Плазмиды, осуществляющие перенос генов клетки-хозяина, обладают, таким образом, способностью к мобилизации хромосом. У Escherichia coli такие F-плазмиды выступают в роли фактора пола. Они способны мобилизовать хромосому не только Е. coli, но и родственных энтеробактерий (Shigella, Klebsiella, Salmonella, Erwinia) и поэтому могут использоваться для переноса генов между бактериями разных родов. Некоторые плазмиды, выделенные из Pseudomonas aeruginosa, еще более «неразборчивы». Так, плазмида R68.45 может переносить хромосомные гены между видами Pseudomonas, в том числе и Pseudomonas putida, но кроме этого, обладает способностью к мобилизации хромосом и таких родов, как Rhizobium, Rhodopseudomonas, Azospiril-lum, Agrobacterium и Escherichia.

К числу наиболее широко используемых в промышленности микроорганизмов Относятся разнообразные виды Streptomyces: с их помощью получают более 60% разновидностей применяющихся сегодня антибиотиков. У этих организмов хорошо развиты системы скрещивания, которые обнаружены и у их близких родственников, видов Nocardia (они синтезируют антибиотики рифамицины

1.4 Системы скрещивания у грибов

У грибов существуют разнообразные типы скрещивания, которые используются в генетических исследованиях. Многие грибы-аскомицеты и базидиомицеты обладают сложноорганизованными системами скрещивания, препятствующими самооплодотворению и другими формами инбридинга. Половой процесс контролируется системой несовместимости. У некоторых грибов система несовместимости биполярна; при этом процесс скрещивания контролируется всего одним локусом, который существует в двух альтернативных аллельных формах. У других грибов (например, Schizophyllum commune) система несовместимости тетраполярна. У них тип спаривания определяется двумя генами, каждый из которых имеет множество аллельных форм. Для успешного скрещивания два партнера должны обладать разными аллелями каждого из двух локусов типа спаривания.

2. Мутагенез и методы выделения мутантов

Генетическое изучение микроорганизмов, создавшее фундамент для современной селекции, стало возможным только, когда были разработаны способы выделения клоновых культур, или клонов.

Клон -- это генетически однородное потомство одной клетки, например колония, возникшая из одной клетки при рассеве культуры на плотной питательной среде. Исследуя свойства такой колонии, можно получить представление и о признаках породившей ее клетки.

Важно отметить, что при последующих пересевах клоновой культуры в результате процесса изменчивости могут появиться варианты, отличающиеся от исходного. И тогда клоновая культура клеток превращается в генетически разнородную клеточную популяцию. Клоновая по происхождению культура, наследственная однородность которой поддерживается отбором по специфическим признакам, называется штаммом. Получение и поддержание высокопродуктивных штаммов -- основная задача селекционной работы.

Важнейшим методом селекции микроорганизмов является отбор мутантов, т. е. организмов с измененными наследственными признаками, которые появляются в результате мутаций. В самом широком смысле мутацию можно определить как внезапно возникающее наследуемое изменение в генетическом материале клетки. Следует различать мутации цитоплазматические, затрагивающие внехромосомные генетические детерминанты, и ядерные, или хромосомные.

В свою очередь, хромосомные мутации можно разделить на три основных типа: 1) изменение числа хромосом; 2) изменение числа и порядка расположения генов (перестройки хромосом или структурные изменения); 3) изменения индивидуальных генов (внутригенные изменения, или мутации в наиболее узком смысле этого слова) (Ш. Ауэрбах, 1978). В селекции микроорганизмов основное значение имеют последние два типа мутаций.

Хромосомные перестройки включают: выпадения участков хромосомы (делении), удвоения (дупликации) или умножения (амплификации) числа отдельных генов или группы генов, вставки участков хромосом в новые места (транспозиции), обмен участками между хромосомами (транслокации), изменения порядка расположения генов на хромосоме (инверсии). Такие мутации могут вызывать как утрату функций, так и приобретение новых признаков, в частности в связи со слиянием генов, которые могут оказаться под контролем несвойственных им регуляторных элементов. При этом могут появиться гибридные белки, увеличиться (уменьшиться) количество продуктов определенных генов. За исключением амплификации, псе хромосомные перестройки стабильны.

Внутригенные мутации изменяют последовательность оснований ДНК в пределах одного гена. Это могут быть выпадения или вставки одного или нескольких оснований, нарушающие порядок считывания гена в процессе трансляции. В клетках такого типа мутанта синтезируется неактивный белок с измененной последовательностью аминокислот. При транзициях происходит замена какого-либо одного пурина или пиримидина (тимина или цитозина) на другой пурин или пиримидин соответственно. При трансверсиях пуриновые основания заменяются на одно из двух пиримидиновых и, наоборот, пиримидиновое основание -- на одно из двух пуриновых.

Важной характеристикой мутантов является их способность, к реверсии, т. е. обратному мутированию к исходному фенотипу. Мутанты, которые появляются в результате реверсии, называются ревертантами. При истинных обратных мутациях в ДНК восстанавливается исходная последовательность оснований. Так ревертируют точковые мутации -- замены оснований, вставки или выпадения одного или нескольких нуклеотидов.

Кроме того, реверсии могут произойти благодаря супрессорным мутациям. При внутригенной супрессии вторая мутация возникает в том же гене, что и первичная мутация, и приводит к более или менее полному восстановлению функции белка. При внегенной супрессии вторая мутация затрагивает другой ген. Так, ошибки кодирования, связанные с нонсенс-мутациями и некоторыми мутациями со сдвигом рамки, могут частично исправляться мутациями в генах, кодирующих РНК Восстановленная активность поврежденного белка при этом обычно не превышает 10 % от исходного уровня.

Когда невозможно провести прямой отбор мутантов, исследуют колонии на индикаторных чашках, применяют тесткультуры микроорганизмов или перепечатывают колонии на различные среды, т. е. используют метод отпечатков, или реплик. Иногда приходится выращивать каждую колонию и определять в культуральной жидкости интересующую активность. Индикаторные чашки дают возможность различать мутанты по цвету колоний и проводить тестирование разнообразных фенотипов в больших популяциях. Такие чашки могут содержать среды с индикатором, выявляющим различие в рН между теми колониями, которые метаболизируют определенные углеводы, и теми, которые не обладают такой способностью. Так, на агаре с трифенилтетразолием колонии, не сбраживающие лактозу, приобретают ярко-красный цвет, а колонии, сбраживающие этот дисахарид, остаются неокрашенными. Используются также специально приготовленные субстраты, распадающиеся с образованием красителя при их гидролизе ферментами, наличие которых тестируется на этих чашках. Иногда вносят субстраты, изменяющие прозрачность сред, и наблюдают образование вокруг колоний мутантов зон просветления.

В 1952 г. Д. Ледерберг и Э. Ледерберг ввели для непрямого отбора мутантов метод отпечатков (рис. 6). Согласно этому методу, чашки Петри засеваются с таким расчетом, чтобы на каждой из них выросло 50--200 колоний. Стерильный бархат или фильтровальную бумагу натягивают на металлический или деревянный цилиндр и закрепляют металлическим кольцом. Чашки с выросшими колониями переворачивают и прикладывают к бархату. Затем к этому же бархату (с отпечатками колоний на нем) прикладывают чистые чашки с различными средами. После соответствующей инкубации на них образуются колонии в том же расположении, что и на исходной (матричной) чашке. Если матричная чашка содержала полноценную среду, то отпечатками на минимальные среды можно выявить ауксотрофные мутанты. Различные модификации этого метода широко используются для выделения мутантов с питательными потребностями, а также мутантов, чувствительных к различным физическим, химическим и биологическим агентам (температура, антибиотики, фаги и др.).

Получение ауксотрофных мутантов с помощью метода отпечатков может быть облегчено, если обогащать ими популяцию клеток, используя пенициллин или его аналоги. Эти антибиотики убивают только растущие клетки. Например, ауксотрофные по треонину мутанты Е. coli не растут на минимальной среде без треонина. В этих условиях пенициллин будет убивать только прототрофные клетки. Однако полной селекции ауксотрофов эта процедура не обеспечивает.

Иногда приходится проводить несколько циклов обработки пенициллином, попеременно выращивая бактерии в среде с треонином без пенициллина и в минимальной среде без треонина с пенициллином. После одного цикла достигается обогащение желаемыми мутантами в 1000 и даже в 10000 раз. Следовательно, если необходимая мутация возникает спонтанно с частотой 10~⁷, то достаточно просмотреть несколько тысяч колоний, выживших после обработки пенициллином, чтобы найти колонию с нужной мутацией.

Вывод

Сегодня в этой области произошли явные перемены: если раньше единственным используемым генетическим методом был отбор улучшенных штаммов, то сегодня предлагаются совсем новые подходы, основанные на технологии рекомбинантных ДНК (генетическая инженерия). С их помощью путем ферментации можно получать новые виды продукции: белки и пептиды человека, антигены вирусов. Надо сказать, что большой интерес к биотехнологии в значительной мере обусловлен именно появлением генетической инженерии. Сейчас широкое применение находят методы модификации генетического материала как in vivo, так и in vitro для разработки новых и модернизации существующих биотехнологических процессов.

Литература

1. Биотехнология Принципы и применение Пер с англ. /Под ред. И. Хтгенса, Д.Беста, и Дж.Джонса. М.: Мир, 1988.-480ст.

2. Экологическая биотехнология. Под. ред. Форебера и Дис.Вайза. - Л.: Химия. - 1991 - 120с.

3. Герасименко В.Г. Биотехнология. - Киев.: Высшая школа - 1989. - 342 с.

4. Белков В.А. Биотехнология. Микробиологическое производство биологически активных веществ. - М.: Высшая школа. - 1997. - 220 с.

5. Мильчук М.Д., Новак Т.В., Кунах В.А. Біотехнологія рослин. - Київ, Поліграфконсалтінг, 2003. - 250 с.

6. Рыльский А.Ф. Краткий курс лекций по биотехнологии (для студ. Дневного отделения биологического факультета).- Запорожье: ЗГУ, 1996.- 75с.