Исследование микрофлоры тела сомов Clarias batrachus и антибиотических свойств их кожной слизи

Размещено на http://www.allbest.ru/

Аннотация

В данном отчёте рассказывается об исследовании микрофлоры тела сомов Clarias batrachus и антибиотических свойств их кожной слизи. Работа проводилась на кафедре Микробиологии и иммунологии РГАУ МСХА им. К. А. Тимирязева.

В отчёте изложены основные методы изучения микрофлоры, методики приготовления питательных сред, правила работы в лаборатории и техники безопасности, а так же методы идентификации микроорганизмов.

Оглавление

Введение

1. Характеристика организации

1.1 Основные сведения о РГАУ-МСХА

1.2 Основные сведения о кафедре Микробиологии и Иммунологии

1.3 Состав кафедры

1.4 Направления деятельности кафедры

2. Экспериментальная часть

2.1 Отбор проб

2.2 Посев и результаты эксперимента №2

2.3 Посев и результаты эксперимента №3

Заключение

Список литературы

Введение

Актуальность работы. Качество, безопасность и продуктивность являются основными определяющими факторами в цепи создания ценности пищевых продуктов. Изучение микрофлоры рыб даст более полное понимание их биологии, поможет создать оптимальные условия содержания, кормления и отлова.

Цель работы: изучить антибиотические свойства кожной слизи рыб; изучить принципы работы в микробиологической лаборатории.

Задачи работы. Для осуществления поставленной цели были определены следующие задачи: 1. Овладеть навыками подготовки посуды и инструментов для микробиологических исследований. 2. Изучить микрофлору кожи сомов. 3. Овладеть навыками приготовления основных питательных сред. 4. Научиться анализировать результаты роста микроорганизмов. 5. Освоить методики идентификации микроорганизмов.

Теоретическая основа работы. Для работы были использованы: «Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований» под редакцией А.С. Лабинской; М.С.Поляк, В.И.Сухаревич, М.Э.Сухаревич. «ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ МЕДИЦИНСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ» Санкт-Петербург, 2002 г.

Структура работы. В данной работе 2 главы, первая глава посвящена характеристике организации, составу кафедры и направлению её деятельности. Вторая глава посвящена основным методам изучения микрофлоры, а так же методах идентификации микроорганизмов.

Практическая значимость. Оптимальные условия содержания рыбы, влияющие на показатели её качества, как продукта потребления, можно установить, изучив её микрофлору. В данной работе приводятся результаты первичных исследований по изучению кожной слизи сомов.

1. Характеристика организации

1.1 Основные сведения о РГАУ МСХА

Официальное наименование: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А.Тимирязева»

Дата основания: 27 октября 1865

Учредитель: Министерство сельского хозяйства Российской Федерации

Адрес: 127550, г. Москва, Тимирязевская ул., 49.

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А.Тимирязева" осуществляет свою деятельность в области образования на основании Устава Университета, утвержденного Министерством сельского хозяйства Российской Федерации от 28 августа 2014 года № 30-у.

1.2 Основные сведения о кафедре Микробиологии и Иммунологии

Главная задача кафедры - подготовка молодых специалистов. Преподавание проводится на 7 факультетах университета по 8 направлениям и 15 специальностям. Ежегодно на кафедре проходят обучение более 1,5 тыс. студентов, включая слушателей вечернего и заочного отделений. В последние годы существенно расширился спектр преподаваемых дисциплин. Кроме курса общей микробиологии, развитие которого идёт по направлению более глубокой специализации в соответствии со специальностями подготовки, разработаны новые дисциплины специализации: “Биология почв” - для обучающихся по специальности “Агрохимия и агропочвоведение” (доц. А. А. Ванькова) и “Микробиология вина” - для специальности “Плодоводство и виноградарство” (ст. преп. Л. А. Свиридова).

Кафедра осуществляет руководство дипломным проектированием совместно с выпускающими кафедрами университета и ежегодно выпускает в среднем 10 дипломников. Дипломные работы студенты выполняют на высоком методическом уровне и всегда успешно защищают. В 2006, 2007 и 2008 гг. дипломники кафедры стали победителями ежегодной студенческой научной конференции РГАУ-МСХА им. К. А. Тимирязева и представили свои работы от университета на Смотр-конкурс на лучшую научную студенческую работу среди аграрных вузов России, где получили дипломы I степени. Среди дипломантов два студента факультета почвоведения, агрохимии и экологии, 1 - зооинженерного факультета и 1 - технологического (научные руководители - проф. О. Д. Сидоренко, доц. Т. А. Карепина, доц. Г. В. Годова). Большую работу по организации и проведению научных исследований студентов проводит руководитель СНО доц. О. В. Селицкая.

1.3 Состав кафедры

Ванькова Анна Андреевна	Доцент	Микробиология; Биология почв; Микробиология вина; Общая микробиология и общая санитарная микробиология	К.б.н.
Волобуева Ольга Гавриловна	Доцент	Микробиология; Общая биология и микробиология	К.б.н.
Годова Галина Владимировна	Доцент	Микробиология; Микробиологический контроль и санитарно-гигиеническая оценка объектов окружающей среды и продуктов с.-х. производства; Санитария и гигиена питания	К.б.н.
Емцев Всеволод Тихонович	Профессор	Микробиология; Микробная биотехнология в сельском хозяйстве; Экологическая биотехнология	Д.б. н.
Карепина Татьяна Алексеевна	Доцент	Микробиология	К.б.н.
Колесников Олег Васильевич	Ассистент	Микробиология	К.б.н.
Маннапова Рамзия Тимергалеевна	Профессор	Микробиология и иммунология	Д.б.н
Свиридова Людмила Александровна	Доцент	Микробиология вина	К.б.н.
Селицкая Ольга Валентиновна	Зав. кафедрой, доцент	Микробиология; Биология почв; Микробные биотехнологии в сельском хозяйстве	К.б.н.
Сидоренко Олег Дмитриеевич	Профессор	Микробиология и иммунология; Микробиология продуктов животноводства	Д.с.-х. н.

1.4 Направления деятельности кафедры

микроорганизм лаборатория питательный посев

Научная тематика кафедры формируется в соответствии с приоритетными направлениями развития науки, технологий и техники в Российской Федерации. Исследования направлены на изучение почвенных микроорганизмов, их взаимоотношений с растениями, создание инновационных микробных биотехнологий для сельского хозяйства и охраны окружающей среды. В рамках этих направлений проводится работа по созданию микробных препаратов нового поколения, обладающих комплексным защитно-стимулирующим действием на растения, повышающих урожайность и качество продукции. Проведены полевые испытания и рекомендованы с/х производству высокоэффективные экологически чистые биопрепараты, для зерновых, овощных и технических культур - “Биоплант - К” (авторы проф. Емцев В. Т., ст. н. с. Селицкая О. В.), “Бактосем” (автор проф. Сидоренко О. Д.), “Афандин” (авторы проф. Шильникова В. К., проф. Шкаликов В. А.); для бобовых культур - “Ризоторфин” (авторы проф. Сидоренко О. Д., доц. Ванькова А. А.). Разработан также микробный препарат для биоремедиации нефтезагрязнённых почв - “Псевдомин” (авторы проф. Емцев В, Т., ст. н. с. Селицкая О. В., асп. Станкевич Д. С.). Предложены новые биологические технологии переработки отходов сельского хозяйства и промышленности, позволяющие утилизировать растительные остатки, навоз, птичий помёт, отходы пищевой промышленности путём компостирования (автор проф. Сидоренко О. Д.). Проводится работа по созданию новых микробных биопрепаратов, обладающих способностью быстро и эффективно разрушать неприродные полимерные соединения (полиэтиленовые плёнки, пластмассы и т. п.), входящие в состав городских и промышленных отходов.

Новым и перспективным научным направлением кафедры является создание эффективных растительно-микробных систем на основе симбиотических взаимоотношений между растениями и микроорганизмами, способных на 60-70% обеспечивать себя азотом за счёт биологической азотфиксации, обладающих пластичностью, устойчивостью к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды и высокой продуктивностью.

Возобновлены исследования по санитарной микробиологии почв - весьма актуальному и перспективному направлению, но к сожалению не развивавшемуся после работ Е. Н. Мишустина середины ХХ века. Проводится длительный мониторинг с целью оценки и прогнозирования изменения состояния почв в условиях мегаполиса. Изучаются особенности микробных ценозов урбанизированных почв, возможность выживания в почве патогенных микроорганизмов, процессы самоочищения, разрабатываются способы оздоровления городских почв. Планируется создание коллекции индикаторных микроорганизмов для экспресс-диагностики в окружающей среде токсичных веществ различной природы (пестицидов, радионуклидов, тяжёлых металлов, продуктов органического синтеза, нефти и нефтепродуктов и т. п.). Это дало бы возможность принимать экстренные меры по ликвидации опасных для человека очагов химического загрязнения.

В научных исследованиях на современном этапе преобладает экологическое направление, в рамках которого разрабатываются следующие проблемы:

1. изучение микробных сообществ антропогенно-измененных почв, в том числе агроценозов и урбанизированных территорий;

2. разработка микробных биопрепаратов для растениеводства и рекультивации почв, загрязненных ксенобиотиками;

3. микробиологическая деструкция полимерных композиционных материалов в почве;

4. изучение почвы как среды обитания патогенных и условно-патогенных микроорганизмов;

5. создание эффективных сорто-микробных систем;

6. биоконверсия отходов сельскохозяйственной и перерабатывающей промышленности.

2. Экспериментальная часть

Первый эксперимент закончился неудачей из-за недостаточно отработанной техники отбора проб, посева и приготовления сред.

Второй и третий эксперименты дали более точные результаты и будут рассмотрены в данной работе.

2.1 Отбор проб

Пробы отбирались с сомов Батракус и Клариус Батракус. Клариевые сомы живут в аквариуме при средней температуре около 23 градусов в количестве тридцати особей; смена воды происходит раз в 3-5 дней. Сомы батракусы живут в аквариуме в количестве 10 особей при средней температуре около 23 градусов, смена воды также раз в 3-5 дней. Оба вида кормят форелевым эквивалентом GarantAqua раз 2 дня.

Перед отбором проб рыбы ополаскивались стерильной водой и помещались в чистый сачок. Пробы брались с помощью стерильных тампонов с площади примерно 100 кв. сантиметров, после чего помещались в пробирки с 20 миллилитрами стерилизованного физиологического раствора. Содержимое перед экспериментом тщательно перемешивались на шейкере-«качалке».

Кроме того, на анализ были взяты пробы воды из обоих аквариумов.

2.2 Посев и результаты эксперимента №2

С взятых проб делалось 6 разведений.

№1 - проба с кожи клариевого сома;

№2 - проба воды из аквариума клариевых сомов;

№3 - проба с кожи сома батракуса;

№4 - проба воды из аквариума батракусов.

Во втором эксперименте посев совершался на МПА, среду Кесслера и среду Сабуро. При посеве проб с сомов на МПА и Сабуро брались с первого по четвёртое разведения; при посеве проб воды - с третьего по шестое разведения. На среду Кесслера сеяли первые три разведения проб с сомов и первые воды. Со среды Кесслера (где был отмечен положительный результат) был пересев на среду Эндо.

Таблица 1. Результаты посева на среду Кесслера.

Разведение и кол-во инокулята	Селективное обогащение. С. Кесслера	Потверждение С. Кесслера/Мак Конки	Потверждение
	24 ч.	48 ч.	24 ч.	48 ч.	С. Эндо
1 мл 4-1	Газ +, муть +/газ +, муть +	Газ +, муть +/газ +, муть +	-	-	К. с золотистым м.б., ореол -
1 мл 3-3	Газ -, муть -/газ -, муть -	Газ -, муть -/газ -, муть -	-	-	-
1 мл 3-2	Газ -, муть -/газ -, муть -	Газ -, муть +/ газ +, муть +	-	-	Ползучие мал. к., ореол + (мал.)/ роз. к., ореол + (мал.)
1 мл 3-1	Газ +, муть +	Газ +, муть +	-	-	Ползучие мал. к., м.б. +, ореол -/ св. роз. к., м.б. +, ореол + (св. роз.)
1 мл 2-2	Газ +, муть +	Газ +, муть +	-	-	Ползучие мал. к., м.б. +, ореол -/ мал. к. м.б. +, ореол -
1 мл 2-1	Газ +, муть +/ газ +, муть +	Газ +, муть +/ газ +, муть +	-	-	Мал. к. м.б. +, ореол -/ мал. к. м.б. +, ореол -
1 мл 1-3	Газ -, муть -/ газ -, муть -	Газ -, муть -/ газ -, муть -	-	-	-
1 мл 1-2	Газ -, муть -/ газ -, муть -	Газ -, муть +/ газ - , муть +	-	-	Мал. к., м.б. -, ореол + (роз.)/ мал. к., м.б. -, ореол + (роз.)
1 мл 1-1	Газ +, муть +/ газ -, муть +	Газ +, муть +/ газ +, муть +	-	-	Ползучие мал. к., м.б. +, ореол -/ ползучие мал. к., м.б. +, ореол -

Таблица 2. Результаты посева на МПА

Кол-во инокулята и номер пробы	Выявление МПА (72 часа)
	Разведение	КОЕ	Разведение	КОЕ	Разведение	КОЕ
1 мл №1	2	-	3	131/175	4	40/37
1 мл №2	3	103/118	4	73/62	5	19/4
1 мл №3	2	160/174	3	78/64	4	-/7
1 мл №4	3	65/66	4	10/15	5	-/-

Остальные разведения не поддаются учёту (количество КОЕ > 300)

Посев на среду Сабуро не дал точных результатов из-за неправильных методик обработки инструментов и приготовления среды.

2.3 Посев и результаты эксперимента №3

В третьем эксперименте пробы отбирались тем же методом, как и в двух предыдущих. Посев совершался на среду Кесслера (пересев на Эндо), МПА, а так же пробы вносились в планшетку Food System (пересев на ряд селективных сред).

Таблица 3. Результаты посева на среду Кесслера

Разведение и кол-во инокулята	Селективное обогащение. С. Кесслера/Мак-Конки	Потверждение С. Кесслера/Мак-Конки	Потверждение
	24 ч.	48 ч.	24 ч.	48 ч.	С. Эндо
1 мл 1-1	Газ +, муть +/газ +, муть +	Газ +, муть +/газ +, муть +	-	-	Ползучие мал. к., м.б. -, ореол + (мал.)/ ползучие мал. к., м.б. -, ореол + (мал.)
1 мл 1-2	Газ -, муть +/газ -, муть +	Газ -, муть -/газ -, муть -	-	-	Ползучие мал. к., м.б. -, ореол + (мал.)/ ползучие мал. к., м.б. -, ореол + (мал.)
1 мл 3-1	БГКП +	БГКП +	-	-
1 мл 3-2	БГКП +	БГКП +	-	-
1 мл 2-1	Газ +, муть +/ газ +, муть +	Газ +, муть +/ газ +, муть +	-	-	Ползучие мал. к., м.б. -, ореол -/ ползучие мал. к., м.б. -, ореол -
1 мл 2-2	Газ +, муть +/ газ +, муть +	Газ +, муть +/ газ +, муть +	-	-	Ползучие мал. к., м.б. -, ореол -/ ползучие мал. к., м.б. -, ореол -
1 мл 2-3	Газ -, муть -/ газ -, муть -	Газ +, муть +/ газ -, муть +	-	-	Мал. к., м.б. +, ореол + (мал.)/ мал. к., м.б. -, ореол -
1 мл 2-4	Газ -, муть -/ газ -, муть -	Газ -, муть -/ газ - , муть +	-	-	-
1 мл 2-5	Газ -, муть -/ газ -, муть -	Газ -, муть -/ газ -, муть -	-	-	-
1 мл 4-1	Газ +, муть +/ газ +, муть +	Газ +, муть +/ газ +, муть +	-	-	Ползучие мал. к., м.б. +, ореол + (мал.)/ ползучие мал. к., м.б. -, ореол + (мал.)
1 мл 4-2	Газ +, муть +/ газ +, муть +	Газ +, муть +/ газ +, муть +	-	-	Ползучие мал. к., м.б. +, ореол + (мал.)/ ползучие мал. к., м.б. -, ореол + (мал.)
1 мл 4-3	Газ -, муть -/ газ -, муть -	Газ -, муть -/ газ -, муть -	-	-	-
1 мл 4-4	Газ -, муть -/ газ -, муть -	Газ -, муть -/ газ -, муть -	-	-	-

Биохимические реакции для идентификации

1-LDС Декарбоксилирование лизина

2-H2 S продукция H2 S

3-UR гидролиз мочевины

Предварительная идентификация микроорганизмов

4-PRO Proteus/Providencia spp.

5-PSE Pseudomonas spp.

6-STA Staphylococcus aureus

7-ESC Escherichia coli

8-IND Индольный тест для подтверждения Escherichia coli

9-BCE Bacillus cereus

10-LIS Listeria spp.

11-CAT Каталазный тест для подтверждения Listeria spp.

12- Y/M Дрожжи и плесени

Таблица 4. Результаты проверки на тест-системе Food System, проба 1-2

Реагент	Результат
LDC	-
H2S	+
UR	+
PRO	-
PSE	+
STA	-
ESC	-
Индол	+
BCE	+
Lis.	-
CAT	+
Y/M	+

Таблица 5. Результаты проверки на тест-системе Food System, проба 3-2

Реагент	Результат
1. LDC	+
2. H2S	+
3. UR	-
4. PRO	-
5. PSE	+
6. STA	+
7. ESC	-
8. Индол	-
9. BCE	+
10. Lis.	-
11. CAT	+
12. Y/M	-

Далее содержимое лунок пересевалось на селективные среды:

1 - на среду Рамбаха (выявление бактерий рода Salmonella);

4 - CLED (выявление бактерий рода Proteus);

5 - цетримидный агар (выявление бактерий рода Pseudomonas);

9 - MYP (выявление бактерий рода Bacillus);

6 - №10, BP (выявление бактерий рода Staphylococcus aureus);

12 - Сабуро (обнаружение грибов и плесеней);

7 - Эндо (выявление БГКП);

6 - ЭКА (выявление бактерий рода Staphylococcus aureus).

Таблица 6. Результаты посева на МПА

Кол-во инокулята и номер пробы	Выявление МПА (72 часа)
	Разведение	КОЕ	Разведение	КОЕ	Разведение	КОЕ
1 мл №1	2	97/90	3	17/15	-	-
1 мл №2	3	18/-	4	51/55	-	-
1 мл №3	2	204/103	3	40/41	-	-
1 мл №4	3	118/102	-	-	-	-

Остальные разведения не поддаются учёту.

Результаты роста на различных селективных средах

Среда Рамбаха: рост 1-2, 3-2 (глянцевые зелёные и пурпурно-зелёные колонии);

CLED: рост 1-2, 3-2, 4-2 (жёлтые глянцевые колонии);

MYP: рост 1-2, 3-2, 4-2 (светло-жёлтые глянцевые колонии);

BP: рост 1-2, 3-2 (глянцевые коричневые колонии с ореолом и без);

№10: рост 1-2, 3-2 (жёлтые глянцевые колонии с ореолом);

Цетримидный агар: рост 3-2 (белые глянцевые колонии);

ЭКА: рост 1-2, 3-2, 2-2 (мелкие белые колонии с чёрным ореолом);

Эндо: рост 1-2.

Заключение

Исследования были проведены в микробиологической лаборатории; принципы работы были изучены на практике. Были изучены антибиотические свойства кожной слизи рыб, и по результатам вышеприведённых исследований можно с некоторой вероятностью утверждать, что на коже сомов обоих видов не обитают бактерии рода Salmonella. Также можно сказать, что в слизи встречаются бактерии рода Citrobacter. Кроме того, в воде из аквариумов встречаются плесени (идентифицировать не удалось), которых при нормальных условиях содержания не бывает на коже рыб. По наблюдениям, при охлаждении воды до почти критических для сомов температуры, плесени так же могут быть и на их коже.

Список литературы

«Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований» под редакцией А.С. Лабинской;

М.С.Поляк, В.И.Сухаревич, М.Э.Сухаревич. «ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ МЕДИЦИНСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ» Санкт-Петербург, 2002 г.

Размещено на Allbest.ru