Выделение споровых микроорганизмов грунта пещеры Баскунчакская (Астраханской области)

Различия между гетеротрофами с высокими потребностями в готовых органических и теми, потребности которых минимальны и сводятся, как правило, одному какому - нибудь органическому источнику углерода, заключаются таким образом, в степени развития их биосинтетических способностей (Кочемасов, Ефремова, 1987).

Глава 2 Объекты и методы исследования

2.1 Объекты исследования

Объектом исследования являлась пещера Баскунчакская.

Пещера представляет собой горизонтальный двух-, трехъярусный лабиринт по характеру морфологии условно делимый на три части: Основную Галерею - северо-восточную, самую крупную от входа №1,Вертикальный Шкуродер - узкий меандр от входа № 3 и Лабиринт, соединяющий первые две части. Обвальные залы и галереи шириной в несколько метров с четко выраженной на стенах ярусностью местами имеют высоту до 10 м. В целом сухая, пещера имеет два сифона: один - в лабиринтовой части, вбирающий временный водоток из тальвега, второй - в виде озера диаметром около 4 м, из которого периодически появляется водоток в Основную Галерею. Это озеро-сифон единственным доступным источником питьевой воды (проведен химический анализ) как в пещере, так и на несколько километров в окрестности. Пещера Баскунчакская является наиболее крупной подземной карстовой формой Прикаспийской низменности. Начало формирования пещеры относится к концу позднехвалынского времени, то есть примерно 6 тысяч лет назад. На протяжении этого времени в полости четыре раза существовал достаточно мощный водный поток, что на фоне вертикальных движений, обусловленных солянокупольной тектоникой, привело к формированию нескольких уровней и отразилось в морфологии поперечных профилей ходов в некоторых частях пещеры. В Баскунчакской пещере можно наблюдать разнообразные карстовые формы: желобковые и лунковые кары, закарстованные трещины, гипсовые ножи. Турбулентные потоки, некогда имевшие здесь место, создали на некоторых участках пещеры своеобразные останцовые формы, морфологически сходные со сталагнатами. В зимнее время в определенных местах пещеры образуются ледяные сталагмиты (Белононич, Цой , 1998).

Первая проба была отобрана возле горизонтального шкуродера на глубине 20-25 см.

Вторая проба была отобрана в галерее входа №2 на глубине 10-15 см.

Третья проба в галерее входа №3 на глубине 10-15 см.

Четвертая проба была отобрана в главной Галереи на глубине 10 - 15 см.

Пятая проба была отобрана в начале вертикального шкуродера.

Шестая проба была отобрана в лабиринтовой части пещеры.

Седьмая проба отобрана в галерее входа №2.

Восьмая проба отобрана в грязевом сифоне.

Девятая проба отобрана в районе горизонтального шкуродера.

2.2 Методы исследования

2.2.1 Методы отбора проб

Почвенный образец берут стерильным буром, стерильной лопаткой и стерильным ножом в заранее приготовленную стеклянную широкогорлую стерильную банку, закручивающуюся пробкой, обернутой стерильной ватой, либо в стерильные полиэтиленовые или пергаментные мешки. На пакеты, банки наклеивают этикетки с указанием места взятия проб, горизонта и других сведений. Бур, лопату и нож перед взятием образца тщательно очищают, затем обжигают горящим спиртом (Теппер ,1987).

Почвенные образцы анализируют в первые сутки. В случае необходимости допускается хранение их в холодном помещении (в холодильнике) в течение двух дней. Для большей однородности среднего образца, соблюдая все правила асептики, его тщательно перемешивают, вынимают корни растений, различные включения (Теппер ,1987).

Для дальнейшего исследования отобранных проб, предварительно необходимо произвести стерилизацию микробиологической посуды и сред, используемых в последующей работе.

2.2.2 Методы стерилизации

Стерилизация или обеспложивание (от лат. sterilis - бесплодный), это полное уничтожение клеток микроорганизмов в питательных средах, посуде и пр.

Известно несколько методов стерилизации. Чаще всего применяют стерилизацию нагреванием.

1. Фламбирование, или прокаливание.

Прокаливать можно непосредственно перед употреблением платиновые петли, иглы, шпатели, мелкие металлические предметы (ножницы, ланцеты, пинцеты), а также стеклянные палочки, предметные, покровные стекла и т.д.

2. Стерилизация сухим жаром

Ее применяют для обработки посуды и сухих материалов. При этом стерилизуемый объем выдерживают при170?C в течение 2 часов в печи Пастера или в электросушильных шкафах. Перед стерилизацией стеклянную посуду закрывают ватными пробками и обертывают бумагой. Чашки, пробирки, пипетки, заворачивают в бумагу или помещают в особые футляры и пеналы, в которых посуда может хранится после стерилизации (Теппер,1987).

3. Стерилизация текучим паром.

Текучим паром (100?C) обрабатывают предметы, портящиеся от сухого жара, и некоторые питательные среды, не выдерживающие более высокой температуры (среды с углеводами, МПЖ, молоко), Проводят стерилизацию в кипятильнике Коха по 30 мин. в течение 3 суток ежедневно. Такая стерилизация называется дробной.

4.Стерилизация насыщенным паром под давлением.

Это наиболее быстрый и надежный способ стерилизации, при котором гибнут самые устойчивые ссоры. С его помощью стерилизуют большинство питательных сред, посуду.

Обработку насыщенным паром проводят в герметически закрывающимся толстостенном котле - автоклаве. (Теппер,1987).

2.2.3 Приготовление почвенной суспензии и посев. Приготовление разведений

Численность популяций микроорганизмов обычно велика, поэтому для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд последовательных разведений. Разведения готовят в стерильной водопроводной воде или физрастворе. В ходе опыта целесообразно использовать один и тот же коэффициент разведения, например 10, что уменьшает вероятность ошибки.

Для приготовления разведений стерильную воду разливают по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1 мл исследуемой суспензии стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 мл стерильной воды - это 1-е разведение, 10?№. Полученное разведение тщательно перемешивают новой стерильной пипеткой, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру выполняют 3-5 раз, затем той же пипеткой отбирают 1мл полученной суспензии и переносят во 2-ю пробирку - получают 2-е разведение. Таким же образом готовят и последующие разведения. Степень разведений зависит от плотности исследуемой популяции микроорганизмов; соответственно она тем больше, чем больше плотность популяции.

Для приготовления каждого разведения следует обязательно использовать новую пипетку. Пренебрежение этим правилом приводит к получению ошибочного результата (Методические указания по количественному учету микроорганизмов, 2004).

Техника посева. В чашки Петри посевы могут быть произведены двумя способами: глубинным посевом или рассевом по поверхности питательной среды. При первом методе в стерильную чашку Петри вносят или исследуемую воду, или разведение грунта, или разведения культуры и заливают расплавленным и охлажденным до 40-45?C агаром. Как при внесении посевного материала, так и при заливании его агаром крышка чашки Петри приподнимается как можно меньше (Родина ,1965).

2.2.4 Учет микроорганизмов на плотных средах

После инкубации засеянные среды вынимают из термостата и в них подсчитывают число колоний.

При подсчете колоний на богатых плотных питательных средах (МПА, МПА+сусло-агар, КАА, сусло-агар, среда Чапека, Среда Эшби и т.д.) закрытые чашки Петри просматривают в проходящем свете и с внешней стороны их колонии отмечают маркером. Если на чашке больше 200 колоний, то их можно подсчитывать с помощью камеры Вольфюгеля. Учет микроорганизмов на МПА делают визуально на четвертый день после посева, проводя микроскопирования и подсчитывая ОМЧ (Теппер,1987).

2.2.5 Приготовление окрашенных препаратов

Обработка предметного стекла. Прежде чем приступить к приготовлению микроскопических препаратов необходимо предметные и покровные стекла, Они должны быть чистыми и обезжиренными. Доказательства хорошего обезжиривания является равномерное распределение капли воды на их поверхности (Асонов 1989).

Приготовление мазка. Мазок готовят на предметном стекле при помощи микробиологической петли или пастеровской пипетки. Мазки готовят из культур микробов, выращенных на плотных или жидких питательных средах. Петлю нагревают до покраснения. Над пламенем горелки открывают пробирку, внутрь ее вводят петлю. Охлаждают, после чего петлей соприкасаются с культурой, которую затем тонким слоем наносят на поверхность предметного стекла. При изготовлении мазков из плотных субстратов или агаровых культур на поверхность стекла вначале наносят каплю стерильной воды. Мазок фиксируют над пламенем горелки (Асонов 1989).

2.2.6 Техника окраски по Граму

На хорошо обезжиренное стекло наносят три тонких мазка разных культур микроорганизмов. Мазки высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают в течение 1 мин метилвиолетом. Сливают краситель и, не промывая препарат водой, наносят на него раствор Люголя на 1 мин (до полного почернения мазка). Препарат, на промывая водой, обрабатывают,96%-ным спиртом в течение 15-20 с. Время обесцвечивания очень существенно, при превышении указанного срока обесцвечивается и грамположительные клетки, при недостаточным сроке обработки препарат окажется перекрашенным. Промыв препарат водой, его окрашивают фуксином в течение 1 мин (Теппер 1987).

После этой обработки грамположительные микроорганизмы окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные имеют только цвет дополнительной окраски (фуксина).

Результаты окраски по Граму зависят от возраста культуры: в старых культурах клетки всегда окрашиваются грамотрицательно. Поэтому лучше использовать молодые односуточные культуры (Теппер 1987).

Определение бактерий группы кишечных палочек

При исследовании почв на присутствие БГКП рекомендуется применение титрационного метода при предполагаемой невысокой степени фекального загрязнения, метод мембранных фильтров используется при анализе малозагрязненных почв. При высокой степени фекального загрязнения рекомендуется делать прямой посев почвенной суспензии (1: 10) на среду Эндо.

Титрационный метод. Из приготовленных разведений почвенной суспензии делают посевы во флаконы и пробирки с жидкой питательной средой Кесслера - 10 мл (из разведения 1:10) - в 50 мл среды, по 1 мл из последующих разведений - в 9 мл среды. Посевы инкубируются в течение 48 ч при температуре 37⁰С. При отсутствии во флаконах и пробирках роста, характеризующегося газообразованием и помутнением, дается отрицательный ответ об отсутствии БГКП.

Если в засеянных сосудах обнаруживается рост в виде помутнения среды или помутнения и газообразования, следует сделать высев в чашки Петри со средой Эндо или в пробирки с розолововым агаром, инкубировать 24 ч при температуре 37 ⁰С . Дальнейшей идентификацией (аналогично определению БГКП в воде) подвергаются типичные для эшерихий красные или розовые с металлическим блеском колонии на среде Эндо, а также желтые или оранжевые колонии на розоловой среде. Результат выражается в коли - индексе, т. Е. количество БГКП, обнаруженных в 1 г почвы.

Глава 3 Результаты исследования

В ходе работы было проведено микробиологическое исследование образцов грунта пещеры Баскунчакская. Для выделения бактерий, дрожжей и грибов, представляющих естественную микрофлору пещеры, использовались среда МПА, Чапека и Сабуро. Учет численности проводился через 48 часов на МПА и через неделю на Чапеке и Сабуро. Для учета санитарно - показательных микроорганизмов (бактерий группы кишечная палочка) использовался бродильный метод. Посев осуществлялся со среды Кесслера на среду Эндо, учет результатов проводился через 2 суток культивирования при температуре + 37 ⁰С. Учитывались окрашенные в красный цвет колонии, состоящие из грамотрицательных, оксидазоотрицательных палочек.

Таблица №1

Численность сапротрофной микрофлоры в пещере Баскунчакская.

В шести исследуемых пробах грунта, в числе гетеротрофов, доминируют бациллы. Предположительно, основываясь на культуральных и морфологических признаках, обнаруженные микроорганизмы можно отнести к следующим родам: Bac.megaterium, Bac.subtiles, Bac.mesentericus.

Общее микробное число, варьирует от 7,5• 10⁷ до 1,05 • 10⁶ кое/г.

При определении численности плесневых грибов был произведен начальный визуальный осмотр пещеры, на местах стоянок туристов, на грунте, были обнаружены колонии грибов. Микроскопирование показало, что данные колонии предположительно относятся к роду Penicillium.

На среде Чапека и Сабуро был осуществлен посев 6 проб грунта пещеры отобранных с учетом отдаленности от главных выходов и в трудно доступных местах.

Таблица № 2.

Численность грибов обнаруженных в пещере Баскунчакская.

В числе исследуемых проб грунта, среди грибов, доминирующее положение занимают р. Aspergillus, р. Penicillium.Численность грибов варьирует от 1,5 - 3,6• 10⁵ кое/г грунта. В удаленных и труднодоступных местах количество грибов значительно меньше, чем в местах активно посещаемых туристами. В исследуемых пробах, дрожжи обнаружены не были.

Количество БГКП варьирует в допустимых пределах, от менее 9 до 10 клеток /г. Но наличие даже такого незначительного количества БГКП, может свидетельствовать об антропогенном загрязнение пещеры.

Сводная таблица определения численности микроорганизмов в пробах грунта пещеры Баскунчакская.

Основываясь на полученных результатах можно сделать следующее заключение:

1) в пробах отобранных в грунте пещеры Баскунчакская были обнаружены преимущественно Г «+» споровые палочки. Предположительно обнаруженные микроорганизмы можно отнести к следующим родам: Bac.megaterium, Bac.suрtiles, Bac. mesentericus.

2) Помимо сапротрофной микрофлоры были обнаружены плесневые грибы, доминирующее положение занимают р. Aspergillum, р. Penicillium. Численность грибов варьирует от 1,5 - 3,6• 10⁵ кое/г грунта. В удаленных и труднодоступных местах количество грибов значительно меньше чем в местах активно посещаемых туристами. Также среди грибов был обнаружен р. Fusarium, многие виды которого являются патогенными для человека. При визуальном осмотре пещеры, на местах стоянок туристов, на грунте, были обнаружены колонии грибов, предположительно относящихся к роду Penicillium.

Гетеротрофные микроорганизмы и грибы, обнаруженные в пещере, могут являться индикаторами рекреационного влияния, оказываемого на нее, как на объект туристического значения в результате эксплуатации пещеры в качестве экскурсионного объекта.

3)БГКП были обнаружены в пределах нормы. В труднодоступных местах отмечается их полное отсутствие. Незначительное наличие БГКП также свидетельствует об антропогенном загрязнении пещеры.

Вывод

Основываясь на полученных результатах можно сделать следующие выводы:

1.В пробах, отобранных в грунте пещеры Баскунчакская, среди сапротрофов, доминирующее положение занимают микроорганизмы, предположительно относящиеся к следующим родам: Bac.megaterium, Bac.suрtiles, Bac. mesentericus. Общее микробное число, варьирует от 7,5 • 10⁷ до 1,05 • 10⁶ кое/г. Среди микромицетов доминируют р. Aspergillus р. Penicillium.Численность грибов варьирует от 1,5 - 3,6• 10⁵ кое/г грунта.

2. Количество БГКП варьирует в допустимых пределах, от менее 9 до 10 клеток /г. Но наличие даже такого незначительного количества БГКП, может свидетельствовать об антропогенном загрязнение пещеры.

Список литературы

1. Асонов Н.Р. Микробиология.-2-е изд., перераб. и доп.- М.:

АгропромиздатЮ1989.-350с.

2.Вербина Н.М. Гидромикробиология с основами общей микробиологии. - М.: «Пищевая промышленность», 1980. - 288с.

3.Государственный природный заповедник. «Богдинско - Баскунчакский»

Астрахань. 1998.

4. Методические указания по количественному учету микроорганизмов для студентов специальности 012400 «Микробиология», Куликова И.Ю., 2004-35с.

5.Кочемасов З.Н. Ефремова С.А. Санитарная микробиология и вирусология. - М.: Медецина, 1987. - 352с.

6.Мищустин Е.Н. Микробиология. - М.: Агропромиздат, 1987-338с.

7.Нетрусов А.П

8. Определитель бактерий Берджи. В 2 - х т.: перевод с англ./ Под ред.

Дж. Хоулта, Н.Грига, П.Снита, Дж. Стейли, С. Уильямса - М.: Мир,

1997. - 364с.

9. Расанов Н.Р. Микробиология. М.: Колос, 1989.

10. Теппер Е.З. и др. Практикум по микробиологии Учеб. пособие для вузов. М.: Агропромиздат, 1987. - 237с.

11. http:?? www.ecocave.ru.